专利名称：治疗与新生血管生成相关疾病的基因工程药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程药物，特别是涉及含有人重组纤溶酶原K5片段用于治疗与新生血管生成相关的疾病的药物。
近年来的研究显示，纤溶酶原(Plasminogen)内部的K5区(kringle5，以下简称为K5，存在于Plasminogen，但不属于Angiostatin)对内皮细胞的增殖和迁移比Angiostatin有更强的抑制作用。(Ji，W.R.，Barrientos，L.G.，Trail，P.A.，1998，BBRC 247，414-419 Cao，Y.，Chen，A.，Llinas，M.，1997，J.Biol.Chem.272，22924-22928)。
K5是一种血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)蛋白水解的片段(Cao，Y.，Ji，R.W.，Davidson，D.，Folkman，J.，1 996，J.Biol.Chem.27129461)，是纤维酶原中第5个kringle区。每个kringle由80个氨基酸组成(Castellino FJ，McCanceSGThe kringle domains of human plasminogen.Ciba Foundation Symposium21246-65，1997)。已经证明，K5抑制内皮细胞增殖；而且，其抑制活性高于angiostatin(即kringle 1-4)(Cao，Y.，Ji，R.W.，Davidson，D.，Folkman，J.，1996，J.Biol.Chem.27129461、Cao，Y.，Chen，A.，Llinas，M.，1997，J.Biol.Chem.272，22924-22928、O’Reilly，M.S.，Holmgren，L.，Shing，Y.，Folkman，J.，1994，Cell.79315)。另外，K5也抑制内皮细胞迁移这一血管生成的重要步骤(Ji，W.R.，Barrientos，L.G.，Trail，P.A.，1998，BBRC 247，414-419、Lu H，Dhanabal M，Volk R，Waterman MJF，Ramchandran R，Knebelmann B，Segal M，Sukhatme VPKringle 5 causes cell cycle arrest and apoptosis of endothelial cells.BiochemBiophy Res Comm 285668-673，1999)。K5对内皮细胞的的作用是通过诱导细胞周期循环抑制和细胞凋亡而起作用的，并且针对于内皮细胞的增殖。由于其具有的高效、细胞类型的选择性，以及较短的氨基酸序列，K5被认为是治疗新生血管疾病的有效物质。
但用Plasminogen K5作为药物，用于治疗与新生血管生成相关的肿瘤、视网膜疾病尚未见报道。
本发明发现了重组K5在体内和体外对视网膜以及肿瘤新血管形成具有明显抑制作用。
本发明的技术方案是1.K5的获得1)构建人重组K5表达系统利用RT-PCR技术，从人的肝脏RNA中扩增出K5cDNA，将该PCR产物克隆到pET22载体中的Eco RI和HindIII的位点上，形成了6X组氨酸和K5的融合基因序列。表达载体构建的正确性通过测序确认。
2)人重组K5的表达和纯化将上述载体转化E.coli菌株BL-21/DE3，该菌株表达的人重组K5主要在原生质膜(preplasmic)间隙。重组蛋白的表达是通过IPTG的诱导。用溶菌酶和离心的方法回收原生质膜间隙的蛋白。将由此得到的蛋白进行分离纯化。得到的人重组K5蛋白用SDS-PAGE方法和Western印迹法进行确认。
2.药效学实验用本发明的药物进行了如下生物学实验1)重组K5对人眼视网膜毛细管内皮细胞(HRCEC)生长抑制实验结果显示HRCEC在低氧(1％O2)条件下比在正常氧条件下数量明显增多(p＜0.05，n＝4)，其半数抑制浓度EC50在正常氧和低氧条件下分别是70nM和600nM。
2)K5的细胞型特异性抑制结果显示K5对原发周膜细胞(Pericyte)或E1A-NR3细胞(从大鼠视网膜神经元衍生的一种无限增殖化细胞系)无抑制作用(p＞0.05，n＝4)。证明K5的抑制作用仅针对于神经内皮细胞。
3)K5预防大鼠视网膜神经血管形成体内实验结果显示K5处理过的动物眼比对照组视网膜神经血管前体细胞明显减少(K5实验组33.3±2.7nuclei/section；PBS对照组66.1±5.9，P＜0.01，n＝8)。证明注射K5可预防视网膜神经血管的发展。并提示K5的抑制作用取决于浓度。
4)K5抑制视网膜神经血管生长的体内实验在视网膜神经血管新生后，用K5处理的眼睛，其视网膜神经血管生长的平均数仅有轻微增长，(注射前74.6±12.4nuclei/section，注射后80.3±22.5P＝0.4，n＝8)。相反用PBS的对照组视网膜神经血管生长的平均数增长了1倍(注射前74.6±12.4nuclei/section，注射后145.5±24.1 nuclei/section P＜0.01，n＝8)。然而，K5并不减少血管细胞前体的数量。该结果提示，K5一次注射后可抑制神经血管的生长，而不影响血管内皮细胞前体。
5)K5的安全性实验眼部注射K5后无明显的组织学改变或炎症细胞渗透发生。此外，正常的视网膜内血管在注射后无可检测到的改变。该发现提示K5在所用浓度下不会引起视网膜或正常血管毒性。
6)K5的抗肿瘤作用用人重组K5蛋白分别对视网膜充血的大鼠和产生肿瘤的裸鼠进行治疗试验。对视网膜充血的大鼠，带有肿瘤的裸鼠，用K5进行肿瘤的原位注射，4周后，取下肿瘤，进行肿块大小分析和形态学上的分析。实验表明，K5能明显地抑制肿瘤的生长。
本发明的优点和效果1)本发明所用的人K5的基因产物是人体内源性蛋白。利用细菌发酵生产人K5基因产物，属于生物高科技，污染小，产率高，成本低。
2)人重组K5多肽为16kD，比其它天然人蛋白类的血管生长因子抑制剂的分子量都小，更适宜作为药物分子。
3)本发明的药物在体外体内均可有效抑制血管细胞生长，且该种抑制是特异性的，不对非血管细胞产生抑制。即对非血管细胞不产生毒害与损伤。
2.人重组K5的表达和纯化将上述载体转化E.coli菌株BL-21/DE3(美国Novagen公司产品)。该菌株表达的人重组K5主要在原生质膜(preplasmic)间隙。重组蛋白的表达是通过IPTG的诱导。用溶菌酶和离心的方法回收原生质膜间隙的蛋白。将由此得到的蛋白过His-Bind柱(美国Novagen公司产品)进行分离纯化。纯化后得到的人重组K5蛋白用SDS-PAGE方法和Western印迹法进行确认。
实施例2 K5对人视网膜细胞生长抑制实验1.实验材料视网膜细胞来源从美国南卡Lion眼库协会(theSouth Carolina Lion′s EyeBank Association)获得志愿者人眼。
2.实验方法A.人眼视网膜毛细管内皮细胞(HRCEC)和周膜细胞(Pericyte)的分离与培养从人眼中分离出视网膜毛细管内皮细胞(HRCEC)掺入用荧光探针标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI 1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanineperchlorate，Biomedical Technologies Inc.，Stoughton，MA)，确定培养物中第二代内皮细胞的纯度。周膜细胞(Pericyte)的分离按文献(Grant MB，Guay，CPlasminogen activator production by human retinal endothelial cells ofnon-diabetic and diabetic origin.Invest Ophthalmol Vis Sci 3253-64，1991)方法进行。
B.活细胞计数将处于第二和第六代的上述细胞接种在覆盖有明胶/纤连蛋白的12孔培养板中，每孔的细胞接种密度为0.8×104，在含15％的FBS的培养基中培养24小时后，改换为含5％FBS和1ng/ml bEGF的培养基，在改换的培养基中加入不同浓度的K5，每种浓度设4个重复。然后，细胞在正常氧浓度和低氧浓度(1％O2)的条件下分别培养72小时。通过胰蛋白酶化法，从培养板中取出细胞，重悬浮于生长介质(growth media)中，用0.4％台盼蓝(trypan blue)染色，然后在光学显微镜下进行活细胞计数。用Student′s test分析平均细胞数，以确定K5对细胞生长的抑制和抑制的特异性。
3.实验结果重组K5在正常氧和低氧条件下对HRCEC的体外抑制实验用浓度为20、40、80、160nM的重组K5处理HRCEC，在正常氧和低氧条件下分别培养72小时，然后进行细胞计数。当浓度在20nM时，在正常氧和低氧条件下K5就可明显降低细胞数量(p＜0.01 n＝4)。半数抑制浓度EC50在正常氧和低氧条件下分别是70nM和600nM。
结论HRCEC在低氧(1％O2)条件下比在正常氧条件下数量明显增多(p＜0.05，n＝4)。
实施例3 K5的细胞型特异性抑制实验条件同实施例2，结果显示K5不显示任何有意义的对原发周膜细胞(Pericyte)或E1A-NR3细胞(从大鼠视网膜神经元衍生的一种无限增殖化细胞系)的抑制作用(p＞0.05，n＝4)。K5的浓度从20-320nM均可观察到此。提示K5的抑制作用仅针对于神经内皮细胞。
实施例4动物体内视网膜神经血管形成的诱导1.实验动物从位于Indianapolis的Harlan购得Spragre Dawley和BrownNorway大鼠。
2.实验方法视网膜神经血管形成的诱导和数量确定按文献(Smith LE，et alOxygen-induced retinopathy in the muse.Invest Ophthalmol Vis Sci35101-111.1994、Smith LEH et alEssential role of growth hormone inischemia-induced retinal neovascularization.Science 2761706-1709，1997)的方法进行，稍有改动。将8只白化病的Spragre Dawley和Brown Norway新生大鼠随机分组。出生后7日的大鼠暴露于低氧环境下(75％O2)5天，然后在正常氧条件下饲养7天，以诱导视网膜神经血管形成。
3.视网膜神经血管形成的检验蛋白印迹法分析将视网膜切片，然后进行超声降解匀化。用BioRad蛋白试验测定上清液的蛋白浓度。50微克可溶蛋白经SDS-PAGE(15％聚丙烯酰胺凝胶)电泳，并电转移至Hybond ECL硝化纤维滤膜(AmershamInternational plc)。然后用5％BLOTTO在TBST缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.6，137mMNaCl，0.1％Tween 20)溶液在室温下振摇1小时，以阻断该膜。加入兔抗-VEGF抗体(Santa Cruz，CA)至该BLOTTO中，浓度为1∶4000，与该膜在4℃培养振摇过夜。室温下将该膜用TBST冲洗三次，每次20分钟。用辣根过氧化酶(Amersham International plc)标记的驴抗兔抗体用BLOTTO溶液称释至1∶4000，在室温下与该膜温育2小时。将该膜用TBST冲洗三次，用ECL检测盒(Amersham International plc)将该膜显色成带，然后用KodakX-Omat胶片曝光。同样的膜用特异于b-肌动蛋白的抗体进行带状化和再次蛋白印迹。
蛋白印迹法分析证实经氧诱导的Brown Norway大鼠视网膜病变中，Brown Norway大鼠前视网膜血管生成细胞的生成数量较Spragre Dawley大鼠更多，因此随后的实验均采用Brown Norway大鼠。氧诱导的Brown Norway大鼠视网膜病变在所有实验大鼠中可观察到明显的视网膜神经血管形成、微动脉瘤、非灌注区和出血现象。
实施例5 K5预防大鼠视网膜神经血管形成体内实验实验动物来源及诱导病理模型方法同实施例4。
实验方法将人重组K5蛋白溶于PBS，1mg/ml，进行过滤除菌。一部分动物在从低氧环境转入正常氧环境后立即注射K5，实验证明，此时，尚未发生新神经血管形成。在正常氧环境下饲养7日后检查视网膜神经。
另一部分动物在从低氧环境转入正常氧环境7日后注射K5，将注射后的动物在正常氧条件下饲养7天，将实验动物麻醉，用玻璃毛细管针将不同浓度K5注射到右眼的玻璃体中，左眼作为对照，注射PBS。将注射后的动物在正常氧条件下饲养7天后杀死鼠，取出眼体，用10％福尔马林固定，做切片。用苏木精和曙红染色。用250倍光学显微镜对视网膜玻璃体侧的血管细胞核进行记数，并对每只眼8个矢状切面进行细胞形态学检测。每组动物的血管细胞核数目进行平均。将该平均数与对照组进行比较，用Student′s test方法进行分析。
视网膜血管生长情况检验方法高分子量荧光素造影术按文献(Smith LE，et alOxygen-induced retinopathy in the muse.InvestOphthalmol Vis Sci 35101-111，1994)方法，将实验动物麻醉并灌注荧光素(经由心室内注射Sigma生产的50mg/ml，2×106分子量异硫氰酸酯葡聚糖荧光素fluorescein isothiocyanate-dextran)后，立即处死动物，取出眼体，用4％低聚甲醛固定10分钟，将视网膜做切片，除去晶状体和玻璃体，在4％低聚甲醛中培育3小时。将处理后的视网膜平铺在一个明胶覆盖的玻片上。在荧光显微镜(Axioplan2 Imaging，Zeiss)下检查血管系统。
实验结果接受了3ul K5(3ug/ul)K5注射的眼，比起用同体积PBS注射的对照组，显示出神经血管丛减少。K5处理过的眼比对照组视网膜神经血管前体细胞也明显减少(K5实验组33.3±2.7 nuclei/section；PBS对照组66.1±5.9，P＜0.01，n＝8)。
结果表明一次性注射K5，至少可部分预防在缺血条件下，视网膜神经血管的发展。而注射同体积浓度仅为0.3ug/ul K5不会产生有意义的神经血管细胞的减少(65.3±2.0 nuclei/section，P＝0.9，n＝8)，提示K5的抑制作用取决于浓度。
实施例6 K5抑制视网膜神经血管生长的体内实验在视网膜神经血管新生后，为确定K5的作用，在转入正常氧条件后7日将K5注射入大鼠玻璃体中，此时已发生明显的视网膜神经血管新生。然后在正常氧条件下再饲养7日，让新生视网膜神经血管继续生长，然后计数。用K5处理的眼睛，视网膜神经血管生长的平均数仅有轻微增长，(注射前74.6±12.4nuclei/section，注射后80.3±22.5 P＝0.4，n＝8)。相反用PBS的对照组视网膜神经血管生长的平均数增长了1倍(注射前74.6±12.4nuclei/section，注射后145.5±24.1nuclei/section P＜0.01，n＝8)。统计学分析表明，经K5处理过的眼比起用PBS处理过的眼注射7日后神经血管细胞少(P＜0.05，n＝8)。然而，K5并不减少血管细胞前体的数量。该结果提示，K5一次注射后可抑制神经血管的生长，而不影响血管内皮细胞前体。
实施例7 K5对视网膜的安全性实验实验动物同实施例3、4。
为确定毒性和抗原性，在注射K57日后检查了视网膜结构。无明显的组织学改变或炎症细胞渗透发生。此外，正常的视网膜内血管在注射后无可检测到的改变。该发现提示K5在所用浓度下不会引起视网膜或正常血管毒性。
实施例8用K5进行动物体内肿瘤的抑制作用实验动物荷瘤裸鼠(接种人肺癌细胞)共30只，分3组，每组10只鼠。1组K5肿瘤原位注射组；2组K5腹腔注射组(阳性对照组)；3组生理盐水肿瘤原位注射(空白对照组)。
实验药物人重组K5蛋白磷酸缓冲液，浓度为3微克/微升实验方法给1组荷瘤鼠进行肿瘤的原位注射受试药物3微克/微升/150克体重；2组进行同样药量的腹腔注射；3组原位注射同体积量的生理盐水。每周一次注射，4周后，取下肿瘤，进行肿块大小分析和形态学上的分析。
实验结果原位注射组的肿瘤明显小于腹腔和生理盐水注射组，肿瘤体积平均小于1/3。结果表明，用K5进行原位注射对肿瘤具明显抑制作用。
权利要求
1.人重组纤溶酶原K5片段在制备治疗与新生血管生成相关疾病的药物中的应用。
2.权利要求1所述的与新生血管生成相关疾病，包括视网膜病和肺癌。
全文摘要
本发明涉及一种含有人重组纤溶酶原K5片段，用于治疗与新生血管生成相关的疾病的药物。本发明用重组K5进行了人眼视网膜毛细管内皮细胞生长抑制实验、预防和抑制大鼠视网膜神经血管形成体内实验和K5的抗肿瘤实验，结果显示重组K5在体内和体外对视网膜新血管形成具有明显抑制作用并能明显地抑制肿瘤的生长，而且对非血管细胞不产生毒害与损伤。
文档编号A61P27/02GK1408431SQ01141908
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月21日 优先权日2001年9月21日
发明者顾军, 马建新 申请人:北京华兴生生物技术有限公司