专利名称：含有纳米相钙磷盐、胶原和海藻酸盐的骨材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种含有纳米相钙磷盐、胶原和海藻酸盐的骨材料的制备方法，属生物工程技术领域。
背景技术：
骨修复的研制开发一直是生物医学工程领域科学工作者努力的方向。现在已经开发了包括金属、陶瓷、高分子以及其复合材料制成的多种骨修复材料，但是由于力学性能，生物相容性以及降解性等方面的不足，手术中实际使用的骨修复材料效果最好的还是自体骨和异体骨。但是自体骨和异体骨有分别有数量有限和存在免疫排斥，感染疾病的危险的问题。
发明内容
本发明的目的是提出一种含有纳米相钙磷盐、胶原和海藻酸盐的骨材料的制备方法，该材料以仿生合成的钙磷盐、蛋白质和多糖为原料，使其微观结构具有仿骨特性，因而具有很好的生物相容性和生物活性。
本发明提出的含有纳米相钙磷盐、胶原和海藻酸盐的骨材料的制备方法，包括下列各步骤(1)在酸溶的胶原溶液中缓慢滴加含有钙离子的溶液，加入钙离子的量为每克胶原滴加钙离子0.01～0.16mol，滴加的同时搅拌，其中，用以溶解胶原的酸为盐酸、硝酸或乙酸，胶原溶液的浓度为5.0×10-5～5.0×10-3g/ml。
(2)在上述第1步的溶液中边搅拌边缓慢滴加含磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子的量与第1步中加入的钙离子的量的摩尔比为Ca∶P＝1～2∶1。
(3)在上述第2步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液至pH值为6～8，PH值用试纸或pH计测定，在pH值为5～6时开始出现沉淀，pH值为7时出现白色悬浊液。
(4)将溶液静置1～5天，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复清洗三次后，放入冻干机内冰冻干燥，随后研磨制得干粉备用。
(5)将上述第4步制得的干粉与海藻酸钠以质量比为10～1∶1的比例混合后，加少量水充分调和，固体粉末与水的质量比为1∶3～0.5，生长因子如重组人骨形态发生蛋白2(以下简称BMP)可以在此步以水溶液的形式加入，加入量为每克固体粉末中加入1～10毫克。
(6)将充分调和后的产物填入外表面带微孔的模具中，置于重量百分比浓度为0.5～10％的氯化钙溶液中浸泡8小时以上，至材料成型以后脱模。
(7)将脱模后的材料在蒸馏水中浸泡12～48小时，在30～50℃烘干，或在-5～-20℃冷冻后放入冰冻干燥机中除去水分，前一种方法将得到比较致密高强度的骨材料。而后一种方法将得到带有孔洞结构的骨框架材料。
上述产品用环氧乙烷蒸气消毒2～4小时，或用Co60照射消毒后保存备用。
发明中以生物自组装的方法合成了纳米晶磷酸钙胶原基复合材料，该材料由纳米相的钙磷盐和胶原分子自组装而成。它在纳米尺度上具有重复片层结构，周期为10-15nm，由胶原层和钙磷盐层交替排列而成，由于其从成分和结构上仿天然骨，因此具有很好的生物相容性和很高的生物活性。发明中的另一种原料海藻酸钠是目前在组织工程中用作细胞支架的生物材料主要是一种天然高分子材料。它具有无毒、亲水、生物相容性及细胞亲和性好的特点。发明中制备的材料的强度主要由钙化的海藻酸盐提供，其强度值和降解性能都和海藻酸钠的加入量及钙化程度有关。这就可以在一定程度上调整材料的降解速度。通过把这种生物相容性好，降解速度可控，易于成型的天然高分子材料和纳米晶磷酸钙胶原基复合材料整合为高孔隙率的框架材料，得到了有着优异生物相容性和生物活性的可降解骨替代材料，可以作为可降解骨替代材料在医疗方面得到广泛应用。样品制备过程中还可以加入适量的生长因子，最大限度的提高材料的生物活性。材料在微观结构上仿骨和采用天然原料是本发明的两大特点，材料也因此具有优异的生物性能。
根据本发明的方法制备的骨材料，具有优异的生物相容性，而且结构上也具有仿骨性。其钙磷盐晶体尺寸在纳米量级，与有机成分胶原的结合紧密，排列有一定规律。由于采用的是天然原料此材料的生物相容性也很好。且此材料强度和孔隙率合理，可以作为植入型可降解骨材料得到应用。
具体实施例方式本发明所用的胶原为益而康公司的I型胶原凝胶(浓度固含量1％，所含胶原为纯化的牛皮胶原)，CELLON公司购买的液态I型胶原(浓度0.3％溶液PH值由HCl调整所含胶原为纯化的牛皮胶原)，天津第二附属医院的I型胶原凝胶(浓度固含量1％，所含胶原为纯化的牛跟腱胶原)；所用的含PO43-的溶液为Na2HPO4，H3PO4，(NH4)2HPO4的水溶液；所用的含钙离子的溶液为CaCl2·6H2O，Ca(NO3)2，CaCl2·2H2O的水溶液。使用的海藻酸钠来自Acros Co.、青岛胶南明月海藻工业、北京西四化工原料等公司。
实施例1所用材料为从益而康公司购买的I型胶原凝胶(浓度固含量1％，所含胶原为纯化的牛皮胶原)、分析纯CaCl2·6H2O、分析纯Na2HPO4、海藻酸钠来自Acros Co.。
(1)将20g胶原凝胶溶于300ml 0.5M乙酸溶液中，缓慢滴加18.3ml 1mol/l CaCl2和11ml 1mol/l Na2HPO4，滴加的同时用磁力搅拌器搅拌；(2)继续搅拌，同时缓慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值为7；
(3)静置溶液1天，除去上清，离心分离出沉淀用去离子水反复清洗三次后放入冻干机内进行冰冻干燥，研磨后制得干粉备用；(4)将2.4克第(3)步制得的干粉与0.6克海藻酸钠混和后加5毫升蒸馏水充分调和。
(5)将调和后的产物填入外表面带微孔的模具中，微孔直径为0.45微米，于5％(w％)的氯化钙溶液中浸泡12小时后脱模。
(6)脱模后的材料在蒸馏水中浸泡12小时后于-20℃冷冻，随后放入冰冻干燥机中32小时除去水分。
(7)将第(6)步的产品用环氧乙烷蒸气消毒2小时后保存。
实施例2所用材料为天津第二附属医院的I型胶原凝胶(浓度固含量1％，所含胶原为纯化的牛跟腱胶原)、分析纯CaCl2·2H2O、分析纯(NH4)2HPO4、海藻酸钠来自北京西四化工原料公司。
(1)20g胶原凝胶溶于300ml 0.1M HNO3溶液中，缓慢滴加10ml 1mol/l CaCl2和10ml 1mol/l (NH4)2HPO4，滴加的同时用磁力搅拌器搅拌；(2)继续搅拌，同时缓慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值为7；(3)静置溶液4天，除去上清，离心分离出沉淀用去离子水反复清洗三次后放入冻干机内进行冰冻干燥，研磨后制得干粉备用；(4)将1.8克第(3)步制得的干粉与0.6克海藻酸钠混和后用3毫升重组人骨形态发生蛋白2 BMP的悬浮液充分调和，BMP的含量为16.8毫克。
(5)将调和后的产物填入外表面带微孔的模具中，微孔直径为0.45微米，于5％(w％)的氯化钙溶液中浸泡24小时后脱模。
(6)脱模后的材料在蒸馏水中浸泡48小时后于30℃烘干24小时。
(7)将第(6)步的产品用环氧乙烷蒸气消毒4小时后保存。
实施例3所用材料为CELLON公司购买的液态I型胶原(浓度0.3％溶液PH值由HCl调整所含胶原为纯化的牛皮胶原)、分析纯的CaCl2·6H2O、分析纯H3PO4(含量＞＝85％密度1.689g/ml)，海藻酸钠来自Acros Co.。
(1)100ml胶原溶液中滴加溶于10ml去离子水中的1.125ml H3PO4，滴加的同时用磁力搅拌器搅拌；(2)称取结晶良好的6.01g CaCl26H2O溶于20ml去离子水，使其完全溶解，将其滴加入上一步制得的溶液中后，继续搅拌1小时；(3)继续搅拌，同时缓慢滴加0.75mol/1的NaOH溶液至PH值为7；(4)静置溶液1天，除去上清，离心分离出沉淀用去离子水反复清洗三次后放入冻干机内进行冰冻干燥，研磨后制得干粉备用；(5)将2.1克第(4)步制得的干粉与0.3克海藻酸钠混和后用5毫升重组人骨形态发生蛋白2(BMP)的悬浮液充分调和，BMP的含量为7.2毫克。
(6)将调和后的产物填入外表面带微孔的模具中，微孔直径为0.45微米，于3％(w％)的氯化钙溶液中浸泡32小时后脱模。
(7)脱模后的材料在蒸馏水中浸泡1小时后于-10℃冷冻，随后放入冰冻干燥机中32小时除去水分。
(8)将第(7)步的产品用环氧乙烷蒸气消毒2小时后保存。
实施例4所用材料为益而康公司购买的I型胶原凝胶(浓度固含量1％，所含胶原为纯化的牛皮胶原)、分析纯Ca(NO3)2、分析纯Na2HPO4，海藻酸钠来自Acros Co.。
(1)20g胶原凝胶溶于300ml 0.5M乙酸溶液中，缓慢滴加16.5ml 1mol/lCa(NO3)2和11ml 1mol/l H3PO4，滴加的同时用磁力搅拌器搅拌；(2)继续搅拌，同时缓慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值为7；(3)静置溶液1天，除去上清，离心分离出沉淀用去离子水反复清洗三次后放入冻干机内进行冰冻干燥，研磨后制得干粉备用；(4)将2克第(3)步制得的干粉与1.5克海藻酸钠混和后直接填入外表面带微孔的模具中，微孔直径为0.6微米，于8％(w％)的氯化钙溶液中浸泡12小时后脱模。
(5)将脱模后的材料在蒸馏水中浸泡24小时，随后在45℃下烘干24小时(6)参照国标用Co60照射消毒后保存。
实施例5所用材料为益而康公司购买的I型胶原凝胶(浓度固含量1％，所含胶原为纯化的牛皮胶原)、分析纯CaCl2·6H2O、分析纯Na2HPO4，海藻酸钠来自青岛胶南明月海藻工业。
(1)30g胶原凝胶溶于300ml 0.5M乙酸溶液中，缓慢滴加18.3ml 1mol/l CaCl2和11ml 1mol/l Na2HPO4，滴加的同时用磁力搅拌器搅拌；(2)继续搅拌，同时缓慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值为7；(3)静置溶液5天，除去上清，离心分离出沉淀用去离子水反复清洗三次后放入冻干机内进行冰冻干燥，研磨后制得干粉备用；(4)将1.8克第(3)步制得的干粉与0.6克海藻酸钠混和加2毫升蒸馏水充分调和。
(5)将调和后的产物填入外表面带微孔的模具中，微孔直径为0.6微米，于10％(w％)的氯化钙溶液中浸泡8小时后脱模。
(6)脱模后的材料在蒸馏水中浸泡30分钟后于-20℃冷冻，随后放入冰冻干燥机中24小时除去水分。
(7)将第(6)步的产品用环氧乙烷蒸气消毒4小时后保存。
权利要求
1.一种含有纳米相钙磷盐、胶原和海藻酸盐的骨材料的制备方法，其特征在于该方法包括下列各步骤(1)溶的胶原溶液中缓慢滴加含有钙离子的溶液，加入钙离子的量为每克胶原滴加钙离子0.01～0.16mol，滴加的同时搅拌，其中，用以溶解胶原的酸为盐酸、硝酸或乙酸，胶原溶液的浓度为5.0×10-5～5.0×10-3g/ml；(2)在上述第1步的溶液中边搅拌边缓慢滴加含磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子的量与第1步中加入的钙离子的量的摩尔比为Ca∶P＝1～2∶1；(3)在上述第2步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液至pH值为6～8，PH值用试纸或pH计测定，在pH值为5～6时开始出现沉淀，pH值为7时出现白色悬浊液；(4)将溶液静置1～5天，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复清洗三次后，放入冻干机内冰冻干燥，随后研磨制得干粉备用；(5)上述第4步制得的干粉与海藻酸钠以质量比为10～1∶1的比例混合后，加少量水充分调和，固体粉末与水的质量比为1∶3～0.5；(6)充分调和后的产物填入外表面带微孔的模具中，置于重量百分比浓度为0.5～10％的氯化钙溶液中浸泡8小时以上，至材料成型以后脱模；(7)将脱模后的材料在蒸馏水中浸泡12～48小时，在30～50℃烘干，或在-5～-20℃冷冻后放入冰冻干燥机中除去水分，得到骨框架材料。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在上述第5步中以水溶液的形式加入生长因子重组人骨形态发生蛋白2，加入量为每克固体粉末中加入1～10毫克。
全文摘要
本发明涉及一种含有纳米相钙磷盐、胶原和海藻酸盐的骨材料的制备方法,首先在酸溶的胶原溶液中缓慢滴加含有钙离子的溶液,然后在该溶液中边搅拌边缓慢滴加含磷酸根离子的水溶液,再边搅拌边缓慢滴加碱液调pH值,将溶液静置,除去上清,离心分离出沉淀,研磨制得干粉,将干粉与海藻酸钠混合,加水调和,调和后的产物填入模具中,成型、脱模、并在蒸馏水中浸泡,干燥后得到骨材料。本发明的方法制备的骨材料,具有优异的生物相容性,结构上也具有仿骨性。其钙磷盐晶体尺寸在纳米量级,与有机成分胶原的结合紧密,排列有一定规律。由于采用的是天然原料此材料的生物相容性也很好。此材料强度和孔隙率合理,可以作为植入型可降解骨材料得到应用。
文档编号A61L27/24GK1337271SQ0114190
公开日2002年2月27日 申请日期2001年9月21日 优先权日2001年9月21日
发明者崔福斋, 张曙明, 廖素三, 冯庆玲 申请人:清华大学