专利名称：稀土杂多酸盐(蓝)类抗艾滋病药物及其制备方法
技术领域：
本发明属于化学合成药物领域，涉及到稀土杂多酸盐(蓝)类化合物。
背景技术：
自80年代发现首例艾滋病病例以来艾滋病在全球迅速蔓延，目前全球累计约有6000万的HIV感染/艾滋病患者，每天约有16000名新的感染者。这种疾病是由人类免疫缺陷为基本特征的一种传染病，艾滋病通过艾滋病毒在细胞内大量繁殖，破坏了CD4细胞，使细胞的免疫能力下降和丧失。美国FDA批准的核苷类药物(AZT)和蛋白酶抑制剂单独或联合使用，可以抑制病毒复制，部分地恢复了机体的免疫水平，延缓了病人的寿命，但是这些药物存在着价格昂贵，易产生耐药性，毒副作用较大。
杂多化合物地药物化学研究自七十年代初就有报道，八十年代中期，发现钨锑杂多化合物(NH4)17Na[NaSb9W21O86]·14H2O(HPA-23)[美国专利，4,759,929]，它能竞争性的抑制艾滋病毒的逆转录酶，作为抗AIDS药物被用作临床研究。后来发现它能产生严重的毒副作用而停止临床使用，90年代初发现Keggin结构杂多化合物具有一定的抗HIV-1活性，且毒性较低，例如K7[PTi2W10O40](Inouye Y.，Take Y.，TokutakeY.，Chem.Pharm.Bull.1990，38(1)285)。最近，美国的C.L.Hill报道含铌的杂多化合物(K7[P2W17(NbO2)O61]、K7[P2W17NbO62])能抑制艾滋病毒的蛋白酶。(Deborah A.Judd，James H.Nettles，Neysa Nevins，James P.Snyder，Dennis C.Liotta，Jordan Tang，JacquesErmolieff，Raymond F.Schinazi，Craig L.Hill.J.Am.Chem.Soc.2001，123，886-897.
迄今，在现有报道中没有含有通式Ax(H2O)x[AyLnz(H2O)2xClqXjTimMa12-mO40]·nOg(I)化合物作为有效成分在猴体内抗艾滋病方面的报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种抗病毒活性高、毒性低、价格低廉的抗艾滋病毒类的药物。
本发明的目的之二在于提供一种制备上述药物的方法。
本发明的目的是这样达到的
本发明的抗HIV-1药物是以通式Ax(H2O)x[AyLnz(H2O)2xClqXjTimMa12-mO40]·nOg所表示的具有Keggin结构的Mo或W系稀土杂多酸化合物。配原子通常是Mo或W。杂原子X通常是周期表中的p区或d区元素。杂原子X以四面体配位(XO4)与四个氧原子连接，配原子M以八面体配位与周围六个氧原子结合，三金属簇(M3O13)是构成杂多阴离子的一个重要的结构单元，在M3O13中，三个八面体共边相连，每个八面体公用边上的角顶氧原子被三个金属原子共用，Keggin结构中就是由这样四个三金属簇连接而成，每一个不同M3O13结构单元中的八面体共角连接。杂多蓝是杂多酸还原后得到的混合价态配合物。，Keggin结构杂多阴离子还原成杂多蓝后得到的电子进入不同的边共用三金属簇内，阴离子结构仍保持母体酸或盐结构，这种杂多化合物中的杂多阴离子具有如下一般特征
(1)阴离子结构为笼型，离子半径一般为5-30，分子量为1000-5000。
(2)多数可得粉未状固体，易溶于水及极性溶剂中。
(3)含有较多的结晶水。
(4)对酸碱稳定性较强，具有较强的抗碱解能力。
本发明的抗HIV-1药物的水溶液在pH＝2～8时化学性质是稳定的，其水溶液中的酸碱稳定性是依据电位滴定法测定的。
二水合钨酸钠(或钼酸钠)600克(1.82mol)、含IIIA-VA族或d区过渡元素的化合物0.86mol(例如磷酸二氢钠、硅酸钠等)溶解在2000克的蒸馏水中，滴加四氯化钛61克(0.32mol)后，回馏，过滤，向滤液中加入一定量(8.1mol)碱金属盐或氨基酸盐得白色沉淀物，沉淀物用500克热水重结晶，得到一定质量的固体AxXjTimMa12-mO40·nH2O。其中A为碱金属，氨基酸阳离子，X为周期表中IIIA-VA族，或d区过渡元素中的一种，M＝W或Mo，x＝1～6，j＝1，m＝1～3，n＝3-5.一定质量的AxXjTimM12-mO40·nH2O溶于500克水，加入一定量还原剂搅拌，再加入一定量稀土盐，在40～80℃下搅拌2～8小时，几天后析出固体Ax(H2O)x[AyLnz(H2O)2xClqXjTimMa12-mO40]·nOg。通常下，x＝1～6，y＝1～5，z＝0.5～1，q＝1，j＝1，m＝1～3，n＝1～5，a为M的化合价，一般为+6或+5价。
本发明用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物形式使用。
本发明所述的药用载体赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂，填料以及药物制品辅剂。本发明药物可经口服或注射(静脉注射、肌肉注射)两种形式给药。
该药物价格低廉、毒副作用低，对猴体内的SIV(猴免疫缺陷病毒)，细胞内的HIV有强烈的抑制病毒复制的作用。
为了更好地理解本发明的实质、下面将用本发明的通式(I)所包含的化合物K4(H2O)4[K3.5La0.5(H2O)8ClPTi2W10O40]·NH2OH(代号HPB-1)的药理作用结果为例，来说明本发明的实质，但本发明的内容并不局限于此。
(一)药效学实验
一.体外实验
采用三种细胞株(MT4、H9、PBMC)，分别感染HIV-1，观察HPB-1对HIV-1复制的抑制作用。
1.MT4细胞
方法
①实验在96孔培养板进行，于各孔加入100μL不同浓度HPB-1药液，每个浓度药液至少设两个孔，另取新鲜培养的MT4细胞，每毫升5×105，加HIV-1病毒1×103TCID50/mL，37℃、CO2培养箱内培养1.5-2.0小时，离心弃去上清，再用RPMI1640洗一次，去除游离的病毒，加入完全培养基到1ml，于96孔板每个加有药的孔中加入100μl此感染HIV-1的细胞(5×104/100μl)，37℃、CO2培养箱内培养，三天后换药，于孔中吸出100μl的上清，加入100μl与本孔相同浓度的药液，对照组加入100μl的培养基。第六天收集各孔取上清，采用Microelisa方法及试剂，测定P24抗原量。每次实验设病毒对照、细胞对照及AZT阳性药对照，根据所测P24抗原量下列公式计算抑制率。
不同浓度药液所得的不同抑制率，经统计处理，求得半数抑制量，体外实验即半数抑制浓度(IC50)
②HPB-1对MT4细胞毒性的检测
按上法于96孔板加入药液及正常细胞(未感染病毒)，三天后用MTT法测定细胞毒性，计算出半数毒性浓度(TC50)。
结果
六天抑制实验的半数抑制量(IC50)
浓度(μg/mL) 25 12.5 6.25 3.13
抑制率 92.587.6 62.5 34.3
半数抑制量(IC50)＝5.3μg/mL
半数毒性浓度(TC50)＝537μg/mL
2.H9细胞
实验在96孔培养板进行，每孔加入100μL不同浓度药液，每个浓度药液设两个孔，取新鲜培养的H9细胞，每毫升5×105，加HIV-1病毒1×103TCID50/mL，37℃、CO2培养箱内培养，两小时后离心弃去上清，再用RPMI 1640洗一次，去除游离的病毒，加入培养基到1ml，于96孔板每个加有药的孔中加入100μl感染HIV-1的细胞(5×105/100μl)，37℃、CO2培养箱内培养，第四天、第六天，每2天换药，于孔中吸出100μl的上清，加入100μl与本孔相同浓度的药液，对照组加入100μl的培养基。实验设病毒对照、细胞对照及AZT阳性药对照，每2天取上清，每孔取100μl，放-80℃保存，全部收集完测定RT，药物组与病毒对照组比较计算。
结果HPB-1抑制HIV-1在H9细胞内的复制(RT test)
时间(天)4 6 8
0.4mg/mL抑制率(％) 97.9 99.3 99.7
0.2mg/mL抑制率(％) 98.1 99.1 99.6
3.PBMC细胞
方法医院新鲜取得的PBMC，计数、离心1200rpm，弃去上清，配成3×106cell/mL，所用培养基应加入IL2(每毫升培养基加入1μl 1000单位的IL2)，37℃ 37℃过夜。)实验以5×106为一感染单位，HPB-1浓度为0.1mg/mL，相同浓度设两孔，病毒对照，细胞对照均各设两孔，24孔板每孔5×106细胞在0.5mL药液或培养基中(对照孔)，每孔加入4×104IU的HIV-1(NL4)病毒，吹打均匀，转入12孔板，再加入相同药液或培养基1.5mL，使总量为2mL，37℃培养，每3-4天取上清，每孔取100μl，放-80℃保存，全部收集完测定RT，药物组与病毒对照组比较计算。
结果HPB-1抑制HIV-1在PRMC细胞内的复制(RT test)
二.体内实验HPB-1对感染SIV的恒河猴体内药效学研究
受试药物1.HPB-1和AZT
实验动物实验用恒河猴，体重为4.5-5.5kg，雌雄各半，共16只。
饲料膨化饲料，恒河猴购自中国医学科学院实验动物研究所灵长类繁殖中心。
实验分组1.HPB-1低剂量治疗组(35mg/kg)
2.HPB-1中剂量治疗组(115mg/kg)
3.HPB-1高剂量治疗组(350mg/kg)
4.AZT治疗组(100mg/kg)
5.SIVmac251感染对照组
实验方法
1实验动物实验用恒河猴，4.5-5.5kg，雌雄各半，共16只，购自中国医学科学院实验动物研究所灵长类繁殖中心。用商品化膨化饲料饲养。实验前经体检无异常，经血清学间接免疫荧光(IFA)抗体检查法检查排除潜在的猴免疫缺陷病毒(SIV)，猴逆转录D型病毒(SRV)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-I)的感染。
2.感染毒株和剂量用美国Aaron Diamond艾滋病研究中心赠与的SIVmac251病毒株，每只动物用相当于3MID100病毒剂量的病毒液1ml静脉感染。
3实验治疗方案HPB-1和AZT胶囊均由中国预防医学科学院，病毒研究所提供，(HPB-1原料为东北师大化学系提供)。动物分HPB-1低剂量治疗组、HPB-1中剂量治疗组、HPB-1高剂量治疗组、AZT阳性药物治疗和SIVmac251感染对照组，每组动物3～4只，雌雄各半。病毒感染后30分钟开始口服给药，HPB-1低剂量组(每胶囊含35mg)每动物每日一次，每次1粒，中剂量组(每胶囊含115mg)每动物每日一次，一次1粒，高剂量组(每胶囊含350mg)每动物每日给药一次，每一次1粒，AZT阳性药物对照组每动物每日给药一次，每次100mg，SIVmac251感染对照组不给药治疗，药物治疗程为连续不间断给药60天。
4.感染前后观察感染前除一般体检外，称体重，采血(作感染前的各项指标检查)。感染和治疗继续做一般观察和检查，并按程序定时采血浆病毒滴度、血液中CD4+淋巴细胞数和抗体滴度。60天实验结束，处死动物。
5.血浆病毒分离动物感染SIVmac251后，选择第7、11、14、21、28、42、60天采取血样，肝素抗凝分离血浆，血浆分别从200μl开始以5倍递减量稀释于24孔板内，以10％小牛血清RPMI-1640补至每孔1ml，然后加入105个SIVmac251敏感细胞株CEMx174细胞液0.6ml，置37℃，CO2孵箱，每3～4天观察和细胞传代一次。以接种最小的标本仍然出现典型的细胞融合病变为标本的病毒滴度。标本观察3周判定病毒分离结果。
6.血液中CD4淋巴细胞数测定选择动物实验前和感染SIVmac251后第14、28、42、60天采取血样标本，计算出血液中CD4+含淋巴细胞的总数。
7.抗SIVmac251病毒抗体测定选择动物实验前和感染SIVmac251后第14、28、42、60天采取血样标本，测定血浆中抗SIVmac251病毒抗体的水平。
实验结果与分析
1.血浆病毒分离感染对照组动物从感染后7天开始4/4的动物血浆中分离到病毒，2周左右病毒滴度达到高峰，以后病毒血症水平逐渐降低，8周时仍有2/3的动物存在低水平的病毒血症(6至8周期间有1只动物死亡)，这符合SIVmac251的感染特征；而HPB-1低剂量组、HPB-1中剂量组、HPB-1高剂量组、AZT治疗组4组动物的病毒血症水平与感染对照组相比，均表现出了不同程度的抑制作用，主要表现在(1)在病毒感染后7天病毒血症出现时，4组动物病毒分离阳性率较感染对照组动物低，分别为2/3、1/3、0/3、1/3；(2)在病毒感染后2周病毒血症达到高峰时，4组动物的病毒血症平均水平明显低于病毒感染对照组动物，HPB-1高剂量组略高于AZT治疗组的病毒繁殖抑制水平；(3)病毒感染后1周至6周期间，4个治疗组动物的各采样点的病毒血症平均水平，低于病毒感染对照组动物相对应的时间点的病毒血症平均水平。
2.血液中CD4+淋巴细胞数测定感染对照组动物血液中CD4+淋巴细胞数在感染SIV病毒后至感染后4周期间有一个急剧的降低过程，4周以后逐渐稳定在一低水平上；4个药物治疗组动物血液中CD4+淋巴细胞数的变化规律与感染对照组动物基本相似，稍不同的是4个药物治疗组动物血液中CD4+淋巴细胞数与感染对照组动物相比较在感染SIV病毒膈感染4周期间下降速度相对较慢，此结果表明HPB-1和AZT治疗组与感染对照组相比由于病毒血症平均水平较低，所以降低了SIV感染所造成的细胞免疫损害。
3抗SIVmac251病毒抗体的测定，感染对照组动物感染后2周抗体开始出现并逐渐上升，于8周左右达到并维持在较高水平；HPB-1低剂量组、HPB-1中剂量组、HPB-1高剂量组、AZT治疗组4组动物的病毒特异抗体检测情况基本与感染对照组动物相同。
4.一般情况SIV病毒感染后两周后起，5组动物均有浅表淋巴结进行性肿大，这是猴SIV感染的主要临床表现之一，表明5组动物在临床上感染成功。一般精神和食欲尚可。HPB-1低剂量组、HPB-1中剂量组、HPB-1高剂量组、AZT治疗组4组动物未发生严重的感染并发症和死亡。
以上结果表明HPB-1口服后，可明显抑制病毒复制，其作用随剂量的增加而增大，高者可达96.3％。HPB-1恒河猴体内实验血浆病毒血症动态变化见图1，HPB-1，AZT恒河猴体内实验对SIV病毒抑制率的比较见图4
三.作用靶点的研究
病毒生活周期包括病毒进入细胞，逆转录酶，整合酶，转录，蛋白酶等阶段也即是药物作用的靶点。进入细胞的阶段，又包括病毒，CD4受体，CCR5辅助受体(M细胞)，CXCR4辅助受体(T细胞)几个部位。“鸡尾酒疗法”是采用作用于逆转录酶的靶点药物及作用于蛋白酶靶点的药物联合应用，因而大大提高了有效率，和延长寿命，从而了解药物作用的靶点十分重要。本实验应用病毒基因重组的“单一生活周期”(single life cycle)模型，研究HPB-1作用的靶点。此模型中感染后2-6小时是病毒进入细胞阶段，10-14小时为逆转录阶段，20小时以后是整合、转录、蛋白合成阶段。药物在何时间段产生作用，表明作用于何靶点。
1)HPB-1作用靶点分析
实验方法1)MAGI法实验用“单一生活周期”(single life cycle)的模型。用24孔板接种Hela-CD4+-LTR-X-Gel细胞0.4×105/孔，放置24小时，使之吸附，贴壁，第二天，吸去孔中上清，加入定量HIV(NL4)，不同时间(0，6，12，18，24，36小时)于不同孔各加入100μl不同浓度的HPB-1药液或阳性对照药液，培养基对照(Mock)，37℃、CO2培养箱，三小时后再加入200μl相同药液，37℃、CO2培养箱内培养48小时，收集上清以备检测，各孔吸去上清加入固定液1毫升，再以K4[Fe(CN)6]、K3[Fe(CN)6]及x-gel染色，显微镜下蓝色细胞表示带有病毒基因。根据每孔蓝色细胞数计算抑制率，
结果结果表明HPB-1主要作用于病毒进入细胞阶段(图5)
2)HPB-1作用于病毒进入细胞阶段中辅助受体作用部位的分析
病毒进入细胞与三个部位有关，即病毒的gp120蛋白，细胞膜上的CD4受体及辅助受体CCR5(嗜M细胞)及CXCR4(嗜T细胞)
实验方法
方法同上(MAGI test)但不同辅助受体所用细胞株及病毒则不同，CXCR4用的病毒株为NL4，细胞株为Hela-CD4-LTR-β-Galatosidase(嗜T)、CCR5用的病毒为YU2细胞株为293T(嗜M)，48小时后同法检测结果。
结果对两种辅助受体均有抑制作用(如下表)
结果HPB-1对辅助受体的作用对两种辅助受体均有抑制作用，说明不一定对辅助受体本身有作用，而可能作用于CD4或病毒脱壳等，有待进一步分析。
浓度(mg/mL) 辅助受体 细胞株、病毒 抑制率(％)
0.4 CCR5 293T、YU2 98.6
0.04 98.3
0.004 97.3
浓度(mg/mL) 辅助受体 细胞株、病毒 抑制率(％)
0.499.7
Hela-CD4-LTR-X-Gel、
0.04 CXC4 99.2
NL4
0.004 91.0
(二)急性毒性实验
将30只昆明系小白鼠，体重20±2g种，雌雄各半，随机分成3组，每组10只(雌雄各半)，一次灌胃观察一周后死亡情况，结果表明最大耐受剂量为1500mg/kg，绝对致死量为4000mg/kg。半数致死量LD50为2254mg/kg，LD50可信限范围2425～2094mg/Kg。
下面结合实施例进一步对本发明实质内容进行说明
实施例1HPB-1的制备
二水合钨酸钠(600克，1.82mol)，磷酸二氢钠(120克，0.86mol)溶在2000克蒸馏水中，滴加四氯化钛(61克，0.32mol)，回馏20分钟，过滤，向滤液中加入600克固体KCl得白色沉淀物。沉淀物用500克热水重结晶，得到固体K7PTi2W10O40·5H2O66克，K7PTi2W10O40·5H2O66克溶于500克水，加入11克盐酸羟胺搅拌，再加入11克氯化镧，40～80℃搅拌2～8小时，几天后析出无色晶体K4(H2O)4[K3.5La0.5(H2O)8ClPTi2W10O40]·NH2OH。分子结构图见附图1。HPB-1生产流程图见附图2。
实施例2HPB-2的制备
按上述实施例1的方法制备K7PTi2W10O40·5H2O，K7PTi2W10O40·5H2O66克溶于500克水，加入9克水合肼搅拌，再加入12克氯化钕，40～80℃搅拌2-8小时。几天后析出紫色晶体K4(H2O)4[K3.5Nd0.5(H2O)8ClPTi2W10O40]·NH2NH2(HPB-2)80g。
以上实施例1、2的制备方法可按配方的质量比任意放大或缩小。
将所合成的HPB-1，HPB-2与赋形剂可重量比1∶3比例，制成胶囊。按其与赋形剂重量比1∶3比例，制成压片。按常规注射液制法加注射用水，过滤，灌封灭菌制成注射液。
附图1为HPB-1的分子结构。
附图2为HPB-1生产流程图。
附图3 HPB-1恒河猴体内实验血浆病毒血症动态变化(TCID/mL)示意图。
附图4 HPB-1，AZT恒河猴体内实验对SIV病毒抑制率的比较示意图。
附图5感染后加入HPB-1后的时间响应示意图。
权利要求
1.稀土杂多酸盐(蓝)类抗艾滋病药物，其特征是通式为Ax(H2O)x[AyLnz(H2O)2xClqXjTimMa12-mO40]·nOg，其中A为碱金属，氨基酸阳离子，X为周期表中IIIA-VA族或d区过渡元素中的一种，M为Mo或W，Ln为La、Pr、Nd和Sm，Og为羟胺或肼。通常下，x＝1～6，y＝1～5，z＝0.5～1，q＝1，j＝1，m-1～3，n＝1～5，a为M的化合价，一般为+6或+5价。
2.如权利要求1所述稀土杂多酸盐(蓝)类抗艾滋病药物，其特征是所述的Ax(H2O)x[AyLnz(H2O)2xClqXjTimMa12-mO40]·nOg为K4(H2O)4[K3.5La0.5(H2O)8ClPTi2W10O40]·NH2OH或K4(H2O)4[K3.5Nd0.5(H2O)8ClPTi2W10O40]·NH2NH2。
(1).稀土杂多酸盐(蓝)类抗艾滋病药物的制备方法，其特征是将二水合钨酸钠(或钼酸钠)600克(1.82mol)、含IIIA-VA族或d区过渡元素的化合物0.86mol(例如磷酸二氢钠、硅酸钠等)溶解在2000克的蒸馏水中，滴加四氯化钛61克(0.32mol)后，回馏，过滤，向滤液中加入一定量(8.1mol)碱金属盐或氨基酸盐得白色沉淀物，沉淀物用500克热水重结晶，得到一定质量的固体AxXjTimMa12-mO40·nH2O。其中A为碱金属，氨基酸阳离子，X为周期表中IIIA-VA族，或d区过渡元素中的一种，M＝W或Mo，x＝1～6，j＝1，m＝1～3，n＝3-5.一定质量的AxXjTimM12-mO40·nH2O溶于500克水，加入一定量还原剂搅拌，再加入一定量稀土盐，在40～80℃下搅拌2～8小时，几天后析出固体Ax(H2O)x[AyLnz(H2O)2xClqXjTimMa12-mO40]·nOg。
(2).如权利要求(1)所述的稀土杂多酸盐(蓝)类抗艾滋病药物的制备方法，其特征是将二水合钨酸钠(600克，1.82mol)，磷酸二氢钠(120克，0.86mol)溶在2000克蒸馏水中，滴加四氯化钛(61克，0.32mol)，回馏20分钟，过滤，向滤液中加入600克固体KCl得白色沉淀物。沉淀物用500克热水重结晶，得到固体K7PTi2W10O40·5H2O66克，K7PTi2W10O40·5H2O(66克)溶于500克水，加入11克盐酸羟胺搅拌，再加入11克氯化镧，40～80℃搅拌2～8小时，几天后析出固体K4(H2O)4[K3.5La0.5(H2O)8ClPTi2W10O40]·NH2OH。
3.如权利要求(1)所述的稀土杂多酸盐(蓝)类抗艾滋病药物的制备方法，其特征是将二水合钨酸钠(600克，1.82mol)，磷酸二氢钠(120克，0.86mol)溶在2000克蒸馏水中，滴加四氯化钛(61克，0.32mol)，回馏20分钟，过滤，向滤液中加入600克固体KCl得白色沉淀物，沉淀物用500克热水重结晶，得到固体K7PTi2W10O40·5H2O66克，K7PTi2W10O40·5H2O66克溶于500克水，加入9克水合肼搅拌，再加入11克氯化钕，40～80℃搅拌2～8小时，几天后析出固体K4(H2O)4[K3.5Nd0.5(H2O)8ClPTi2W10O40]·NH2NH2。
全文摘要
本发明属于化学合成药物领域，发明了一类稀土杂多酸盐(蓝)类抗艾滋病的药物，其通式为Ax(H2O)x[AyLnz(H2O)2xClqXjTimMa12－mO40]·nOg。特别是K4(H2O)4[K3.5La0.5(H2O)8ClPTi2W10O40]·NH2OH(代号HPB－1)，该药物价格低廉、毒副作用低，对HIV感染的细胞，SIV(急性猴免疫缺陷病毒)有强烈的抑制病毒复制的作用。
文档编号A61P31/00GK1502339SQ0212844
公开日2004年6月9日 申请日期2002年7月31日 优先权日2002年7月31日
发明者王恩波, 李泽琳, 韩正波, 曾毅, 刘术侠 申请人:东北师范大学, 病毒病预防控制所