抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体及其制备。本发明提供了一株保藏号为CCTCC?NO:C201475的杂交瘤细胞株CR-M01，以该杂交瘤细胞株可以分泌特异性识别猪红细胞CR1-like的抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体。本发明的单克隆抗体能够特异性识别猪红细胞上的CR1-like蛋白，并能够特异性阻断猪红细胞对致敏乳胶颗粒的免疫粘附，在猪红细胞CR1-like的功能研究中具有很高的应用价值。
【专利说明】抗猪红细胞CR1-1 ike单克隆抗体及其制备
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种单克隆抗体，具体涉及一种抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体，以及该单克隆抗体的制备，本发明还涉及分泌该抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
【背景技术】
[0002]自美国学者Siegel等在1981年提出“红细胞免疫系统(Red cell immunesystem, RCIS) ”概念以来,人们逐渐认识到红细胞不仅具有在血液中携带氧气的呼吸功能和调节血液PH值的缓冲功能，还具有免疫功能，并包含完整的自我调控系统。目前，人类医学领域中有关红细胞免疫的研究已经非常深入，红细胞在体内广泛参与特异性与非特异性免疫、机体免疫调控，并影响多种疾病的发生、发展，而CRl是人红细胞免疫功能最重要的物质基础。
[0003]人CRl是一种存在于红细胞、淋巴细胞、白细胞表面的相对分子质量205kDa的单链糖蛋白，其在每个红细胞上的数量为950，以散在和集簇状态分布在细胞膜上。人红细胞上有50%的CRl呈集簇分布，而其他细胞上CRl的集簇分布率却小于15%，红细胞CRl的这种集簇分布方式可使它与C3b包被的免疫复合物的结合位点呈多价性，且连接更为牢固。由于血液循环中绝大多数的CRl存在于红细胞膜上，红细胞清除血液循环免疫复合物的几率比白细胞大500-1000倍，因此，以CRl基础的红细胞免疫黏附是人红细胞最重要的免疫功能。当人红细胞对免疫复合物的结合受到限制时，免疫复合物就会沉积在敏感组织中，导致许多疾病的发生。
[0004]目前的研究证实，多种哺乳动物、啮齿类动物、禽类红细胞具有免疫粘附功能，但并未证实CRl是动物红细胞唯一的免疫粘附受体，也未见有特异性阻断这种免疫粘附的研究报告，更未从动物红细胞膜上获得过粘附受体并证明其蛋白质特性。猪作为我国饲养量最大的家畜和人类医学和生物医学工程领域最常用的模型动物，对猪红细胞CRl-1ike功能的研究，将有可能提高和改善猪养殖和疾病治疗的现状，并为其他动物红细胞免疫粘附的研究提供借鉴，也将为人类开展以CRl为靶点的疾病治疗和药物研发提供研究基础。
[0005]由于对猪红细胞CRl-1ike研究缺乏有效的试验工具，特别是抗猪红细胞CRl-1ike的特异性抗体，使得猪红细胞CRl-1ike研究进展较为缓慢。因此，提供一种抗猪红细胞CRl-1ike的单克隆抗体，对进一步研究猪红细胞CRl-1ike具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种分泌特异性识别猪红细胞CRl-1ike的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及上述杂交瘤细胞株分泌的抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体。
[0007]本发明提供了一株抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株命名为CR-MOl，于2014年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉市武昌珞珈武汉大学，邮编430072。保藏号为CCTCC N0:C201475。
[0008]本发明所述的杂交瘤细胞株是通过杂交瘤技术，以合成的多肽作为免疫原建立的。
[0009]本发明还提供了由所述杂交瘤细胞株CR-MOl分泌的抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体，所述单克隆抗体的亚型为IgGl。
[0010]所述单克隆抗体纯化后,经western blot和免疫突光染色,证明其能够特异性识别猪红细胞CRl-1ike蛋白。
[0011]进而，本发明所述抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体能够特异性的阻断猪红细胞的免疫粘附作用。
[0012]本发明提供的抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体的制备方法包括如下步骤:
I抗原制备
对GenBank登录的猪红细胞CRl-1ike基因进行分析，选取CDS区翻译出相应的蛋白质序列，分析蛋白质序列二级结构，获得以下抗原位点pep =NSFffSIPEGNCKRKT0将抗原位点合成多肽，多肽分别偶联KLH和BSA，其中KLH-pep用于小鼠免疫，BSA-pep用于ELISA后期筛选。
[0013]2动物免疫
以KLH-p印免疫Balb/c小鼠，ELISA检测血清效价大于10000的小鼠，融合前3天用免疫原50 μ g/只量腹腔注射待融合小鼠进行加强免疫。
[0014]3杂交瘤细胞制备
制备免疫脾细胞，与培养的骨髓瘤细胞进行冲击融合，采用HAT选择性培养基筛选出杂交瘤细胞，ELISA筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，克隆扩增冻存，同时对杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体进行亚型鉴定。
[0015]4单克隆抗体制备
取Balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml液体石腊1_2周后腹腔内接种杂交瘤细胞，小鼠腹部膨大后用注射器抽取腹水，用Protein-A亲和纯化，检测纯化抗体纯度、浓度及亲和力。用Western Blot和免疫荧光染色证明所制备单克隆抗体的特异性。
[0016]本发明所制备的杂交瘤细胞株CR-MOl及其分泌的单克隆抗体能够特异性的识别猪红细胞上的CRl-1ike蛋白，所获得单克隆抗体能够特异性的阻断猪红细胞对致敏乳胶颗粒的免疫粘附，在猪红细胞CRl-1ike的功能研究中具有很高的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体的SDS-PAGE。
[0018]图2是Western Blot分析抗猪红细胞CRl-like单克隆抗体与抗原的特异性结合图。
[0019]图3是免疫荧光染色分析抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体与抗原的特异性结合(显微镜放大倍数1000倍)。其中A为阴性对照，B为加单克隆抗体。
[0020]图4是抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体阻断猪红细胞的免疫粘附作用(显微镜放大倍数1000倍)，其中A加PBS，B加同型抗体，C加单克隆抗体。
【具体实施方式】
[0021]实施例1、杂交瘤细胞株CR-MOl的获得 I抗原的制备
对GenBank登录的猪红细胞CRl-1ike基因(Gene ID: 1640741)进行分析，选取CDS区，利用 Translate (http://web.expasy.0rg/translate/)翻译出相应的蛋白序列，Gene1us软件分析蛋白质的二级结构、亲疏水性、抗原性、跨膜区等，选择蛋白质二级结构弹性大、亲水性强、抗原性强、非跨膜区的位置；同时在NCBI上进行与同物种的同源性分析，避开同源性的区域，最终获得以下抗原位点P印=NSFffSIPEGNCKRKT0
[0022]采用美国ABI公司的多肽自动合成仪，以获得的抗原位点序列采用固相合成法合成多肽，合成程序按照ABI操作指南及Fmoc化学合成步骤。经过缩合一洗涤一去保护一中和洗涤一下一轮缩合等操作，直到完成所要求的序列，使用Kaiser方法对成肽过程中缩合反应程度进行定性监测。利用HPLC对合成的多肽进行纯化，LCMS检测多肽纯度，-80°C保存。
[0023]将合成的多肽分别与KLH和BSA用sulfo_GMBS法偶联。称量多肽，用0.05M PBS溶解，终浓度为6mg/ml，根据需求分装好多肽。将KLH和BSA以sulfo-GMBS溶解活化，将活化好的“载体蛋白-sulfo-GMBS”溶液滴加到上述多肽溶液中，以垂直混匀器在室温下旋转混匀3h (或4°C旋转过夜)。用DTNB分析液检测偶联前后自由巯基光吸收值的变化，偶联前OD413 —偶联后OD413 > 2.0，说明偶联成功，否则失败。根据活化后载体蛋白的浓量来确定偶联后“载体蛋白-多肽”的浓度。KLH-p印用于小鼠免疫，BSA-pep用于ELISA后期筛选。
[0024]2动物免疫
将KLH-p印按60 μ g/只小鼠的量，分别皮下初次免疫4只SPF Balb/c雌性小鼠，免疫间隔14d，初免后，加强4次，加强免疫每次剂量30 μ g/只，第4次加强后，眼眶采血分离血清，采用间接ELISA法测定免疫血清效价。
[0025]取20 μ g BSA-pep 1/2/3多肽溶解于1ml 0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ I/孔，4°C过夜。用含有0.05% Tween-20 PBS洗板3次，用1%BSA封闭液37°C封闭2h，使用0.05% Tween-20 PBS洗板3次，将小鼠免疫血清从200倍开始2倍梯度稀释，取100μ I加入96孔板，37°C孵育lh，0.05% Tween-20 PBS洗板3次后，加入100 μ I
I: 1000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG，37°C孵育lh，0.05% Tween-20 PBS洗板3次后，加入100 μ I TMB显色，室温避光15min，加50 μ I IM HCl终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值的比> 2.1为阳性来判断免疫血清效价。
[0026]取血清效价大于10000的小鼠，融合前3天，用免疫原50 μ g/只腹腔注射待融合小鼠进行加强免疫。
[0027]3细胞融合
将状态良好的SP2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中；小鼠摘眼球取血，拉颈处死，放入75%酒精中浸泡5min ;在平皿中倒入少量无血清MDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中，用剪刀和镊子取下小鼠脾脏放到细胞筛上，用注射器内芯轻轻充分碾碎，碾好的细胞吸入到装有SP2/0的离心管中，1500rad/min离心5min。用剪刀和镊子取下小鼠胸腺，碾碎，碾好的胸腺细胞加入到15ml离心管中，再加入1ml HAT,放在孵箱中备用。将离心好的细胞倒掉上清，用无血清MDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/min, 5min),弃上清，拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37°C温水中，在Imin内缓慢加入1ml PEG，加完后，温水中静置lmin。然后在2min内缓慢加入2ml的无血清IMDM,接着在2min内缓慢加入8ml的无血清IMDM。1000rad/min离心5min,弃上清,加入1ml血清，小心将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞，再加入25ml灭菌半固体培养基(含HAT)，充分混匀。均匀倒入30个细胞培养皿中，将细胞培养皿放入湿盒中于孵育箱中培养。
[0028]4筛选单克隆细胞
间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2~3次，直至100%细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体的杂交瘤细胞株I株，命名为CR-M01。
[0029]将克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。采用ELISA鉴定阳性杂交瘤细胞株所分泌单克隆抗体的亚型，单克隆抗体的亚型为IgGl。
[0030]实施例2、单克隆抗体的制备 I抗体的制备
取Balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷预处理I~2周，之后每只小鼠腹腔接种16个杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约I~2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
[0031]2抗体的纯化
用 Protein A/G 亲和柱(Pierce Protein A/G Magnetic Beads,货号:thermo 88802)纯化抗体。纯化步骤按照实际说明书进行如下操作:用偶联缓冲液以1: 3稀释腹水，配平，1000rpm 4°C离心20min，0.22Mm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质。用5~10倍柱体积的偶联缓冲液平衡预装亲和柱，保持流速为4滴/S。用注射器将样品注入柱子上端接口，收集流出液于50ml离心管中，保持流速为5s/滴。用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速为4滴/S。在对应所需中和液附近取几个值，加入EP管；滴加洗脱液到1.0ml，混匀后检测PH值。根据结果调整中和液的量，使中和结果pH为7.0。取5个EP管，根据中和液调试结果，按量分别加入中和液维持抗体生物活性，避免抗体失活。用5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱抗体，收集于上述EP管中。用5倍柱体积pH2.7洗脱缓冲液过柱，保持流速为4滴/S。用5~10柱体积G柱偶联缓冲液平衡柱子至pH7.0，保持流速为4滴/s。
[0032]实施例3、单克隆抗体的特性鉴定 I抗体的纯度测定
以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90%以上，如图1所示。
[0033]2抗体的浓度测定
采用Beyotime公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定单克隆抗体的浓度,亚型IgGl的抗体浓度为3.12mg/mL.
[0034]3抗体的效价测定
经ELISA测定，亚型IgGl的抗体效价为108。
[0035]4 抗体的 Western Blot 鉴定
提取猪红细胞的膜蛋白，经12% SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温下封闭2h，加入I: 1000稀释单克隆抗体，4°C孵育过夜，0.1% Tween-20的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗膜3次，每次1minJaAl: 10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育 Ih,0.1% Tween-20 的 Tris-HCl 缓冲液(ρΗ7.4)洗膜 3 次，每次 1min, ECL发光试剂盒显色后曝光。杂交瘤细胞制备的抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体出现单一的特异性条带，结果如图2所示。
[0036]5抗体的免疫荧光鉴定
采集猪新鲜血，加入等体积的PBS，然后将血液加入等体积的淋巴细胞分离液上层，1500rpm离心15min。用吸管吸取管底红细胞，加入3~4ml用细胞洗液(PBS，pH7.4，含2%胎牛血清)中，1500rpm离心5min，再用细胞洗液洗涤2次。将细胞100倍稀释后计数板计数，同时观察细胞形态。将红细胞稀释至I X 16个/ml，加入制备的抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体(I: 100稀释)，37°C孵育lh，以PBS (ρΗ7.4)为阴性对照。PBS (ρΗ7.4)洗涤细胞后，加入FITC标记羊抗鼠二抗(I: 1000)，37°C孵育lh，PBS (ρΗ7.4)洗涤细胞后，荧光显微镜下观察，经抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体染色的细胞观察到绿色荧光，如图3所示。结果证明杂交瘤细胞制备的抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体可识别天然猪红细胞CRl-1ike 蛋白。
[0037]实施例4、单克隆抗体阻断猪红细胞对乳胶颗粒的免疫粘附 I材料及试剂
乳胶颗粒(Invitrogen), BSA-Alexa Fluor? 488 (Invitrogen)JP^Kbuffer (0.1MMES)，激活 buffer (10mg/ml EDAC)，含 2%BSA 的偶联 buffer，2.5mM EDTA 溶液，30mM CaCl210mM MgCl2 溶液。
[0038]2 步骤
取乳胶颗粒(Beads)原液10 μ I,用偶联buffer重悬为1ml。将重悬的Beads与5 μ IBSA-Alexa Fluor? 488 混匀，立即调 pH 为 6.5。取 ρΗ6.5 的激活 buffer 50 μ 1，与上述悬液混匀，室温条件下，暗室反应15min, 1000rpm离心5min,弃上清。用含2% BSA的偶联buffer洗漆乳胶颗粒2次,PBS重悬beads。在悬液中加入适量人血清(含Ca、Mg离子),使血清终浓度为20%，对照血清加入足量的EDTA，同时置于37°C水浴中，致敏反应lOmin，反应结束后加入足量的EDTA终止补体反应，1000rpm离心5min，弃上清。用含2%BSA的偶联buffer洗涤乳胶颗粒2次，PBS重悬beads。将猪红细胞与抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体在37°C中预孵育15min，1200rpm离心5min，弃上清，PBS洗涤两次并重悬。将上述重悬的红细胞与致敏beads暗室反应15min，以加PBS和加同型抗体分别作为对照，1200rpm离心5min，弃上清，PBS洗涤三次，重悬后荧光显微镜观察。
[0039]结果如图4所示，抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体能够特异性的阻断猪红细胞对致敏乳胶颗粒的免疫粘附作用。
【权利要求】
1.抗猪红细胞CRl-1ike单克隆抗体杂交瘤细胞株CR-M01，保藏号CCTCCN0:C201475。
2.由保藏号CCTCCNO:C201475的杂交瘤细胞株CR-MOl分泌的单克隆抗体。
3.权利要求2所述单克隆抗体作为识别猪红细胞CRl-1ike检测试剂的应用。
4 .权利要求2所述单克隆抗体作为阻断猪红细胞CRl-1ike免疫粘附试剂的应用。
【文档编号】C12N5/20GK104164407SQ201410308534
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】李宏全, 姜俊兵, 马海利, 孙耀贵, 崔娇艳, 尹伟, 范阔海, 王治维, 孙娜, 赵昕 申请人:山西农业大学