专利名称：预防鼻病毒感染的新型免疫粘附素的制作方法
技术领域：
本发明涉及融合人类鼻病毒受体蛋白和免疫球蛋白的免疫粘附素及其在植物内的表达。该免疫粘附素也计划用于人类鼻病毒感染的预防和治疗。
背景技术：
普通感冒一般是相对轻微的疾病，但感冒也可以导致严重的并发症，例如中耳炎、鼻窦炎和哮喘加重。人类鼻病毒(HRV)引起成人感冒的50％和儿童感冒的25％(Bella和Rossmann，J Struct Biol.12869-74，1999，和Sperber和Hayden，Antimicrob Agents Chemother.32409-19，1988)。社会花费为此达到每年数十亿美元。这些微小并且裸露的RNA病毒代表小核糖核酸病毒的一种亚组(Rueckert，Virology，pp.507-548，eds.，Fields等，Raven Press，Ltd.New York，1990)。鼻病毒的X光晶体图识别到直径300的二十面体对称的衣壳(1＝0.1nm)，该衣壳由60拷贝的每种病毒外被蛋白VP1，VP2和VP3构成(Rossmann，Nature 317145-153，1985)。HRV表面凹陷或“峡谷”提示受体结合位点(Colonno等，Proc Natl Acad Sci USA.855449-5453，1985；Rossmann等，Nature 317145-153，1985)。HRV的102种血清型中，91种(称作主要组)共享一种细胞表面糖蛋白为它们的受体，该细胞表面糖蛋白称为细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(Greve等，Cell 56839-847，1989；Staunton等，Cell 56849-853，1989)；该结合位点位于N-末端结构域1中(Greve等，J Virol.656015-6023，1991；Staunton等，Cell 61243-254，1990)。
ICAM-1是一种含有五个细胞外结构域、一个疏水跨膜结构域和一个短胞质结构域的膜蛋白。ICAM-1在许多免疫和炎症反应的重要细胞上表达，并在其它细胞表面诱导表达(Casasnovas等，Proc Natl Acad SciUSA.954134-9，1998)。ICAM-1的功能为白细胞整联蛋白LFA-1和Mac-1的配体(Springer，Cell.7630114，1994；Staunton等，Cell 61243-254，1990)。由于跨膜结构域的相互作用，ICAM-1在细胞表面主要以二聚体形式存在(Miller等，J Exp Med.1821234-41，1995；Reilly等，J Immunol.155529-32，1995)。
由五个细胞外结构域组成的重组可溶性ICAM-1(sICAM-1)在体外被证实可以有效的阻断鼻病毒感染人类细胞(Greve等，J Virol.656015-6023，1991；Marlin等，Nature.34470-2，1990)。sICAM-1对抗实验室菌株和野生分离菌株谱的活性分析证实，HRV的所有主要菌株都对sICAM-1敏感。不以ICAM为受体的少量菌株并不受sICAM-1影响(Crump等，Antiviral Chem Chemother.4323-327，1993；Ohlin等，Antimicrob Agents Chemother.381413-5，1994)。
可溶性ICAM-1的体外抗病毒活性似乎通过不止一种机制介导。这些机制包括与细胞表面ICAM-1竞争结合位点、干扰病毒进入或及通过使未成熟病毒RNA释放形成空衣壳而直接使病毒失活(Arruda等，AntimicrobAgents Chemother.361186-1191，1992；Greve等，J Virol.656015-6023，1991；Marlin等，Nature.34470-2，1990；Martin等，J Virol.673561-8，1993)。
HRV的宿主范围仅限于灵长类动物。一项新的研究证实，可溶性ICAM-1可以预防黑猩猩的鼻病毒感染(Huguenel等，Am J Respir CritCare Med.1551206-10，1997)。虽然黑猩猩并不出现临床症状，通过检测血清转化和病毒释放证实了感染的存在。在给药时或给药后10分钟后给予HRV时，单剂量10mg可溶性ICAM-1的鼻内喷雾可以有效地预防HRV-16感染。
人类临床实验证实，可溶性ICAM-1降低实验HRV感冒的严重性(Turner等，JAMA 2811797-804，1999)。该实验共有196位受试者接受不同制剂的可溶性ICAM-1或安慰剂的治疗。一些受试者在接种HRV39前7小时给予可溶性ICAM-1或安慰剂，其他受试者在病毒接种十二小时后给药。药物以鼻内溶液或粉末形式给药，每日6次持续7天(每天用量4.4mg)。该项研究通过病毒分离或血清转化证实可溶性ICAM-1不预防感染(安慰剂治疗组92％感染率，可溶性ICAM-1治疗组85％感染率)。但是可溶性ICAM-1对于所有的疾病检测值确实有影响。总体症状评分降低45％，患有临床感冒的受试者比例降低23％，并且鼻粘液重量降低56％。在使用粉末和溶液制剂组间或接种前和接种后两组间没有明显区别。使用可溶性ICAM-1治疗不会导致任何副作用或鼻粘膜吸收。并且使用可溶性ICAM-1治疗并不抑制抗HRV型特异性抗体的产生。
如上述讨论，ICAM-1以二聚体的形式存在于细胞表面。Martin等，在J Virol.673561-8，(1993)中第一次提出，多聚可溶性ICAM-1多价结合HRV可能导致更高的有效亲和性，其称为亲和力，使病毒易于脱外被。他们构建的多价ICAM-1/免疫球蛋白分子假定较单价可溶性ICAM-1在中和HRV上更为有效，因此可以提高治疗效率。这些ICAM-1/免疫球蛋白分子包括与IgA1(IC1-2D/IgA)、IgM(IC1-2D/IgM)和IgG1(IC1-2D/IgG)铰链区和重链恒定区融合的ICAM-1氨基末端结构域1和2。而且，五个细胞外结构域融合于IgA1(IC1-5D/IgA)。在HRV结合、感染性和构象分析中，比较了这些ICAM-1/免疫球蛋白分子和含有两个(sIC1-2D)和五个(sICl-5D)结构域的可溶性ICAM-1。ICAM-1/IgA免疫球蛋白分子(IC1-5D/IgA)是可溶性ICAM-1效率的200倍，ICAM-1/IgM免疫球蛋白分子(IC1-2D/IgM)和ICAM-1/IgG免疫球蛋白分子(IC1-2D/IgG)分别是可溶性ICAM-1效率的25和10倍。这些分子在抑制鼻病毒结合细胞和破坏病毒衣壳构象上有较高的效率。ICAM-1/IgA免疫球蛋白分子在纳摩尔浓度范围有效。对比IC1-2D/IgA和IC1-2D/IgG证实，使用的恒定区Ig种类对效率有很大影响。
随后的研究对比了可溶性ICAM-1和IC1-5D/IgA对九种主要HRV血清型和适当耐受可溶性ICAM-1的HRV-39变异体的抑制活性(Crump等，Antimicrob Agents Chemother.381425-7，1993)。IC1-5D/IgA较单体可溶性ICAM-1对于标准血清型的抑制在重量基础上的有效性是50至143倍，摩尔基础上的有效性是60至170倍。HRV-39变异体对可溶性ICAM-1的耐受性是野生型的38倍多，而对IC1-5D/IgA的耐受性只有野生型的5倍。这一结论与病毒逃脱多价分子抑制的频率低于病毒逃脱单价可溶性受体的假设一致(Martin等，J Virol.673561-8，1993)。设计检测病毒失活的分析证实，可溶性ICAM-1不能直接使HRV-39和HRV-13明显失活(感染性降低＜0.5log10)。然而，与IC1-5D/IgA共孵育导致这些相同病毒的感染性降低约1.0log10(Crump等，Antimicrob AgentsChemother.381425-7，1994)。Martin等(J Virol.673561-8，1993)的结果提示，价越多，分子的效应越强。通过蔗糖梯度沉淀可以分离IC1-2/IgM的二聚体和十聚体形式。十聚体对阻断HRV与Hela细胞结合的效应是二聚体的五倍。
所描述的ICAM-1/免疫球蛋白分子有一些局限性，包括繁杂的生产技术和这种生产方法的高花费。而且，以上描述的ICAM-1/免疫球蛋白分子作为多聚体，在必须使鼻病毒失活的苛刻环境里仅有局限的稳定性。
本发明免疫粘附素较本领域已知的那些有明显的优势。本发明中植物表达的免疫粘附素可以为四聚体而并不仅为二聚体。有多个结合位点的免疫粘附素对病毒有较高的亲和力，从而提高免疫粘附素的效率。而且，把分泌成分和免疫球蛋白J链与本发明免疫粘附素结合，提高免疫粘附素在粘膜环境内的稳定性(Corthesy，Biochem Soc Trans.25471-475，1997)。与分泌结合的分泌型IgA是正常存在于乳汁和初乳等粘膜分泌液内的抗体同种型。不同于其它的抗体同种型，SIgA能在没有蛋白水解降解的条件下通过肠道。SIgA在室温条件下的粗植物制备物中也非常稳定。分泌成分的功能可能是在粘膜的苛刻条件下保护抗体(Paul，Fundamental Immunology，Raven Press，NY，Third Edition，pp.303-304，1993)。而且，在植物内生产本发明免疫粘附素较动物细胞培养更为经济，由于植物并不携带任何动物病毒，植物产品对于人类使用更为安全。
发明概述本发明涉及免疫粘附素包含含有与免疫球蛋白重链至少一部分连接的鼻病毒受体蛋白的一种嵌合ICAM-1分子，其中J链和分泌成分与该嵌合ICAM-1分子结合。
在优选实施方案中，本发明的免疫粘附素由鼻病毒受体蛋白细胞外结构域1，2，3，4和5任意的组合形成的一种鼻病毒受体蛋白和连接于免疫球蛋白重链的ICAM-1组成。本发明也涉及免疫粘附素，其中免疫球蛋白为IgA，IgA1，IgA2，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgD，IgE或由不同免疫球蛋白同种型的结构域或片段构成的嵌合免疫球蛋白重链。
本发明其它的优选实施方案中，免疫粘附素包含多种与J链和分泌结分组合的嵌合ICAM-1分子。价数提高使之与鼻病毒的有效亲和力升高，因此提高免疫粘附素的效率。
在本发明的一个优选实施方案中，所有用于生产本发明免疫粘附素的蛋白都为人类蛋白。除了在植物和植物细胞中生产，本发明考虑一种表达于哺乳动物细胞、毛根培养物、组织培养的植物细胞和植物、脊椎动物或非脊椎动物来源的异源细胞内的免疫粘附素。
在本发明的优选实施方案中，免疫粘附素在占植物基因组一部分的单子叶植物和双子叶植物内表达。植物表达相对于培养细胞表达可以使生产免疫粘附素的花费明显减少。
本发明考虑的免疫粘附素具有植物特异的糖基化作用。其氨基酸序列内具有糖基化信号天冬氨酸-X-丝氨酸/苏氨酸的多肽的编码基因在植物细胞表达时，通过与该的序列天冬氨酸残基连接的寡糖而糖基化，其中X可以为任意氨基酸残基。见Marshall，Ann.Rev.Biochem.，41673(1992)和Marshall，Biochem.Soc.Symp.，4017(1974)对起糖基化信号功能的多肽序列的概括性综述。这些信号在哺乳动物和植物细胞内都可被识别。在蛋白的成熟末期，植物或植物细胞表达的蛋白较在其它类型细胞，包括哺乳动物细胞和昆虫细胞表达的蛋白具有不同形式的糖基化作用。已有具体的研究鉴定植物特异糖基化作用，并与其它类型细胞的糖基化作用进行对比，例如，Cabanes-Macheteau等，Glycobiology 9(4)365-372(1999)和Altmann，GlycoconjugateJ.14643-646(1997)描述的研究。这些研究组和其它研究组已经证实，植物特异的糖基化作用产生木糖与甘露糖β(1，2)连接的多糖，但哺乳动物和昆虫细胞中的糖基化作用并不导致木糖β(1，2)连接于甘露糖。植物特异的糖基化作用使岩藻糖α(1，3)连接于毗邻的GlcNAc，而哺乳动物细胞中的糖基化作用使岩藻糖α(1，3)连接于毗邻的GlcNAc。而且，植物特异的糖基化作用不能导致唾液酸添加至蛋白多糖的末端，而哺乳动物的糖基化作用可以添加唾液酸。
在其它实施方案中，本发明的免疫粘附素是一种组合物的一部分，该组合物包含植物材料和结合J链和分泌成分的免疫粘附素。所述的植物材料可以是植物细胞壁、植物细胞器、植物细胞质、完整的植物细胞、存活的植物等。可能存在的特殊植物材料或植物大分子包括二磷酸核酮糖羧化酶、光采集复合物、色素、二级代谢物或叶绿素。本发明组合物中的免疫粘附素的质量浓度为0.001％～99.9％(排除水)。在其它实施方案中，免疫粘附素质量浓度为0.01％～99％(排除水)。在其它实施方案中，本发明组合物的植物材料或植物大分子的质量浓度为0.01％～99％(排除水)。
本发明也考虑治疗和预防人类鼻病毒感染受试者的方法，包括减少人类鼻病毒对病毒易感宿主细胞的感染性，或通过使用本发明免疫粘附素接触该病毒的方法减少由人类鼻病毒引发或传播的普通感冒，其中免疫粘附素结合人类鼻病毒并降低其传染性。该免疫粘附素介导感染的途径，包括与细胞表面ICAM-1竞争结合位点，干扰病毒进入或脱外被，和/或通过释放未成熟病毒RNA形成病毒空衣壳而直接使病毒失活(Arrude等，Antimicrob Agents Chemother.361186-1191，1992；Greve等，JVirol.656015-6023，1991；Martin等，Nature.34470-2，1990；Martin等，J Virol.673561-8，1993)。在其它的实施方案中，通过一种方法治疗受试者人类鼻病毒的感染，包括向受试者鼻内给予有效量的本发明的免疫粘附素，其中该免疫粘附素降低人类鼻病毒的传染性。
附图简述
图1说明了pSSPHuA2，在该载体中，编码含有人类ICAM-1前5个结构域的嵌合ICAM-1分子和人类IgA2m(2)Fc区的DNA进行融合。该载体包含驱动信号肽和人类IgA2m(2)重链恒定区表达的SuperMas启动子。通过PCR扩增编码ICAM1-5结构域的序列，使之含有方便的酶切位点(5’SpeI和3’SpeI)，以方便信号肽和Cα1结构域之间的插入。为了提高构建体的表达水平，在重链的3’末端添加编码ER保留信号(RSEKDEL)的DNA。
图2说明了一种嵌合ICAM分子。2A说明了嵌合ICAM-1分子产生的DNA表达盒。2B说明在信号肽剪接后，成熟融合蛋白的氨基酸序列。克隆引入使用的氨基酸以下划线标注，并且标记ICAM-1的5个细胞外结构域和IgA2m(2)重链Cα1-Cα3结构域间的连接。黑体N说明十五个潜在的糖基化位点。
图3说明该免疫粘附素在独立转化的烟草愈伤组织中的表达。3A说明非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶免疫印迹，其上使用包含不同转化烟草愈伤组织(C)和液体提取物(Aq)的样品，并探测人类ICAM的存在。图中给出分子量标记，其参考标准(R)是人类ICAM(～75kD)和人类SIgA(＞＞250kD)(每种约75ng)的混合物。3B说明含有从愈伤组织Rhi107-11中部分纯化的免疫粘附素多种级分的非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶免疫印迹。分析的纯化组分是汁液(J)，G-100级分(G)，无菌过滤的G-100级分(SG)和人类SIgA(75ng)与人类ICAM-1(75ng)(RS)的参考标准混合物。
使用抗人ICAM(～ICAM)、人IgA重链(～α)，人分泌成分(～SC)和人J链(～J)抗体探测印迹。其次，必须使用酶偶联的抗体标记带有碱性磷酸酶的免疫阳性条带。
图4说明酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果，其说明植物提取物和可溶性ICAM-1在与抗ICAM mAb结合时的竞争。此测定中的96孔板用0.25μg的可溶性ICAM-1/ml包被。正方形代表sICAM浓度的升高，圆圈代表愈伤组织提取物数量升高(无菌过滤的G-100级分)，它用于与恒定量的一种鼠(抗人ICAM)抗体竞争粘附的ICAM。
图5说明一种免疫粘附素抑制人类鼻病毒杀伤HeLa细胞能力的分析结果(细胞病变效应或CPE分析)。5A说明在包括ICAM-Fc融合体(IC1-5D/IgA)中的免疫粘附素或抗阿霉素抗体的部分纯化提取物存在下，人类鼻病毒对HeLa细胞CPE的对比分析结果。(右侧向上和向下的三角代表来源于Rhi107-11并包含免疫粘附素的两种提取物。)5B说明在可溶性人类ICAM-1或ICAM-Fc融合体(IC1-5D/IgA)的免疫粘附素提取物存在下，人类鼻病毒对HeLa细胞CPE的对比分析结果。插图说明可溶性ICAM(1.35μg/ml)和IC1-5D/IgA(0.12μg/ml；少11.3倍)的IC50值范围的放大。
图6说明制造1克最终的免疫粘附素所必须的产量评估。该图说明了在20％的产率下和预期的表达水平和植物重量下生产1g免疫粘附素所需的植物数量。对于不同水平的免疫粘附素表达(mg/kg鲜重)和总体收率(设定为20％)，可以在合理可能性窗口内(虚线方框)判断用于具体生产目的(1g/收获物)每种植物的重量和植物的总数。所需的植物量降低，与特殊生长和再生长周期相反。期望得到的生物量，作为时间和生长状况的函数影响收获的时间和收获的间隔时间。可以通过交错种植和收获期调整这些生长周期，使之适应纯化方案的实际需要。
图7说明表2列出的每种免疫球蛋白基因的蛋白的编码序列和氨基酸序列。
图8说明实施例2中描述的用于转化植物的质粒序列，该质粒用于研究本发明免疫粘附素的表达。
图8A说明质粒PSSpICAMHuA2的核苷酸和蛋白序列。
图8B说明豆球蛋白信号肽的核苷酸和蛋白序列。
图8C说明pSHuJ蛋白编码区的核苷酸和氨基酸序列。
图8D说明pSHuSc蛋白编码区的核苷酸和氨基酸序列。
图8E说明质粒pBMSP-1的核苷酸序列。
图8F说明质粒pBMSP-1spJSC的核苷酸序列。
图9包括ICAM-1、人类IgA2的核苷酸和蛋白序列SEQ ID NO1；SEQ IDNO2；SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQID NO7；SEQ ID NO8和其它核苷酸序列。
发明详述A.定义在此使用的以下缩写和术语包括但并不限于以下定义。
本发明的实施将使用，除非另外指明，本领域技术人员已知的免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA常规技术。见例如，Sambork等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(1989)；Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel等des.，(1987))；the series Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.)；M.J.Macpherson等，eds.，Pcr 2A Practical Approach(1995)；Harlow和Lane，eds，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)，和H.Jones，，Methods In Molecular Biology vol.49“PlantGene Transfer And Expression Protocols”(1995)。
免疫球蛋白分子或抗体。包含共价偶联的免疫球蛋白重链免疫和免疫球蛋白轻链活性部分的多肽或多聚体蛋白，并能与抗原特异性结合。所述免疫球蛋白或抗体分子是一种大家族的分子，它们包括多种类型的分子，例如IgD、IgG、IgA、分泌型IgA(SIgA)、IgM和IgE。
构建体或载体。转移到目的植物组织或细胞的一种人工组装的DNA片段。代表性的构建体包含有特殊目的基因、标记基因和适当的控制序列。术语“质粒”指一种自主的，自我复制的染色体外DNA分子。在一个优选实施方案中，本发明的质粒构建体包含抗体重链和轻链的编码序列。质粒构建体包含适当的调节元件，也称为“表达盒”。在一个优选实施方案中，质粒构建体还可以包含一种筛选或可选择标记，例如一种抗生素抗性基因。
可选择标记。编码的产物可以使转基因组织在一种选择性培养基中生长的基因。选择性标记的非限制性实例包括编码抗生素，例如氨苄青霉素、卡那霉素等抗性的基因。其它的可选择标记为本领域技术人员熟知。
转基因植物。基因工程植物或基因工程植物的后代。转基因植物通常至少包含一种非相关生物体来源的物质，例如病毒、其它的植物或动物。
嵌合ICAM-1分子ICAM-1细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合与免疫球蛋白重链蛋白的至少一部分的融合，它是通过把ICAM-1序列连接于免疫球蛋白重链基因序列的上游，并从构建体表达编码蛋白而形成的。
嵌合免疫球蛋白重链免疫球蛋白重链至少包含一部分来源于不同同种型或亚型的免疫球蛋白重链或其它肽、多肽或蛋白的氨基酸序列。一种代表性的嵌合免疫球蛋白重链含有至少来源于两种不同同种型或亚型免疫球蛋白重链的氨基酸残基序列。
双子叶植物(dicots)胚具有为两瓣种子或子叶的开花植物。双子叶植物的实例为烟草、番茄、紫花苜蓿等豆类、橡树、枫树、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、胡桃、仙人掌、紫罗兰和毛茛。
有效量有效量的本发明的免疫粘附素足够可检测地抑制鼻病毒传染性、细胞毒性或复制性；或减少鼻病毒传染的严重性或持续时间。
人类鼻病毒(HRV)一种无被膜的RNA病毒，代表一种细小核糖核酸病毒亚组，是人类感冒的主要病因。鼻病毒也被称为鼻病毒、呼肠孤病毒和细小病毒，见pp.1057-1059，Zinsser Microbiology，Joklik等，eds.Appleton和Lange(1992)。
免疫粘附素包含嵌合ICAM-1分子的复合物，任选包含分泌成分和J链。
免疫球蛋白重链包含免疫球蛋白抗原结合域的至少一部分和免疫球蛋白重链可变区的至少一部分或免疫球蛋白重链恒定区的至少一部分的多肽。因此，免疫球蛋白来源的重链与免疫球蛋白基因超家族成员有明显的氨基酸序列同源区。例如，Fab片段的重链是一种免疫球蛋白来源的重链。
免疫球蛋白轻链包含免疫球蛋白抗原结合域的至少一部分和免疫球蛋白轻链可变区或恒定区的至少一部分的多肽。因此，免疫球蛋白来源的轻链与免疫球蛋白基因超家族成员有明显的氨基酸同源区。
免疫球蛋白分子包含共价偶联的免疫球蛋白重链免疫和免疫球蛋白轻链活性部分，并能与抗原特异性结合的蛋白。
ICAM-1分子细胞间粘附分子-1。ICAM-1作为人类鼻病毒的受体起作用。
J链一种参与免疫球蛋白多聚化和运送多聚化免疫球蛋白通过上皮细胞的多肽。见The Immunoglobulin HelperThe J Chain inImmunoglobulin Genes，第345页，Academic Press(1989)。J链见于IgM五聚体和IgA二聚体，一般通过二硫键连接。J链在鼠和人类中都有研究。
单子叶植物(monocots)胚芽具有一个子叶或种子叶的开花植物。单子叶植物的实例为百合花、大麻、玉米、燕麦等谷物、小麦、大麦、兰花、鸢尾、洋葱和棕榈。
糖基化作用通过寡糖修饰蛋白。见Marshall，Ann.Rev.Biochem.，41673(1972)和Marshall，Biochem.Soc.Symp.，4017(1974)对起糖基化信号功能的多肽序列的总体综述。哺乳动物和植物细胞都可识别这些信号。
植物特异的糖基化作用在植物表达的蛋白内发现的糖基化作用模式不同于哺乳动物或昆虫细胞中蛋白的糖基化作用。植物或植物细胞表达的蛋白较其它类型的细胞，包括哺乳动物细胞和昆虫细胞有不同的糖基化作用模式。鉴定植物特异的糖基化作用并与其它细胞类型的糖基化作用相对比的详细研究见Cabanes-Macheteau等，Glycobiology 9(4)365-372(1999)，Lerouge等，Plant Molecular Biology3831-48(1998)和Altmann，Glycocon jugate J.14643-646(1997)。植物特异的糖基化作用产生的多糖中的木糖β(1，2)连接于甘露糖。哺乳动物和昆虫细胞的糖基化作用都不能使木糖β(1，2)连接于甘露糖的多糖。植物不能使唾液酸连接于多糖的末端，而哺乳动物细胞可以达到。而且，植物特异的糖基化作用使岩藻糖α(1，3)连接于毗邻GlcNAc，而哺乳动物细胞的糖基化作用使岩藻糖α(1，6)连接于毗邻GlcNAc。
分泌成分(SC)分泌性免疫球蛋白的一种成分，它帮助免疫球蛋白对抗灭活试剂，从而提高分泌型免疫球蛋白的生物效应。该分泌成分可以来源于任何哺乳类或啮齿类动物，包括鼠或人类。
sICAM一种天然存在的可溶性ICAM-1剪切形式，缺少疏水性跨膜结构域和ICAM的羰基末端细胞质结构域。
本文件引入的文章、专利和专利申请在此全文引入作为参考。
B.含有嵌合ICAM分子的免疫粘附素本发明提供生产含有嵌合ICAM分子的免疫粘附素分子的新方法。本发明的免疫粘附素含有与J链和分泌成分结合的由连接于免疫球蛋白重链分子一部分的鼻病毒受体蛋白组成的嵌合ICAM-1分子。本发明的嵌合ICAM-1分子含有不同来源的两种分子鼻病毒受体蛋白部分和免疫球蛋白链部分。本发明的鼻病毒受体蛋白来源于细胞间粘附分子-1(ICAM-1)。人类鼻病毒受体ICAM-1核苷酸序列已由Staunton等，Cell 52925-933(1988)；Greve等，Cell 56839-847(1989)；Greve等，J.Virology 656015-6023(1991)；Staunton等，Cell 61243-254(1990)测定并鉴定，描述于SEQ ID No.3和Genbank注册号No.M24283。
ICAM-1分子是一种膜蛋白(SEQ ID NOS1和2)，具有五个细胞外结构域，一个疏水性跨膜结构域和一个短的细质结构域。这些特征已由Casasnovas等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，954134-4139(1998)和Staunton等，Cell 52925-933(1988)描述。本发明特别使用ICAM-1分子结构域，该结构域负责定位于N-末端结构域1和2的人类鼻病毒的结合(Greve等，J.Virol.，656015-6023(1991)，以及Staunton等，Cell 61243-254(1990))。本发明也考虑包含ICAM-1分子细胞外结构域1、2、3、4和5任意组合的鼻病毒受体蛋白部分。在特别优选实施方案中，鼻病毒受体蛋白部分包含ICAM-1分子的结构域1和2，在其它优选实施方案中，也包含ICAM-1分子结构域1、2、3、4和5。
本领域熟知五个细胞外结构域的界限，并见Staunton等，Cell 52925-933(1988)的描述。近似结构域界限见下表1。
表1ICAM-1结构域氨基酸1 1-882 89-1053 106-2844 285-3855 386-453本发明使用的ICAM-1结构域1约在1-88位残基；结构域2约在89-105位残基；结构域3约在106-284位残基；结构域4约在285-385位残基；结构域5约在386-453位残基。本领域技术人员应理解这些结构域的精确界限可以改变。
本发明的嵌合ICAM-1分子优选至少包含IgM或IgA重链的一部分，该部分使免疫球蛋白重链结合于免疫球蛋白J链，并因此结合于分泌成分。来源于本发明免疫球蛋白重链的嵌合ICAM-1部分可以由选自IgA重链或IgM重链或其它重链同种型的各个结构域组成。来源于IgA或IgM之外的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的免疫球蛋白结构域也考虑通过分子工程结合于免疫球蛋白J链，因而可以用于产生本发明的免疫球蛋白。
本领域技术人员应理解免疫球蛋白由约100-110个氨基酸残基的结构域组成。这些不同的结构域已为本领域所熟知并具有已知界限。使用现代分子生物学技术可以成功地去除单个结构域并用其它抗体分子的结构域替换。这些结构域是以链内二硫键稳定的球状结构的。这赋予分散的形状，使结构域之成为自制单位，可以被其它形状相似的结构域替换或与其交换。免疫球蛋白重链恒定区结构域赋予多种特性，称作包含该结构域的特定分子上的抗体效应子功能。效应子功能的实例包括固定补体、胎盘转移、结合葡萄球菌蛋白、结合链球菌蛋白G、结合单核细胞、中性粒细胞或肥大细胞和嗜碱性粒细胞。特定结构域和特定免疫球蛋白同种型与这些效应子功能的相互作用已被熟知，例如描述于免疫学，Roitt等，Mosby St.Louis，Mo.(1993 3rdEd.)。
本领域技术人员能够识别免疫球蛋白重链恒定区序列。例如，通过Genbank方便的得到多种免疫球蛋白DNA和蛋白序列。表2说明免疫球蛋白重链基因和该基因编码蛋白的Genbank注册号。表2中列出的序列在图7中说明。
表2
除了嵌合ICAM-1分子，本发明的免疫粘附素还可以包含免疫球蛋白轻链分子或结合于免疫球蛋白来源的重链的免疫球蛋白J链。在优选实施方案中，本发明的免疫粘附素包含两个或四个嵌合ICAM-1分子和结合于至少一个嵌合ICAM-1分子的免疫球蛋白J链。J链如本领域描述并被熟知。见例如，M.Koshland，The Immunoglobulin HelperThe J Chain，in Immunoglobulin Genes，Academic Press，London，pg.345，(1989)和Matsuuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83456-460(1986)。免疫球蛋白J链序列可以从美国多种数据库方便地得到。
本发明的免疫粘附素可以具有结合于嵌合ICAM-1分子的一种分泌成分。这种结合可以通过氢键、二硫键、共价键、离子交换或这些键的组合产生。一般地，嵌合ICAM-1分子通过分子间二硫键相互连接。嵌合ICAM-1分子间的相互作用可以是非共价的或通过二硫键。本发明考虑使用多种不同物种，包括人、大鼠、兔、牛等的分泌成分。这些分子的核苷酸序列为本领域熟知。例如，美国专利6,046,037包括多种序列，该专利在此引入作为参考。
本发明的免疫粘附素包含分泌成分、嵌合ICAM-1分子和J链，一般通过以下化学键连接氢键、二硫键、共价键、离子相互作用或这些键的组合。
本发明也考虑含有一种以上嵌合ICAM-1分子的免疫粘附素。免疫粘附素可以包含单体单位的，不以二硫键与其它嵌合ICAM-1分子结合的嵌合ICAM-1分子。在优选实施方案中，免疫粘附素也包含与其它嵌合ICAM-1分子结合形成二聚体和其它多价分子的嵌合ICAM-1分子。因为嵌合分子内免疫球蛋白部分的结合，嵌合ICAM-1分子一般是二聚体形式。嵌合ICAM-1分子的免疫球蛋白部分允许两个嵌合ICAM-1分子结合形成具有由鼻病毒受体蛋白组成的两个活性结合部分的二聚体分子。在优选实施方案中，通过正常存在于免疫球蛋白结构域之间作为天然存在的免疫球蛋白分子和天然免疫球蛋白的一部分的二硫键区发生二聚化。本领域技术人员应理解，这些天然免疫球蛋白分子内正常存在的二硫键可以被修饰、移动和去除，但依旧保持形成嵌合ICAM-1分子二聚体的能力。
在其它优选实施方案中，由于J链和嵌合ICAM-1分子免疫球蛋白部分的结合，免疫粘附素包括多聚体形式的嵌合ICAM-1分子。J链和两个嵌合ICAM-1分子的二聚体的结合允许形成四聚体形式的免疫粘附素。在一种优选实施方案中，嵌合ICAM-1分子的免疫球蛋白部分来源于IgA分子，J链的添加允许形成包含四个嵌合ICAM-1分子和四个结合位点的四聚体复合物。在其它优选实施方案中，嵌合ICAM-1分子使用嵌合免疫球蛋白重链，嵌合ICAM-1分子可以通过负责结合J链的来自于IgA或IgM的结构域，形成二聚体或其它更高级的多价复合物。在其它嵌合免疫球蛋白分子内，负责两个免疫球蛋白重链的二硫键结合和/或一个免疫球蛋白轻链和一个重链间的二硫键结合的免疫球蛋白部分可以置于嵌合免疫球蛋白分子内，以便形成二聚体或其它高级的多价复合物。
本发明考虑的免疫粘附素包含嵌合ICAM-1分子，其中包含重链的免疫球蛋白结构域来源于重链或轻链免疫球蛋白的不同同种型。本领域技术人员应理解，使用分子技术可以用相似的结构域替代这些结构域，因此产生两种不同免疫球蛋白分子间杂交的免疫球蛋白分子。这些嵌合免疫球蛋白允许对含有分泌成分的免疫粘附素进行构建，使其含有通过不同免疫球蛋白结构域赋予的多种不同的和需要的特性。
本发明也考虑了嵌合ICAM-1分子，其中来源于免疫球蛋白、重或轻J链的嵌合分子可以含有少于源于不同免疫球蛋白分子的一个完整结构域。同样的分子技术亦可用于产生这些嵌合ICAM-1分子。
在优选实施方案中，本发明的嵌合ICAM-1分子至少包含鼠或人IgA1、IgA2和IgM的CH1、CH2和CH3结构域。本发明的其它优选实施方案中的免疫球蛋白结构域至少包括IgM的Cμl、Cμ2、Cμ3或Cμ4结构域。
优选的嵌合ICAM-1分子包含源于人免疫球蛋白的两种不同同种型的结构域。优选的嵌合ICAM-1分子包含的免疫球蛋白至少包含人IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE或IgD的CHl、CH2或CH3结构域。其它作为嵌合ICAM-1分子的一部分使用的优选免疫球蛋白包括至少含有源于IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4的结构域的免疫球蛋白。本发明还考虑了含有至少来源于两种不同哺乳动物免疫球蛋白同种型的免疫球蛋白结构域的嵌合ICAM-1分子。概括的说，任意哺乳动物免疫球蛋白都可用于优选实施方案，例如以下同种型任意IgG同种型、任意IgA、IgE、IgD或IgM同种型。本发明也考虑了人类、鼠或其它哺乳动物物种来源的嵌合ICAM-1分子。在优选实施方案中，嵌合ICAM-1分子包含负责J链与IgA或IgM结合的IgA或IgM的部分。因此，通过在嵌合ICAM-1分子内使用一种嵌合免疫球蛋白，J链可以与主要为不能结合J链或分泌成分的同种型的嵌合免疫球蛋白分子结合。
本发明也考虑了嵌合ICAM-1分子，其包含的免疫球蛋白结构域来源于两种不同同种型的啮齿动物或灵长类动物的免疫球蛋白。本领域技术人员熟知啮齿动物或灵长类动物免疫球蛋白的同种型。本发明的嵌合ICAM-1分子可以包含免疫球蛋白来源的重链，其包括至少一种以下的免疫球蛋白结构域小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgE或IgD的CH1、CH2或CH3结构域；小鼠IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4结构域；人IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的CH1结构域；人IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4结构域；哺乳动物IgG同种型、IgA、IgE或IgD同种型的CH1、CH2、CH3或CH4结构域；哺乳动物IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4结构域；啮齿动物IgG、IgA、IgE或IgD同种型的CH1、CH2或CH3结构域；啮齿动物IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4结构域；动物IgG同种型、IgA、IgE或IgD同种型的CH1、CH2或CH3结构域；和动物IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4结构域。本发明也考虑在嵌合ICAM-1分子内替代或添加来源于免疫球蛋白超家族成员分子的蛋白结构域。免疫球蛋白超家族分子的氨基酸序列和核苷酸序列与免疫球蛋白同源。免疫球蛋白超家族的部分分子可以通过氨基酸或核苷酸序列同源性识别。见例如，Immunoglobulin Genes，第361页，Academic Press(1989)。
在本发明的优选实施方案中，免疫粘附素的表达是通过产生具有植物特异的糖基化作用的免疫粘附素的方法得到。本领域熟知，糖基化作用是植物细胞内蛋白的一种主要修饰(Lerouge等，Plant MolecularBiology 3831-48，1998)。其它类型的细胞中也发生蛋白的糖基化作用，包括哺乳动物和昆虫细胞。糖基化过程始于内质网，通过共翻译转移寡糖前体至新生多肽链的特定残基。这些寡糖被加工为不同类型的多糖，其不同点在于存在残基的类型和残基间连接的特性，该加工存在于糖蛋白从内质网移动至其最终目的地的分泌通路上。本领域技术人员应理解，在成熟后期，植物或植物细胞表达的蛋白较其它类型细胞，包括哺乳动物细胞和昆虫细胞表达的蛋白有不同的糖基化作用模式。已有具体的研究鉴定植物特异的糖基化，并与其它类型细胞的糖基化进行对比，例如，Cabanes-Macheteau等，Glycobiology 9(4)365-372(1999)和Altmann，Glycoconjugate J.14643-646(1997)描述的研究。这些研究组和其它研究组已经证实植物特异的糖基化作用产生的多糖中的木糖β(1，2)连接于甘露糖。哺乳动物和昆虫细胞的糖基化作用都不能使木糖β(1，2)连接于甘露糖的多糖。植物特异的糖基化作用使岩藻糖α(1，3)连接于毗邻GlcNAc，而哺乳动物细胞的糖基化作用使岩藻糖α(1，6)连接于毗邻GlcNAc。而且，植物特异的糖基化作用不能使唾液酸添加至蛋白多糖的末端，而哺乳动物中的糖基化作用可以添加唾液酸。
以植物特异的方式糖基化的本发明的免疫粘附素可以包含一种嵌合ICAM-1分子，其包含ICAM-1分子细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合。图2B说明本发明的嵌合ICAM-1/IgA2分子(SEQ ID N08)的氨基酸序列，其包含ICAM-1的所有五种结构域。黑体N代表天冬酰胺残基，其在植物细胞、哺乳动物和昆虫细胞的糖基化作用中与寡糖部分连接。本领域技术人员应理解，糖基化位点是三肽Asn-X-Ser/Thr，其中X可以是除了脯氨酸和天冬氨酸以外的任意氨基酸残基(Kornfeld和Kornfeld，Annu Rev Biochem 54631-664，1985)。因此，本领域技术人员应理解，蛋白的哪一个氨基酸具有植物特异的糖基化作用将取决于存在ICAM-1的哪一个结构域。因为ICAM-1的序列和结构域界限已知(见Staunton等，Cell 52925-933，1988)，本领域技术人员可以明确如何测定任何5种ICAM-1结构域潜在组合上的植物特异的糖基化位点。
在本发明的其它优选实施方案中，免疫粘附素含有植物特异的糖基化作用，并包含具有ICAM-1细胞外结构域1、2、3、4和5的任何组合的嵌合ICAM-1分子，它进一步包含与所述嵌合ICAM-1分子结合的J链和分泌成分。同嵌合ICAM-1分子一样，本领域技术人员可以识别J链和分泌成分序列内的植物特异的糖基化作用位点。
本发明考虑了具有植物特异的糖基化作用的免疫粘附素，其中包含嵌合ICAM-1分子，其中免疫球蛋白重链选自IgA(SEQ ID NOS15-18)，IgA1(SEQ ID NOS15-16)，IgA2(SEQ ID NOS17)，IgG1(SEQ IDNOS19-20)，IgG2(SEQ ID NOS21-22)，IgG3(SEQ ID NOS23-24)，IgG4(SEQ ID NOS25-26)，IgM(SEQ ID NOS46-47)，IgD(SEQ IDNOS27-32和36-41-43)，IgE(SEQ ID NOS44-45)和嵌合免疫球蛋白重链。本领域技术人员应理解，哪些免疫球蛋白重链序列或哪些免疫球蛋白重链序列组合被组合于嵌合免疫球蛋白重链，才能对免疫粘附素嵌合ICAM-1分子的糖基化数量和位点有影响。正如嵌合ICAM-1分子，本领域技术人员可以识别免疫球蛋白重链序列，包括可被构建的多种嵌合免疫球蛋白重链序列中的植物特异的糖基化作用位点。
同时在此提供免疫粘附素的功能衍生物。“功能衍生物”意味着本发明多肽或核酸的一种“化学衍生物”、“片段”或“突变体”，其保持至少一部分的蛋白功能，例如与蛋白特异抗体的反应性、酶活性或结合活性，这些功能保证该衍生物在本发明中的用途。本领域熟知，由于遗传密码子的简并性，多种不同的核苷酸序列可以编码同样的氨基酸序列。本领域也熟知，氨基酸的保守性取代可以使蛋白或多肽保持原始的功能。在两种情况下，本公开内容的意图包括所有的改变。
该衍生物也可通过常规方法工程化，使其包含一种亲和纯化标签，从而可以生产大量和/或相对纯化或分离量的免疫粘附素。存在多种不同形式的标签，它们可被掺入免疫粘附素的一种或多种成分，优选地不破坏无标签的免疫粘附素的所需结合活性。这些标签可被工程化为与编码本发明免疫粘附素的核苷酸序列融合的可表达核酸序列。可以进一步使该标签工程化，使其可以通过例如商品化的酶被去除。
可以进一步去除密码子或用非简并性密码子取代一个或多个密码子，产生一种结构上修饰的多肽，其基本上与未修饰的核苷酸分子产生的多肽有相似的有效性。如本领域所认知的，两种多肽可以是功能上等价的，正如产生它们的两种核酸分子，尽管两种核酸分子间的差异不与遗传密码子相关。
该方法的操作以及生产后的化学衍生可以用于，例如增加稳定性、可溶性、吸收性、生物学或治疗效应、和/或生物半衰期。能介导这些效应的部分已被公开，例如，Remington’s Pharmaceutical Science，18thed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)。本发明范围内的一种功能衍生物是一种“突变体”多肽，它相对于天然多肽缺少一个或多个氨基酸或包含添加的或取代的氨基酸。通过适当修饰蛋白的DNA编码序列，突变体即可来源于一种天然得到的复合物组分，包括在天然序列的C-末端、N-末端和/或内部的一个或多个位点上添加、去除、和/或修饰一种或多种氨基酸的密码子。众所周知，上述的突变体含有添加、取代和/或其它的氨基酸，它保持天然蛋白的一种或多种特征性部分。
使用本领域普通技术人员熟知的标准技术可以制备去除、插入和/或取代了氨基酸残基的蛋白的功能性衍生物。例如，使用定点突变技术得到功能衍生物的修饰成分(实例见Adelman等，1983，DNA 2183)，其中使用例如以上描述的技术修饰DNA编码序列中的核苷酸得到修饰的编码序列，接着在原核或真核宿主细胞内表达该重组DNA。还可以使用本领域熟知的方法，通过直接化学合成，方便地制备氨基酸去除、插入和/或取代的蛋白。蛋白的功能衍生物一般具有与天然蛋白同样的定量生物活性。
而且，本发明的免疫粘附素并不仅为修饰的ICAM-1/Ig免疫粘附素，还包括其它的天然ICAM家族成员、同种型、和/或其它同源氨基酸序列，例如人类、灵长类动物、啮齿类动物、犬科动物、猫科的动物、牛、鸟类等。免疫粘附素使用的Ig类型也可进一步改变，例如可以假定在给定物种的范围内或外的不同的Ig家族成员特性。ICAM和Ig是多种多样的，具有已知的序列，本领域技术人员可以使用它们创造不同的具有或多或少不同功效的免疫粘附素，并在给定生物体内实施治疗。下表说明，但非完全性地列举了具有ICAM-1同源性，可用于产生其它免疫粘附素分子的实例。
表3
同样地，已知人类和其它物种的不同Ig分子的许多重链恒定区可以用在此描述的嵌合体的特定Ig区取代。
C.含有免疫粘附素的载体、细胞和植物本发明也考虑了含有本发明的免疫粘附素的表达和克隆载体、细胞和植物。分离免疫粘附素各种部分的编码基因的技术为本领域技术人员熟知，运用这些技术可以把多种所需片段插入表达载体和克隆载体，例如那些能够导入细胞和转基因植物的载体。
本发明考虑了组装免疫粘附素的方法，该方法包括以下步骤把编码嵌合分子和免疫球蛋白J链的DNA片段导入一种生物体，再把编码分泌成分的DNA导入同一生物体。优选的分泌成分至少包含人类多免疫球蛋白受体(pIgR)氨基酸残基序列或其它物种的类似氨基酸残基的1至约606位的一个氨基酸残基片段(Mostov，Ann Dev.Immu.1263-841994)。
本发明所考虑的真核细胞包括植物细胞，其中含有本发明的免疫粘附素。本发明也考虑植物细胞，其包含本发明的免疫粘附素各种成分的编码核苷酸序列。本领域技术人员应理解，编码分泌成分保护蛋白、嵌合ICAM-1分子和J链的核苷酸序列一般将与启动子可操作性连接，并以表达载体或表达盒的一部分存在。典型地，如果使用的真核细胞是一种植物细胞，那么应使用能在植物细胞内操作的启动子。在嵌合ICAM-1基因之后，分泌成分基因和J链基因得到分离，它们一般被操作性连接于一种表达载体内的转录启动子。本发明也考虑表达载体，其包含操作性连接于表达的调节序列的编码嵌合ICAM-1分子的核苷酸序列。这些表达载体将待表达的核苷酸序列置于一种特定的细胞启动子序列3’端，使该核苷酸序列转录和表达。该表达载体也包含改进转录效率的各种增强子序列。而且，也可以包括终止子、聚腺苷酸化(poly A)位点和其它的3’末端加工信号，以增加在特定细胞内转录的核苷酸序列的量。
选定生物体内各成分的表达可以来源于一种独立复制的质粒、或来源于染色质的永久成分、或来源于瞬时产生编码这些成分的转录物的任意DNA片段。适于转化的生物体可以是原核或真核生物。复合物各成分的导入可以通过直接DNA转化、biolistic递送入生物体或通过另一种生物体介导，例如通过重组土壤杆菌在植物细胞上的作用二介导。在转基因生物体内表达蛋白通常需要共导入一种合适的启动子元件和聚腺苷酸化信号。在本发明的一项实施方案中，启动子元件潜在性导致组分在植物所有细胞内的组成型表达。在大多数或所有细胞内的组成型表达可以确保前体占据同一个细胞内膜系统，这可能是组装所必需的。
表达载体可被宿主细胞相容，优选使用植物细胞相容的载体表达本发明的基因。用于在植物内表达基因的代表性表达载体为本领域所熟知，包括Rogers等在Meth.in Enzymol.，153253-277(1987)中描述的来源于肿瘤诱导的(Ti)根癌土壤杆菌质粒的载体。然而，众所周知，一些其它的表达载体系统在植物内也有一定功能。见例如，Verma等，PCT出版号WO87/00551及Cooking和Davey，Science，2361259-1262(1987)。
以上描述的表达载体包含表达控制元件，包括启动子。待表达的基因被操作性连接于表达载体，允许启动子序列指导RNA聚合酶结合并合成所需的多肽编码基因。用于基因表达的启动子为可诱导的、病毒的、合成的、组成型和可调控型。本领域技术人员熟知，所使用表达载体的选择和最终把编码本发明部分免疫粘附素的核苷酸序列操作性连接于哪些启动子，直接依赖于所需的功能特性，例如表达蛋白的位置和时间及待转化的宿主细胞，这些是本领域构建重组DNA分子所固有的限制性。然而，在本发明的实施中使用的表达载体至少能够指导复制，并优选能够指导使操作性连接于其上的包括于DNA片段中的多肽编码基因的表达。
在优选实施方案中，用于表达基因的表达载体包括一种植物细胞内有效的选择标记，优选为药物抗性选择标记。优选的药物抗性标记是表达产生卡那霉素抗性的基因，即一种包含胭脂碱合成酶启动子、Tn5新霉素磷酸转移酶II和胭脂碱合成酶合成酶3’非翻译区的嵌合基因，见Rogers等在Methods For Plant Molecular Biology，a Weissbach andH.Weissbach，eds.，Academic Press Inc.，San Diego，Calif.(1988)的描述。一种有用的植物表达载体可以从Pharmacia，Piscataway，N.J.购得。在植物中表达外源蛋白的表达载体和启动子描述于美国专利5,188,642；5,349,124；5,352,605和5,034,322，在此引入作为参考。
通过互补粘性末端将DNA操作性连接至载体的多种方法已得到开发。例如，可以将互补的均聚合物轨迹添加至DNA片段，以便插入载体DNA。载体和DNA片段即可通过互补均聚合物尾部之间的氢键连接，形成重组DNA分子。作为选择，包含一个或多个限制性位点的合成接头可用于连接DNA片段至表达载体。
通过钝端DNA片段与过量合成接头分子在酶存在下共孵育，该合成接头即可连接于钝端DNA片段，其中酶能够催化钝端DNA分子的连接，例如噬菌体T4 DNA连接酶。因此，该反应的产物为末端带有合成接头序列的DNA片段。这些DNA片段再用适当的限制性内切酶剪切并连接入表达载体，载体事先用可以产生与合成接头末端相容的末端的酶消化。包括多种限制性内切酶位点的合成接头可以通过许多商业化来源方便的得到，包括New England BioLabs，Beverly，Mass。
编码本发明的分泌成分、J链和嵌合ICAM-1分子的核苷酸序列被直接导入同一植物细胞或把这些成分的每一种分别导入植物细胞并再生植物，杂交各种成分，得到包含所有所需成分的最终植物细胞。
可以使用任何方法把编码本发明免疫粘附素各成分的核苷酸序列导入真核细胞。例如，把基因导入植物的方法包括土壤杆菌介导的植物转化、原生质体转化、基因转移至花粉、注入生殖器官和未成熟胚胎。每种方法都有自身的利和弊。因此，把基因导入一种具体真核细胞或植物物种的具体方法不一定是对另一种真核细胞或植物物种最有效的方法。
根癌土壤杆菌介导的转化是把基因导入植物细胞常用的系统，因为DNA能被导入整个植物组织，而避免从原生质体再生完整植物的需要。使用土壤杆菌介导的表达载体把DNA导入植物细胞为本领域所熟知。见例如，Fraley等，Biotechnology，3629(1985)和Rogers等，Methodsin Enzymology，153253-277(1987)描述的方法。进一步，Ti-DNA的整合是相对精确的过程，几乎不导致基因的重排。待转化的DNA区域通过边界序列决定，间插DNA通常被插入植物基因组，如Spielmann等，Mol.Gen.Genet.，20534(1986)和Jorgensen等，Mol.Gen.Genet.，207471(1987)的描述。现代土壤杆菌转化载体也能够在大肠杆菌内复制，使操作更加方便，如Klee等在Plant DNA Infectious Agents，T.Hohn and J.Schell，eds.，Springer-Verlag，New York，pp.179-203(1985)中的描述。现代科技进一步优化了土壤杆菌介导的基因转移的载体，改变了载体的基因排列和限制性内酶切位点以方便构建能表达不同多肽编码的基因。Rogers等在Methods in Enzymology，153253-277(1987)中描述的载体具有方便的多接头区，其侧翼为指导插入的多肽编码基因表达的启动子和聚腺苷酸化位点，适用于本发明的目的。
对于土壤杆菌介导转化有效的植物物种，应选用这种基因转移方便和特性明确的方法。土壤杆菌介导的叶盘和其它组织的转化不限于根癌土壤杆菌天然感染的植物物种。因此，土壤杆菌介导转化对双子叶植物最有效。
虽然使用土壤杆菌载体可以在芦笋产生转基因植物，几乎没有单子叶植物是土壤杆菌的天然宿主，如Bytebier等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8453-45(1987)。因此，商业上重要的谷物，例如水稻、玉米和小麦必须使用其它的转化方法。植物原生质体转化可以用以下方法达到，包括磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合。见例如，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199183(1985)；Lorz等，Mol.Gen.Genet.，199178(1985)；Fromm等，Nature，319791(1986)；Uchimiya等，Mol.Gen.Genet.，204204(1986)；Callis等，Genes and Development，11183(1987)和Marcotte等，Nature，335454(1988)。
这些方法在不同植物物种中的应用依赖于具体植物物种从原生质体再生的能力。从原生质体再生谷类的说明方法见Fujimura等，PlantTissue Culture Letters，274(1985)；Toriyama等，TheorAppl.Genet.，7316(1986)；Yamada等，Plant Cell Rep.，485(1986)；Abdullah等，Biotechnology，41087(1986)。
对于不能从原生质体成功再生的植物物种，可以使用其它方法把DNA导入完整的细胞或组织。例如，从未成熟胚胎或外植体再生谷类见Vasil，Biotechnology，6397(1988)的描述。而且，“粒子枪”或高速微粒技术也可使用。使用这些技术，DNA在微小(0.525μm)金属粒子表面以1至几百米每秒的速度穿透细胞壁进入细胞质，如Klein等，Nature，32770(1987)；Klein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，858502(1988)和McCabe等，Biotechnology，6923(1988)的描述。该金属粒子穿透数层细胞，从而允许组织外植体内细胞的转化。金属粒子已经成功地应用于转化玉米细胞，得到可育性稳定转化的烟草和大豆植株。组织外植体的转化不需要通过原生质体阶段，因此加速了转基因植物的产生。
也可以通过直接把DNA转化入花粉而导入植物，如Zhou等，Methodsin Enzymology，101433(1983)；D.Hess，Intern Rev.Cytol.，107367(1987)；Luo等，Plant Mol.Biol.Report，6165(1988)描述。多肽编码基因的表达可以通过把DNA注入植物生殖器官得到，如Pena等，Nature，325274(1987)描述。DNA可以被直接注入未成熟胚胎细胞并使脱水的胚胎再水合，如Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.，7530(1987)和Benbrook等，在Proceeding Bio Expo 1986，Butterworth，Stoneham，Mass.，pp27-54(1986)描述。
从单植株原生质体或多种外植体再生植株为本领域所熟知。见例如，Methods for Plant Molecular Biology，A.Weissbach and H.Weissbach，eds.，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(1988)。这种再生和生长过程包括选择转化细胞和茎、转化茎生根和幼苗在土壤内生长。
通过根癌土壤杆菌从叶外植体导入外源基因的植物再生可以如Horsch等，Science，2271229-1231(1985)描述。在这个过程中，转化体在存在一种选择性试剂的培养基和诱导被转化植物物种茎发芽的培养基中生长，如Fraley等，Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A.，804803(1983)描述。该过程一般在2-4周的时间内长出茎，这些转化茎再被转移至含有选择性试剂和抗生素的适当生根诱导培养基，其中的抗生素用来预防细菌生长。在选择性试剂存在下生根形成幼苗的转化茎被转移至土壤中允许根的生长。这些过程应根据所使用的具体植物物种而变化，该变化为本领域所熟知。
本发明的免疫粘附素可以由任意植物细胞生产，包括来源于双子叶植物或单子叶植物、茄科植物、苜蓿、豆类或烟草的植物细胞。
本发明转基因植物可以从所有可进行有性杂交的植物物种产生，该植物可以使用本领域技术人员已知的方法转化。可使用的植物物种是双子叶植物，包括烟草、番茄、豆类、苜蓿、橡树和枫树；单子叶植物，包括草类、玉米、谷类、燕麦、小麦和大麦；和低等植物，包括裸子植物、松树、问荆、石松、苔类、金鱼藻、苔藓、海藻、配子体、孢子体和蕨类植物。
本发明也考虑在哺乳动物细胞等真核细胞内表达免疫粘附素。本领域技术人员应理解，存在多种系统用于在哺乳动物细胞内表达免疫粘附素，并可以在这些细胞内简便地修饰这些系统以表达本发明的免疫粘附素和嵌合ICAM-1分子。在优选实施方案中，本发明的嵌合ICAM-1、J链和分泌成分分子被置于载体pCDM8内，该载体已由Aruffo等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，848573-8577(1987)描述。使用的pCDM8并不是唯一的，还有多种其它的系统不利用cog细胞表达系统。例如，以下美国专利描述了可用于嵌合ICAM-1分子和其它免疫粘附素分子的真核表达系统。
D.包含免疫粘附素的组合物本发明也考虑了包含本发明免疫粘附素和植物大分子或材料的一种免疫粘附素。代表性的植物大分子或植物材料来源于可用于本发明的所有植物。植物大分子与本发明免疫粘附素共同存在于，例如，植物细胞内、植物细胞提取物中或植物内。组合物中与本发明免疫粘附素结合的典型植物大分子是二磷酸核酮糖羧化酶、光采集复合物色素(LHCP)、二级代谢物或叶绿素。本发明组合物中的植物材料或植物大分子的浓度为干重的0.01％～99％(排除水)。其它组合物中的本发明免疫粘附素的质量浓度为1％～99％(排除水)。其它组合物中的本发明免疫粘附素的质量浓度为50％～90％(排除水)。
本发明的组合物可以含有质量浓度为0.1％～5％的植物大分子(排除水)。组合物内存在的质量一般由植物大分子和本发明免疫粘附素组成。当本发明的免疫粘附素以较高或较低浓度存在时，组合物中植物大分子的浓度将向相反方向变动。在其它实施方案中，组合物内的植物大分子以质量浓度0.12％～1％(排除水)存在。
本发明考虑一种组合物，包含嵌合ICAM-1分子、J链或分泌成分。如前面的描述，这些成分构成一种复合物并结合。该组合物一般包括植物来源的分子。该组合物也可在产生功能性免疫粘附素和植物来源分子的提取过程后得到。
该提取方法包括对含有该复合物的植物施加一种力，从而使该植物的质外体小室破裂，释放所述复合物。该力包括如释放质外体液体的主要方法中使用的剪切力。
完整植物或植物提取物包含免疫粘附素和多种其它植物大分子的混合物。二磷酸核酮糖羧化酶(RuBisCo)或RuBisCo片段为混合物中含有的大分子。另一种大分子是LHCP。另一种分子是叶绿素。
其它制备含有嵌合ICAM-1分子免疫粘附素组合物的有效方法包括使用多种溶剂提取并对植物材料采用真空处理。本发明组合物可以包括质量浓度为0.1％～5％(排除水)的植物大分子。
本发明也考虑了可用于治疗病人或动物的治疗组合物。可以在从植物或其它转基因生物体提取前或后给予该治疗组合物。免疫粘附素一旦被提取，即应通过大小排阻、离子交换或亲和层析等常规技术进一步纯化。植物分子可以与该复合物共同给药。
本发明也考虑了植物来源分子和动物来源分子间的相对比例可以变动。具体植物蛋白，例如RuBisCo或叶绿素的量可以是提取物质量的低至0.01％或高至99.9％(排除水)。
本发明也考虑了不进一步纯化具体治疗成分，直接使用含免疫粘附素的治疗性植物提取物。可以通过局部施用、口服、鼻喷雾或任何其它适于递送抗体至粘膜靶病原体的方法给药。
E.药物组合物、制剂和给药途径。
在此描述的免疫粘附素可以给药于病人，优选以适当药物组合物的形式给药。这种组合物可包含，但不限于以上描述的成分。该组合物在给药时，优选地表现治疗和/或预防特性中的一种或两种。可以根据本领域常规方法制备该组合物，并制成多种不同的形式，例如溶液、悬浮液或乳状液，和在服用前适于溶解于液体的固体形式。多肽和蛋白的制剂和给药技术可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPubishing Co.，Easton，PA，最新版。使用这些程序，普通技术人员即可利用本发明免疫粘附素达到成功，而无需过多的实验。
1.给药途径本发明的适当给药途径包括，例如口、鼻、吸入、眼内、咽喉、支气管、经粘膜或肠内给药。还可以选择在局部给药，例如通过注射或其它方法在优选的作用位点给药。
2.制剂本发明药物组合物也可以其自身熟知的方式加工，例如常规混合、溶解、粒化、糖衣化、研末、乳化、装入胶囊、封闭或冻干。一种或多种生理可接受的载体包括赋形剂和/或其它辅助剂，其促进活性复合物添加入药物制剂。适当的制剂依赖于所选择的具体给药途径。
对于注射给药，本发明的试剂应在水溶液，优选生理可接受的缓冲液，例如汉克氏液、林格氏液或生理盐水中配制。对于经粘膜给药，制剂中应使用适于穿透障碍的渗透剂。这些渗透剂通常为本领域所熟知。
对于口服给药，通过结合活性复合物和本领域熟知的药物可接受载体，可以容易对复合物进行制剂化。这些载体使本发明的复合物被制成片剂、药丸、锭剂、胶囊、液体、凝胶体、糖浆、膏剂、悬浮液等，以适用于口服治疗的病人。适当的载体包括赋形剂，例如填料，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇和/或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、番茄淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，也可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或其盐，如褐藻酸钠。
锭剂的核心被适当包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可任选的包括阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波泊尔胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆溶液、和适当的有机溶剂或溶剂混合物。可添加染料或色素于片剂或锭剂包衣，用于识别或鉴定活性复合物剂量的不同组合。
可以口服的药物制剂包括明胶制成的适推型胶囊，及明胶和增塑剂，例如甘油或山梨醇制成的软而密封的胶囊。适推型胶囊包括活性成分和与之混合的填料，例如乳糖、淀粉等粘合剂，和/或滑石粉或硬脂酸镁等滑润剂、和任选的稳定剂。在软胶囊内，活性复合物可在适当液体内溶解或悬浮，例如脂肪、液体石蜡或液体聚乙二醇。而且可以添加稳定剂。所有口服给药的制剂应以适于这种给药方式的剂量给药。
对于经颊给药，组合物应采用片剂或锭剂的常规形式给药。
对于吸入给药，用于的本发明复合物可以方便地以气溶胶喷雾的形式递送，该气溶胶喷雾是从加压包喷雾器推进的，同时使用了适当的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体。在加压气溶胶的情况下，可以通过活瓣计量确定剂量单位。可以将用于吸入器或吹入器的胶囊和明胶等弹射剂配制为包含复合物和适当粉剂基质，例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
作为选择，活性成分也可在使用前以粉剂形式用一种适当的载体例如无致热原无菌水重建。
而且，该复合物也可被制成贮存制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或肌肉内注射给药。因此，例如，该复合物可以用适当的聚合物或疏水材料(例如以可接受的油存在的乳状液)或离子交换树脂，或配制为微溶衍生物，例如微溶的盐。
而且，该复合物可以通过缓释系统递送，例如包含治疗试剂的固体疏水聚合物的半通透基质。多种缓释材料都已被确定，并为本领域技术人员所熟知。根据化学特性，缓释胶囊可以在几周至高达100天内释放该复合物。根据治疗试剂的化学特性和生物稳定性，可以使用其它蛋白稳定方案。
药物组合物也可以包含适当的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括但并不仅限于，碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚乙二醇等聚合物。
药物兼容的盐可以与多种酸，包括但并不仅限于，盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等形成。盐更易于溶解在相对无碱形式的水或其它质子溶剂中。调节溶液的pH值也常规用于最优化所需的特性。
3.确定有效剂量和剂量方案适于本发明使用的药物组合物包括含有的活性成分的量可达到所需目的，如治疗和/或预防的组合物。药物有效量是指可以有效预防、减轻或改善疾病症状或延长被治疗者存活期的复合物量。本领域技术人员能够确定一种药物有效量，一般将该量确定为0.5μg/kg/日～500g/kg/日，各个剂量一般包括约1ng至几ng的免疫粘附素。
对于本发明方法使用的任何复合物，最初可以通过细胞培养分析来估计治疗有效量。例如，对不同动物或细胞培养物可以给予多种剂量，并对比其效应。通过这种方法可以鉴定所需的浓度范围，并由此制备和给药。最优化的方法是本领域普通技术人员熟知的。
技术人员不仅应考虑药物有效性，也要考虑标准制药过程在细胞培养或实验动物内的毒性，例如测定LD50(人群50％致死剂量)和ED50(人群50％治疗有效剂量)。毒性和疗效的剂量比是治疗指数，它可通过LD50和ED50的比值表示。优选治疗指数值较高的复合物。从这些细胞培养分析和动物研究获得的数据可以用作人类制剂的剂量范围。优选的该复合物剂量浓度范围包括几乎没有或无毒的ED50。根据使用的剂剂型和给药途径，使用的剂量可在该浓度范围内变动。医生可以根据病人的情况选择使用精确的制剂、给药途径和剂量。(见例如，Fingl等，1975，in“The Pharmacological Basis of Therapeutics，”ch.1 p.1)。
可以调整给药的剂量和频率，使免疫粘附素在粘膜水平充分保持或达到药效，如治疗和/或预防效果。最小有效浓度(MEC)应根据每种免疫粘附素和免疫粘附素制剂变化，但可通过体外和/或体内数据估计。达到MEC的必需剂量应根据个体特性和给药途径决定。然而，此处的分析可用于确定粘膜浓度，其可在剂量和精确配制上被进一步优化。
可以使用MEC值决定剂量间隔。复合物可以通过一种方式给药，其保持粘膜水平高于MEC的时间为10-90％，30-90％，最优选50-90％。
如果需要，该组合物也可在包或撒布器内存在，其中可以含有包含活性成分的一种或多种单位剂形。该包可以包含例如金属或塑料箔，例如起泡包(blister pack)。该包或撒布器也可以带有给药的说明。该包或撒布器也可以带有与注释，说明容器使用调控药品制造、使用或销售的政府机构所规定的形式，该注释反应了该机构批准了该形式的免疫粘附素用于人类或兽医给药。这种注释可以作为，例如美国食品和药品监督局批准的处方药标签或批准的产品插页。可制备包含配制于相容的药物载体中的本发明复合物的组合物，将其置于一个适当的容器中，并标记用于治疗适应症，例如治疗或预防由宿主生物体/患者ICAM分子介导的疾病。
F.治疗和预防ICAM-1介导疾病的方法对于需要治疗和/或预防性使用本发明免疫粘附素嵌合体，例如对于抗鼻病毒感染和/或伴随感冒的症状的患者，应给于其药物有效量的所需免疫粘附素，优选作为根据以上描述确定、生产和给药的药物组合物的一部分。这些制剂和递送形式可以广泛的变化。以下描述即是用于推断有效量和毒性的预备程序，也可方便的用于确定人类和其它动物的治疗和预防参数和方案。这些程序仅为说明，并不意味限制本发明。而且，这些是本领域普通技术人员常规使用的程序。
1.免疫粘附素降低鼻病毒在人类中的感染性的能力剂量递增耐受研究可以使用例如随机对照试验检测本发明的免疫粘附素，例如该免疫粘附素在鼻内给药对感染的效果。可以使用其它给药途径。存在多种可用于监控效果的测定，例如分析评估疾病症状，如鼻病毒感染引起的感冒症状的IL-8反应分析。这些研究能够评估在受试患者使用后，免疫粘附素对于鼻病毒感染的治疗和预防的程度。例如，对健康和不健康受试者给予该免疫粘附素，并在一段时间中评估，例如随鼻病毒接种和/或疾病的进展而评估。使用的临床方案应基于先前用于评估重组可溶性ICAM-1分子抵抗鼻病毒感染的有效性的方法，或其改进方案(Turner等，JAMA 2811797-804，1999)。
所有物种、年龄、健康或疾病状态的雄性或雌性受试者都可用于评估。受试者在研究前可能表现出血清中和抗体滴度，所述滴度可能反应于感染和免疫粘附素给药而波动。
本发明的免疫粘附素可被制成内含各种量的免疫粘附素的一种缓冲盐，并以不同的时间间隔向患者给药。单升高剂量和多升高剂量研究可用于评估免疫粘附素的安全性。在每种情况下，每种剂量水平上都有一个或多个受试者参与评估，其中一些接受免疫粘附素治疗，任选一个或多个接受安慰剂治疗。在任一研究中，都可评估多个剂量水平。剂量水平可以变动，一般在ng至g范围内。
在毒性和/或药效评估时，可以间隔秒、分钟、小时、周和月给药。
可以评定药物安全性和毒性，例如通过视觉检查鼻粘膜的刺激或炎症症状。也可根据常规方法进行血液安全性评估，并使用敏感分析，例如ELISA测定多种血液成分，包括循环免疫粘附素和鼻病毒数量。鼻灌洗检测也可通过类似常规方法进行操作。
常规统计分析和计算可被用于测定对单个患者和/或受试者群体有效性和预测随时间的毒性。
本领域熟知的侵袭研究也可用于证实其对临床感冒的治疗保护和/或降低病毒侵袭后的感冒症状，其使用商购的起始材料，例如病毒、细胞和动物。见例如，Gwaltney等，Prog.Med.Virol.39256-263，1992。
以下实施例说明本发明的公开内容。这些实施例不应限制本发明专利申请范围。
实施例1.免疫粘附素表达盒的构建通过PCR克隆制备编码ICAM-1细胞外结构域D1至D5的表达盒。具体的说，包含ICAM-1细胞外所有五个Ig样结构域的片段是使用以下寡核苷酸引物从质粒pCDIC1-5D/IgA(参考Martin等的文献)中扩增得到5’-TCTGTTCCCAGGAACTAGTTTGGCACAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTC-3’
(SEQ ID NO6)5’-CATACCGGGGACTAGTCACATTCACGGTCACCTCGCGG-3’(SEQ ID NO7)这两条引物设计为在PCR片段的5’和3’端引入SpeI位点(加下划线的核苷酸)。PCR过程使用Pfu聚合酶(Stratagene)减少错误的聚集。将该PCR片段克隆入PCRScript载体(Stratagene)，并在测序后融合至人类IgA2表达盒(羰基末端含或不含SEKDEL)。
开发了在植物内表达的人类J链和分泌成分构建体，以及人类IgA2重链构建体。制成一种重链表达盒载体，称为pSSpHuA2(见图1)。它包括编码豆球蛋白信号肽的序列(Baumlein等，Nucleic Acids Res.14(6)，2707-2720，1986)。豆球蛋白序列由GenBank注册号No.X03677提供，豆球蛋白信号肽序列为SEQ ID NO10(也见图8)，在驱动信号肽表达的SuperMas启动子和IgA2m(2)重链恒定区之间为含SpeI和SacI位点的IgA2m(2)恒定区。
扩增的编码人类ICAM-1前五个结构域和人类IgA2m(2)Fc区的DNA被融合入植物表达盒，产生嵌合ICAM-1分子表达构建体，如图2A所示。这是通过把编码ICAM-1的五个细胞外结构域的片段克隆入pSSpHuA2载体，产生pSSPICAMHuA2而完成的。方便的限制性位点(5’SpeI和3’SpeI)允许扩增片段被插入信号肽和Cα1结构域之间。在得到的构建体内，嵌合ICAM-1分子的表达受组成型启动子“SuperMas”(Ni等1995)和nos 3’终止子区控制。
得到的嵌合ICAM-1分子构建体不含可变区。在mRNA翻译时，预计信号肽的剪切将ICAM-1重链融合定位于植物细胞内质网(ER)。编码ER保留信号(RSEKDEL，SEQ ID NO5)的DNA被附着于重链3’末端，以提高构建体的表达水平。RSEKDEL(SEQ ID NO4)氨基酸序列是将蛋白保留在植物细胞内质网的共有信号序列。该序列已被证实提高植物体内抗体聚集水平(Schouten等，Plant Molecular Biology30781-793，1996)。嵌合ICAM-1分子构建体的氨基酸序列如图2B所示。该构建体的DNA序列和翻译框架在用作粒子轰击前应核实无误。
目前证实，J链与IgA的组装发生于高尔基体(Yoo等，J.Biol.Chem.27433771-33777，1999)，无RSEKDEL的重链也在高尔基体内构建。ICAM-1片段被克隆入无RSEKDEL的含IgA2m(2)恒定区表达盒。
2.在植物内表达组装的免疫粘附素A.免疫粘附素表达载体pSSPICAMHuA2(SEQ ID NO9和图8)质粒全长6313bp。49-1165位核苷酸代表Super启动子(Ni等，Plant Journal 7661-9-676，1995)。1166-3662位核苷酸包括编码与接头序列杂交的人类ICAM-1/人类IgA2m(2)恒定区的序列。包括了共有Kozak序列(Kozak，Cell 44(2)283-92，1986)(nt 1186-1192)和蚕豆豆球蛋白信号肽(nt1189-1257；Bumlein等，Nucleic Acids Reg.14(6)2707-2720(1986))以增强转录起始。先前已公布了人类IgA2m(2)恒定区(nt3663-3633)序列(Chintalacharuvu等，J.Imm.1525299-5304，1994)。将编码内质网保留信号SEKDEL的序列附着于重链末端(nt3634-3654)。3663-3933位核苷酸来源于胭脂碱合成酶3’末端(转录终止和聚腺苷酸化信号；Depicker等，1982)。质粒的剩余部分来源于pSP72载体(Promega)。
PSHuJ(SEQ ID NO11和图8)质粒全长4283bp。14-1136位核苷酸代表Super启动子(Ni等，Plant Journal 7661-9-676，1995)，图8所示的1137-1648位核苷酸包含编码包括天然信号肽(Krajci等，Biochem.And Biophys.Res.Comm158783，1994)和接头序列的人类J链的序列。包括了共有Kozak序列(Kozak，Cell 44(2)283-92，1986)(nt 1151-1157)以增强转录起始。1649-1902位核苷酸来源于胭脂碱合成酶3’末端(转录终止和聚腺苷酸化信号；Depicker等，J Mol Appl Genet 1(6)561-73(1982)。质粒的剩余部分来源于pSP72载体(Promega)。
pSHuSC(SEQ ID NO12和图8)质粒全长5650bp。13-1136位核苷酸来源于Super启动子(Ni等，Plant Journal 7661-9-676，1995)，1137-2981位核苷酸包含编码包括天然信号肽(Krajci等，Biochem.AndBiophys.Res.Comm1 58783，1994)和接头序列的人类分泌成分的序列。共有Kozak序列(Kozak，Cell 44(2)283-92，1986)(nt 1151-1157)增强转录起始。2982-3236位核苷酸来源于胭脂碱合成酶3’末端，提供转录终止和聚腺苷酸化信号；见Depicker等，J Mol Appl Genet1(6)561-73(1982)。质粒的剩余部分来源于pSP72载体(Promega)。
pBMSP-1质粒(SEQ ID NO13和图8)来源于pGPTV-KAN。Becker等在Plant Molecular Biology 20，1195-1197，(1992)中描述的新的植物二元载体，其可选择标记邻近左侧T-DNA边界，以及在左侧和右侧边界之外的序列。pBMSP-1的18-187位核苷酸代表右侧T-DNA边界，1811-775位核苷酸代表superMAS启动子。2393-2663位核苷酸代表NOS启动子(Depicker等，J Mol Appl Genet 1(6)561-73，1982)，2698-3492位核苷酸编码NPT II基因(使其具有卡那霉素抗性)，3511-3733位核苷酸是来源于根癌土壤杆菌基因7的聚腺苷酸化信号(Gielen等，Embo J3835-46，1984)。1768-976位核苷酸编码NPTII基因，4317-4464位核苷酸代表左侧T-DNA边界。
pBMSP-1spJSC质粒(SEQ ID NO14和图8)来源于pBMSP质粒，含有super启动子控制的J和SC。该质粒1-149位核苷酸代表左侧T-DNA边界。955-733位核苷酸是来源于根癌土壤杆菌基因的聚腺苷酸化信号，1768-976位核苷酸编码NPT II基因(使其具有卡那霉素抗性)，2073-1803位核苷酸代表NOS启动子。2635-3768位核苷酸代表superMAS启动子，3774-5595位核苷酸编码人类分泌成分，5603-5857位核苷酸代表NOS聚腺苷酸化信号。5880-6991位核苷酸代表superMAS启动子，7007-7490位核苷酸编码人类连接链，7504-7757位核苷酸代表NOS聚腺苷酸化信号。7886-8057位核苷酸代表右侧T-DNA边界。
pGPTV-HPT质粒编码赋予潮霉素抗性的酶，可以从Max-Planck-Institut für Züichtungsforschung(Germany)购得。见Becker在PlantMolecular Biology 20，1195-1197(1992)中的描述。
B.植物转化和植物内免疫粘附素的表达以上描述的表达盒被用于在植物内生产组装的免疫粘附素。把pSSPICAMHuA2、pSHuJ、pSHuSC和pBMSP-1质粒共轰击入烟草叶组织(N.tabacum cultivar Xanthi)，转化的微愈伤组织在卡那霉素存在的营养琼脂上筛选。各个微愈伤组织指示独立的转化事件，其被从母体组织中解剖并在具有卡那霉素的营养琼脂上繁殖。
对愈伤组织进行转基因表达的筛选。通过免疫印迹及PCR证实#7132愈伤组织表达嵌合ICAM-1免疫粘附素和J链(未给出数据)。该愈伤组织不具有编码SC的DNA。培养的愈伤组织生长良好，能够积聚充足的质量，再次对#7132愈伤组织进行轰击，该次轰击使用以上描述的两种质粒，其中PBMSP-1SpJSC包含J链和SC的表达盒，pGPTV-HPT包含赋予潮霉素抗性的hpt I基因表达盒。在营养琼脂选择和生长后，通过免疫印迹可鉴定一些表达以一些组装状态存在的嵌合ICAM-1分子、J链和SC的独立转化体。
图3说明嵌合ICAM-1分子在独立转化烟草愈伤组织内的表达。图3A说明非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶免疫印迹，其上使用包含不同转化的烟草愈伤组织(C)和水提取物(Aq)的样品并探测人类ICAM的存在。免疫粘附素的溶解性使我们确信提取物可以方便地制备，相似的信号使我们相信表达的可重复性。图3B说明含有从愈伤组织Rhi107-11中部分纯化的免疫粘附素的多种级分的非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶的免疫印迹。该印迹通过抗人ICAM(～ICAM)、人IgA重链(～α)、人分泌成分(～SC)和人J链(～J)抗体探测。其次，必须使用酶偶联的抗体和碱性磷酸酶标记免疫阳性条带。通过在未表达愈伤组织提取物内检测不到免疫阳性条带，进一步确证免疫印迹的特异性(未给出数据)。没有糖基化的嵌合ICAM-1分子二聚体的估计MW是173，318；这种形式很可能出现在条带中的250kD标记下，因为它对于ICAM-1和重链为免疫阳性。该条带对SC(总体估计MW～248kD)也为免疫阳性，但对J链则不是，这是有些出乎意料的，因为SIgA组装的途径是规范的，它涉及两种细胞类型(在哺乳动物中)，并要求SC组装前存在J链。一种包括单分子J链和单分子SC的免疫粘附素四聚体在糖基化前的估计MW约为440kD。一些物种的分子量超过200kD，可见对所有四种标记均为免疫阳性。
使用DNA包被的微粒轰击，在植物和动物中得到稳定的转化体(见Sanford等，Meth.Enz.217483-509，1993的综述)。粒子介导的用编码本发明免疫粘附素载体进行的转化使用Bio-Rad制造的PDS-1000/He粒子加速设备。PDS-1000/He粒子加速设备系统使用氦气压向靶细胞加速DNA包被的微粒。该技术的物理特性使其用途广泛并方便操作。我们已经成功的使用分泌型IgA的所有四种组分转化烟草。
基本的biolistic过程如以下操作通过在1ml无水乙醇内混合60mg粒子制备一种微粒的原悬浮液。该悬浮液经涡旋后，移出25-50μl至另一无菌微量离心管内。离心30秒后弃除乙醇，用1ml无菌水重悬沉淀并离心5分钟。弃除水分，并用25-50μl的DNA溶液重悬沉淀，该溶液含有并不总是等摩尔量的质粒DNA的混合物。每种制备物内加入的质粒量为0.5ng～1μg。依次加入以下物质220μl无菌水，250μl 2.5MCaCl2和50μl 0.1M亚精胺。该混合物至少涡旋10分钟后，离心5分钟。弃除上清液，用600μl无水乙醇沉淀DNA/微粒，混合并离心1分钟。弃除乙醇并用36μl的乙醇重悬沉淀。在Kapton(DuPont)制造的巨载体片中心，尽量均匀的加入10μl悬浮液，乙醇自动挥发。该巨载体片和破裂盘被放置在单元内。包含表面消毒烟草叶的培养皿被放置在终止屏下。腔室被排空至28-29mmHg时，目标被轰击一次。该方案最优化于烟草使用，也可通过改变参数优化使其适用于其它植物，例如He压力、包被粒子的数量、巨载体和终止屏间的距离和终止屏至组织的飞行距离。
嵌合ICAM-1分子表达盒也在二元载体中组装，以便用于土壤杆菌介导的转化。一种设计用于表达人类J链和分泌成分，及卡那霉素抗性的土壤杆菌二元载体被导入根癌土壤杆菌LBA4404株。在另一种二元载体内的嵌合ICAM/IgA分子也用于转化LBA4404。根据标准步骤，两种菌株的过夜培养物被用作与烟草叶片同时“共培养”(Horsch等，Science2271229-1231，1985)。
使用标准步骤再生被轰击和土壤杆菌转化的烟草叶盘(Horsch等，Science 2271229-1231，1985)。因为从轰击组织再生的转化植物在成熟时经常产生基因沉默，通过土壤杆菌介导的转化制备转基因烟草植物，可以在成熟植物内达到更高的表达率。
3.组装的免疫粘附素的纯化纯化根据实施例3表达的免疫粘附素。大量培养愈伤组织用于促进提取过程的开发。一种部分纯化方案提供了稳定浓度，适于多种缓冲条件下，用于研究免疫粘附素进一步纯化的后续色谱技术(见图3)。在榨汁机内提取愈伤组织，所述榨汁机在两个不锈钢齿轮间碾碎组织，组织浸洗在含柠檬酸钠(0.6M，pH7.4)和尿素(终浓度2M)的缓冲液内。汁液(～1ml/g鲜重)在通过粗棉布粗滤后，用0.67倍体积的饱和硫酸氨沉淀。可以在离心和在Dounce匀浆器内用小量体积的50mM柠檬酸钠(pH6.6)彻底提取后收集得到一种绿色沉淀物匀浆。再次离心收集得到一种清亮棕色的上清液，通过Sephadex G-100柱在去盐模式缓冲液交换下部分纯化。该去盐/缓冲液交换步骤允许在所需缓冲液条件下制备部分纯化的浓度(～0.2ml/g鲜重愈伤组织)；再用0.25X磷酸缓冲盐溶液洗脱G-100柱。该洗脱液可在2-8℃的条件下至少稳定存放10天。
4.免疫粘附素抑制人类鼻病毒的感染性根据实施例3制备的免疫粘附素已被证实可以抑制人类鼻病毒对细胞的感染性。根据实施例3制备的愈伤组织提取物与可溶性ICAM-1成功地竞争同抗ICAM单克隆抗体的结合。图4说明从酶联免疫吸附测定(ELISA)得到的数据。此测定用0.25μg可溶性ICAM-1/ml包被96孔板。方块代表sICAM浓度的提高，圆圈代表用于与粘附的ICAM竞争定量小鼠(抗人ICAM)抗体的愈伤组织提取物(从G-100得到的无菌过滤级分)用量的提高。在冲洗孔之后，用偶联于辣根过氧化物酶的抗小鼠抗体检测粘附的小鼠抗体。以邻苯二胺为底物，在490nm检测粘附的酶活性。通过公式OD490＝y＝y0+a/[1+e^-{(x-x0)/b}]可以很好的描述数据(正方形，sICAM；圆圈，提取物)，其中a＝ymax，y0＝ymin，b＝曲线快速变化部分的斜率及x0＝50％反应水平的x值。相对于可溶性ICAM-1，在此检测的免疫粘附素提取物包含～250μg ICAM/ml的等价物；由于受ICAM-1重链融合物的二聚体和四聚体组装的预计亲和力效应的影响，这是一个过高的估计。因此，该ELISA证实免疫粘附素与可溶性ICAM-1竞争结合抗ICAM单克隆抗体。
该竞争性ELISA通过对比达到50％反应时所需要的各种级分的标化量，允许活性恢复的定量评估。在纯化时，免疫粘附素制剂的滴度可以表达为倒数稀释液，或为达到50％反应时需要将1毫克免疫粘附素稀释到的毫升数。该ELISA将促进免疫粘附素纯化过程的开发。
一种细胞病变效应分析(CPE)证实部分纯化的免疫粘附素抑制人类鼻病毒对人类细胞感染性的特异能力(图5)。在每种混合物与HeLa S3细胞在33℃铺板前，用人类ICAM-1、ICAM/IgA融合体(Dr.Tim Springer惠赠)、或表达我们的ICAM/IgA免疫粘附素或另一种不同抗体的愈伤组织提取物预孵育HRV-39血清型鼻病毒。三天后固定存活细胞，并用结晶紫的甲醇溶液染色；570nm处的光密度提供细胞活力的一种成比例检测方法。
来源于Rhi107-11的两种提取物包含免疫粘附素，它们明显抑制病毒感染和杀伤HeLa S3细胞的能力(图5A，右侧向上和向下的三角)。因为该提取物仅为部分纯化，我们也分析一种相似制备的提取物，其包括直接对抗化疗药物阿霉素的人类IgA2m(2)。该提取物包含一种相似的具有不相关的结合特异性的免疫球蛋白，不能抑制鼻病毒的感染性，它证实ICAM-1重链融合体的表达赋予了抑制的特异性。CPE分析证实，如所期望的，可溶性ICAM-1和IC1-5/IgA(Martin等，1993)对表达活性抑制的不同能力(图5B)。图5B的插图是可溶性ICAM-1(1.35μg/ml)和IC1-5/IgA(0.12μg/ml；低11.3倍)IC50范围的按比例放大。
5.用于临床和毒理学研究的免疫粘附素的生产和纯化通过制备转基因烟草植物生产足够量的用于临床和毒理学研究需要的免疫粘附素。该表达免疫粘附素的转基因植物(无ER保留信号)通过土壤杆菌介导的转化得到。期望缺少ER保留信号，从而提高组装，因为新生SIgA通过包括反式高尔基体的完整高尔基体产生，其中SC与dIgA共价连接，如脉冲实验所示(Chintalacharuvu和Morrison，Immunotechnology 4165-174，1999)。因为土壤杆菌介导的转化更可能产生具有一致的转基因表达水平的植物，这些植物的后代可被用作生产临床级的免疫粘附素。
为了最大化表达水平并创建一个纯种系，需要建立纯合植物。在采集种子前，最高产的植物(T0代)能够在温室内自我受精。四分之一的T1代植物预期为纯合体。它们在温室内生长，使多种植物的种子样品在含卡那霉素的培养基内开始发芽。所有来源于纯合阳性植物的后裔(T2)预期为绿色。一些杂合植物的后代预期为白色或黄色。通过回交野生型植物和后裔提取物的免疫印迹证实纯合性。
收获和加工可在生产竞争中连续筛选，特别是由于可以从单个植株中得到大量的收获物，即一次收获将植物切至土壤水平，重新生长进行下一次收获。在建立免疫粘附素生产等级时，必须确定所需最终的免疫粘附素的量，解释表达水平(mg制备的免疫粘附素/kg烟草鲜重)、知道植物的生长速率和平均的植物预期重量、和纯化方案的总体产率(设定20％)。设定生产3g最终的免疫粘附素总体需要4次收获，每次预期生产1g最终的免疫粘附素。
已知这些目标和参数，可以确定必需的植物数和植物生长所需的空间。图6说明生产1克最终的免疫粘附素的必需生产量评估。该图说明在预期的表达水平和植物重量下，以20％产率生产1g免疫粘附素所需的植物数。在免疫粘附素的不同表达水平(mg/kg鲜重)和总体回收率(设定为20％)、以及每个植物的重量，因此可以确定合理可能性窗中(虚线方框)指定产品目标(1g/收获)的植物总数。所需植物数量降低，与指定生长和再生长周期数相反。预期的生物量产生是时间和生长条件的函数，它影响收获的时间和收获之间的时间。这些生长周期可以通过交错种植和收获期而适应纯化方案的实际。根据我们的经验，需要x个植物。例如，在合理表达水平，即100mg免疫粘附素/kg下，从植物制备1g最终的免疫粘附素，需要250个植物，收获时的重量为200g/植物(发芽后约80天)。以这种规模，这些植物需要约10m2的生长空间并在150天内收获两次。
一次加工50kg以上的生物量需要多种适度的大规模操作，其在食物加工工业内都有相对部分。这些操作包括大批材料处理、减小体积、榨汁和过滤。用一种Vincent Press和Durco过滤系统有效地加工这些量。榨汁步骤使用已被证实的，简单的柠檬酸钠和尿素缓冲液。这些成分对提取物起缓冲作用，帮助防止酚醛酸的氧化和其与蛋白的结合(Gegenheimer，Methods in Enzymology 182174-193，1990；Loomis，Methods in Enzymology，31528-544，1974；Van Sumere等，TheChemistry and Biochemistry of Plant Proteins，1975.)并保证免疫粘附素在后续酸沉淀中的可溶性。
过滤不溶于酸的脂和蛋白(总量的约90％)，接着通过切线流动超滤浓缩免疫粘附素，并去除其中小的蛋白，特别是酚醛酸。双重过滤提高小分子的去除率并交换制备用于短期储存和后续层析的缓冲液。SP-琼脂糖凝胶(在pH5.0或以下结合)或Q-琼脂糖凝胶(在pH5.5或以上结合)是一种可用于过滤免疫粘附素的离子交换层析。它们容易得到、具有刻度、稳固及具有高能力。特别是，它们可用于膨胀床形式，这种形式减少了过滤前步骤的严格性。阳离子交换层析最先使用，其较阴离子交换层析更具选择性。免疫粘附素从蛋白潜在存在的一些物种中纯化得到，其中至少95％的蛋白以ICAM-1/IgA、ICAM-1/dIgA或ICAM-1/SIgA的形式存在，二价和四价ICAM-1结构域的存在对有效抗病毒活性是关键的。接着检测纯化免疫粘附素中内毒素的可接受水平、尼古丁等生物碱和生物负载。而且，监测了有效性水平(通过ELISA和CPE分析确定)、蛋白浓度、pH和外观。随后确定临床用免疫粘附素的稳定性，确保患者接受完全强效的免疫粘附素。甚至部分纯化的提取物在冷冻条件下也能保持10天的稳定。临床配制的免疫粘附素(在磷酸缓冲液中)在-20℃、2-8℃和37℃存放3-6个月后的滴度和效力也进行了检验。
6.免疫粘附素具有植物特异的糖基化作用对生产的免疫粘附素进行分析，确定其中存在的糖基化作用模式。Cabanes-Macheteau等，Glycobiology9(4)365-372(1999)，证实在一种植物表达的抗体构建体上存在一些植物特异的糖基化部分。使用他们的方法证实，根据实施例1、2和3生产的免疫粘附素具有一种植物特异的糖基化模式。我们预期这种多样性也是免疫粘附素可变性的一种来源。粗提物已在体外被证实具有抗病毒活性(未显示数据)，所以糖基化作用并不表现影响有效性。N-连接糖基化作用(图2说明嵌合ICAM-1分子仅存在15个潜在的位点)可能是使免疫印迹条带多样的因素。用N糖苷酶A在印迹前消化免疫粘附素制剂，表现出条带模式的多样性瓦解成较少的离散的条带。这样，最初通过还原和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定糖基化形式。而且，通过CPE分析和竞争ELISA检测消化和伪消化片段，证实N-连接糖基化对体外效力和滴度的影响。
7.免疫粘附素灭活人类鼻病毒分析根据实施例1、2和3制备的免疫粘附素通过结合病毒、阻止病毒进入和诱导形成病毒空衣壳灭活HRV的能力。为了检测免疫粘附素与HRV的结合，免疫粘附素与[3H]亮氨酸标记的HRV-39孵育30分钟后，加入HeLa细胞1小时。在冲洗后，细胞和结合的病毒用Triton X-100分离，并在闪烁计数器上检测[3H]水平。
对比用免疫粘附素孵育时HRV-39的灭活和sICAM-1对HRV的灭活。在与sICAM-1单体孵育时，HRV-39并没有明显的直接灭活(感染性降低＜0.5log10)，而与IC1-5D/IgA孵育时，感染性降低约1.0log10(Arruda等，Antimicrob.Agents Chemother.363686-1191，1992；Crump等，Antimicrob.Agents Chemother.381425-7，1994)。为了检测免疫粘附素灭活HRV-39的能力，10650％组织培养感染剂量的HRV-39在摇板平台上的培养基内33℃孵育1小时，培养基包含浓度是每种分子对于病毒IC50的10倍的sICAM-1或免疫粘附素或为普通培养基。每种病毒-免疫粘附素或病毒-培养基混合物再以10倍稀释度进行系列稀释，在96孔板中HeLa细胞上测定滴度。
免疫粘附素对HRV粘附宿主细胞的作用通过在存在或缺少免疫粘附素时，MOI为0.3条件下孵育HRV-39与HeLa细胞而检测。4℃1小时吸光过程后，冲洗细胞，用加上或减去免疫粘附素的培养基替换培养基。细胞在33℃孵育10小时(允许复制一轮)，通过冻/融细胞收获病毒。在HeLa细胞上测定病毒滴度。
ICAM-IgA(IC1-5D/IgA)较sICAM-1在诱导HRV构象改变上更为有效，使之形成无感染性的病毒空颗粒(Martin等，J.Virol.673561-8，1993)。为了检测根据实施例1、2和3生产的免疫粘附素诱导HRV构象改变和引起病毒RNA释放的能力，纯化的免疫粘附素与[3H]亮氨酸标记的HRV-39孵育30分钟，再把病毒覆盖于5-30％蔗糖梯度。40,000rpm离心90分钟后，收集各级分，检测[3H]水平，并检测各级分的感染性。(完整HRV沉积于蔗糖梯度上的149s，而缺少RNA的空衣壳沉积于75s(Martin等，J.Virol.673561-8，1993))。由于ICAM/SigA的价增加，我们预期ICAM/SIgA免疫粘附素较ICAM-IgA在诱导非感染性颗粒形成中更为有效。
使用CPE分析检测纯化免疫粘附素对一组主要和次要(不使用ICAM-1作为受体)HRV血清型的抑制作用。ICAM-1对HRV感染性的抑制能力在病毒各分离物中各不相同。已被证实，在使用HeLa细胞分析检测一组HRV主要受体血清型时，sICAM-1的EC50值为0.6μg/ml-＞32μg/ml(Crump等，Antimicrob.Agents Chemother.381425-7，1994)。我们的研究包括9种主要血清型(HRV-3，-13，-14，-16，-23，-39，-68，-73和-80)和次要受体血清型HRV-1A。
8.临床研究证实免疫粘附素对降低在人类中的感染性的能力剂量递增耐受研究在两个随机对照实验中检测本发明的免疫粘附素，用于确定鼻内给予免疫粘附素对感染、IL-8反应和实验鼻病毒感冒的影响。这两个研究评估了在鼻病毒接种前或后，给予受试者免疫粘附素的作用。在此使用的临床方案基于先前评估重组可溶性ICAM-1分子对抗鼻病毒感染有效性使用的方案(Turner等，JAMA 2811797-804，1999)。
A.受试者受试者从Charlottesville的Virginia大学社区募集。受试者需要具有良好的健康状态、不吸烟、年龄在18～60岁。有变态反应疾病或非变态反应性鼻炎、异常鼻解剖结构或粘膜、或前两周有呼吸道感染病史的受试者应排除在外。妊娠或哺乳妇女或没有采用医学许可生育控制的妇女也排除在外。在病毒侵袭研究实验中(I/II期，见下文)，受试者必须对实验病毒易感，这是通过在实验开始90天内测定对病毒的血清中和抗体滴度为1∶4或低于1∶4而证实的。
B.研究药物本发明的免疫粘附素被制成含2.6mg/ml的磷酸缓冲液(PBS)喷雾溶液。安慰剂由PBS组成，与活性制剂有相同的外观。该溶液通过使用一种配备计量鼻喷雾泵的药瓶给药。该泵每次递送70μl溶液，其中每次喷雾包含183μg免疫粘附素。该药物的给药量是每日6次(间隔3小时)，每次每个鼻孔喷雾两次，全天总量4.4mg。该剂量与tremacamra研究感染时所使用的mg蛋白/日表示的可溶性ICAM-1的剂量相同(Turner等，JAMA 2811797-804，1999)。1摩尔免疫粘附素的质量约为1摩尔sICAM-1质量的两倍。然而，由于sICAM-1和ICAM-IgA融合体间体外活性不同，免疫粘附素在摩尔基础上较sICAM-1有效数倍。因此，该量是必需量的保守计算值。除非在剂量递增研究中发现该剂量的问题，一般均使用该量。
C.研究设计单升高剂量和多升高剂量研究用于评估免疫粘附素的安全性。在所有情况下，每个剂量水平评估三位受试者，两位接受免疫粘附素治疗，一位接受安慰剂。在单升高剂量研究中评估四种剂量水平。最低的个体剂量是侵袭研究中预期剂量的半数，而最高量是侵袭研究中预期剂量的两倍。以下是剂量水平每鼻孔喷一次(总量366μg)，每鼻孔喷两次(总量732μg)，每鼻孔喷三次(总量1098μg)，每鼻孔喷四次(总量1464μg)。
同样的剂量水平也用于多升高剂量研究。受试者在5天内每3小时(每日6次)接受一定量药物。两个研究均在每个剂量水平评估受试者，直到明确在前一个水平没有急性毒性才开始每个后续水平。所有受试者在第一个剂量后21天后返回单剂量，并在6周进行随访(检测血清抗免疫粘附素抗体)。
一个独立的实验组内有12个受试者，给药剂量是每个鼻孔喷两(总量732μg)，并在1、2、4、8和16小时进行鼻灌洗(每个时间点两个受试者)。为了计算免疫粘附素在体内的半衰期，通过ELISA在PanoramaResearch分析灌洗物中的免疫粘附素。在剂量递增和半衰期测定研究(共28位受试者)中使用的免疫粘附素总量约为270mg。
D.安全性评估除了常规不良事件记录，通过三种途径评定免疫粘附素的安全性。首先，在首次给药前和末次给药后，研究者对受试者鼻粘膜进行视诊，特别观察刺激或炎症症状。记录任何可见的变化。其次，在治疗前和末次给药后1、4和8天(多升高剂量研究中21天)采集样品用于标准血液安全评估。第三，血清样品保存，冷冻，并用于测定是否免疫粘附素可以穿透鼻粘膜进入血液。其通过两种方式完成。第一，通过ELISA检测血清样品中免疫粘附素的存在。在此分析中，吸附于微量滴定板的抗人IgA抗体捕获血清内所有的免疫粘附素，其通过一种抗ICAM抗体检测。使用含有已知浓度免疫粘附素的正常人类血清样品测定所述分析的敏感性。也可选择使用抗ICAM抗体吸附于平板并捕获血清中的免疫粘附素，这可以通过抗IgA抗体检测。第二，使用ELISA方法分析对于免疫粘附素的免疫应答，该方法使用吸附于微量滴定板的免疫粘附素。血清内的任何抗免疫粘附素抗体与之结合，并通过抗人IgG或抗人IgM检测。对比治疗前和治疗后血清样品，滴度的任何变化都被认为是摄取免疫粘附素治疗的迹象。如果有抗免疫粘附素抗体存在的阳性迹象，应进行额外的实验进一步区分抗ICAM-1和抗IgA的活性。
筛选发生对免疫粘附素的变态反应的患者。(在先前的研究中，可溶性ICAM局部施用于鼻部或在口腔中局部使用都没有发生不良反应。)使用一种敏感的两步ELISA(R&D System)检测鼻灌洗物中抗免疫粘附素特异性IgE抗体，检测个体表现的鼻变态反应症状。
E.统计学分析这些研究使用的样本大小基于使用鼻病毒侵袭模型的先前研究。保护研究设计的样本大小应能够充分检测到临床感冒发生率从安慰剂组的75％至主动治疗组的25％的降低，其一侧水平为α＝.05和1-β＝.80。而且，假定SD为5.8单位时，样本大小应能够充分检测到总体症状分值变化5个单位。
9.临床研究证实免疫粘附素降低在人类中的感染性的能力侵袭研究侵袭研究用于证实，在病毒侵袭后，使用本发明免疫粘附素治疗可以抵御临床感冒或减轻感冒症状。
A.侵袭病毒本研究使用的侵袭病毒是鼻病毒39(HRV-39)。鼻病毒39型是一类主要的鼻病毒，其粘附于细胞需要ICAM-1。根据共同认可的原则对所述侵袭病毒池进行安全检测(Gwaltney等，Prog.Med.Virol.39256-263，1992)。所有的受试者均接种约200倍的平均组织培养感染量(TCID50)。在患者仰卧体位时，每隔15分钟向患者鼻孔内分别滴入两次250μl的病毒接种物。
表1
B.研究设计进行两个随机鼻病毒侵袭研究(见表1)。在接种前和接种后评估本发明免疫粘附素的同样制剂。在两个研究中，药物在5天内每天给药6次。在受试者登记参与每个研究时，既被随机分配接受免疫粘附素或匹配安慰剂治疗。该研究采用盲法，所有临床实验人员、受试者和PanoramaResearch的雇员保持双盲，直到收集完所有的数据。
接种前研究在病毒侵袭前4小时(2个剂量)开始给药。在第二次给予免疫粘附素(或安慰剂)后1小时开始病毒侵袭，然后继续按照方案给予第一天剩余的四个研究药物剂量。该研究的18位受试者接受主动治疗，18位受试者接受安慰剂。
在接种后研究中，在病毒侵袭后24小时开始给药。因为已经用于其它有关病毒侵袭保护的研究(Harris和Gwaltney，Clin.Infect.Dis.231287-90，1996)和出现明显的感冒症状，所以选择使用该时间点。本研究的病毒侵袭在研究第0天的早晨给药，约为研究第1天早晨初次给药前24小时。该研究的36位受试者接受主动治疗，18位受试者接受安慰剂。
从研究的第0天(病毒侵袭日)至第6天，受试者被分离在独立的旅馆房间内。研究期间，每天早晨第一次给药前记录症状分值并进行鼻灌洗分离病毒，每晚再次记录症状分值。在研究第6天，解除受试者的隔离状态，但每晚记录症状分值直到第14天。受试者在研究第21天返回研究点，此时采集最后的血清样本用于检测抗免疫粘附素抗体。两个病毒侵袭研究(共54位受试者)使用的免疫粘附素总量约为1200mg。
C.病毒分离在细胞培养物内通过病毒分离检测病毒释放。通过在每个鼻腔内滴入5ml 0.9％的生理盐水采集鼻冲洗样品。该冲洗液排入一塑料杯中，在用于病毒培养前，可冷藏1～2小时。通过吸附于一种琼脂糖支持物(Affi-Gel 10，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上的抗ICAM-1抗体处理，从样品分离免疫粘附素。在-80℃储存每次处理的部分样品，其余样品被接种于两管HeLa-1细胞，HeLa细胞系的富集是为了产生ICAM-1(Arruda等，J.Clin.Microb.341277-1279，1996)。
通过典型细胞病变效应的发生识别鼻病毒。在病毒侵袭后任一研究日出现病毒培养阳性的受试者认为被病毒感染。通过在HeLa-1细胞的微量滴定板中培养10倍系列稀释液，测定储存于-80℃的样品中的病毒滴度。
通过使用标准方法检测血清中和抗体滴度来测定侵袭病毒抗体(Gwaltney等，Diagnostic Procedures for Virol Rickettsial andChlamydial Infections，p.579-614，American Public HealthAssociation)。在筛选过程中进行血清样品抗体检测，具体时间为病毒侵袭前(急性期)和21天后(恢复期)。恢复期血清样品的侵袭病毒抗体滴度较急性期血清样品至少升高4倍的受试者认为被病毒感染。
D.疾病严重性评估使用先前描述的方法(Turner等，.JAMA 2811797-804，1999)进行疾病严重性评估。在病毒侵袭前(基线)记录症状分值，并在以后的6天内每天记录两次，间隔约12小时。在研究的第7至14天，每个受试者在晚上记录一次他/她的症状分值。在每次评估中，受试者被要求判断从上次症状评估后的期间内以下8种症状的最大严重性打喷嚏、流鼻涕、鼻阻、咽喉痛、咳嗽、头痛、不适和寒战。每种症状被标以0至3的严重性分值，其分值相当于报告症状无症状、轻微、中度或严重。如果在基线处出现症状，该基线症状分值应从报告症状分值中减去。每日两次评估中的较高值被认为是该症状的每日症状分值。8个独立症状的每日症状分值相加得到总体每日症状分值。病毒侵袭后最初5天(研究第1-5天)的总体每日症状分值被相加，并在研究第5天晚上询问每个受试者“你认为患感冒了吗？”总体症状分值至少为6、流鼻涕至少3天和主观认为患感冒的受试者被定义为患有临床感冒。
排出的鼻分泌物的量在第1-7天通过向所有受试者提供预先称重的鼻组织包检测。该组织在使用后被存放于密封的塑料袋内。每天早晨采集并称量使用的组织和原包内未使用的组织。
E.IL-8分析目前研究提示，宿主炎症反应，特别是白介素8(IL-8)，可能在鼻病毒感染引起感冒症状的发病机理中起重要作用。使用一种先前描述的商购ELISA(R&D Systems，Minneapolos，Minn)测定鼻灌洗物中的IL-8浓度(Turner等，JAMA 2811797-804，1999)。
F.安全性评估侵袭研究使用同实施例8描述的剂量递增研究中同样的评估方法。
G.统计学分析统计学分析使用同实施例8描述的剂量递增研究中相似的方法。
权利要求
1.一种免疫粘附素，包含嵌合ICAM-1分子，所述嵌合ICAM-1分子包含连接于免疫球蛋白重链的至少一部分的鼻病毒受体蛋白；和结合于该嵌合ICAM-1分子的J链和分泌成分。
2.权利要求1的免疫粘附素，其中所述鼻病毒受体蛋白由ICAM-1的细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合组成。
3.权利要求1的免疫粘附素，其中所述免疫球蛋白选自IgA、IgA1、IgA2、IgM和嵌合免疫球蛋白重链。
4.权利要求1的免疫粘附素，进一步包含至少一种额外的嵌合ICAM-1分子。
5.权利要求1的免疫粘附素，其中所述鼻病毒受体蛋白由ICAM-1的细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合组成；并且该免疫球蛋白重链至少包含IgA2重链的一部分。
6.表达于转基因植物的权利要求1的免疫粘附素。
7.表达于单子叶植物的权利要求1的免疫粘附素。
8.表达于双子叶植物的权利要求1的免疫粘附素。
9.权利要求1的免疫粘附素，其中所有蛋白为人类蛋白。
10.表达于异源细胞的权利要求1的免疫粘附素，该异源细胞来源于植物、脊椎动物或无脊椎动物。
11.表达于哺乳动物细胞的权利要求1的免疫粘附素。
12.表达于毛根培养物的权利要求1的免疫粘附素。
13.表达于组织培养的植物细胞的权利要求1的免疫粘附素。
14.一种免疫粘附素，包括嵌合ICAM-1分子，所述嵌合ICAM-1分子包含与免疫球蛋白重链的至少一部分连接的鼻病毒受体蛋白，其中免疫粘附素具有植物特异的糖基化作用。
15.权利要求14的免疫粘附素，其中所述免疫粘附素进一步包含与该嵌合ICAM-1分子结合的J链和分泌成分。
16.权利要求14的免疫粘附素，其中所述鼻病毒受体蛋白由ICAM-1的细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合组成。
17.权利要求1 4的免疫粘附素，其中所述免疫球蛋白重链选自IgA、IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE和嵌合免疫球蛋白重链。
18.权利要求14的免疫粘附素，进一步包含至少一种额外的嵌合ICAM-1分子。
19.权利要求14的免疫粘附素，其中所述鼻病毒受体蛋白由ICAM-1的细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合组成；该免疫球蛋白重链至少包含IgA2重链的一部分。
20.权利要求14的免疫粘附素，其中所有蛋白为人类蛋白。
21.表达于来源于植物的异源细胞的权利要求14的免疫粘附素。
22.表达于毛根培养物的权利要求14的免疫粘附素。
23.表达于组织培养的植物细胞的权利要求14的免疫粘附素。
24.表达于植物的权利要求14的免疫粘附素。
25.表达于单子叶植物的权利要求14的免疫粘附素。
26.表达于双子叶植物的权利要求14的免疫粘附素。
27.一种组合物，包含免疫粘附素和植物材料，其中所述免疫粘附素包括嵌合ICAM-1分子，该嵌合ICAM-1分子包含与免疫球蛋白重链的至少一部分连接的鼻病毒受体蛋白。
28.权利要求27的组合物，进一步包含与所述嵌合ICAM-1分子结合的J链和分泌成分。
29.权利要求27的组合物，其中所述鼻病毒受体蛋白由ICAM-1的细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合组成；该免疫粘附素具有植物特异的糖基化作用。
30.权利要求27的组合物，其中所述免疫球蛋白选自IgA、IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE和嵌合免疫球蛋白重链。
31.权利要求27的组合物，进一步包含至少一种额外的嵌合ICAM-1分子。
32.权利要求27的组合物，其中所述鼻病毒受体蛋白由ICAM-1的细胞外结构域1、2、3、4和5的任意组合组成；该免疫球蛋白重链是一种IgA2重链。
33.一种减少人类鼻病毒对易感于人类鼻病毒的宿主的感染的方法，所述方法包括用权利要求1、14或27的免疫粘附素接触病毒，其中该免疫粘附素结合人类鼻病毒并降低其感染性。
34.一种减少由人类鼻病毒引起感冒的起始或散播的方法，所述方法包括用权利要求1、14或27的免疫粘附素接触病毒，其中该免疫粘附素结合人类鼻病毒并降低其感染性。
35.一种治疗或预防人类鼻病毒感染人类受试者的方法，所述方法包括给予受试者有效量的权利要求1、14或27的免疫粘附素，其中该免疫粘附素降低人类鼻病毒的感染性。
36.一种治疗或预防人类鼻病毒感染受试者的方法，所述方法包括鼻内给予受试者有效量的权利要求1、14或27的免疫粘附素，其中该免疫粘附素降低人类鼻病毒的感染性。
37.一种治疗或预防人类鼻病毒感染受试者的方法，所述方法包括口腔给予受试者有效量的权利要求1、14或27的免疫粘附素，其中该免疫粘附素降低人类鼻病毒的感染性。
38.一种药物组合物，其中包含存在于药物可接受缓冲液内的权利要求1、14或27的免疫粘附素。
39.一种表达载体，其中包含编码操作性连接于植物启动子的嵌合ICAM-1分子，该嵌合ICAM-1分子包含与免疫球蛋白重链的至少一部分连接的鼻病毒受体蛋白。
全文摘要
本发明的免疫粘附素可以用于治疗鼻病毒感染。所述免疫粘附素包含嵌合ICAM分子，也可任选包含J链和分泌成分。该嵌合ICAM分子是具有连接于免疫球蛋白的鼻病毒受体蛋白的一种融合蛋白。本发明还包括较大提高和改进的在植物内生产免疫粘附素方法。该免疫粘附素的每种成分都在植物细胞内生产，并因此在植物细胞内组装。生产本发明免疫粘附素的方法使这些分子的生产具有有效性和经济性。本发明也涉及在植物和哺乳动物细胞等多种真核细胞内生产该免疫粘附素。本发明免疫粘附素可以用作鼻病毒引起人类的感冒的治疗药物。
文档编号A61K47/48GK1440423SQ01812138
公开日2003年9月3日 申请日期2001年4月28日 优先权日2000年4月28日
发明者J·W·拉里克, K·L·维科夫 申请人:行星生物技术有限公司