专利名称：胶原纤维的提取方法和用其制造组织填充剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种胶原纤维的提取方法，和一种用胶原纤维制造软组织填充剂的方法，和一种用胶原纤维制造硬组织填充剂的方法。
胶原纤维比较硬，有较高的张力。一个胶原分子直径为1.5μm，长为280μm，由三条α构型的多肽链组成；每条链含1052个氨基酸残基，其中甘氨酸占三分之一，脯氨酸和羟脯氨酸各占四分之一，每隔二个氨基酸有一个甘氨酸，甘氨酸与脯氨酸、羟脯氨酸或其他氨基酸组成三氨基酸联合体。多肽链的N末端和C末端均无三氨基酸联合体，留有酸性氨基酸和碱性氨基酸，胶原分子的这些区域叫做端肽，不形成三股螺旋；交联是指胶原分子内部和胶原分子间的结构关系，为纤维成熟提供更多的张力和稳定性，交联在组织成熟过程中进行，在酶的作用下赖氨酰或羟脯氨酰转变为相应的醛，然后与醛亚氨或羟基形成Schiff碱或醛亚氨型化合物，这种反应自发产生。
胶原是一种具有刚性的纤维蛋白，一般的蛋白酶很难将其降解，其生理性转化也远远低于其它蛋白质。胶原半衰期较长，常以月或年计算，但当组织迅速进行重建时，胶原的降解或蜕变相对地要快些，其半衰期则以天或小时计算。异种或同种胶原移植最关键的问题是材料的抗原性问题，从分子水平已经证实，可注射胶原是一种弱抗原性材料。胶原的主要抗原位点位于分子的N末端和C末端区域。这两个肽端具有很大的种属差异性，起到主要免疫作用。当提取胶原时这两个区域被选择性地水解或去除而失活，仅在分子体的三股螺旋结构内部保留微弱的抗原性，且不足以引起明显的排斥反应，从而大大降低了胶原的抗原性。动物胶原可能激发一定的免疫反应，在用临床剂量可注射性胶原治疗病人时可以检测到抗胶原抗体的增高，甚至在无皮肤反应的病人中亦可检测到，但这些抗体与人的胶原无交叉反应，对大多数病人来说与胶原的生物性接触对人体无害。
胶原分为可溶性胶原和不溶性胶原。不溶性的定义是相对的，其不溶的原因与细胞间质成分的相互作用有关，另外随着年龄的增长，胶原分子间及其它分子间也会形成架桥---交联。这些不溶性胶原分子与其他非胶原成分混在一起，给从组织中提取胶原造成了一定困难。人胎儿皮肤中可溶性胶原提取率有5％，进入少年期后提取率只有1％。在一定条件下反复抽提和加入抑制剂抑制胶原纤维的形成，可以使小牛皮肤胶原有50％变成可溶性胶原。
目前，提取胶原的方法通常是将新生小牛皮肤或人胎盘组织去脂，切碎酸溶，酶解，酸提，高速离心，重复上述酸提离心步骤，盐析透析，交联重组，消毒，沉淀冷冻干燥。
现有胶原提取方法的提取物是可溶性胶原，由于动物材料来源局限性强，提取过程复杂，需要添加交联剂，产物粘滞度大，提取率不高，不能制作胶原膜，所以临床应用很受限制。
本发明的目的在于提供一种胶原纤维的提取方法，方法简单易行，产物稳定，该方法获得的胶原纤维可以在临床上的到广泛应用。
本发明是这样实现的一种胶原纤维的提取方法，该方法包括下述步骤(1)选择健康牲畜屠宰后洗刷去毛，取背部去脂肪全层皮肤和/或肌腱和/或板筋和/或骨，常温下用高渗酸浸泡24-120小时；(2)将待用组织取出，清洗除酸，再将其浸泡于温度为4℃---20℃的0.1％---2％胃蛋白酶溶液中，12---24小时；(3)将待用组织取出清洗，获得无细胞胶原框架，将无细胞胶原框架切割成0.05cm---0.5cm大小的组织块；(4)重复上述步骤(1)和步骤(2)(5)将组织块研磨成直径为10μm---50μm，长度为300μm---500μm的胶原纤维丝。
根据上述方法，其中步骤(1)采用3---10N的醋酸或盐酸。
根据上述方法，其中步骤(2)采用0.5---6N的碱中和酸。
根据上述方法，其中步骤(5)采用偏光显微镜监控。
一种用上述方法制得的胶原纤维制造软组织填充剂的方法，该方法包括上述提取胶原纤维的步骤，还包括将胶原纤维丝用生理盐水或磷酸缓冲溶液稀释成80---120mg/ml，装入注射器，封口，用Co60照射。
一种用上述方法制得的胶原纤维制造硬组织填充剂的方法，该方法包括上述提取胶原纤维的步骤，还包括将胶原纤维丝置入一定形状的模具内，加压成型，在40℃---90℃下干燥，用Co60照射。
本发明中胶原纤维的提取方法完全不同于现有的可溶性胶原提取工艺。本发明的制取原料包括动物的皮肤、肌腱、软骨、骨等组织，产率可达80％以上。通过采用高渗酸破坏了细胞的结构和溶解了细胞外可溶性成分，酶促反应消除种属特异性，制取无细胞胶原框架，不需要添加交联剂，不需要高速离心、盐析、透析等步骤，获得的产物中无胶原分子的降解产物和可溶性胶原，因此不是高粘物质，提取量从传统的35mg/ml提高到400mg/ml，通常产品使用80---120mg/ml。
本发明所述的软组织和硬组织填充剂的制造方法是在上述胶原纤维的提取方法上的进一步深化的结果。其所获得的软组织填充剂保存期长，产率高，产品稳定；硬组织填充剂填补了目前这一产品从动物组织直接获得的空白。
实施例1 将新屠宰后的牛洗刷去皮，取肌腱500克，常温下用2N的盐酸浸泡48小时；将待用组织取出，用蒸馏水清洗，0.5N碱中和酸，再将其浸泡于温度为20℃，0.1％胃蛋白酶溶液中12小时；将待用组织取出用水清洗，获得无细胞胶原框架。将无细胞胶原框架切割成0.05cm---0.5cm大小的组织块；重复上述酸浸和酶解步骤一次；在偏光显微镜监控下将组织块研磨成直径为10μm---50μm，长度为300μm---500μm的胶原纤维丝。共获得产物2000克。
取一定体积的胶原细丝产物在50℃---90℃间干燥至恒温，称重后计算，含量为400mg/ml。
用本实施例获得的胶原纤维进行下述成分鉴定实验。[目的]与标准物、阳性对照物对照，用红外吸收光谱(分子光谱)、高压液相分析降解的氨基酸种类和百分比含量，确定本发明获得的注射性胶原的质量。[标本来源与测试单位]标准品---胶原蛋白，Sigma公司出品。阳性对照物---人胎盘制成的注射性胶原，中国预防科学院医用胶原公司出品。测试单位---清华大学，进行红外吸收光谱实验。
辽宁省分析测试研究中心，进行高压液相分析氨基酸百分含量、化学法测糖。
本发明所获得的产物是胶原蛋白，不是一般蛋白质；本发明所获得的产物与对照品各类胶原氨基酸含量无显著差异(p＜0.05)；本发明所获得的产物是纯胶原蛋白，无糖辅基。
实施例2 将新屠宰后的猪洗刷去毛，取背部去脂肪全层皮肤500克，常温下用10N的醋酸浸泡68小时；将待用组织取出，用蒸馏水清洗，0.5N碱中和，再将其浸泡于温度为4℃，0.2％胃蛋白酶溶液中24小时；将待用组织取出用水清洗，获得无细胞胶原框架。将无细胞胶原框架切割成0.05cm---0.5cm大小的组织块；重复上述酸浸和酶解步骤一次；在偏光显微镜监控下，将组织块研磨成直径为10μm---50μm，长度为300μm---500μm的胶原纤维丝，共获得产物2000克。
实施例3 根据实施例1所述的方法，其中酸浸采用3N的盐酸浸泡72小时，酶解采用浓度为1.5％的胃蛋白酶溶液浸泡18小时。
实施例4 将获得的胶原纤维丝用生理盐水稀释成120mg/ml，装入注射器，封口，用Co60照射，获得软组织填充剂---可注射胶原。用本实施例所获得的可注射性胶原进行细菌培养，无细菌生长；进行抗原性实验，结果如下将可注射性胶原注射在大鼠尾部皮下组织中，经1.5、3.0和6.0个月，分别杀死三组大鼠，取尾部注射皮下组织切片、H.E染色，在偏光显微镜下观察注入胶原后不同时间的特点，证明用本发明的方法制得的可注射性胶原无明显炎症反应、无抗原性反应，与组织相容，无包裹现象，6.0个月后仍有部分残留的胶原在肌组织间隙和脂肪组织中。
实施例5 根据实施例4所述的方法，将胶原细丝用磷酸缓冲溶液稀释成80mg/ml。
实施例6 根据实施例1所述的方法，将获得的胶原纤维丝置入一定形状的模具内，加压成型，在40℃---90℃下干燥，用Co60照射，获得硬组织填充剂。
权利要求
1.一种胶原纤维的提取方法，该方法包括下述步骤(1)选择健康牲畜屠宰后洗刷去毛，取背部去脂肪全层皮肤和/或肌腱和/或板筋和/或骨，常温下用高渗酸浸泡24-120小时；(2)将待用组织取出，清洗除酸，再将其浸泡于温度为4℃---20℃的0.1％---2％胃蛋白酶溶液中，12---24小时；(3)将待用组织取出清洗，获得无细胞胶原框架，将无细胞胶原框架切割成0.05cm---0.5cm大小的组织块；(4)重复上述步骤(1)和步骤(2)；(5)将组织块研磨成直径为10μm---50μm，长度为300μm---500μm的胶原纤维丝。
2.根据权利要求1所述的胶原纤维的提取方法，其特征在于所述的步骤(1)采用3---10N的醋酸或盐酸。
3.根据权利要求1或2所述的胶原纤维的提取方法，其特征在于所述的步骤(2)采用0.5---6N的碱中和酸。
4.根据权利要求1或2所述的胶原纤维的提取方法，其特征在于所述的步骤(5)采用偏光显微镜监控。
5.一种用权利要求1所述的胶原纤维制造软组织填充剂的方法，该方法包括上述提取胶原纤维的步骤，还包括将胶原纤维丝用生理盐水或磷酸缓冲溶液稀释成80---120mg/ml，装入注射器，封口，用Co60照射。
6.一种用权利要求1所述的胶原纤维制造硬组织填充剂的方法，该方法包括上述提取胶原纤维的步骤，还包括将胶原纤维丝置入一定形状的模具内，加压成型，在40℃---90℃下干燥，用Co60照射。
全文摘要
本发明的名称为胶原纤维的提取方法和用其制造组织填充剂的方法，属于胶原纤维的提取和应用技术领域。现有胶原提取方法选材范围窄，提取物是可溶性胶原，提取过程复杂，需要添加交联剂，产物粘滞度大，提取率不高，不能制作胶原膜。本发明是这样实现的一种胶原纤维的提取方法，该方法包括下述步骤常温下用高渗酸浸泡动物组织；清洗除酸，酶解；获得无细胞胶原框架；研磨为胶原纤维丝。将胶原纤维丝稀释，包装，封口，消毒，获得软组织填充剂。将胶原纤维丝置入模具，加压成型，干燥，消毒，获得硬组织填充剂。本发明胶原纤维产率可达80％以上，获得的产物中无胶原分子的降解产物和可溶性胶原；所获得的组织填充剂保存期长，产率高，品质稳定。
文档编号A61L33/12GK1407002SQ0113143
公开日2003年4月2日 申请日期2001年9月10日 优先权日2001年9月10日
发明者王由, 李永岚, 王维民 申请人:王由