专利名称：：一种三萜类抗艾滋病药物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有新化学结构的一种三萜类化合物3(3-羟基羽扇-20(29)-烯3-O-3',3'-二甲基丁二酸单酯，用于制造抗艾滋病药物。
背景技术：
：艾滋病是"获得性免疫缺陷综合征"(AcquiredImmunodeficiencySyndrome,AIDS),它是由艾滋病病毒，即"人类免疫缺陷病毒"(HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)感染而引起的一种严重危害人类健康并产生严重社会问题的传染性重大疾病，是至今仍无法治愈的恶性传染病。迄今全球的HIV感染者已超过7000万，已有3000多万人死于艾滋病。在我国HIV感染者已超过80万，其流行已经进入快速传播阶段，蔓延形势非常严峻。如果得不到有效控制，将会对我国的社会稳定和经济发展产生严重影响。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)，即逆转录酶抑制剂组合，或者逆转录酶抑制剂加蛋白酶抑制剂组合，联合给药治疗的方法，是目前最有效的病因治疗方法。长期治疗能够使大多数患者达到血浆中测不到病毒的疗效。应用HAART组合的化学药物，对控制病死率、延长生命和减少HIV传播起到了重要作用。但这些药物只能杀灭血中游离存在的病毒，无法淸除已经整合在基因内的病毒；部分患者(如合并结核病的患者)不适宜HAART的联合药物治疗；在治疗过程中病毒因基因突变又有可能产生耐药性，在临床治疗中已经发现对目前所有抗病毒药物均表现抗性的"超级毒株"。此外，多种化学药物联合给药，用量大，毒副作用明显，病人依从性差，再加上药费昂贵等因素，都限制了HAART的应用。新型抗HIV剂的研究开发一直是国内外医药界工作的热点。生物多样性使得动物、植物、微生物以及海洋生物产生结构类型极其丰富的次生代谢产物，从中发掘出数量和结构种类极其丰富的天然产物或药物先导化合物，天然产物是现代新药发现的重要来源。在抗HIV/AIDS天然药物中，一些植物来源的药物活性天然产物对HIV复制的不同阶段能产生抑制作用[DeClercqE.(2000)Currentleadnaturalproductsforthechemotherapyofhumanimmunodeficiencyvirus(HIV)infection.Med.Res.Rev.,20(5):323-349]。某些天然三萜的半合成衍生物可以成为高效抗艾滋病病毒药物先导化合物。例如，白桦脂酸(Betulinicacid)存在于白桦属(Betula)植物和其他多种植物中。白桦脂酸衍生物，尤其是特定结构的二羧酸单酯(或称半酯)往往表现出比原型更强的抗HIV作用。美国学者的研究表明，白桦脂酸抑制HIV复制的半数有效浓度与治疗指数分别为EC5Q=1.4pM和TI=9.3，在C-3位结构修饰后，可获得3-0-(3',3'-dimethylsuccinyl)-betulinicacid(TI>20000，比白桦脂酸强2150倍)、3-0-(3',3，-dimethylglutaryl)-dihydrobetulinicacid(TI〉14000)等高活性的三砲衍生物[Sun，IC,WangHK,KashiwadaY'Shen，JK,CosentinoLM,ChenCH，YangLM，LeeKH.(1998)AntiAIDSagents.34Synthesisandstructure—activityrelationshipsofbetulinderivativesasantiHIVagents[J].JMedChem,41(23):4648-4657]。
发明内容本发明的目的是提供了一种与己知抗艾滋病药物的化学结构均不相同的具有特定三萜类化合物结构的新药3p-羟基羽扇-20(29)-烯3-0-3，,3，-二甲基丁二酸单酯，具有结构式I所示的化学结构；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>结构式I所述的化合物首次公开了新三萜类化合物3P-羟基羽扇-20(29)-烯3-O-3，,3'-二甲基丁二酸单酯拥有的显著抑制艾滋病病毒复制作用。所述的三萜类化合物3|3-羟基羽扇-20(;29)-烯3-0-3',3'-二甲基丁二酸单酯有较强的体外抗HIV-1作用，在H9细胞上对HIV-1复制的半数抑制浓度是0.04pM，治疗指数达到2375。所述的具有新三萜类化合物3(3-羟基羽扇-20(29)-烯3-O-3，，3，-二甲基丁二酸单酯具有显著抑制艾滋病病毒复制作用的，可以作为活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。本发明所述的三萜类化合物3(3-羟基羽扇-20(29)-烯3-0-3'，3'-二甲基丁二酸单酯具有新化学结构，可制成药物制剂，用来治疗HIV-1感染者和艾滋病患者。图1是本发明所说的两种具有体外强效抗HIV-1病毒作用的三萜类化合物的结构式具体实施例方式以下通过附图和实施例对本发明的内容作进一步的详述本领域技术人员能够了解本发明新三萜类化合物3p-羟基羽扇-20(29)-烯3-O-3，,3，-二甲基丁二酸单酯的获取方法及其药理作用；但是这些实施例不得理解为对本发明权利要求的限制。实施例1活性前体化合物的制备方法，取味牛膝5VrwM朋f/^/o/re幼7药材10Kg，用95%的工业酒精室温提取3次，每次48小吋，提取液合并后经减压浓縮得干浸膏700g。浸膏用80%的甲醇搅拌处理，出现大量沉淀，沉淀经过过滤干躁，得量200g。上述上清液用石油醚萃取3次，得石油醚部分20g。上述萃取后的母液经除去大部分甲醇后加少量水成悬浮液，依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各部分经减弱浓縮后得量分别为氯仿部位50g、乙酸乙酯部位15g、正丁醇60g和水溶部位200g。将沉淀部分180g上硅胶柱(100-200目，3Kg)，用石油醚-丙酮梯度洗脱(98:2-4:1，体积比)，用TLC指导洗出馏分的合并，得到Fi-F7共7个部位。FK150g)经TLC发现会有一个主成分，经重结晶得纯净物HBS-0821,经质谱和核磁共振光谱测定确定为三萜类化合物Lupeol。Lupeol，编号HBS-0821，白色针状结晶，易溶于氯仿，熔点215°C。[a]D+26.8(c0.2,CHC13)。分子式为C30H50O。ESI-MSm/z:425.1[M陽H].;工HNMR(400MHz，CDC13)S:4'67(1H,s,H-29a),4.56(1H,s，H-29b),3.15(1H,dd,J=8.2,4.5Hz,H-3)，2.36(1H，m，H-19),1.80(1H,m，H-29),1.60(3H,s，H-30),1.05(3H,s,H-26),0.98(3H,s，H-27),0.95(3H，s,H-24),0.80(3H，s,H-23),0.78(3H,s,H-25),0.75(3H,s,H-28)。13C-NMR(125MHzinCDC13)S.:38.7(C-1),27.4(C-2),78.8(C-3)，38.8(C-4),55.2(C-5),18.3(C-6),34.2(C-7),40.8(C誦8)，50.4(C-9),37.2(C-10),20.9(C-ll),25.0(C-12),38.1(C-13),42.5(C-14),27.5(C-15)，35.6(C-16)，43.0(C-17),48.5(C-18),48.0(C-19),151.0(C-20),29.9(C-21),40.0(C-22),28.0(C-23),15.5(C-24),16.2(C-25),16.0(C-26),14.5(C-27),18.1(C-28),109.5(C-29),19.5(C-30)。实施例2化合物HBS-0827制备在lOOmL圆底烧瓶中加入214.9mg(0.50mmol)Lupeol、107.2mg(0.51mmol)阿魏酸、105.1mg(0.51mmol)DCC、14.2mg(0.12mmol)DMAP和15mL二氯甲烷，在室温下搅拌48h。反应液浓縮，经硅胶柱层析，用石油醚-丙酮(4:1)(体积比)洗脱，蒸除溶剂，得白色固体278.8mg，收率为89.61%。化合物HBS-0827-3A制备」〈O在100mL三口烧瓶中加入1067.0mg(2.5mmo)Lupeol，30mL二氯甲烷，搅拌下滴入326.7mg(2.55mmo1)的2,2-甲基丁二酸酐和20mL二氯甲垸的溶液，滴完后，在室温下搅拌72h。反应液浓縮，柱层析(硅胶200~300目，洗脱剂石油醚-丙酮(4:l)(体积比)洗脱，减压蒸除溶剂，得白色固体1378.1mg，产率为94.15%。化合物的结构确定红外光谱用美国ANALECTRFX65A型光谱仪测定；质谱用QP5000质谱仪或美国API2000LC/MS/MS系统测定；核磁共振谱用德国-瑞士Bruker公司的DRX-400型400兆超导核磁共振仪测定，TMS做内标。HBS-0827，无色晶体，熔点112°C，[a]D+102.5(c=0.05inCHC13)，分子式C40H58O4;ESI-MSm/z:601[M-H]-，'HNMR(400MHz'CDC13)5:7.48(IH，d，J=10,8,H-l'),7.05(IH,d,J=1.2Hz，H-2,苯环)，7.00(IH,dd,J=6.4,1.2Hz,H-6，苯环)，6.75(1H，d,J=6.4Hz,H-5,苯环)，6.27(IH，d,J=10.8Hz，H-2')，3.70(3H,s,3-OCH3,苯环)，4.68(1H,s,H-29a),4.55(IH,s，H-29b),4.59(IH,dd，J=8.5，4.5Hz,H-3),1.06(3H，s,H-26)，0.98(3H，s，H-27)，0.96(3H，s,H-24),0.82(3H,s，H-23),0.79(3H,s，H-25),0.77(3H,s,H-28)。HBS-0827-3A,无色晶体，熔点258。C。[a]D+40.8(c0.5inCHC13)。分子式C30H48O4。ESI-MS，m/z:553[M-H]-,一MR(400MHz，CDC13)S:2.85，2.90(eachIH,d,J=15.5Hz,-CH2-，acylgroup),1.50(6H,s,-CH3x2，acylgroup),4.66(IH,s,H-29a),4.59(IH,s,H-29b),4.49(IH,dd,J=8.2，4.5Hz,H-3),1.56(3H,s,H-30),1.12(3H,s,H-26),0.%(3H，s，H-27),0.99(3H，s,H-24),0.82(3H,s,H-23),0.79(3H，s,H-25),0.78(3H,s,H-28)。13C-NMR(125Hz,CDC13):171.0(C-l'),45.0(C-2')，40.9(C-3')，179.5(C-4'),25.5and26.0(CH3x2,acylgroup),38.6(C-1),23.4(C-2),81.1(C-3),37.8(C-4),55.1(C-5)，18.3(C-6),34.4(C-7),40.6(C-8),50.4(C-9),37.0(C-IO)，20.6(C-ll)，25.0(C-12),38.4(C-13)，42.8(C-14),27.7(C-15),35.4(C-16),43.0(C-17),48.7(C-18),48.0(C-19)，150.8(C-20),29.7(C-21),40.2(C-22),28.2(C-23),15.8(C-24),16.0(C-25),16.1(C-26),14.7(C-27),18.3(C-28),109.0(C-29),19.6(C-30)。实施例3三萜类化合物的体外抗艾滋病病毒作用待测试活性的药物3p-羟基羽扇-20(29)-烯3-0-4-羟基-3-甲氧基肉桂酸单酯(HSB-0827)3p-羟基羽扇-20(29)-烯3-0-3',3，-二甲基丁二酸单酯(HSB-0827-3A)测定方法样品对HIV-1抑制作用的体外评价试验，是在美国国立卫生研究院(NIH)肿瘤研究所(NCI)按照其常规方法进行的。实验中使用H9T淋巴细胞，在含10%胎牛血清、加有L-谷氨酸的完全培养基RPMI1640中，于5%0)2，37。C下连续传代培养。取对数生长期的细胞用于本实验。待测药品先溶解于二甲基亚砜，用培养基稀释成为以下常用的最终浓度100，20，4,和0.8|ig/mL，高活性药物样品则进一步稀释。最终得到一个准确的对病毒的半数抑制浓度ICso。样品备齐时，取H9细胞用HIV-1(IIIB型分离株)感染，同时另取H9细胞以培养基模拟感染(设为病毒阴性对照组)，用于测定样品对细胞的毒性(IC5(j)。研究用病毒一般应达到10"IU(感染单位)/mL的TCID5o值。将感染毒力相当于每细胞O.l至0.01IU的适量病毒加入第1组细胞；另1组只加培养基的细胞用与感染组相同的条件孵育。在37。C和5%C02孵育4h后，两组细胞均用新鲜培养基洗3次，加到含有不同浓度药物或培养基的24-孔板中(形成阳性感染对照或阴性药物对照)，每次测试均用齐多夫定AZT作为阳性药物对照。将板在37°C,5%C02下孵育4天。在第4天收集不含细胞的培养基上清，用ELISA法测定病毒的p24抗原。p24是HIV的核心抗原，其存在可间接地指示病毒在细胞上清中的存在。用Coulter计数器在没有被病毒感染的H9细胞上测定各种样品的毒性。实验结果用如下术语描述TC5Q，是指测试样品对H9细胞产生50%毒性时的浓度；IC50，是指测试样品抑制50%病毒时的浓度；治疗指数(TI)，TI=TC5Q/IC50。测定结果见表2。表2三萜样品及阳性药物在H9细胞上对HIV-1抑制作用试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结论新化合物HSB-0827-3A即3p-羟基羽扇-20(29)-烯3-0-3，,3'-二甲基丁二酸单酯有很强的体外抗HIV-1作用，治疗指数达到2375，有可能发展成为天然来源的抗HIV-1药物。权利要求1.一种三萜类抗艾滋病药物，其特征在于所述的三萜类化合物是3β-羟基羽扇-20(29)-烯3-O-3’，3’-二甲基丁二酸单酯，英文名是3-O-(3’，3’-dimethylsuccinyl)-lupeol，具有结构式I所示的化学结构；结构式I2.根据权利要求1所述的一种三萜类抗艾滋病药物，其特征在于所述的三萜类化合物3卩-羟基羽扇-20(29)-烯3-0-3',3，-二甲基丁二酸单酯有较强的体外抗HIV-1作用，在H9细胞上对HIV-1复制的半数抑制浓度是0.04^M，治疗指数达到2375。3.根据权利要求1所述的一种三萜类抗艾滋病药物，其特征在于所制备的抗艾滋病药物是以所述三萜类化合物3P-羟基羽扇-20(29)-烯3-0-3'，3'-二甲基丁二酸单酯作为药物活性成分，制成的片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等任何一种药剂学上可接受的剂型。全文摘要本发明公开了一种具有抗艾滋病病毒HIV-1作用的天然药物。该药物为三萜类化合物，可制成药物制剂，用来治疗HIV-1感染者和艾滋病患者。文档编号A61K31/56GK101366719SQ20081019901公开日2009年2月18日申请日期2008年10月9日优先权日2008年10月9日发明者邱声祥申请人:中国科学院华南植物园