用于治疗骨病的抗原阵列的制作方法

专利名称：用于治疗骨病的抗原阵列的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种组成物，其包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列，特别是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽阵列。更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含一种病毒样颗粒和至少一个与之结合的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽。本发明也提供一种分别生产该偶联物和有序、重复阵列的方法。本发明的组成物可用于生产治疗骨病的疫苗，作为预防或治疗骨病、有效地诱导免疫应答特别是抗体应答的药物疫苗(pharmaccine)。而且，本发明的组成物尤其可用于在所述范围内有效诱导自身特异性免疫应答。
相关技术活的骨通过平衡协同的重建(remodeling)过程持续更新。主要有两种类型细胞参与了这种重建成骨细胞是骨形成所必需的，而破骨细胞促进骨基质的分解和羟基磷灰石的溶解。在骨生长的年轻个体中，骨形成的速度超过骨吸收的速度，而在老年个体中，吸收速度可以超过形成速度，从而导致骨矿物质密度和/或骨质量的净损失。在后一种情况下，骨强度减弱，导致骨折的危险增加，并且使断裂的骨修复缓慢或不完全。对于人类，已知多种疾病与骨重建的不平衡有关。
最近报道了3种蛋白质，它们关键性地参与由造血前体细胞形成破骨细胞和骨重建的调节。RANKL(NFκB配体的受体激活剂)，也被称为TNFSF11(肿瘤坏死因子超家族成员11)、TRANCE(TNF相关激活诱导的细胞因子)、ODF(破骨细胞分化因子)或OPGL(护骨素(osteoprotegerin)配体)，是一种形成同型三聚体的245个氨基酸的跨膜蛋白质。TACE样蛋白酶能够释放RANKL的胞外区部分。另外，也报道了缺乏跨膜区的剪接变体。释放的RANKL部分含有与TNF-α高度同源的结构域(Lum，L.等人，J.Biol.Chem.27413613-13618(2000))。
如何生产RANKL蛋白和RANKL片段的方法在WO9846751、US5,843,678、WO98259958、US6,242,586、WO9828426、US6,242,213、WO9929865、JP2000102390和WO0015807中公开。
RANKL与破骨细胞上被称为RANK(NFκB的受体激活剂)的跨膜分子相互作用。这种相互作用导致破骨细胞前体激活，最后形成活性骨吸收性破骨细胞。在体内，一种被称为护骨素的可溶性诱饵受体(decoy receptor)，通过其结合RANKL并抑制RANKL与其受体RANK相互作用的能力，参与破骨细胞生成(osteoclastogenesis)的调节。这种抑制导致破骨细胞生成的抑制，从而提供了一种停止过度骨吸收的途径。重组护骨素和可溶性RANK-Fc融合蛋白能够抑制RANKL与其受体RANK的相互作用。根据这些发现，RANKL缺陷小鼠和RANK缺陷小鼠发展为骨硬化症，而过量表达RANKL的转基因小鼠以及护骨素缺陷的小鼠发展为骨质疏松症(Kong YY.等人，Nature397315-322(1999)，Kim，N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA9710905-10910(2000)，Dougall，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA971566-1571(1999)，Bucay，N.等人，Genes Dev.121260-1268(1998))。
RANKL-RANK-护骨素系统的重要性在雌激素缺陷诱导的啮齿动物骨质疏松模型上进一步得到证实。重组护骨素完全消除卵巢切除术诱发的骨损失(Simonet，W.S.等人，Cell 89309-319(1997))。
在佐剂诱导的关节炎模型上，注射护骨素能够防止骨损失和软骨破坏，但是不能防止炎症(爪肿胀)。除了在基质细胞上表达以外，RANKL还在T细胞上表达，RANK被发现于抗原呈递细胞之上。假设在关节炎反应过程中，RANKL表达增强的激活的T细胞介导破骨细胞生成增加和随后的骨损失。RANKL与RANK的相互作用也增加树突状细胞的寿命和辅助性质(Kong Y.Y.等人，Nature 402304-309(1999))。
在牙周感染后发现牙槽骨破坏以及随后的牙丧失。护骨素对RANKL功能的体内抑制减少了微生物攻击后的牙槽骨破坏并且减少了牙周破骨细胞的数量(Teng，Y.T.A.等人，J.Clin.Invest.106R59-R67(2000))。
骨肿瘤和某些转移肿瘤的特征在于，由于破骨细胞生成增加从而骨吸收增加(Hofbauer，L.C.和Heufelder A.E.，J.Clin.Endocrin.Met.852355-2363(2000))。已经表明护骨素抑制前列腺癌诱导的破骨细胞生成，并且防止前列腺肿瘤在小鼠骨中的生长(Zhang Y.等人，J.Clin.Invest.1071219-1220(2001))。在小鼠中也减弱晚期骨癌的疼痛(LugerN.M.等人，Cancer Res.614038-4047(2001))。有多种骨髓瘤是B细胞恶性肿瘤，其特征在于骨髓中浆细胞的积累和溶骨性骨病的发展。在小鼠多发性骨髓瘤模型上，注射护骨素或RANK-Fc融合蛋白防止了溶解性骨损伤的发展并干扰骨髓瘤的进展(Pearse RN.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9811581-11586(2001))。
植入假体无菌性松动的病因学关键是骨-植入物界面处假体周围的骨质溶解，这是由磨损碎屑诱发的炎症引起的。在小鼠模型上，护骨素转染的成纤维细胞样滑膜细胞能够防止磨损碎屑诱发的破骨细胞生成(Gouter J.J.等人，J.Orthop.Res.202169-173(2002))。
在骨质疏松患者群体中，发现高临床发病率的血管钙化。护骨素缺陷小鼠显示动脉钙化，这种钙化能够被重组护骨素逆转，这一发现证实了RANKL-RANK-护骨素系统的参与(Min，H.等人，J.Exp.Med.192463-474(2000))。
所有这些发现都证实了在多种病理性状态中，RANKL-RANK-护骨素系统在调节骨吸收中的极度重要性。迄今为止，主要通过注射重组护骨素或RANK-Fc融合蛋白抑制骨损失。在理论上，以RANKL免疫动物应当能够产生RANKL特异的抗体，该抗体通过与RANK结合位点结合或空间抑制，应能干扰破骨细胞生成。
然而，迄今为止还没有报告用RANKL蛋白或肽接种。而且，也没有关于疫苗可能在针对骨病的保护方面有效的证据，具体而言，因为通过常规接种通常难以诱发对自体分子的抗体应答。
提高接种效率的一种方法是提高所使用的抗原的重复程度。与分离的蛋白质不同，在不使用任何佐剂、有及没有T细胞辅助的情况下，病毒均能诱发快速、有效的免疫应答(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1991))。尽管病毒通常几乎不含蛋白质，但它们比其分离成分能引发更强的免疫应答。对于B细胞应答，众所周知病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和顺序。许多病毒展示一种准晶体表面，其表面显示规则的表位阵列，其可高效交联B细胞上表位特异的免疫球蛋白(Bachmann和Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是一种强激活信号，直接诱导细胞周期的进展和IgM抗体的产生。进而，这些触发的B细胞能够激活T辅助细胞，T辅助细胞随后诱导B细胞从产生IgM抗体向产生IgG抗体转换，并产生长期B细胞记忆—这是所有接种的目标(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。病毒结构甚至与自身免疫病中抗抗体的产生有关，并且作为对病原体的自然应答的一部分(参见Fehr，T.等人，J Exp.Med.1851785-1792(1997))。因此，高度组织的病毒表面呈递的抗体能够诱发强烈的抗抗体应答。
然而，如上所述，免疫系统通常不能产生抗自身来源结构的抗体。对于低浓度存在的可溶性抗原，这是由于Th细胞水平上的耐受。在这些条件下，将自身抗原与一种能够输送T辅助细胞的载体偶联可以打破这种耐受。B和Th细胞可以耐受高浓度存在的可溶性蛋白质或低浓度的膜蛋白。然而，B细胞耐受是可逆转的(无反应性)，施用与外源载体偶联的高度组织形式的抗原能够打破这种耐受(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。
发明概述我们现在发现，与具有固有重复组织结构的核心颗粒结合、在这里具体地分别与病毒样颗粒(VLP)和VLP亚单位结合的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，产生高度有序、重复的偶联物，构成诱导RANKL特异抗体的强免疫原。这些抗体分别能够阻断和中和RANKL与其受体RANK的相互作用。因此，本发明提供一种治疗骨病的治疗方法，它基于有序、重复的RANKL-核心颗粒阵列，特别是VLP-RANKL-偶联物和阵列。这种治疗剂在接种的动物中能够诱导高滴度的抗RANKL抗体。
本发明因此提供一种组成物，其包含(a)含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；和(b)含有至少一个第二附着位点的至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，其中所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇中非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中自然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；其中所述抗原或抗原决定簇和所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。适用于本发明的核心颗粒的优选实施方案有病毒、病毒样颗粒、噬菌体、细菌菌毛或鞭毛，或具有固有重复结构、能够形成本发明有序、重复抗原阵列的其它任何核心颗粒。
更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列，特别是RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽-VLP偶联物。更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含病毒样颗粒和与之结合的至少一个(一种)RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽。本发明也提供一种分别生产该偶联物和有序、重复阵列的方法。本发明的组成物可用于生产治疗骨病的疫苗，作为预防或治疗骨病、以及有效诱发免疫应答特别是抗体应答的药物疫苗(pharmaccine)。而且，在所述情形下本发明的组成物尤其可用于有效诱发自身特异性的免疫应答。
在本发明中，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽一般以定向方式分别与核心颗粒和VLP结合，产生有序、重复的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽抗原阵列。而且，核心颗粒和VLP的高度重复、组织的结构分别介导RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽以高度有序、重复的方式展示，产生高度组织、重复的抗原阵列。此外，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与核心颗粒和VLP的结合提供T辅助细胞表位，因为对于分别用核心颗粒-RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽阵列和VLP-RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽阵列免疫的宿主而言，核心颗粒和VLP是外源的。这些阵列在其高度组织结构、大小和阵列表面的抗原重复性方面不同于现有技术的偶联物。
本发明的一个方面，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽在允许RANKL蛋白或RANKL片段的正确折叠的适当表达宿主中表达，或者合成，而核心颗粒和VLP从分别适于核心颗粒和VLP折叠和装配的表达宿主中表达和纯化。RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽也可以化学合成。然后使RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与核心颗粒和VLP结合，装配成RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽阵列。
另一方面，本发明提供一种组成物，其包含(a)一种病毒样颗粒，和(b)至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，并且其中所述至少一个(一种)抗原或抗原决定簇与该病毒样颗粒结合。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含(a)权利要求1或权利要求22的组成物，和(b)一种药物可接受的载体。
另一方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含一种含有下列成分的组成物(a)含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；(b)含有至少一个第二附着位点的至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，并且其中所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇中非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中自然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。
另一方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含一种含有如下成分的组成物(a)一种病毒样颗粒；和(b)至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或所述抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽；其中所述至少一个(一种)抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
另一方面，本发明提供一种生产权利要求1的组成物的方法，包括(a)提供一种病毒样颗粒；(b)提供至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽；(c)将所述病毒样颗粒与所述至少一个(一种)抗原或抗原决定簇混合，使得所述至少一个(一种)抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
另一方面，本发明提供一种生产权利要求22的组成物的方法，包括(a)提供含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；(b)提供含有至少一个第二附着位点的至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，并且其中所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇中非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中自然存在的附着位点；其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；(c)将所述核心颗粒与所述至少一个(一种)抗原或抗原决定簇混合，其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。
另一方面，本发明提供一种免疫方法，包括对动物或人施用权利要求1或权利要求22的组成物。
另一方面，本发明提供权利要求1或权利要求22的组成物在生产用于治疗骨病的药物中的应用。
另一方面，本发明提供权利要求1或权利要求22的组成物在制备用于治疗或预防性处理骨病(优选地哺乳动物脑病)的药物中的应用。此外，另一方面，本发明也提供权利要求1或权利要求22的组成物单独或与其它试剂组合在生产用于治疗或预防骨病(特别是哺乳动物脑病)和/或刺激哺乳动物免疫系统的组合物、疫苗、药物中的用途。
因此，本发明具体提供适于预防和/或缓解骨病或相关疾病的疫苗组合物。本发明还提供在动物，具体是母牛、绵羊和家畜以及人类中，分别用于预防和/或缓解骨病或相关疾病的免疫和接种方法。本发明的组合物可用于预防或治疗。
在具体实施方案中，本发明提供用来预防和/或缓解由“自身”基因产物，即如此处所用的“自身抗原”引起或加重的骨病或相关疾病的方法。在相关实施方案中，本发明提供分别在动物和个体中诱发免疫应答的方法，该免疫应答导致可预防和/或缓解由“自身”基因产物引起或加重的骨病或相关疾病的抗体产生。
本领域普通技术人员会理解，当对动物或人施用本发明的组成物时，它们可以是在含有盐、缓冲液、佐剂或希望用来提高组成物效能的其它物质的组合物中。在大量资料中提供了适于在制备药物组合物中应用的材料的实例，包括Remington’s Pharmaceutical Sciences(Osol，A编著，Mack Publishing Co.，(1990))。
如果接受个体能够耐受本发明的组合物的施用，则称该组合物是“药理可接受的”。另外，本发明的组合物将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学作用的量)施用。
本发明的组合物可以通过本领域周知的多种方法施用，但是通常通过注射、输液、吸入、口服或其它适当的物理方法施用。这些组合物也可肌肉内、静脉内或皮下施用。用于施用的组合物成分包括无菌水(例如生理盐水)或非水性溶液和悬液。非水性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄榄油，和注射用有机酯，如油酸乙酯。可以利用载体或封闭敷裹提高皮肤通透性并提高抗原吸收。
根据本领域所知、下列附图和发明描述以及权利要求书，本领域普通技术人员会了解本发明的其它实施方案。
附图简述

图1显示C-RANKL的表达和纯化。
C-RANKL的纯化在还原条件下用SDS凝胶分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。蛋白质分子量标志的分子量在左侧空白处列出。1道低分子量标志。2道和3道分别用空载体pGEX6p1和pGEX-RANKL转化的BL21/DE3细胞，在0.4mM IPTG诱导16小时后，细胞裂解液的上清液。4道用GST-Trap FF柱纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白。5道未与GST-Trap FF柱结合的级分。6道用PreScission蛋白酶切割后纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白。7道GST-RANKL消化物上样的GST-Trap FF柱的未结合级分，其中含有纯化的C-RANKL。8道上样GST-PS-C-RANKL消化物并用GSH洗脱的GST-Trap FF柱的结合级分。
图2显示RANKL-C的表达和纯化。
图2A显示GST-EK-RANKL-C的纯化。蛋白质样品在还原条件下通过SDS-PAGE分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。蛋白质分子量标志的分子量在左侧空白处列出。1道预染色的蛋白质分子量标志，宽范围(New England Biolabs)。2道用pMod-GST-EK-mRANKL-C1质粒转化的BL21/DE3细胞，在0.1mM IPTG诱导过夜后，澄清的细胞裂解液。3道澄清的2道裂解液上样的GST-Trap FF柱的流出液。4道GST-Trap FF柱的第一次洗涤液。5道GST-Trap FF柱的第二次洗涤液。6道GST-Trap FF柱的第三次洗涤液。7-15道GST-Trap FF柱的洗脱级分1-9，其中含有纯化的GST-EK-RANKL-C融合蛋白和少量GST-EK蛋白。
图2B显示肠激酶MaxTM对GST-EK-RANKL-C的切割。
GST-EK-RANKL-C的消化在还原条件下通过SDS-PAGE分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。蛋白质分子量标志的分子量在左侧空白处列出。1道预染色的蛋白质分子量标志，宽范围(New England Biolabs)。2道纯化的GST-EK-RANKL-C融合蛋白。3道在4℃下与肠激酶MaxTM温育16小时后的酶切产物。
图2C显示RANKL-C的纯化。
在通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析去除GST-EK后，RANKL-C的纯化在还原条件下通过SDS-PAGE分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。蛋白质分子量标志的分子量在左侧空白处列出。1道预染色的蛋白质分子量标志，宽范围(New England Biolabs)。2道和3道GST-EK-RANKL-C在4℃下与肠激酶MaxTM温育16小时后，酶切产物GST-EK和RANKL-C。4道和5道GST-Trap FF柱的不同量的未结合级分，其中含有高纯度的RANKL-C蛋白。
图3显示C-RANKL与Qβ衣壳蛋白的偶联。
图3A显示偶联产物的SDS-PAGE分析蛋白质在还原条件下通过16％SDS凝胶分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。蛋白质分子量标志的分子量在左侧空白处列出。蛋白带的身份标于右侧空白处。1道预染色的蛋白质分子量标志，宽范围(New England Biolabs)。2道衍化的Qβ衣壳蛋白。3道纯化的C-RANKL蛋白。4道C-RANKL/Qβ偶联反应。
图3B和图3C偶联产物的Western Blot分析。
蛋白质在还原条件下在16％SDS凝胶上电泳，印迹到硝酸纤维素膜上，用抗-Qβ抗血清(图3B)或抗-RANKL抗体(图3C)检测。蛋白质分子量标志的分子量在左侧空白处列出。蛋白带的身份标于右侧空白处。1道预染色的蛋白质分子量标志，宽范围(New EnglandBiolabs)。2道衍化的Qβ衣壳蛋白。3道纯化的C-RANKL蛋白。4道C-RANKL/Qβ偶联反应。
图4显示用与Qβ偶联的C-RANKL免疫的小鼠中，RANKL特异性IgG的ELISA。
雌性Balb/c小鼠在第0、16、64天皮下接种在PBS中的25μg与Qβ偶联的C-RANKL，其中添加或不添加明矾。分析第0、16、23、64、78天血清中RANKL特异的抗体。ELISA滴度表示为在ELISA测定中达到半数最大OD420的血清稀释度的平均值。
图5显示用与Qβ偶联的C-RANKL免疫的小鼠中所诱导抗体的中和活性。
图5A显示C-RANKL与其同源配体RANK的结合测定。ELISA板用10μg/ml C-RANKL包被，与连续稀释的RANK-Fc融合蛋白或无关的Fc融合蛋白一起温育。结合的RANK用HRP偶联的抗-Fc抗体检测。
图5B显示接种与Qβ偶联的C-RANKL的小鼠血清抗体对C-RANKL/RANK-Fc结合的抑制。ELISA板用10μg/ml C-RANKL包被，与连续稀释的第78天小鼠血清和1nM RANK-Fc融合蛋白共温育。融合蛋白与C-RANKL的结合用辣根过氧化物酶偶联的抗-Fc抗体检测。
图6A-C显示用于VLP的AP205蛋白的纯化，通过SDS-PAGE和Western-blotting分析。
图7A-C显示比较AP205噬菌体颗粒与AP205病毒样颗粒的电子显微照片，后者由在大肠杆菌中表达的重组蛋白自发装配而成并被纯化。
发明详述除非另外定义，此处使用的所有技术与科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实施与测试中可以使用与本文所述相似或相当的任何材料和方法，但是下文只对优选的材料和方法加以描述。
1.定义氨基酸接头在此使用时，本说明书中的“氨基酸接头”，也被称为“接头”，它使抗原或抗原决定簇与第二附着位点连接，或者更优选地，已经包含或含有第二附着位点，一般—但不是一定—-是一个氨基酸残基，优选的是半胱氨酸残基。然而，在此使用的术语“氨基酸接头”并非意味着这种氨基酸接头只是由氨基酸残基组成，但是由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明的一个优选实施方案。氨基酸接头的氨基酸残基优选地包含本领域公知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸，所有L-或所有D-氨基酸或其混合物。然而，本发明也包括一种含有一个含巯基或半胱氨酸残基的分子的氨基酸接头。该分子优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分。然而，除了氨基酸接头外，本发明范围内也包括优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分且不含任何氨基酸的接头。抗原或抗原决定簇或任选的第二附着位点与氨基酸接头优选地通过至少一个共价键，更优选地通过至少一个肽键连接。
动物在此使用的术语“动物”包括例如人、绵羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类动物。
抗体在此使用的术语“抗体”是指能够结合表位或抗原决定簇的分子。该术语包括整个抗体及其抗原结合片段，包括单链抗体。最优选地，抗体是人抗原结合性抗体片段，包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)，以及包含VL或VH域的片段。抗体可来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、猪、骆驼、马或鸡抗体。在此使用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体，或者来自不表达内源性免疫球蛋白的一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物，如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598所述。
抗原在此使用的术语“抗原”是指能够被抗体结合，或者如果由MHC分子呈递即能够被T细胞受体(TCR)结合的分子。在此使用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，并且/或者能够诱发体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的激活。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或连接于Th细胞表位，并且使用佐剂。一个抗原可包含一个或多个表位(B和T表位)。上述特异性反应是指抗原通常以高选择性方式优选地与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的其它许多抗体或TCR反应。此处使用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。
抗原决定簇在此使用的术语“抗原决定簇”是指可被B或T淋巴细胞特异识别的抗原部分。B淋巴细胞对抗原决定簇的的响应产生抗体，而T淋巴细胞通过增殖和建立介导细胞和/或体液免疫所必需的效应功能来响应抗原决定簇。
连接(association)在此使用的术语“连接”当用于第一和第二附着位点时，是指第一与第二附着位点优选地通过至少一个非肽键结合。连接的性质可以是共价、离子、疏水、极性的或其任意组合，优选地，连接的性质是共价结合。
第一附着位点在此使用的短语“第一附着位点”是指非天然或天然来源的一种元件，位于抗原或抗原决定簇上的第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。第一附着位点通常且优选地位于核心颗粒(优选地如病毒样颗粒)的表面。核心和病毒样颗粒的表面上分别存在多个一般为重复构型的第一附着位点。
第二附着位点在此使用的短语“第二附着位点”是指与抗原或抗原决定簇有关的一种元件，位于核心颗粒和病毒样颗粒表面的第一附着位点分别可与之连接。抗原或抗原决定簇的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。抗原或抗原决定簇上至少存在一个第二附着位点。因此，术语“含有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇”是指至少含有抗原或抗原决定簇和第二附着位点的抗原或抗原构建体。然而，特别是对于非天然来源的第二附着位点，即抗原或抗原决定簇内非天然存在的位点，这些抗原或抗原构建体含有“氨基酸接头”。
骨病在此使用的术语“骨病”具体包括以骨吸收增加为特征的疾病。术语“骨病”包括但不限于不同形式的骨质疏松症，如原发性骨质疏松症(如特发性、绝经后、退化性或老年骨质疏松症)和继发性骨质疏松症。后者包括由于糖皮质激素过量、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进、性腺功能亢进、高催乳素血症、糖尿病引起的骨质疏松症，药物诱发的骨质疏松症，如糖皮质类固醇、乙醇、苯妥英、烟草、巴比妥酸盐或肝素引起的骨质疏松症，停用诱发的骨质疏松症，以及与骨吸收增加有关的各种疾病，如慢性肾衰竭、肝病、吸收障碍综合征、慢性阻塞性肺病、类肉瘤病。骨吸收增加的其它疾病包括佩吉特病、家族性扩张性骨质溶解、自发性骨质溶解、与风湿性关节炎相关的骨损失、牙周病中的骨吸收和牙损失、骨髓炎、恶性肿瘤的高钙血症、骨肿瘤、骨转移相关的癌症以及太空飞行中发现的失重引起的骨损失。本领域技术人员能够识别以骨吸收增加为特征的其它疾病。
结合在此使用的术语“结合”是指结合或附着，它们可以是共价的，例如化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是例如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。术语“结合”比术语如“偶联”、“融合”和“附着”范围更广，并且包括后者。
外壳蛋白在此使用的术语“外壳蛋白”是指噬菌体或RNA噬菌体的蛋白质，它们能够参与噬菌体或RNA噬菌体的衣壳装配。然而，当指RNA噬菌体的外壳蛋白基因的具体基因产物时，使用术语“CP”。例如，RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的具体基因产物被称为“QβCP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”包含“Qβ CP”以及A1蛋白。噬菌体Qβ的衣壳主要由Qβ CP组成，含有少量A1蛋白。同样，VLP Qβ外壳蛋白主要含有Qβ CP，以及少量A1蛋白。
核心颗粒在此使用的术语“核心颗粒”是指具有固有重复组织的刚性结构。此处使用的核心颗粒可以是合成方法的产物或生物学方法的产物。
偶联的在此使用的术语“偶联的”是指通过共价键或通过强非共价相互作用附着，一般且优选地指通过共价键附着。本领域技术人员常用的偶联生物活性物质的任何方法都能在本发明中使用。
有效量在此使用的术语“有效量”是指足以达到希望的生物学效应的量或必需的量。组成物的有效量是获得这种选择结果的量，此量可由本领域技术人员常规确定。例如，治疗免疫系统缺陷的有效量是引起免疫系统激活、在暴露于抗原后产生抗原特异性免疫应答所必需的量。该术语也与“足量”同义。
用于任何具体用途的有效量根据如下因素而不同，如所治疗的疾病或病症、施用的具体组成物、患者体重和/或疾病或病症的严重程度。本领域普通技术人员能够根据经验确定本发明的具体组成物的有效量，而不需要过多的实验。
表位在此使用的术语“表位”是指在动物、优选地哺乳动物、最优选地在人中具有抗原或免疫原活性的多肽的连续或不连续部分。表位被抗体或通过MHC分子内的T细胞受体被T细胞识别。在此使用的“免疫原性表位”定义为能在动物中引发抗体应答或诱发T细胞应答的多肽部分，这可通过本领域公知的任何方法测定。(参见，例如Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983))。在此使用的术语“抗原性表位”定义为抗体能够免疫特异性结合作为其抗原的蛋白质部分，这种特异性结合可用本领域公知的任何方法测定。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除与其它抗原的交叉反应性。抗原性表位不一定必须是免疫原性的。抗原性表位也可以是T细胞表位，此时它们能被MHC分子内的T细胞受体免疫特异性地结合。
一个表位可以包含具有该表位唯一的空间构象的3个氨基酸。一个表位通常由至少约5个这样的氨基酸组成，更常见地由至少约8-10个这样的氨基酸组成。如果表位是一种有机分子，它可以象硝基苯基一样小。
融合在此使用的术语“融合”是指通过编码核苷酸序列的框内组合，将不同来源的氨基酸序列组合于一条多肽链中。除了与多肽链的末端之一融合外，术语“融合”还明确包括内部融合，即不同来源的序列插入一条多肽链内。
免疫应答在此使用的术语“免疫应答”是指导致B和/或T淋巴细胞和/或抗原呈递细胞激活或增殖的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，在某些情况下，免疫应答可能是低强度的，只有在使用至少一种根据本发明的物质时才能检测到。“免疫原性”是指一种用来刺激活生物的免疫系统的试剂，使得免疫系统的一种或多种功能增强，并且针对该免疫原性剂。“免疫原性多肽”是能够引发细胞和/或体液免疫应答的多肽，无论它是单独的还是与载体相连接，使用或不使用佐剂。优选地可以激活抗原呈递细胞。
“增强”免疫应答的物质是指与不添加该物质时测定的相同免疫应答相比，添加该物质时观察到更强或以任何方式增强或偏离的免疫应答。例如，应用51Cr释放试验，能够测定在免疫过程中使用或不使用该物质获得的样品中细胞毒性T细胞的裂解活性。与不含该物质的CTL裂解活性相比，使CTL裂解活性提高的物质的量被称为足以增强动物对该抗原的免疫应答的量。在一个优选实施方案中，免疫应答至少增强约2倍，更优选地约3倍或更高。分泌的细胞因子的数量或类型也可能改变。此外，诱导的抗体或其亚类的量也可能改变。
免疫在此使用的术语“免疫”或“免疫作用”或相关术语是指提供产生针对靶抗原或表位的基本免疫应答的能力(包括抗体和/或细胞免疫，如效应CTL)。该术语不要求产生完全免疫，而是产生大大高于基线的免疫应答。例如，如果在使用本发明的方法后哺乳动物产生针对靶抗原的细胞和/或体液免疫应答，则可认为针对该靶抗原免疫了该动物。
天然来源在此使用的术语“天然来源”是指其全部或部分都不是合成的，而是自然存在或产生的。
非天然的在此使用的该术语通常是指并非来源于自然，更具体而言，该术语是指来自人工。
非天然来源在此使用的术语“非天然来源”通常是指合成的或者并非来源于自然；更具体而言，该术语是指来自人工。
有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列在此使用的术语“有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列”通常是指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于抗原或抗原决定簇一般且优选地分别相对于核心颗粒和病毒样颗粒均匀空间排列。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可能是一种几何模式。合适的有序、重复抗原或抗原决定簇阵列的典型和优选实例具有严格重复的类结晶排列的抗原或抗原决定簇，优选地间隔1-30纳米，优选地5-15纳米。
菌毛在此使用的术语“菌毛”是指细菌细胞的胞外结构，它由蛋白质单体(例如菌毛蛋白单体)组成，这些单体组织成有序、重复的模式。此外，菌毛也是参与多种过程的结构，如细菌细胞与宿主细胞表面受体的附着、细胞间基因交换和细胞-细胞识别。菌毛的实例包括1型菌毛、P-菌毛、F1C菌毛、S-菌毛和987P-菌毛。菌毛的其它实例在下文描述。
菌毛样结构在此使用的短语“菌毛样结构”是指具有类似于菌毛的特征、由蛋白质单体组成的结构。“菌毛样结构”的一个实例是表达修饰菌毛蛋白的一种细菌细胞所形成的一种结构，这种修饰菌毛蛋白形成与天然菌毛不相同的有序、重复阵列。
多肽在此使用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接组成的分子。它是指氨基酸分子链，不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质都包含于多肽的定义内。该术语也指多肽的表达后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。重组或衍生的多肽不一定由特定的核酸序列翻译而来。也可以用任何一种方法生产，如化学合成。
RANKL蛋白在此使用的术语“RANKL蛋白”是指由RANKL基因编码的蛋白质。RANKL蛋白的不同变体可以分别由核苷酸点突变和多态性以及一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或置换引起，并且明确地包括于本发明的范围内。进一步的变异性可以由翻译后修饰引起，如RANKL的不同糖基化形式，以及RANKL的蛋白水解切割形式(Lum，L.等人，J.Biol.Chem.27413613-13618(2000))。当前已知一些人RANKL基因和其它物种的RANKL基因的剪接变体，可能具有上述突变的这些变体也包括于本发明的范围之内。因此，在此使用的术语“RANKL蛋白”也包括RANKL蛋白变体，包括但不限于上述优选实例。
在此使用的术语“RANKL片段”被广泛定义为代表RANKL蛋白的一部分、至少长50个氨基酸的任何一种多肽，最优选的是RANKL的折叠部分，最优选的是RANKL的胞外部分，更优选的是TNF-α同源区。术语RANKL片段也包括重组产生的蛋白质和多肽，分别对应于RANKL的剪接同工型和蛋白水解切割形式，以及如上所述的所有变体。
在此使用的术语“RANKL肽”被广泛定义为代表RANKL蛋白或RANKL片段一部分的任何一种肽，其含有原始RANKL蛋白或RANKL片段的至少2个、优选地至少3个、更优选地至少4个、更优选地至少5个、更优选地至少6个连续氨基酸，最优选地是RANKL的胞外部分。而且，术语“RANKL肽”优选地包括所述RANKL肽的任何部分，其中所述部分优选地可通过在N端和/或C端删除一个或多个氨基酸产生。RANKL肽可以在真核或原核表达系统中重组表达为单独的RANKL肽或与其它氨基酸或蛋白质的融合体，例如，这种融合是为了有利于RANKL肽的折叠、表达或可溶性，或者利于RANKL肽的纯化。为了使RANKL肽能够与VLP或衣壳的亚单位蛋白偶联，可以向RANKL肽中添加至少一个第二附着位点。此外，RANKL肽也可以用本领域周知的方法合成。在此使用的术语RANKL肽优选地也包括模拟RANKL三维表面结构的肽。这种RANKL肽不一定来源于RANKL的连续氨基酸序列，也可以由RANKL的不连续氨基酸残基组成。这些肽甚至可以含有在相应RANKL蛋白中不存在的氨基酸。
残基在此使用的术语“残基”是指多肽骨架或侧链中的具体氨基酸。
自身抗原在此使用的术语“自身抗原”是指宿主DNA编码的蛋白质，宿主DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物被定义为自身的。另外，两种或几种自身分子组合产生的蛋白质或是自身分子一部分的蛋白质以及与上述两种自身分子具有高度同源性的蛋白质(＞95％；优选地＞97％，更优选地＞99％)也可以认为是自身的。
治疗(处理)在此使用的术语“治疗(处理)”是指预防和/或治疗。例如，当用于传染病时，该术语是指提高患者对病原体感染的抗性，或者换句话说，降低患者感染病原体或表现感染所致病症的可能性的预防处理，以及患者感染后的抗感染处理，例如减轻或消除感染或阻止其恶化。当用于骨病时，术语“处理”是指抑制或减少与骨病相关的骨吸收增加的预防或治疗处理。
疫苗在此使用的术语“疫苗”是指包含本发明的组成物并且是能够对动物施用的形式的制剂。一般而言，疫苗包含常用的盐水或缓冲水溶液介质，本发明的组成物悬浮或溶解于其中。以这种形式，本发明的组成物能够方便地用于预防、改善或治疗疾病。在导入宿主后，疫苗能够引起免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突状细胞的激活和/或其它细胞应答。
任选地，本发明的疫苗还包含一种佐剂，与本发明的化合物相比，它可能占一小部分或大部分。在此使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异刺激物，或可以在宿主中产生沉淀物，当沉淀物与本发明的疫苗组合时能够产生更强的免疫应答。有多种佐剂可以使用。实例包括完全和不完全弗氏佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。
病毒样颗粒(VLP)在此使用的术语“病毒样颗粒”是指一种类似于病毒颗粒的结构。而且，根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非传染性的，因为它缺乏全部或部分病毒基因组，特别是病毒基因组的复制性和传染性部分。根据本发明的病毒样颗粒可以含有与其基因组不同的核酸。根据本发明的病毒样颗粒的一个典型且优选的实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体或RNA-噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”在此可以互换使用，是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。一般且优选地，病毒蛋白质亚单位分别装配为病毒衣壳和衣壳，它们具有固有的重复组织结构，这种结构一般是球形或管状。例如，RNA-噬菌体或HBcAg的衣壳是二十面体对称的球形。在此使用的术语“衣壳样结构”是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体，它在上述几方面类似于衣壳的形态，但是不同于典型的对称装配体，而保持足够的顺序和重复性。
噬菌体的病毒样颗粒在此使用的术语“噬菌体的病毒样颗粒”是指类似于噬菌体结构的病毒样颗粒，它是非复制性和非传染性的，至少缺乏编码噬菌体复制机制的基因，一般也缺乏编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义也包括这样的噬菌体病毒样颗粒，其中上述基因仍然存在但是无活性，于是也产生非复制性和非传染性的噬菌体病毒样颗粒。
RNA噬菌体外壳蛋白的VLP“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”指由RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚单位自装配而成，任选地含有宿主RNA的衣壳结构。一个具体实例是Qβ外壳蛋白的VLP。在此情况下，Qβ外壳蛋白的VLP可能仅仅由Qβ CP亚单位装配而成(通过一种Qβ CP基因的表达产生，该基因例如含有一个通过抑制阻止更长A1蛋白的表达的TAA终止密码子，参见Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))，或者在衣壳装配体中还含有A1蛋白亚单位。
病毒颗粒在此使用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形状。一些病毒类型含有一个由蛋白质衣壳围绕的基因组；其它的具有附加结构(例如包膜、尾等)。
一种(个)术语“一种(个)”在本公开内容中使用时，除非另外说明，是指“至少一种(个)”或“一种(个)或一种(个)以上”。
本领域技术人员应当清楚，本发明的某些实施方案涉及重组核酸技术的应用，如克隆、聚合酶链反应、DNA和RNA的纯化、重组蛋白质在原核和真核细胞中的表达等。这些方法为本领域技术人员公知，在出版的实验室方法手册中常见(例如，Sambrook，J.等人编著，《分子克隆实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997))。应用组织培养细胞系进行的基本实验室技术(Celis，J.编著，《细胞生物学》，AcademicPress，第二版，(1988))和基于抗体的技术(Harlow，E.和Lane，D.，《抗体实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，“蛋白质纯化指南”，Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，《蛋白质纯化原理与实践》，第三版，Springer-Verlag，New York(1994))在文献中也有大量描述，这些文献全部在此引用作为参考。
2.增强免疫应答的组成物和方法本发明提供用于增强动物对RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的免疫应答的组成物和方法。本发明的组成物包含或者由下列成分组成(a)含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；(b)含有至少一个第二附着位点的至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，其中所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇中非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中自然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。更具体而言，本发明的组成物包含或者由下列成分组成一种病毒样颗粒，和至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇与该病毒样颗粒结合，形成有序、重复的抗原-VLP阵列。而且，本发明也能够使技术人员方便地构建这种组成物，尤其用来治疗和/或预防以骨吸收增加为特征的骨病。
在一个实施方案中，核心颗粒包括病毒、细菌菌毛、细菌菌毛蛋白形成的结构、噬菌体、病毒样颗粒、病毒衣壳颗粒或其重组形式。可以选择本领域周知的具有有序、重复外壳和/或核心蛋白结构的任何病毒作为本发明的核心颗粒；合适的病毒的实例包括辛德毕斯病毒和其它甲病毒，弹状病毒(例如水泡性口炎病毒)，小RNA病毒(例如人鼻病毒、Aichi病毒)，披膜病毒(例如风疹病毒)，正粘病毒(例如索戈托病毒、贝特肯病毒、家禽流感病毒)，多瘤病毒(例如多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、禽多瘤病毒BFDV)，细小病毒，轮状病毒，诺瓦克病毒，口蹄疫病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒，烟草花叶病毒，禽兽棚病毒，和人乳头瘤病毒，以及优选的RNA噬菌体，噬菌体Qβ，噬菌体R17，噬菌体M11，噬菌体MX1，噬菌体NL95，噬菌体fr，噬菌体GA，噬菌体SP，噬菌体MS2，噬菌体f2，噬菌体PP7(例如，参见Bachman，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today 17553-558(1996)中的表1)。
在另一个实施方案中，本发明利用病毒的基因工程产生有序、重复的病毒包膜蛋白与第一附着位点的融合体，其包含所选的异源蛋白质、肽、抗原决定簇或反应性氨基酸残基。在本发明的组成物的构建中可以使用本领域公知的其它基因操作；例如，希望通过基因突变限制重组病毒的复制能力。而且，由于化学或物理灭活，或者如所述的由于缺乏可复制的基因组，用于本发明的病毒不能复制。为了与第一附着位点融合而选择的病毒蛋白应当具有组织、重复的结构。在病毒表面上，这种有组织、重复的结构包括类晶体结构，其间距为5-30nm，优选地5-15nm。这类融合蛋白的产生将在病毒表面产生多个有序、重复的第一附着位点，反映原始病毒蛋白的正常组织结构。本领域技术人员应当理解，第一附着位点可以是任何合适的蛋白质、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次级代谢物或其组合，或者是它们的一部分，它们可以用来特异性地附着抗原或抗原决定簇，产生有序、重复的抗原阵列。
在本发明的另一个实施方案中，核心颗粒是一种重组甲病毒，更具体而言，是一种重组辛德毕斯病毒。甲病毒是正链RNA病毒，它们在被感染细胞的细胞质中完整复制其基因组RNA，而不需要DNA中间物(Strauss，J.和Strauss，E.，Microbiol.Rev.58491-562(1994))。甲病毒科的几个成员，辛德毕斯病毒(Xiong，C.等人，Science2431188-1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol.1118-22(1993))、西门利启森林病毒(SFV)(Liljestrm，P.& Garoff，H.，Bio/Technology 91356-1361(1991))及其它病毒(Davis，N.L.等人，Virology 171189-204(1989))，在作为多种不同蛋白质的基于病毒的表达载体(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8578-582(1997)；Liljestrm，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5495-500(1994))以及作为疫苗研制的候选物方面已经受到极大关注。最近，公布了涉及甲病毒在异源蛋白质表达和疫苗研制中的用途的一些专利(参见美国专利号5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245；5,814,482)。本发明的甲病毒核心颗粒的构建可以利用重组DNA技术领域周知的方法进行，如上述文章所述，在此引用作为参考。
可以利用多种不同的重组宿主细胞生产用于抗原或抗原决定簇附着的基于病毒的核心颗粒。例如，已知甲病毒具有广泛的宿主谱；辛德毕斯病毒感染培养的哺乳动物、爬行动物和两栖动物细胞，以及某些昆虫细胞(Clark，H.，J.Natl.Cancer Inst.51645(1973)；Leake，C.，J.Gen.Virol.35335(1977)；Stollar，V.《披膜病毒》R.W.Schlesinger编著，Academic Press，(1980)，pp.583-621)。因此，有大量重组宿主细胞能够在本发明的实施中使用。BHK、COS、Vero、HeLa和CHO细胞特别适于异源蛋白质的生产，因为它们能够以类似于人细胞的方式糖基化异源蛋白质(Watson，E.等人，Glycobiology 4227(1994))并且能够被筛选(Zang，M.等人，Bio/Technology 13389(1995))或基因改造(Renner W.等人，Biotech.Bioeng，4476(1995)；Lee K.等人，Biotech.Bioeng.50336(1996))，在无血清培养基以及悬液中生长。
向宿主细胞中引入多核苷酸载体可以用标准实验室手册所述的方法实现(参见，例如Sambrook，J.等人编著，《分子克隆实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)，第9章；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)，第16章)，包括如电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、转导、划痕导入(scrape loading)、轰击导入和感染等方法。向宿主细胞内导入外源DNA序列的方法在Felgner，P.等人，美国专利号5,580,859中有描述。
包装的RNA序列也可以用来感染宿主细胞。这些包装的RNA序列可以通过添加到培养基中而导入宿主细胞内。例如，在大量资料中描述了非传染性甲病毒颗粒的制备，包括“辛德毕斯表达系统”，C版(Invitrogen目录号K750-1)。
当利用哺乳动物细胞作为重组宿主细胞生产基于病毒的核心颗粒时，这些细胞通常在组织培养基中培养。在培养基中培养细胞的方法在本领域中众所周知(参见，例如Celis，J.编著，《细胞生物学》，Academic Press，第二版，(1998)；Sambrook，J.等人编著，《分子克隆实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)；Freshney，R.，《动物细胞培养》，Alan R.Liss，Inc.(1983))。
在本发明中适于作为核心颗粒的RNA病毒的其它实例包括但不限于呼肠孤病毒科的成员，包括正呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽逆转录病毒的多个血清型)，环状病毒属(蓝舌病毒、Eugenangee病毒、克米罗沃病毒、非洲马疫病毒和科罗拉多蜱热病毒)，轮状病毒属(人轮状病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒、鼠轮状病毒、猿轮状病毒、牛或绵羊轮状病毒、禽轮状病毒)；小RNA病毒科，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，人肠道孤(ECHO)病毒，甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒，猿肠道病毒，鼠脑脊髓炎(ME)病毒，脊髓灰质炎病毒，牛肠道病毒，猪肠道病毒，心肌病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)，门戈病毒)，鼻病毒属(人鼻病毒，包括至少113个亚型；其它鼻病毒)，鹅口疮病毒属(口蹄疫病毒(FMDV))；杯状病毒科，包括猪水泡疹病毒、圣米格尔海狮病毒、猫小RNA病毒和诺瓦克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(东方马脑炎病毒，塞姆利基森林病毒，辛德毕斯病毒，屈曲病毒，阿尼昂尼昂病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，摩莱河谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库宁病毒，中欧蜱传脑炎病毒，远东蜱传脑炎病毒，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，波沃森病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布亚病毒科，包括布亚病毒属(布尼亚维拉病毒及相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕羊疾病病毒)，乌库病毒属(Uukuniemi病毒及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，多种人亚型)，猪流感病毒，禽及马流感病毒，乙型流感(多个人亚型)，丙型流感(可能分离的属)；副粘液病毒科，包括副粘液病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2-5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒，辛德毕斯病毒，屈曲病毒，阿尼昂尼昂病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)；黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，摩莱河谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库宁病毒，中欧蜱传脑炎，远东蜱传脑炎病毒，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，波沃森病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布亚病毒科，包括布亚病毒属(布尼亚维拉病毒及相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕羊疾病病毒)，乌库病毒属(Uukuniemi病毒及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，多种个人亚型)，猪流感病毒，禽及马流感病毒，乙型流感(多种个人亚型)，丙型流感(可能分离的属)；副粘液病毒科，包括副粘液病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2-5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水泡性病毒属(VSV)，钱迪普拉病毒，佛朗德-哈特公园病毒，狂犬病病毒属(狂犬病病毒)，鱼弹状病毒，丝状病毒(马堡病毒和埃博拉病毒)；砂粒样病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，塔卡里伯病毒复合物，拉萨病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人肠道冠状病毒，猫传染性腹膜炎病毒(猫冠状病毒)。
可以用作核心颗粒的DNA病毒的实例包括但不限于痘病毒科，包括正痘病毒属(重型天花病毒、轻型天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、水牛痘病毒、兔痘病毒、小鼠脱脚病病毒)，野兔痘病毒属(粘液瘤病毒，纤维瘤病毒)，禽痘病毒属(鸡痘病毒，其它禽痘病毒)，羊痘病毒属(绵羊痘病毒，山羊痘病毒)，猪痘病毒属(猪痘病毒)，副痘病毒属(触染性脓疮性皮炎病毒，假牛痘病毒，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪瘟病毒，蛙病毒2和3，鱼淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(1型和2型单纯疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，马流产病毒，马疱疹病毒2和3，假狂犬病病毒，传染性牛角膜结膜炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒)和β-疱疹病毒(人巨细胞病毒和猪、猴、啮齿动物巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)，马雷克病病毒，松鼠猴疱疹病毒，蛛猴疱疹病毒，兔疱疹病毒，豚鼠疱疹病毒，勒克肿瘤病毒)；腺病毒科，包括乳腺病毒属(人A、B、C、D、E亚群和未分群的；猿腺病毒(至少23个血清型)，传染性犬肝炎病毒，牛、猪、绵羊、蛙和其它许多种的腺病毒，禽腺病毒属(禽腺病毒)；不可培养的腺病毒；乳头多瘤空泡病毒科，包括乳头瘤病毒属(人乳头状瘤病毒，牛乳头瘤病毒，兔乳头瘤病毒，其它种的多种致病性乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒，猿空泡剂(SV-40)，兔空泡剂(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，以及其它灵长类动物多瘤病毒，如亲淋巴乳头瘤病毒)；细小病毒科，包括腺伴随病毒属，细小病毒属(猫全血细胞减少症病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，阿留申水貂病病毒等)。最后，DNA病毒可包括如慢性传染性神经性病原体(CHINA病毒)的病毒。
在其它实施方案中，细菌菌毛蛋白、细菌菌毛蛋白的亚部分，或含有细菌菌毛蛋白或其亚部分的融合蛋白，可以用来分别制备本发明的组成物和疫苗组合物。菌毛蛋白的实例包括下列细菌产生的菌毛蛋白大肠杆菌、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。适用于本发明的菌毛蛋白的氨基酸序列包括GenBank报告AJ000636(SEQ ID NO1)、AJ132364(SEQ ID NO2)、AF229646(SEQ ID NO3)、AF051814(SEQID NO4)、AF051815(SEQ ID NO5)和X00981(SEQ ID NO6)所述的序列，其完整内容在此引用作为参考。
细菌菌毛蛋白在输入细菌周质之前，通常被加工，除去N端前导序列。此外，本领域技术人员应当认识到，分别用来制备本发明的组成物和疫苗组合物的细菌菌毛蛋白通常不含自然存在的前导序列。
适用于本发明的菌毛蛋白的一个具体实例是大肠杆菌的P-菌毛蛋白(GenBank报告AF237482(SEQ ID NO7))。适用于本发明的大肠杆菌1型菌毛蛋白的一个实例是含有GenBank报告P04128所述氨基酸序列(SEQ ID NO8)的菌毛蛋白，它由具有GenBank报告M27603所示核苷酸序列(SEQ ID NO9)的核酸编码。这些GenBank报告的完整公开内容在此引用作为参考。另外通常也用上述蛋白质的成熟形式分别制备本发明的组成物和疫苗组合物。
适于在本发明的实施中使用的细菌菌毛蛋白或菌毛蛋白亚部分通常能够连接形成有序、重复的抗原阵列。
在体外制备菌毛和菌毛样结构的方法在本领域周知。例如，Bullitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9312890-12895(1996)描述了大肠杆菌P-菌毛亚单位的体外重建。此外，Eshdat等人(J.Bacteriol.148308-314(1981))也描述了适于裂解大肠杆菌1型菌毛和菌毛重建的方法。简而言之，这些方法如下在饱和盐酸胍中37℃温育裂解菌毛。然后通过层析纯化菌毛蛋白，之后用5mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH8.0)透析，形成菌毛蛋白二聚体。Eshdat等人还发现，在用含有5mM MgCl2的5mM三(羟甲基)氨基甲烷(pH8.0)透析后，菌毛蛋白二聚体重装配形成菌毛。
另外，例如使用常规基因工程和蛋白质修饰方法，可以修饰菌毛蛋白，使之含有第一附着位点，抗原或抗原决定簇通过第二附着位点与之连接。此外，抗原或抗原决定簇也可以通过第二附着位点与这些蛋白质中自然存在的氨基酸残基直接连接。这些修饰的菌毛蛋白然后可以在本发明的疫苗组合物中使用。
分别用来制备本发明的组成物和疫苗组合物的细菌菌毛蛋白可以用类似于此处所述对HBcAg修饰的方法进行修饰。例如，可以将半胱氨酸和赖氨酸残基删除或置换为其它氨基酸残基，并且可以向这些蛋白质中添加第一附着位点。此外，菌毛蛋白也可以表达为修饰形式，或者可以在表达后化学修饰。类似地，也可以从细菌中收获完整的菌毛，然后化学修饰。
在另一个实施方案中，从细菌(例如大肠杆菌)中收获菌毛或菌毛样结构，用来形成本发明的组成物和疫苗组合物。适于制备组成物和疫苗组合物的一个实例是大肠杆菌1型菌毛，它由具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的菌毛蛋白单体构成。
本领域周知一些收获细菌菌毛的方法。例如，Bullitt和Makowski(Biophys.J.74623-632(1998))描述了一种从大肠杆菌中收获P-菌毛的菌毛纯化方法。根据该方法，从含有P-菌毛质粒的多菌毛大肠杆菌上剪切菌毛，通过溶解和MgCl2(1.0M)沉淀的循环纯化。
收获后，菌毛或菌毛样结构可用多种方式修饰。例如，可以向菌毛中添加第一附着位点，抗原或抗原决定簇可通过第二附着位点与之附着。换句话说，可以收获并修饰细菌菌毛或菌毛样结构，产生有序、重复的抗原阵列。
抗原或抗原决定簇能够与菌毛或菌毛样结构中所含的自然存在的半胱氨酸残基或赖氨酸残基连接。在这些情况下，自然存在的氨基酸残基的高度有序和重复性将引导抗原或抗原决定簇与菌毛或菌毛样结构偶联。例如，使用异双功能交联剂，菌毛或菌毛样结构能够与抗原或抗原决定簇的第二附着位点连接。
当利用生物自然合成的结构(例如菌毛)制备本发明的组成物和疫苗组合物时，遗传改造这些生物使它们产生具有所需特征的结构通常是有利的。例如，当使用大肠杆菌1型菌毛时，可以修饰从中收获菌毛的大肠杆菌，使之产生具有特定特征的结构。可能的菌毛蛋白修饰的实例包括一个或多个赖氨酸残基的插入、一个或多个自然存在的赖氨酸残基的缺失或置换、一个或多个自然存在的半胱氨酸残基的缺失或置换(例如SEQ ID NO8位点44和84处的半胱氨酸残基)。
另外也可以对菌毛蛋白基因进行其它修饰，产生含有非赖氨酸残基的第一附着位点的表达产物(例如FOS或JUN域)。当然，合适的第一附着位点通常仅限于不妨碍菌毛蛋白形成适于在本发明的疫苗组合物中使用的菌毛或菌毛样结构的附着位点。
细菌细胞中自然存在的菌毛蛋白基因可以在体内修饰(例如通过同源重组)，或者具有特定特征的菌毛蛋白基因可以被插入到这些细胞内。例如，可以将菌毛蛋白基因导入细菌细胞中，作为复制型克隆载体或插入细菌染色体内的载体的一种组分。插入的菌毛蛋白基因也可以与表达调控序列(例如lac操纵子)连接。
在大多数情况下，在本发明的组成物和疫苗组合物中使用的菌毛或菌毛样结构分别由单一类型的菌毛蛋白亚单位构成。通常使用由相同亚单位组成的菌毛或菌毛样结构，因为它们预期能够形成表现为高度有序、重复抗原阵列的结构。
然而，本发明的也包括这样的组成物和疫苗，其包含由不同的菌毛蛋白亚单位构成的菌毛或菌毛样结构。形成这些菌毛或菌毛样结构的菌毛蛋白亚单位可以由细菌细胞中自然存在的基因表达，或者由导入细胞内的基因表达。当自然存在的菌毛蛋白基因和导入的基因都在形成菌毛或菌毛样结构的细胞中表达时，结果通常是由这些菌毛蛋白的混合物形成菌毛或菌毛样结构。此外，当两种或多种菌毛蛋白基因在细菌细胞中表达时，每种菌毛蛋白基因的相对表达通常是决定菌毛或菌毛样结构中不同菌毛蛋白亚单位比例的因素。
当希望获得具有特定混合菌毛蛋白亚单位组成的菌毛或菌毛样结构时，至少一种菌毛蛋白基因的表达可以由一种异源诱导型启动子调节。这些启动子以及其它基因元件可以用来调节细菌细胞中产生的不同菌毛蛋白亚单位的相对含量，从而调节菌毛或菌毛样结构的组成。
另外，抗原或抗原决定簇也能通过非肽键的键与细菌菌毛或菌毛样结构连接，产生在本发明的组成物中使用的菌毛或菌毛样结构的细菌细胞能够被基因改造，从而产生与抗原或抗原决定簇融合的菌毛蛋白。形成菌毛或菌毛样结构的这类融合蛋白适于在本发明的疫苗组合物中使用。
本申请中的病毒样颗粒是指类似于病毒颗粒但是不致病的结构。病毒样颗粒通常缺乏病毒基因组，因此是非传染性的。病毒样颗粒也能通过异源表达而大量生产，并且易于纯化。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒是一种重组病毒样颗粒。熟练技术人员能够利用重组DNA技术和公众易于获得的病毒编码序列生产VLP。例如，为了在杆状病毒表达载体中在病毒启动子的调控下利用可购得的杆状病毒载体表达，可以改造病毒包膜或核心蛋白的编码序列，对序列进行适当修饰，使编码序列与调节序列功能性连接。例如，为了在细菌表达载体中表达，也可以改造病毒包膜或核心蛋白的编码序列。
VLP的实例包括但不限于乙型肝炎病毒(Ulrich等人，Virus Res.50141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160173-178(1995))、辛德毕斯病毒、轮状病毒(美国专利号5,071,651和5,374,426)、口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 131603-1610(1995))、诺瓦克病毒(Jiang，X.等人，Science 2501580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.871456-1461(1991))的衣壳蛋白，逆转录病毒GAG蛋白(WO96/30523)，逆转录转座子Ty蛋白p1，乙型肝炎病毒表面蛋白(WO92/11291)、人乳头瘤病毒(WO98/15631)、RNA噬菌体、Ty、fr-噬菌体、GA-噬菌体和Qβ-噬菌体。
本领域技术人员应当理解，本发明的VLP不限于任何具体形式。该颗粒可以被化学合成或通过生物学方法生产，可以是天然的或是非天然的。例如，这类实施方案包括病毒样颗粒或其重组形式。
在一个更具体的实施方案中，VLP可包含、或基本由、或者由选自下组的重组多肽或其片段组成重组轮状病毒多肽，重组诺瓦克病毒多肽，重组甲病毒多肽，重组口蹄疫病毒多肽，重组麻疹病毒多肽，重组辛德毕斯病毒多肽，重组多瘤病毒多肽，重组逆转录病毒多肽，重组乙型肝炎病毒多肽(例如HBcAg)，重组烟草花叶病毒多肽，重组禽兽棚病毒多肽，重组人乳头瘤病毒多肽，重组噬菌体多肽，重组RNA噬菌体多肽，重组Ty多肽，重组fr-噬菌体多肽，重组GA-噬菌体多肽和重组Qβ-噬菌体多肽。病毒样颗粒可以进一步包含、或基本由、或由这些多肽的一种或多种片段以及这些多肽的变体组成。多肽的变体与其野生型对应物在氨基酸水平上例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或者由RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成。优选地，RNA-噬菌体选自a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；1)噬菌体PP7。
在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA-噬菌体Qβ或RNA-噬菌体fr的重组蛋白或其片段组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，重组蛋白包含、或基本由、或由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。
因此，形成衣壳或VLP的RNA-噬菌体外壳蛋白，或者适于自装配为衣壳或VLP的噬菌体外壳蛋白的片段，是本发明的进一步优选的实施方案。例如，噬菌体Qβ外壳蛋白能够在大肠杆菌中重组表达。进而，这些蛋白质在表达后自发形成衣壳。另外，这些衣壳形成具有固有重复组织的结构。
能够用来制备本发明的组成物的噬菌体外壳蛋白的具体优选实例包括如下RNA噬菌体的外壳蛋白，例如噬菌体Qβ(SEQ IDNO10；PIR数据库，登录号VCBPQβ指Qβ CP，和SEQ ID NO11；登录号AAA16663指QβA1蛋白)，噬菌体R17(SEQ ID NO12；PIR登录号VCBPR7)，噬菌体fr(SEQ ID NO13；PIR登录号VCBPFR)，噬菌体GA(SEQ ID NO14；GenBank登录号NP-040754)，噬菌体SP(SEQ ID NO15；GenBank登录号CAA30374指SP CP，和SEQ IDNO16；涉及SP A1蛋白的登录号)，噬菌体MS2(SEQ ID NO17；PIR登录号VCBPM2)，噬菌体M11(SEQ ID NO18；GenBank登录号AAC06250)，噬菌体MX1(SEQ ID NO19；GenBank登录号AAC14699)，噬菌体NL95(SEQ ID NO20；GenBank登录号AAC14704)，噬菌体f2(SEQ ID NO21；GenBank登录号P03611)，噬菌体PP7(SEQ ID NO22)。此外，噬菌体Qβ的A1蛋白或从其C端丢失多达100、150或180个氨基酸的C端截短形式可能参与Qβ外壳蛋白的衣壳装配。为了确保衣壳形成，通常限制衣壳装配中QβA1蛋白相对于Qβ CP的百分比。
也发现Qβ外壳蛋白在大肠杆菌中表达时自装配为衣壳(Kozlovska TM.等人，GENE 137133-137(1993))。所获得的衣壳或病毒样颗粒显示二十面体噬菌体样衣壳结构，直径25nm，T＝3半对称。噬菌体Qβ的晶体结构已经被解析。衣壳含有180个外壳蛋白拷贝，它们通过二硫桥键连接成共价五聚体和六聚体(Golmohammadi R.等人，Structure 4543-5554(1996))，使Qβ外壳蛋白的衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组Qβ外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有并非通过二硫键与衣壳内的其它亚单位连接或不完全连接的亚单位。因此，在重组Qβ衣壳加样到非还原SDS-PAGE之后，可见对应于单体Qβ外壳蛋白的带以及对应于Qβ外壳蛋白五聚体或六聚体的带。不完全二硫键连接的亚单位在非还原SDS-PAGE中可以表现为二聚体、三聚体乃至四聚体的条带。Qβ衣壳蛋白对有机溶剂和变性剂也显示异常的抗性。我们惊奇地发现，高达30％的DMSO和乙腈浓度和高达1M的胍盐浓度不影响衣壳的稳定性。Qβ外壳蛋白衣壳的高稳定性是一个有利特征，特别对于根据本发明免疫和接种哺乳动物和人的用途而言。
在大肠杆菌中表达后，Qβ外壳蛋白的N端蛋氨酸通常被除去，这可以通过如Stoll，E.等人，J.Biol.Chem.252990-993(1977)所述的N端Edman测序来观察。本发明的范围内也包括由未去除N端蛋氨酸的Qβ外壳蛋白组成的VLP，或者含有N端蛋氨酸已被切除或仍然存在的Qβ外壳蛋白混合物的VLP。
也已经证明，其它RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后自装配(Kastelein，RA等人，Gene 23245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170238-242(1989)，Ni，CZ.等人，Protein Sci.52485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249283-297(1995))。Qβ噬菌体衣壳除了外壳蛋白外还含有所谓的连读蛋白A1和成熟蛋白A2。A1通过在UGA终止密码子处抑制而产生，长度为329个氨基酸。本发明中使用的噬菌体Qβ重组外壳蛋白的衣壳缺乏A2裂解蛋白，而含有来自宿主的RNA。RNA噬菌体的外壳蛋白是一种RNA结合蛋白，与复制酶基因的核糖体结合位点的茎环相互作用，在病毒生命周期中作为一种翻译抑制物。这种相互作用的序列和结构元件已知(Witherell，GW.& Uhlenbeck，OC.Biochemistry 2871-76(1989)；Lim F.等人，J.Biol.Chem.27131839-31845(1996))。已知茎环和RNA通常参与病毒装配(Golmohammadi，R.等人，Structure 4543-5554(1996))。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由、或由RNA噬菌体的突变外壳蛋白、优选地由上述RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。在另一个优选实施方案中，通过置换除去至少一个赖氨酸残基，或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基，来修饰RNA噬菌体的突变外壳蛋白；此外，也可以通过删除至少一个赖氨酸残基，或通过插入添加至少一个赖氨酸残基，来修饰RNA噬菌体的突变外壳蛋白。
在另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、或基本由、或由下列成分组成具有SEQ ID NO10的氨基酸序列的外壳蛋白，或具有SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的氨基酸序列的外壳蛋白的混合物，或SEQ ID NO11的突变体，其中N端蛋氨酸优选地已经切除。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、或基本由、或由突变Qβ外壳蛋白组成。在另一个优选实施方案中，通过置换去除至少一个赖氨酸残基，或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基，来修饰这些突变外壳蛋白。或者，也可以通过删除至少一个赖氨酸残基，或通过插入添加至少一个赖氨酸残基，来修饰这些突变外壳蛋白。
有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的衣壳表面。本发明也可以使用以精氨酸替换暴露的赖氨酸残基的Qβ突变体。在本发明的实施中可以使用下列Qβ外壳蛋白突变体和突变Qβ VLP“Qβ-240”(Lys13-Arg；SEQ ID NO23)，“Qβ-243”(Asn10-Lys；SEQ ID NO24)，“Qβ-250”(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO25)，“Qβ-251”(SEQ IDNO26)和“Qβ-259”(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO27)。因此，在本发明的进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或由突变Qβ外壳蛋白的重组蛋白组成，其包含具有选自下列的氨基酸序列的蛋白质a)SEQ ID NO23的氨基酸序列；b)SEQ ID NO24的氨基酸序列；c)SEQ ID NO25的氨基酸序列；d)SEQ ID NO26的氨基酸序列；和e)SEQ ID NO27的氨基酸序列。上述Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别在本申请人于2002年1月18日提交的未决的美国申请号10/050,902中公开。具体参照上述申请的实施例18。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由、或由上述Qβ突变体之一和相应A1蛋白的混合物组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或由RNA-噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
AP205基因组由成熟化蛋白、外壳蛋白、复制酶和相关噬菌体中不存在的两个开放阅读框组成一种裂解基因和一个在成熟化基因的翻译中起作用的开放阅读框(Klovins，J.等人，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。AP205外壳蛋白可以由质粒pAP283-58(SEQ ID NO111)表达，该质粒是pQb10的衍生物(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137133-37(1993))，含有一个AP205核糖体结合位点。此外，AP205外壳蛋白也可以被克隆到pQb185内，位于载体中的核糖体结合位点的下游。这两种方法都导致蛋白质的表达和衣壳的形成，如本申请人于2002年7月16日提交的标题为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请所述，在此全文引用作为参考。载体pQb10和pQb185都是由pGEM载体衍生的载体，这些载体中克隆基因的表达受trp启动子控制(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137133-37(1993))。质粒pAP283-58(SEQ ID NO111)包含具有下列序列的推断的AP205核糖体结合位点，它位于AP205外壳蛋白的XbaI位点下游和ATG起始密码子直接上游tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg。载体pQb185在XbaI位点下游和起始密码子上游包含一个SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg，SD序列以下划线标出)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段组成。
本发明的这一优选实施方案包含形成衣壳的AP205外壳蛋白。这些蛋白质是重组表达或从天然来源制备。电子显微镜检查(EM)和免疫扩散证实，在细菌中产生的AP205外壳蛋白自发形成衣壳。在EM中可见，AP205外壳蛋白(SEQ ID NO112)形成的衣壳与AP205 RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳的结构特征几乎无法区别。AP205 VLP具有高度免疫原性，能够与抗原和/或抗原决定簇连接，产生展示以重复方式定向的抗原和/或抗原决定簇的疫苗构建体。针对这样展示的抗原能够产生高滴度抗体，表明结合的抗原和/或抗原决定簇能够与抗体分子相互作用，并且具有免疫原性。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或由RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段组成。
AP205 VLP的可装配突变形式，包括第5位氨基酸脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白(SEQ ID NO113)，也可以在本发明的实施中使用，形成本发明的一个进一步优选的实施方案。这些VLP、天然来源的AP205 VLP或AP205病毒颗粒可以与抗原结合，产生根据本发明的有序、重复的抗原阵列。
AP205 P5-T突变外壳蛋白可以由质粒pAP281-32(SEQ IDNO114)表达，该质粒由pQb185直接衍生，含有突变AP205外壳蛋白基因而不是Qβ外壳蛋白基因。用表达AP205外壳蛋白的载体转染大肠杆菌，以表达AP205外壳蛋白。
分别用来表达外壳蛋白和突变外壳蛋白、导致自装配为VLP的方法，在本申请人于2002年7月17日提交的标题为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请中有描述，在此全文引用作为参考。合适的大肠杆菌株包括但不限于大肠杆菌K802、JM109、RR1。合适的载体和菌株及其组合的鉴定方法是通过SDS-PAGE分别检测外壳蛋白和突变外壳蛋白的表达，如下鉴定衣壳的形成和装配任选地首先通过凝胶过滤纯化衣壳，随后用免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137133-137(1993))检测。
由载体pAP283-58和pAP281-32表达的AP205外壳蛋白，由于在大肠杆菌细胞质中加工，可能缺乏初始的蛋氨酸。AP205 VLP的切割形式、未切割形式或其混合物是本发明的进一步优选的实施方案。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段和RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或重组突变外壳蛋白的片段组成。
在本发明的实施中也可以使用分别能够装配为VLP和衣壳的重组AP205外壳蛋白片段。这些片段可以通过分别在外壳蛋白和突变外壳蛋白的内部或末端删除产生。只要不妨碍VLP的装配，外壳蛋白和突变外壳蛋白序列中的插入或抗原序列与外壳蛋白和突变外壳蛋白序列的融合，是本发明更进一步的实施方案，分别产生嵌合AP205外壳蛋白和颗粒。插入、缺失以及与外壳蛋白序列融合的结果，以及是否不妨碍与装配为VLP，能够通过电子显微镜检查确定。
由上述AP205外壳蛋白、外壳蛋白片段和嵌合外壳蛋白形成的颗粒可以以纯化形式分离，分离方法是联合使用利用沉淀的分级分离步骤和利用凝胶过滤(例如使用Sepharose CL-4B、Sepharose CL-2B、Sepharose CL-6B柱及其组合)的纯化步骤，如本申请人于2002年7月17日提交的标题为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请所述，在此全文引用作为参考。分离病毒样颗粒的其它方法为本领域公知，可以用来分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLP)。例如，美国专利号4,918,166描述了利用超速离心分离酵母逆转录转座子Ty的VLP，在此全文引用作为参考。
几种RNA噬菌体的晶体结构已经被测定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4543-554(1996))。利用这些信息，能够鉴定表面暴露的残基，从而能够修饰RNA-噬菌体外壳蛋白，使得通过插入或置换可以插入一个或多个反应性氨基酸残基。因此，噬菌体外壳蛋白的这些修饰形式也可以用于本发明。因此，也可以用形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP和噬菌体MS2的外壳蛋白)制备本发明的组成物。
尽管上述变体蛋白的序列不同于其野生型，但是这些变体蛋白通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还分别包括进一步包含形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体的组成物和疫苗组合物，以及分别制备这些组成物和疫苗组合物的方法，用来制备这些组成物的各种蛋白质亚单位，和编码这些蛋白质亚单位的核酸分子。因此，本发明的范围内包括野生型蛋白质的变体形式，它们可形成衣壳或衣壳样结构，保留连接并形成衣壳或衣壳样结构的能力。
因此，本发明进一步分别包括含有如下蛋白质的组成物和疫苗组合物，该蛋白质包含、或基本由、或由与野生型蛋白质至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，它们分别可形成有序的阵列，具有固有的重复结构。
本发明的范围内还包括编码用来制备本发明组成物的蛋白质的核酸分子。
在其它实施方案中，本发明进一步包括含有如下蛋白质的组成物，该蛋白质包含、或基本由、或由与SEQ ID NO10-27所示任何一种氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
适用于本发明的蛋白质也包括形成衣壳或衣壳样结构或VLP的蛋白质的C端截短突变体。这类截短突变体的具体实例包括具有SEQID NO10-27中任何一种所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从C端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些C端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质也包括形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的N端截短突变体。这类截短突变体的具体实例包括具有SEQ IDNO10-27中任何一种所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些N端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质包括形成衣壳或衣壳样结构的N端和C端截短突变体。适宜的截短突变体包括具有SEQ ID NO10-27中任何一种所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸，从C端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些N端和C端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
本发明还包括含有如下蛋白质的组成物，这些蛋白质包含、或基本由、或由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
因此，本发明包括由形成衣壳或VLP的蛋白质制备的组成物和疫苗组合物，由各种蛋白质亚单位和VLP或衣壳制备这些组成物的方法，制备这些蛋白质亚单位的方法，编码这些亚单位的核酸分子，和利用本发明的这些组成物接种和/或在个体中引发免疫应答的方法。
如上所述，本发明包括病毒样颗粒或其重组形式。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的组成物中使用的颗粒包含乙型肝炎核心蛋白(HBcAg)或HBcAg片段。在另一个实施方案中，本发明的组成物中使用的颗粒包含这样的乙型肝炎核心蛋白(HBcAg)或HBcAg片段，它们经过修饰除去或减少了游离半胱氨酸残基的数量。Zhou等人(J.Virol.665393-5398(1992))证实，修饰后除去自然存在的半胱氨酸残基的HBcAg保留连接并形成衣壳的能力。因此，适于在本发明的组成物中使用的VLP包括那些包含修饰的HBcAg或其片段的VLP，其中一个或多个自然存在的半胱氨酸残基已经删除或被替换为另一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。
HBcAg是通过加工乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的一种蛋白质。HBcAg的一些同种型已经被鉴定，本领域技术人员能够容易地获得其氨基酸序列。在大多数情况下，本发明的组成物和疫苗组合物分别用HBcAg的加工形式制备(即已经除去乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列的HBcAg)。
另外，在不发生加工的条件下生产HBcAg时，HBcAg通常表达为“加工的”形式。例如，当利用将蛋白质表达定向于细胞质的大肠杆菌表达系统生产本发明的HBcAg时，这些蛋白质通常表达为不含乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列。
可以用于本发明的乙型肝炎病毒样颗粒的制备在下列专利中公开，例如WO00/32227，具体见实施例17-19和21-24，以及WO01/85208，具体见实施例17-19、21-24、31和41，和本申请人于2002年1月18日提交的未决的美国申请号10/050,902。最后一个申请具体参照实施例23、24、31和51。全部三篇文献均在此引用作为参考。
本发明还包括经修饰后删除或置换了一个或多个其它半胱氨酸残基的HBcAg变体。本领域众所周知，游离半胱氨酸残基能够参与一些化学副反应。这些副反应包括二硫键交换，与例如在与其它物质联合治疗中注射或形成的化学物质或代谢物反应，或暴露于紫外线后的直接氧化以及与核苷酸的反应。于是可能产生毒性加合物，特别是考虑到HBcAg具有结合核酸的强烈倾向。毒性加合物以多种种类分布，它们单个均以低浓度存在，但同时存在时达到毒性水平。
鉴于上述，在疫苗组合物中使用经修饰除去天然存在的半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点是，当抗原或抗原决定簇附着时，毒性物质所能够结合的位点在数量上减少或者完全消失。
适用于实施本发明的一些天然存在的HBcAg变体已经被鉴定。例如，Yuan等人(J.Virol.7310122-10128(1999))描述了在对应于SEQID NO28的位点97处异亮氨酸残基被置换为亮氨酸残基或苯丙氨酸残基的变体。一些HBcAg变体以及几种乙型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列公开于GenBank报告AAF121240(SEQ ID NO29)、AF121239(SEQ ID NO30)、X85297(SEQ ID NO31)、X02496(SEQ IDNO32)、X85305(SEQ ID NO33)、X85303(SEQ ID NO34)、AF151735(SEQ ID NO35)、X85259(SEQ ID NO36)、X85286(SEQ ID NO37)、X85260(SEQ ID NO38)、X85317(SEQ ID NO39)、X85298(SEQ IDNO40)、AF043593(SEQ ID NO41)、M20706(SEQ ID NO42)、X85295(SEQ ID NO43)、X80925(SEQ ID NO44)、X85284(SEQ ID NO45)、X85275(SEQ ID NO46)、X72702(SEQ ID NO47)、X85291(SEQ IDNO48)、X65258(SEQ ID NO49)、X85302(SEQ ID NO50)、M32138(SEQ ID NO51)、X85293(SEQ ID NO52)、X85315(SEQ ID NO53)、U95551(SEQ ID NO54)、X85256(SEQ ID NO55)、X85316(SEQ IDNO56)、X85296(SEQ ID NO57)、AB033559(SEQ ID NO58)、X59795(SEQ ID NO59)、X85299(SEQ ID NO60)、X85307(SEQ ID NO61)、X65257(SEQ ID NO62)、X85311(SEQ ID NO63)、X85301(SEQ IDNO64)、X85314(SEQ ID NO65)、X85287(SEQ ID NO66)、X85272(SEQ ID NO67)、X85319(SEQ ID NO68)、AB010289(SEQ IDNO69)、X85285(SEQ ID NO70)、AB010289(SEQ ID NO71)、AF121242(SEQ ID NO72)、M90520(SEQ ID NO73)、P03153(SEQ IDNO74)、AF110999(SEQ ID NO75)和M95589(SEQ ID NO76)，其公开内容均在此引用作为参考。这些HBcAg变体在氨基酸序列的多个位点处不同，包括对应于位于SEQ ID NO77中位点12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183处氨基酸残基的氨基酸残基。WO00/198333、WO00/177158和WO00/214478描述了适于在本发明的组成物中使用、并可根据本申请书公开内容进一步修饰的其它HBcAg变体。
如上所述，在本发明的组成物和疫苗组合物中将分别使用一般为加工的HBcAg(即缺乏前导序列的)。本发明包括使用上述变体HbcAg的疫苗组合物，以及使用这些组合物的方法。
一种多肽的氨基酸序列是否具有与上述野生型氨基酸序列之一或其亚部分至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，可以利用公知的计算机程序如Bestfit程序常规确定。当利用Bestfit或其它任何序列比对程序确定一种具体序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时，设置参数，使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分数，并且同源性缺口可以为参照序列中氨基酸残基总数的5％。
具有SEQ ID NO29-72和73-76所示氨基酸序列的HBcAg变体和前体彼此相对相似。因此，HBcAg变体中位于对应于SEQ ID NO77中一个具体位点处的氨基酸残基，是指SEQ ID NO77所示氨基酸序列中该位点处的氨基酸残基。在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒之间，这些HBcAg变体之间的同源性在很大程度上足够高，因此本领域技术人员不难查阅分别如SEQ ID NO77所示的氨基酸序列，以及具体HBcAg变体的氨基酸序列，并鉴定“相应的”氨基酸残基。此外，SEQID NO73所示的HBcAg氨基酸序列，显示来源于感染土拨鼠的病毒的HBcAg的氨基酸序列，与含有SEQ ID NO77所示氨基酸序列的HBcAg有足够的同源性，显然在SEQ ID NO64中存在3个氨基酸残基的插入，位于SEQ ID NO77的氨基酸残基155与156之间。
本发明也包括包含感染鸟类的乙型肝炎病毒的HBcAg变体的疫苗组合物，以及包含这些HBcAg变体的片段的疫苗组合物。对于这些HBcAg变体，在应用于本发明的疫苗组合物中之前，这些多肽中自然存在的1、2、3个或更多的半胱氨酸残基可以被置换为另一种氨基酸残基或者删除。
如上所述，去除游离半胱氨酸残基减少了毒性成分能够与HBcAg结合的位点数，也除去了该HBcAg或相邻HBcAg分子的赖氨酸和半胱氨酸残基能够交联的位点。因此，在本发明的另一个实施方案中，乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一个或多个半胱氨酸残基被删除或替换为另一种氨基酸残基。
在其它实施方案中，本发明的组成物和疫苗组合物分别含有已经除去C端区(例如SEQ ID NO77的氨基酸残基145-185或150-185)的HBcAg。适于在本发明的实施中使用的其它修饰HBcAg包括C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
适于在本发明的实施中使用的HBcAg也包括N端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的修饰HBcAg。
适于在本发明的实施中使用的HBcAg还包括N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸并且从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
本发明还包括分别包含具有以下特征的HBcAg多肽的组成物和疫苗组合物，该HBcAg多肽包含、或基本由、或由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
在本发明的某些实施方案中，向HBcAg多肽内引入一个赖氨酸残基，以介导RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与HBcAg的VLP的结合。在优选实施方案中，用一种具有以下特征的HBcAg制备本发明的组成物，该HBcAg包含、或由SEQ ID NO77的氨基酸1-144或1-149、1-185组成，它经过修饰，使得对应于位点79和80的氨基酸被替换为氨基酸序列为Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO78)的肽。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO77位点48和107处的半胱氨酸残基突变为丝氨酸。本发明进一步包括含有具有以下特征的相应多肽的组成物，该多肽具有SEQ ID NO29-74中任何一种所示的氨基酸序列，也含有上述氨基酸改变。在本发明的范围内还包括能够连接形成衣壳或VLP并且含有上述氨基酸改变的其它HBcAg变体。因此，本发明进一步包括分别含有具有以下特征的HBcAg多肽的组成物和疫苗组合物，该多肽包含、或由与任何一种野生型氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列、以及必要时加工除去N端前导序列并通过上述改变修饰的这些蛋白质的形式组成。
本发明的组成物或疫苗组合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗组合物可由氨基酸序列不同的HBcAg组成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和一个或多个氨基酸残基已经改变(例如缺失、插入或置换)的修饰HBcAg的疫苗组合物。另外，本发明的优选疫苗组合物是表现为高度有序、重复的抗原阵列的组合物，其中该抗原是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，至少一个RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽通过至少一个共价键分别与所述核心颗粒和病毒样颗粒结合。优选地，至少一个RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽通过至少一个共价键分别与核心颗粒和病毒样颗粒结合，其中所述共价键是一种非肽键，分别产生核心颗粒-RANKL的有序、重复阵列和RANKL-VLP阵列或偶联物。这种RANKL-VLP阵列和偶联物一般且优选地分别具有重复、有序的结构，因为至少一个、通常一个以上的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽以定向方式与VLP结合。优选地，10、20、40、80、120个以上的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与VLP结合。根据下文应当理解，所述至少一个RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与VLP的定向、明确的结合和附着，分别确保了重复、有序的RANKL-VLP阵列和偶联物的形成。此外，VLP的典型、固有的高度重复、组织的结构有助于RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽以高度有序、重复的方式展示，分别产生高度组织、重复的RANKL-VLP阵列和偶联物。
因此，本发明优选的偶联物和阵列在高度组织化结构、大小和阵列表面抗原的重复性等方面分别不同于现有的偶联物。而且，本发明优选的实施方案还允许颗粒和抗原在表达宿主中表达，保证抗原(即至少一个RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽)的正确折叠，和VLP的正确折叠和装配。
本发明公开了RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与核心颗粒和VLP结合的方法。如本发明的一个方面所表明的，一般且优选地使用异双功能交联剂，通过化学交联使RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与核心颗粒和VLP结合。有几种异双功能交联剂在本领域公知。在优选实施方案中，异双功能交联剂含有一个能够与优选的第一附着位点(如核心颗粒和VLP或至少一个VLP亚单位的赖氨酸残基的侧链氨基)反应的功能基团，并含有另一个能够与优选的第二附着位点(如在RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽上自然存在并通过还原可供反应的半胱氨酸残基，或构建的并任选地通过还原可供反应的半胱氨酸残基)反应的功能基团。该方法的第一步，一般称为衍化，是核心颗粒或VLP与交联剂反应。反应产物是活化的核心颗粒或活化的VLP，也被称为活化的载体。第二步，用常用方法如凝胶过滤或透析除去未反应的交联剂。第三步，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与活化的载体反应，该步骤一般被称为偶联步骤。未反应的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽任选地可以在第四步例如通过透析除去。有几种异双功能交联剂在本领域公知。包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其它例如可从Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)获得的含有一个氨基反应性功能基团和一个半胱氨酸残基反应性功能基团的交联剂。上述交联剂均能导致硫醚键的形成。适于在本发明的实施中使用的另一类交联剂的特征在于偶联后在RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与核心颗粒或VLP之间引入一个二硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。交联剂衍化核心颗粒和VLP的程度分别可受不同实验条件影响，如每个反应物的浓度，一种试剂相对于另一种试剂的过量程度，pH，温度和离子强度。偶联程度，即分别在每个核心颗粒和VLP亚单位上RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的数量，可通过改变上述实验条件调节，以满足疫苗的要求。RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的溶解度可能限制能够在每个亚单位上偶联的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的数量，当获得的疫苗不可溶时，减少每个亚单位上RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的数量是有利的。
RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与核心颗粒和VLP结合的一种特别有利的方法是核心颗粒和VLP表面上的赖氨酸残基分别与RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽上的半胱氨酸残基连接。因此，在本发明的一个优选实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，第二附着位点是半胱氨酸残基。在某些实施方案中，为了分别与核心颗粒和VLP偶联，可能需要构建一个含有半胱氨酸残基的氨基酸接头，作为RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的第二附着位点或者作为第二附着位点的一部分。此外，也可通过插入或突变向RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽内引入半胱氨酸。此外，也可以通过化学偶联引入半胱氨酸残基或硫醇基。
氨基酸接头的选择分别取决于抗原和自身抗原的性质，即取决于RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的性质，其生化性质，如pI、电荷分布和糖基化。柔性的氨基酸接头通常是优选的。氨基酸接头的优选实施方案选自(a)CGG；(b)N-端γ-1接头；(c)N-端γ-3接头；(d)Ig铰链区；(e)N-端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5；(g)N-端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ-1接头；(m)C-端γ-3接头；(n)C-端甘氨酸接头；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5；(p)C-端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8。
氨基酸接头的进一步优选的实例包括免疫球蛋白的铰链区、甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n和甘氨酸接头(G)n，它们均进一步含有一个半胱氨酸残基作为第二附着位点，任选地还含有额外的甘氨酸残基。一般来说，所述氨基酸接头的优选实例是N-端γ1CGDKTHTSPP；C-端γ1DKTHTSPPCG；N-端γ3CGGPKPSTPPGSSGGAP；C-端γ3PKPSTPPGSSGGAPGGCG；N-端甘氨酸接头GCGGGG；C-端甘氨酸接头GGGGCG；C端甘氨酸-赖氨酸接头GGKKGC；N端甘氨酸-赖氨酸接头CGKKGG。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，特别是当抗原是一种RANKL肽时，在肽的C端优选GGCG、GGC或GGC-NH2(“NH2”表示酰胺化)接头，在其N端优选CGG，作为氨基酸接头。甘氨酸残基通常插入大氨基酸与作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免偶联反应中较大氨基酸的潜在空间位阻。
RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽上的半胱氨酸残基必须是还原状态，才能与活化的VLP上的异双功能交联剂反应，即必须有含有游离巯基的游离半胱氨酸或半胱氨酸残基。当作为结合位点的半胱氨酸残基是氧化形式时，例如，如果形成二硫桥键，则需要用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫桥键。
根据上述优选方法，利用异双功能交联剂使RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与核心颗粒和VLP结合，可使RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽以定向方式分别与核心颗粒和VLP偶联。RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与核心颗粒和VLP结合的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS分别交联RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与核心颗粒和VLP的方法。RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽也可以首先通过反应硫醇化，例如使用SATA、SATP或iminothiolane。必要时，在去保护之后，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽可以分别与核心颗粒和VLP偶联，如下所述。在分离过量的硫醇化试剂之后，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与预先用含有半胱氨酸反应性基团的异双功能交联剂活化的核心颗粒和VLP反应，因此展示至少一个或几个半胱氨酸残基反应性的功能基团，如上所述，硫醇化的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽能够与它反应。任选地，在反应混合物中含有少量的还原剂。另外一些方法使用同型双功能剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)，或含有分别对核心颗粒和VLP的胺基或羧基有反应性的功能基团的其它已知的同型双功能交联剂，使RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别附着于核心颗粒和VLP。
在另一个实施方案中，通过糖基化RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽上存在的碳水化合物部分的修饰以及随后分别与核心颗粒和VLP反应，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与核心颗粒和VLP结合。在一个实施方案中，糖基化的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽在碳水化合物部分的温和氧化反应中与高碘酸钠反应，产生活化的含有一个或多个醛基功能基团的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽。这样活化的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与过量的高碘酸钠分离，进而分别与核心颗粒和VLP反应，其中核心颗粒和VLP或至少一种VLP亚单位的赖氨酸残基分别与RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽上已经形成的醛基功能基团反应，如Hermanson，G.T.《生物偶联技术》，Academic PressInc.，San Diego，CA，USA所述。如上述公开文献所述，通过调节pH可以控制活化的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的自聚合。形成的希夫碱优选地用氰基硼氢化钠进一步还原，随后通过凝胶过滤或透析除去后者。此外，核心颗粒和VLP也可以分别在核心颗粒和VLP或至少一种VLP亚单位的羧基处与EDC和二酰肼如脂肪酸二酰肼反应，产生可与活化的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽上存在的一个或多个醛基功能基团反应的酰肼部分。这样形成的腙可以用氰基硼氢化钠进一步还原。此外，活化的含有一个或多个醛基功能基团的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽也与半胱胺反应，结果在RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽中引入一个半胱氨酸基团。适于RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与核心颗粒和VLP交联的其它交联方法和交联剂，以及进行交联反应和使用化学交联剂的指南和化学交联步骤，可参见Hermanson，G.T.《生物偶联技术》，Academic Press Inc.，San Diego，CA，USA。
VLP与RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的其它结合方法包括核心颗粒和VLP分别被生物素化，以及RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽表达为链霉亲和素融合蛋白的方法，或RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽以及核心颗粒和VLP分别都被生物素化的方法，如WO00/23955所述。在这种情况下，通过调节RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与链霉亲和素的比例，首先使RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与链霉亲和素或亲和素结合，使得仍有游离结合位点可以分别与下一步添加的核心颗粒和VLP结合。此外，也可以在“一锅”反应中混合所有成分。能够与核心颗粒和VLP或RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽交联的其它配体-受体对(其中受体和配体存在可溶形式可供利用)，也可以作为使RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与核心颗粒或VLP接合的结合剂。此外，配体或受体也可以与RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽融合，从而介导与化学结合或融合有受体或配体的核心颗粒和VLP的结合。融合也可以通过插入或置换实现。
如前所述，在本发明的一个优选实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP，在一个更优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP。
一个或几个抗原分子，即RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，可以附着于RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳或VLP的一个亚单位上，如果空间上允许，优选地通过RNA噬菌体VLP的暴露的赖氨酸残基附着。RNA噬菌体外壳蛋白的VLP，特别是Qβ外壳蛋白VLP的一个具体特征是每个亚单位可以偶联几个抗原的可能性。这能够产生密集的抗原阵列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一个RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽分别与核心颗粒和病毒样颗粒的结合和附着是通过病毒样颗粒的至少一个第一附着位点与抗原或抗原决定簇的至少一个第二附着位点之间的相互作用和连接而实现的。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面展示数量确定的赖氨酸残基，具有确定的布局，有3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用，另外4个赖氨酸残基暴露于衣壳外面。这些明确的特性有利于抗原附着于颗粒外部，而不是赖氨酸残基与RNA相互作用的颗粒内部。其它RNA噬菌体外壳蛋白的VLP在其表面也有数量确定的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基有确定的布局。
在本发明的进一步优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，并且/或者第二附着位点包含巯基或半胱氨酸残基。在本发明的一个非常优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，第二附着位点是半胱氨酸残基。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，通过其上自然存在的或构建的半胱氨酸残基与RNA噬菌体外壳蛋白VLP的赖氨酸残基特别是与Qβ外壳蛋白VLP的赖氨酸残基结合。
来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中的高表达量，这允许以较低的成本生产大量的材料。
如上所述，本发明的偶联物和阵列在高度组织化结构、大小以及阵列表面抗原重复性等方面分别不同于现有的偶联物。而且，用VLP作为载体可以分别形成具有不同抗原密度的坚固的抗原阵列和偶联物。具体而言，使用RNA噬菌体的VLP，特别是使用RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP，能够获得极高的表位密度。具有高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白VLP组成物的制备可以根据本申请所述实现。
如此处定义的第二附着位点可以是天然存在或非天然存在于抗原或抗原决定簇。如果抗原或抗原决定簇上没有合适的天然存在的第二附着位点，则必须为该抗原构建非天然的第二附着位点。
如上所述，有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的VLP表面。这些残基一般在与交联剂分子反应时被衍化。如果不是所有暴露的赖氨酸残基都与抗原偶联，在衍化步骤后，与交联剂反应的赖氨酸残基中交联剂分子与ε-氨基附着。这导致一个或几个正电荷丢失，可能不利于VLP的可溶性和稳定性。如下文所述的公开的Qβ外壳蛋白突变体中，通过用精氨酸代替一些赖氨酸残基，我们防止了正电荷的过多丢失，因为精氨酸残基不与交联剂反应。而且，用精氨酸代替赖氨酸残基可产生更确定的抗原阵列，因为可以与抗原反应的位点变少了。
因此，在本申请公开的下列Qβ外壳蛋白突变体和突变Qβ VLP中，用精氨酸替换了暴露的赖氨酸残基Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ IDNO23)、Qβ-250(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO25)和Qβ-259(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO27)。克隆构建体、表达蛋白质、纯化VLP，并与肽和蛋白质抗原偶联。也构建了Qβ-251(SEQ ID NO26)，在本申请中能够找到关于如何表达、纯化和偶联Qβ-251外壳蛋白VLP的指南。
在另一个实施方案中，我们公开了含有一个额外赖氨酸残基的Qβ突变外壳蛋白，它适用于获得更高密度的抗原阵列。克隆该突变Qβ外壳蛋白Qβ-243(Asn10-Lys；SEQ ID NO24)，表达蛋白质，分离并纯化衣壳或VLP，表明额外赖氨酸残基的引入不妨碍亚单位自装配为衣壳或VLP。因此，可以用Qβ外壳蛋白突变体的VLP制备RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽阵列和偶联物。抗原与VLP附着、特别是与RNA噬菌体外壳蛋白VLP附着的一种特别优选的方法是连接RNA噬菌体外壳蛋白VLP表面的赖氨酸残基与抗原(即RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽)上自然存在的或构建的半胱氨酸残基。为了使半胱氨酸残基能够有效地作为第二附着位点，必须有一个巯基能用来偶联。因此，半胱氨酸残基必须是还原状态，即，必须有一个游离半胱氨酸或含有游离巯基的半胱氨酸残基。如果作为第二附着位点的半胱氨酸残基是氧化形式，例如，如果它形成二硫桥键，则需要使用如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。必须根据每种抗原调节还原剂的浓度和还原剂超过抗原的摩尔数。必要时需要检测滴定范围，从低至10μM或更低的浓度，到可达10-20mM或更高，并估计抗原与载体的偶联。虽然如本申请人于2002年1月18日提交的未决的美国申请号10/050,902所述，低浓度还原剂适于偶联反应，但技术人员应当知道，较高的还原剂浓度抑制偶联反应，此时必须通过透析或凝胶过滤除去还原剂。透析或平衡缓冲液的pH值低于7，优选低于6。必须检测低pH缓冲液与抗原活性或稳定性的相容性。
通过选择交联剂和其它反应条件，能够调节RNA噬菌体外壳蛋白的VLP上的表位密度。例如，交联剂Sulfo-GMBS和SMPH一般能够获得高表位密度。高浓度反应物正向影响衍化，可以通过操纵反应条件来控制与RNA噬菌体外壳蛋白VLP偶联、特别是与Qβ外壳蛋白VLP偶联的抗原数量。
在设计非天然的第二附着位点之前，必须选择融合、插入或一般构建的位置。例如，第二附着位点位置的选择可以以抗原的晶体结构为基础。抗原的这种晶体结构可以提供关于分子C端或N端的可用性(例如取决于溶剂可及性)或关于适于作为第二附着位点的残基(如半胱氨酸残基)暴露于溶剂的信息。对于Fab片段，暴露的二硫桥键也可以是第二附着位点的来源，因为通过温和还原，它们通常能够转化为单个半胱氨酸残基。可以选择不影响RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的免疫原性的温和还原条件。如果自身抗原免疫旨在抑制自身抗原与其天然配体的相互作用，通常添加第二附着位点，使得能够产生针对与天然配体相互作用位点的抗体。因此选择第二附着位点的位置，以避免第二附着位点或含有第二附着位点的任何氨基酸接头的空间位阻。在其它实施方案中，希望有针对不同于自身抗原与其天然配体相互作用位点的抗体应答。在这些实施方案中，第二附着位点的选择应防止产生针对自身抗原与其天然配体相互作用位点的抗体。
选择第二附着位点位置的其它标准包括抗原的寡聚状态、寡聚位点、辅因子的存在、以及是否存在揭示抗原结构和序列中如下位点的实验证据其中抗原的修饰不妨碍自身抗原的功能或者不妨碍产生可识别自身抗原的抗体。
在最优选的实施方案中，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽包含单一的第二附着位点或单一的反应性附着位点，它们分别能够与位于核心颗粒、VLP或VLP亚单位上的第一附着位点连接。这确保了至少1个、一般1个以上、优选地超过10、20、40、80、120个抗原分别与核心颗粒和VLP确定、均一地结合和连接。因此，抗原上含有单一第二附着位点或单一反应性附着位点确保了单一、均一类型的结合和连接，产生高度有序、重复的阵列。例如，如果通过赖氨酸(作为第一附着位点)和半胱氨酸(作为第二附着位点)相互作用分别实现结合和连接，根据本发明该优选实施方案，确保了每个抗原只有一个半胱氨酸残基能够分别与VLP和核心颗粒的第一附着位点结合和连接，而无论该半胱氨酸残基在抗原上是天然存在还是非天然存在。
在一些实施方案中，在抗原上构建第二附着位点需要融合一个含有根据本发明的公开内容适于作为第二附着位点的氨基酸的氨基酸接头。因此，在本发明的一个优选实施方案中，氨基酸接头通过至少一个共价键与抗原或抗原决定簇结合。优选地，该氨基酸接头包含或由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，氨基酸接头包含一个巯基或半胱氨酸残基。在另一个优选实施方案中，该氨基酸接头是半胱氨酸。根据本发明，氨基酸接头的一些选择标准以及氨基酸接头的进一步优选实施方案在上文中已经提及。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述至少一个抗原或抗原决定簇，即RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，分别与核心颗粒和病毒样颗粒融合。如上所述，VLP一般由至少一种可装配为VLP的亚单位组成。因此，在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇，优选地所述至少一个RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，与病毒样颗粒或能够掺入VLP内的蛋白质的至少一个亚单位融合，产生嵌合VLP-亚单位-RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽融合蛋白。
RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的融合可以按如下实现插入VLP亚单位序列内，或与VLP亚单位或能够掺入VLP内的蛋白质的N端或C端融合。在下文中，当述及一种肽与VLP亚单位的融合蛋白时，包括该肽与亚单位序列任一端的融合或向亚单位序列内的内部插入。
也可以按如下实现融合向VLP亚单位变体内插入RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽序列，其中亚单位序列的一部分缺失，被称为截短突变体。截短突变体可能包括VLP亚单位序列的N端或C端部分缺失或内部部分缺失。例如，氨基酸残基79-81缺失的特定VLP HBcAg是含有内部缺失的截短突变体。RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与截短突变体VLP亚单位的N端或C端的融合也是本发明的实施方案。同样，也可以通过置换实现表位在VLP亚单位序列内的融合，例如对于特定VLP HBcAg，用一种外源表位代替氨基酸79-81。因此，如下文所述，实现融合的方法包括向VLP亚单位的序列中插入RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽序列，用RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽序列置换VLP亚单位序列的一部分，或者缺失、置换或插入的组合。
嵌合的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽-VLP亚单位通常能够自装配为VLP。展示与其亚单位融合的表位的VLP在此也被称为嵌合VLP。如上所述，病毒样颗粒包含或由至少一种VLP亚单位组成。在本发明的另一个实施方案中，病毒样颗粒包含或由嵌合VLP亚单位和非嵌合VLP亚单位(即不含融合抗原的VLP亚单位)的混合物组成，产生所谓的镶嵌颗粒。这可能有利于确保VLP的形成和装配。在这些实施方案中，嵌合VLP-亚单位的比例可以是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95％或更高。
可以向与VLP亚单位序列任一端融合或者VLP亚单位序列内部插入的肽或表位序列的任一端添加侧翼氨基酸残基。在待融合的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽中的侧翼序列中使用甘氨酸和丝氨酸残基是特别优选的。甘氨酸残基提供额外的柔韧性，这可降低外源序列向VLP亚单位序列内融合的可能的去稳定作用。
在本发明的一个具体实施方案中，VLP是一种乙型肝炎核心抗原VLP。已经报道了与HBcAg N端的融合(Neyrinck，S.等人，NatureMed.51157-1163(1999))、或向所谓的主要免疫显性区(MIR)的插入融合(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，WO01/98333)，它们是本发明的优选实施方案。MIR中存在缺失的HBcAg的自然存在的变体也已经有报道(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，在此全文引用作为参考)，与N端或C端的融合、以及与野生型HBcAg相比在对应于缺失位点的MIR位点处的插入融合，也是本发明的实施方案。与C端的融合也已经有报道(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。本领域技术人员能够容易地找到如何利用经典分子生物学技术构建融合蛋白的指南(Sambrook，J.等人编著，《分子克隆实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ho等人，Gene 7751(1989))。编码HBcAg和HBcAg融合蛋白并且可用于表达HBcAg和HBcAg融合蛋白的载体和质粒已经有报道(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，Neyrinck，S.等人，Nature Med.51157-1163(1999))，可以在本发明的实施中使用。通过实施例(实施例6)，我们也描述了向HBcAg的MIR内插入一种表位，产生嵌合的自装配HBcAg。优化自装配效率和展示插入HBcAgMIR内的表位的一个重要因素是插入位点的选择，以及插入时从MIR内HBcAg序列上删除的氨基酸数量(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP0 421 635；US6,231,864)，或者换句话说，HBcAg的哪些氨基酸将被置换为新的表位。例如，已经报道了用外源表位置换HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP0421635；US6,231,864)。HBcAg含有一个长精氨酸尾(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))，它不是衣壳装配所必需的，能够结合核酸(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。包含或缺乏这一精氨酸尾的HBcAg是本发明的两个实施方案。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP。在细菌、特别是在大肠杆菌中表达后，RNA噬菌体的主要外壳蛋白自发装配为VLP。能够用来制备本发明组成物的噬菌体外壳蛋白的具体实例包括RNA噬菌体如噬菌体Qβ(SEQ ID NO10；PIR数据库，登录号VCBPQβ指Qβ CP，和SEQ ID NO11；登录号AAA16663指Qβ A1蛋白)和噬菌体fr(SEQ ID NO4；PIR登录号VCBPFR)的外壳蛋白。
在一个更优选的实施方案中，所述至少一个RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与一种Qβ外壳蛋白融合。已经报道了如下融合蛋白构建体，其中表位与Qβ A1蛋白截短形式的C端融合，或插入A1蛋白内(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology，399-15(1996))。A1蛋白是通过UGA终止密码子的抑制产生的，长度为329个氨基酸，或者如果考虑N端蛋氨酸的切除，为328个氨基酸。丙氨酸(Qβ CP基因编码的第二个氨基酸)之前N端蛋氨酸的切除在大肠杆菌中常常发生，Qβ外壳蛋白CP的N端也是如此。位于UGA琥珀密码子3’的A1基因部分编码长度为195个氨基酸的CP延伸。在CP延伸的位点72与73之间插入至少一个RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，形成本发明另一实施方案(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))。RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽在C端截短的Qβ A1蛋白C端的融合形成本发明的进一步优选的实施方案。例如，Kozlovska等人(Intervirology 399-15(1996))描述了如下Qβ A1融合蛋白，其中表位在位点19处截短的Qβ CP延伸的C端融合。
如Kozlovska等人(Intervirology 399-15(1996))所述，展示融合表位的颗粒的装配一般需要同时存在A1蛋白-RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽融合和野生型CP，才能形成镶嵌颗粒。然而，本发明的范围内也包括包含如下病毒样颗粒、特别是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP的实施方案其仅仅由融合了至少一个RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的VLP亚单位组成。
镶嵌颗粒的产生可以用多种方法实现。Kozlovska等人，Intervirology 399-15(1996)描述了两种方法，它们均能在本发明的实施中使用。第一种方法，通过在CP与CP延伸之间含有一个UGA终止密码子的编码Qβ A1融合蛋白的质粒在具有下述特征的大肠杆菌株中表达，介导VLP上融合表位的有效展示，该大肠杆菌株携带编码克隆的UGA抑制性tRNA的质粒，使UGA密码子翻译为Trp(pISM3001质粒(Smiley B.K.等人，Gene 13433-40(1993)))。另一种方法，将CP基因终止密码子修饰为UAA，共转化表达A1蛋白-RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽融合蛋白的第二种质粒。第二种质粒编码不同的抗生素抗性，其复制起点与第一种质粒相一致(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))。第三种方法，CP和A1蛋白-RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的融合蛋白以双顺反子的形式编码，与一种启动子如Trp启动子有效连接，如Kozlovska等人，Intervirology 399-15(1996)的图1所示。
在另外一个实施方案中，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽插入fr CP的氨基酸2与3之间(切割的CP的编号，其中N端蛋氨酸已经切除)，从而产生RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽-frCP融合蛋白。用于构建和表达可自装配为VLP的fr CP融合蛋白并且在本发明的实施中可以使用的载体和表达系统已有报道(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993))。在一个具体实施方案中，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽序列插入fr CP缺失变体内氨基酸2之后，其中fr CP的残基3和4已经删除(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993))。
还报道了表位在RNA噬菌体MS-2外壳蛋白的N端突起β-发夹中的融合，以及随后融合表位在RNA噬菌体MS-2的自装配VLP上的呈递(WO92/13081)，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽通过插入或置换向MS-2 RNA噬菌体的外壳蛋白内的融合也属于本发明的范围。
在本发明的另一个实施方案中，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与乳头瘤病毒的衣壳蛋白融合。在一个更具体的实施方案中，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1融合。已报道了用于构建及在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达BPV-1融合蛋白的载体和表达系统(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO00/23955)。用一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽置换BLV-1 L1的氨基酸130-136，产生BPV-1 L1-RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽融合蛋白，这是本发明的一个优选实施方案。已报道了在杆状病毒载体中克隆以及在杆状病毒感染的Sf9细胞中的表达，这可以在本发明的实施中应用(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO00/23955)。展示融合的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的装配颗粒可以用多种方法纯化，例如凝胶过滤或蔗糖梯度超速离心(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO00/23955)。
在本发明的另一个实施方案中，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与能够掺入Ty VLP内的Ty蛋白融合。在一个更具体的实施方案中，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽与TYA基因编码的p1或衣壳蛋白融合(Roth，J.F.，Yeast 16785-795(2000))。酵母逆转录转座子Ty1、2、3、4已经从酿酒酵母中分离，而逆转录转座子Tf1已经从粟酒裂殖酵母中分离(Boeke，J.D.和Sandmeyer，S.B.，“酵母转座元件”，《酵母的分子和细胞生物学基因组动力学、蛋白质合成和能量学》，p.193，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1991))。逆转录转座子Ty1和2与植物和动物元件的copia类别有关，而Ty3属于逆转录转座子的gypsy家族，它与植物和动物逆转录病毒有关。在Ty1逆转录转座子中，p1蛋白，也被称为Gag或衣壳蛋白，长度为440个氨基酸。在VLP的成熟过程中p1在位点408处被切割，产生p2蛋白，后者是VLP的必要组分。
已报道了与p1的融合蛋白和在酵母中表达所述融合蛋白的载体(Adams，S.E.等人，Nature 32968-70(1987))。例如，通过向pMA5620质粒的BamHI位点内插入编码RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的序列，该RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽可以与p1融合(Adams，S.E.等人，Nature 32968-70(1987))。将编码外源表位的序列克隆到pMA5620载体内导致融合蛋白的表达，该融合蛋白包含Ty1-15的p1的氨基酸1-381，其C端与外源表位的N端融合。同样，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的N端融合，或向p1序列内的内部插入，或p1序列的部分置换，也属于本发明的范围。具体而言，在Ty序列内位于Ty蛋白p1的氨基酸30-31、67-68、113-114和132-133之间插入RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽(EP0677111)，形成本发明的优选实施方案。
适于RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽融合的其它VLP有，例如逆转录病毒样颗粒(WO9630523)、HIV2 Gag(Kang，Y.C.等人，Biol.Chem.380353-364(1999))、豇豆花叶病毒(Taylor，K.M.等人，Biol.Chem.380387-392(1999))、细小病毒VP2 VLP(Rueda，P.等人，Virology 26389-99(1999))、HBsAg(US4,722,840，EP0020416B1)。
适于实施本发明的嵌合VLP的实例也包括Intervirology 391(1996)所述的那些。预期可用于本发明的VLP的其它实例有HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、烟草花叶病毒。也已经制备了SV40、多瘤病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒和诺瓦克病毒的病毒样颗粒，这些VLP的嵌合VLP也属于本发明的范围。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽。
在本发明的一个进一步非常优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是一种人RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇包含、基本由、或者由一种选自下组的氨基酸序列组成a)SEQ ID NO79的氨基酸序列；b)SEQ ID NO79的任一个片段的氨基酸序列。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽变体，例如特别是含有氨基酸置换或肽插入或多态性的变体。如前所述，包含RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽变体的组成物和疫苗组合物分别也属于本发明的范围。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是RANKL片段。优选地，该抗原或抗原决定簇是选自下组的人RANKL片段a)人RANKL的胞外区，b)人RANKL的剪接同工型1；c)产生分泌型人RANKL的剪接同工型2，d)蛋白水解产生的人RANKL的可溶区，和e)TNF-α同源区。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇包含、基本由、或者由一种选自下组的氨基酸序列组成a)SEQ ID NO79的氨基酸序列；b)SEQ ID NO80的氨基酸序列；c)SEQ ID NO81的氨基酸序列；d)SEQ ID NO82的氨基酸序列；e)SEQ ID NO83的氨基酸序列；f)SEQ ID NO84的氨基酸序列；g)SEQ ID NO100的氨基酸序列；h)SEQ ID NO101的氨基酸序列；i)SEQ ID NO79-84、100、101中任一个的任何片段的氨基酸序列。
RANKL蛋白和RANKL片段可以通过在原核或真核表达系统中表达RANKL cDNA产生。许多实例已经在文献中描述，可能在修饰后，它们可以用来表达所需形式的任何RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽。RANKL蛋白和RANKL片段已经在哺乳动物细胞(Anderson，D.M.等人，Nature 390175-179(1997)，Lacey，D.L.等人，Cell 93165-176(1998)，Wong B.R.等人，J.Biol.Chem.27225190-25194(1997)，Lum，L.等人，J.Biol.Chem.27413613-13618(2000))、昆虫细胞(Willard，D.等人，Prot.Express.Purif.2048-57(2000))、原核细胞(Xu，J.等人，J.Bone Mineral Res.152178-86(2000)，Yasuda等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 953597-3602(1998))中表达。WO9846751、US5,843,678、WO98259958、US6,242,586、WO9828426、US6,242,213、WO9929865、JP2000102390和WO0015807中也有如何生产RANKL蛋白和片段的公开内容。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是一种RANKL肽。这种RANKL肽或其片段可以用标准分子生物学技术生产，其中编码目的片段的核苷酸序列通过PCR扩增，并且克隆为与多肽尾(如组氨酸尾、Flag尾、myc尾)或抗体恒定区(Fc区)融合的融合体。在RANKL片段与该尾之间引入一个蛋白酶酶切位点，纯化后用相应蛋白酶消化可以使RANKL片段能够与该尾分离。另一种方法，可以用本领域技术人员周知的标准肽合成反应在体外合成RANKL片段。另一种方法，通过蛋白酶消化或化学切割全长RANKL蛋白或RANKL片段，可以生产RANKL肽或RANKL片段，这两种方法都是本领域技术人员周知的。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原簇还包含至少一个第二附着位点，该位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇中非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中自然存在的附着位点。本申请中给出了关于如何修饰用于结合病毒样颗粒的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的指南。优选的第二附着位点包含一个用于结合衍化VLP的半胱氨酸，以上描述和实施例12和13中给出了实例。
我们已经建立了与TNF-α同源的人RANKL区的三维结构模型。我们发现，在与本发明VLP上第一附着位点相互作用的折叠结构中，天然存在的半胱氨酸可能不可接近。最近解析的小鼠RANKL的X射线结构证实了我们的模型(Lam，J.等人，J.Clin.Invest.108971-979(2002))。优选在N端附着含一个氨基酸接头的第二附着位点，该附着位点含有一个如实施例12所述额外的半胱氨酸残基。然而，如实施例13所述，含有一个半胱氨酸残基作为第二附着位点并且在RANKL构建体C端融合的氨基酸接头是本发明的进一步优选的实施方案。具有一个含半胱氨酸残基并与RANKL胞外区融合的N-端氨基酸接头的人RANKL构建体是本发明的一个极其优选的实施方案。
现公开了小鼠RANKL片段构建体(SEQ ID NO96和SEQ IDNO99)，也可以制备优选的人RANKL片段构建体，例如SEQ IDNO100-104的序列。进一步优选的构建体包含完整的人RANKL蛋白、选自下组的人RANKL片段a)RANKL的胞外区(SEQ ID NO82)，b)RANKL的剪接同工型1(SEQ ID NO80)；c)产生分泌型RANKL的剪接同工型2(SEQ ID NO81)，d)蛋白水解产生的RANKL可溶区(SEQID NO83)，和e)TNF-α同源区(SEQ ID NO84)或人RANKL肽序列。使用优选含有与VLP结合的人RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽的本发明组成物，针对RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽免疫，可以提供一种治疗或预防骨病的方法。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽包含RANKL蛋白的至少一个抗原性位点。本领域技术人员知道如何分别鉴定相应的肽和氨基酸序列。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是一种对于与受体RANK的相互作用而言非常重要的RANKL肽。我们对人RANKL结构的模拟和已发表的小鼠RANKL的晶体结构表明，RANKL单体由含两条反向平行的扁平β-折叠的β-夹心组成。第一个折叠由β-链A”、A、H、C和F构成，而第二个折叠由β-链B’、B、G、D和E构成。内部的A”AHCF β-折叠参与亚单位间的连接，而B’BGDE β-折叠主要分布于外表面。β-链通过AA”环、CD环、DE环、EF环连接。装配成同源三聚体，使得每个RANKL单体中β-夹心的一边正对相邻单体的AHCF β-折叠的内部疏水表面包装。现在认为RANK结合位点包括由同源三聚体的相邻单体形成的裂隙。根据小鼠与人序列的同源性，选择包含RANK结合位点的肽。在一个优选实施方案中，来自RANKL与RANK相互作用位点的肽选自a)包括氨基酸171-194的AA”环(SEQ ID NO87)，b)包括氨基酸246-253的DE环(SEQ ID NO88)，c)包括氨基酸235-245的β-链D(SEQ ID NO89)，d)包括氨基酸223-234的CD环(SEQ ID NO90)，e)包括氨基酸262-272的EF环(SEQ ID NO91)，f)包括氨基酸200-207的β-链B’-环B’B(SEQID NO92)，g)包括氨基酸300-305的GH环(SEQ ID NO93)，h)所述肽a-g的任何一个片段，i)所述肽a-g的任何N端和/或C端延伸，其为至少1个氨基酸到25个氨基酸，j)肽a-i的任何融合体。适用于本发明的其它RANKL肽可以根据其固有的诱发T细胞或抗体应答的特性经过实验确定。通常如下实现用选择的肽在适于免疫的制剂中分别免疫实验动物，用本领域技术人员周知的方法测定T细胞和B细胞应答(即抗体应答)。如果抗原是一种蛋白质、多肽或肽，该区可以由连续氨基酸序列构成。或者，抗体表位也可以由不连续的氨基酸序列构成，其中在蛋白质、多肽或肽的三维折叠后，这些氨基酸以空间紧靠并形成表位的方式排列。如上所述，连续的目的肽片段可以通过免疫实验鉴定。
适用于本发明的进一步优选的RANKL肽可以用已有的或将有的单克隆或多克隆抗体确定，其方法为本领域技术人员周知。
适用于本发明的其它RANKL肽可以通过用RANKL特异性抗体筛查噬菌体展示肽库来确定，这是本领域技术人员周知的一种方法。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是任何动物的分离的RANKL，以及任何动物RANKL的任何抗原性片段。本领域技术人员知道如何由这些分离的RANKL蛋白或片段产生片段和肽。
相关领域的普通技术人员应当理解，对此处所述的方法和应用进行其它适当的修饰和改变是显而易见的，可以在不背离本发明的范围或其任何实施方案的情况下进行这种修饰和改变。现在已经详细描述了本发明，通过下列实施例将能更清楚地理解本发明，这些实施例只是用于说明，而无意限制本发明。
实施例实施例1突变Qβ外壳蛋白的构建和表达，突变Qβ外壳蛋白VLP或衣壳的纯化质粒构建和突变外壳蛋白的克隆pQβ-240的构建质粒pQβ10(Kozlovska，TM等人，Gene137133-137)作为构建pQβ-240的起始质粒。突变Lys13→Arg通过反向PCR产生。反向引物设计为反向尾-尾方向5′-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3′和5′-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3′。
第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，第二次PCR使用上游引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′和下游引物5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′。第二次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆到用相同限制性内切酶酶切的pQβ10表达载体中。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商方法进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-240的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的高效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列(SEQ ID NO23)AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-243的构建质粒pQβ10作为构建pQβ-243的起始质粒。突变Asn10→Lys通过反向PCR产生。反向引物设计为反向尾-尾方向5′-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3′和5′-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3′。
第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，第二次PCR使用上游引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′和下游引物5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′。第二次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆到用相同限制性内切酶酶切的pQβ10表达载体中。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商方法进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-243的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的高效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列(SEQ ID NO24)AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-250的构建质粒pQβ-240作为构建pQβ-250的起始质粒。突变Lys2→Arg通过定点诱变产生。用上游引物5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′和下游引物5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′合成突变PCR片段，将其导入pQβ-185表达载体内单一的限制酶切位点NcoI和HindIII处。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商方法进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-250的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列(SEQ ID NO25)ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-251的构建质粒pQβ10作为构建pQβ-251的起始质粒。突变Lys16→Arg通过反向PCR产生。反向引物设计为反向尾-尾方向5′-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3′和5′-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3′。
第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，第二次PCR使用上游引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′和下游引物5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′。第二次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆到用相同限制性内切酶酶切的pQβ10表达载体中。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商方法进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-251的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。由该构建体编码的氨基酸序列如SEQ.ID NO26所示。
pQβ-259的构建质粒pQβ-251作为构建pQβ-259的起始质粒。突变Lys2→Arg通过定点诱变产生。用上游引物5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′和下游引物5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′合成突变PCR片段，将其导入pQβ-185表达载体中单一的限制酶切位点NcoI和HindIII处。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商方法进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-259的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列(SEQ ID NO27)AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYQβ和Qβ突变体的表达与纯化的一般方法表达用Qβ外壳蛋白表达质粒转化大肠杆菌JM109。含20μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基中接种用Qβ外壳蛋白表达质粒转化的克隆。接种的培养物不加振摇37℃温育16-24小时。制备的接种物随后用含有20μg 1ml氨苄青霉素的100-300ml新鲜LB培养基1∶100稀释，并且不加振摇37℃温育过夜。获得的二次接种物在摇瓶中用含有1％酪蛋白氨基酸和0.2％葡萄糖的M9培养基1∶50稀释，并且在振摇下37℃温育过夜。
纯化纯化程序使用的溶液和缓冲液1.裂解缓冲液LB50mM Tris-HCl pH8.0，含5mM EDTA，0.1％tritonX100和新鲜制备的5微克/毫升PMSF。不含溶菌酶和DNAse。
2.SAS饱和硫酸铵水溶液。
3.缓冲液NET20mM Tris-HCl，pH7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEG40％(w/v)聚乙二醇6000，溶于NET破碎与裂解冷冻细胞以2ml/g细胞的浓度重悬浮于LB中。将混合物以22kH超声处理5次各15秒，间隔1分钟，在冰上冷却该溶液。然后用JaneckiK60转头以14000rpm离心裂解液1小时。除非另外说明，以下描述的离心步骤全都用同一转头进行。上清液贮存于4℃，而细胞碎片用LB洗涤2次。离心后合并裂解液上清液和洗涤级分。
分级分离在搅拌下，向上述合并的裂解液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液。调节SAS的体积为总体积的1/5，获得20％的饱和度。将溶液静置过夜，次日以14000rpm离心20分钟。沉淀用少量20％硫酸铵洗涤，再次离心。合并获得的上清液，逐滴加入SAS，获得40％的饱和度。将溶液静置过夜，次日以14000rpm离心20分钟。获得的沉淀溶解于NET缓冲液中。
层析将溶解于NET缓冲液中的衣壳或VLP蛋白加样到SepharoseCL-4B柱上。在层析过程中洗脱出3个峰。第一个峰主要含有膜和膜片段，不予收集。衣壳含于第二个峰中，而第三个峰含有其它大肠杆菌蛋白质。
合并峰级分，将NaCl浓度调节至终浓度为0.65M。在搅拌下逐滴加入体积相当于合并峰级分一半的PEG溶液。将该溶液不加搅拌静置过夜。以14000rpm离心20分钟沉淀衣壳蛋白。然后溶解于最小体积的NET中，再次加样到Sepharose CL-4B柱上。合并峰级分，用60％饱和(w/v)的硫酸铵沉淀。离心并溶解于NET缓冲液后，将衣壳蛋白加样到Sepharose CL-6B柱上再次进行层析。
透析和干燥合并以上获得的峰级分，用无菌水充分透析，冻干保存。
Qβ-240的表达和纯化将细胞(质粒QP-240转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中，超声处理5次各15秒(水冰夹套)，13000rpm离心1小时。将上清液贮存于4℃，直到进一步加工，而碎片用9ml LB洗涤2次，最后用9ml 0.7M尿素LB溶液洗涤。合并所有上清液，加样到SepharoseCL-4B柱上。用硫酸铵沉淀合并的峰级分并离心。重新溶解的蛋白质然后用Sepharose 2B柱、最后用Sepharose 6B柱进一步纯化。最后衣壳峰用水充分透析，如上所述冻干。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-243的表达和纯化将细胞(大肠杆菌RR1)重悬浮于LB中，如一般方法所述进行处理。用Sepharose CL-4B柱、最后用Sepharose CL-2B柱，通过连续两次凝胶过滤步骤纯化该蛋白质。合并峰级分，如上所述冻干。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-250的表达和纯化将细胞(pQβ-250转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中，如上所述进行处理。用Sepharose CL-4B、最后用Sepharose CL-2B柱，通过凝胶过滤纯化该蛋白质，如上所述冻干。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-259的表达和纯化将细胞(pQβ-259转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中并超声处理。碎片用10ml LB洗涤1次，第二次用10ml 0.7M尿素LB溶液洗涤。该蛋白质用Sepharose CL-4B柱通过两次凝胶过滤层析步骤纯化。如上所述透析并冻干蛋白质。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
实施例2含有一个赖氨酸残基的肽向HBcAg(1-149)c/e1表位内的插入HBcAg的c/e1表位(残基72-88)位于乙型肝炎病毒衣壳(HBcAg)表面的尖端区中。通过基因工程方法用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly置换该区的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)(HBcAg-Lys构建体)。引入的赖氨酸残基在其侧链上含有一个反应性氨基，能够用于HBcAg颗粒与含有游离半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。
具有SEQ ID NO78所示氨基酸序列的HBcAg-Lys DNA通过PCR产生分别PCR扩增编码HBcAg片段(氨基酸残基1-78和81-149)的两个片段。这些PCR使用的引物中也引入编码Gly-Gly-Lys-Gly-Gly肽的DNA序列。HBcAg(1-78)片段用引物EcoRIHBcAg(s)和Lys-HBcAg(as)从pEco63扩增。HBcAg(81-149)片段用引物Lys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)从pEco63扩增。引物Lys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在两种PCR产物的末端引入互补DNA序列，使得两种PCR产物在随后的装配PCR中融合。装配的片段用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)PCR扩增。
对于PCR，在含有2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mMMgSO4的50ml反应混合物中使用100pmol每种oligo和50ng模板DNA。对于这两个反应，温度循环如下进行94℃2分钟；94℃(1分钟)，50℃(1分钟)，72℃(2分钟)30个循环。
引物序列EcoRIHBcAg(s)(5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3’)Lys-HBcAg(as)(5’-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3’)Lys-HBcAg(s)(5’-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3’)HBcAg(1-149)Hind(as)(5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)为了通过PCR融合这两个PCR片段，在含有2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50ml反应混合物中使用100pmol引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，以及100ng两种纯化的PCR片段。PCR循环条件为94℃2分钟；94℃(1分钟)，50℃(1分钟)，72℃(2分钟)30个循环。装配的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，纯化，在适当缓冲液中用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化19小时。消化的DNA片段连接于EcoRI/HindIII-消化的pKK载体中，产生pKK-HBcAg-Lys表达载体。通过EcoRI/HindIII限制酶切分析和插入片段的DNA测序对PCR产物向载体内的插入进行分析。
实施例3HBcAg-Lys的表达与纯化用pKK-HBcAg-Lys转化大肠杆菌K802或JM109株。用1ml细菌过夜培养物接种100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基。将培养液在37℃下培养4小时，直到600nm的OD值大约达到0.8。添加IPTG至终浓度为1mM诱导HBcAg-Lys的合成。诱导后，将细菌在37℃下再振摇4小时。以5000×g离心15分钟收集细菌。将沉淀冻存于-80℃。融解沉淀，重悬浮于添加了200μg/ml溶菌酶和10μlBenzonase(Merck)的细菌裂解缓冲液中(10mM Na2HPO4，pH7.0，30mM NaCl，0.25％ Tween-20，10mM EDTA)。将细胞在室温下温育30分钟，通过超声处理破碎。在IPTG诱导HBcAg-Lys表达中使用携带pKK-HBcAg-Lys表达质粒或对照质粒的大肠杆菌细胞。在加入IPTG之前，从携带pKK-HBcAg-Lys质粒的细菌培养液和携带对照质粒的培养液中采集样品。加入IPTG4小时后，再次从含有pKK-HBcAg-Lys的培养液和对照培养液中采集样品。通过SDS-PAGE，随后考马斯蓝染色，监测蛋白质的表达。
然后以12,000×g离心裂解液30分钟，除去不可溶的细胞碎片。使用抗HBcAg单克隆抗体(YVS1841，购自Accurate Chemical andScientific Corp.，Westbury，NY，USA)，通过Western blotting分析上清液和沉淀，表明大量HBcAg-Lys蛋白是可溶的。简而言之，以14,000×g离心来自表达HBcAg-Lys的大肠杆菌细胞和来自对照细胞的裂解液30分钟。分离上清液(＝可溶级分)和沉淀(＝不可溶级分)，用SDS样品缓冲液稀释至相同体积。通过SDS-PAGE，随后用抗-HBcAg单克隆抗体YVS 1841进行Western blotting分析样品。
对澄清的细胞裂解液进行分级梯度离心，其中使用的蔗糖分级梯度由4ml 65％蔗糖溶液、覆盖于其上的3ml 15％蔗糖溶液以及随后的4ml细菌裂解液组成。样品在4℃下以100,000×g离心3小时。离心后，从梯度顶部采集1ml级分，通过SDS-PAGE，随后通过考马斯蓝染色分析。HBcAg-Lys蛋白通过考马斯蓝染色检测。
HBcAg-Lys蛋白在15％与65％蔗糖之间的界面处富集，表明其已经形成衣壳颗粒。大多数细菌蛋白质仍存在于该梯度的不含蔗糖的上层中，因此HBcAg-Lys颗粒的分级梯度离心导致颗粒的富集和部分纯化。
HBcAg-Lys的大规模表达和纯化如下进行。制备过夜培养物，方法是将单菌落接种到100ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃培养过夜。次日用800ml LB氨苄青霉素培养基稀释25ml预培养物，使培养物生长到光密度OD600为0.6-0.8。然后用1mM IPTG诱导培养物，再培养4小时。收集细胞，基本如上所述进行裂解。
然后纯化HBcAg-Lys，方法是首先用硫酸铵(30％饱和)从澄清的细胞裂解液中沉淀蛋白质，然后将重新溶解的沉淀加样到凝胶过滤柱(Sephacryl S-400，Pharmacia)上。合并的级分再次用硫酸铵沉淀，重新溶解沉淀，再次加样到同一凝胶过滤柱上。最后合并级分并浓缩，用Bradford试验(BioRad)测定其浓度。
实施例4不含游离半胱氨酸残基、含有插入的赖氨酸残基的HBcAg的构建用下列方法构建一种肝炎核心抗原(HBcAg)，在此称为HBcAg-lys-2cys-Mut，它在对应于SEQ ID NO77中48和107的位点处不含半胱氨酸残基，含有一个插入的赖氨酸残基。
按如下引入所述两个突变，首先应用下列PCR引物组合分别扩增如实施例2所述制备的HBcAg-Lys基因的3个片段。用PCR方法和常规克隆技术制备HBcAg-lys-2cys-Mut基因。
简而言之，用下列引物制备片段1引物1EcoRIHBcAg(s)CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG引物248asGTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC用下列引物制备片段2引物348s
GSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC引物4107asCTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC用下列引物制备片段3引物5HBcAgl49hind-asCGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG引物6107sGTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG然后用PCR引物EcoRIHBcAg(s)和107as组合片段1和2，产生片段4。然后用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAgl49hind-as组合片段4和片段3，产生全长基因。全长基因用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化，克隆到在相同限制酶切位点酶切的pKK载体(Pharmacia)中。HBcAg-lys-2cys-Mut的表达和纯化如实施例3所述进行。
实施例5HBcAgl-185-Lys的构建将肝炎核心抗原(HBcAg)1-185如实施例2所述修饰。通过基因工程方法用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly取代c/e1表位(残基72-88)区的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)(HBcAgl-185-Lys构建体)。引入的赖氨酸残基在其侧链上含有一个反应性氨基，可以用于HBcAg颗粒与含有游离半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。用PCR方法和常规克隆技术制备HBcAgl-185-Lys基因。
按如下插入Gly-Gly-Lys-Gly-Gly序列如以上实施例2所述，从pEco63扩增HBcAg基因的两个不同片段，随后通过PCR融合这两个片段，装配为全长基因。使用下列PCR引物组合片段1引物1EcoRIHBcAg(s)(见实施例2)
引物2Lys-HBcAg(as)(见实施例2)片段2引物3Lys-HBcAg(s)(见实施例2)引物4HBcAgwtHindIIIICGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG装配引物1EcoRIHBcAg(s)(见实施例2)引物2HBcAgwtHindIIII装配的全长基因然后用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化，克隆到在相同限制酶切位点处酶切的pKK载体(Pharmacia)中。
实施例6肽表位在HBcAg MIR区中的融合将HBcAgl-185的残基79和80置换为具有序列VNLTWSRASG的表位CεH3。CεH3序列来源于人IgE重链第三恒定区的序列。用装配PCR法将该表位插入HBcAgl-185序列中。第一个PCR步骤中，用来源于ATCC克隆pEco63并用引物HBcAg-wt EcoRI fwd和HBcAg-wt Hind III rev扩增的HBcAgl-185基因作为两个不同反应的模板，扩增含有编码CεH3序列的序列元件的两个片段。然后在装配PCR反应的第二个PCR步骤中将这两个片段装配在一起。
第一个PCR步骤的引物组合CεH3fwd与HBcAg-wt Hind III rev，和HBcAg-wt EcoRI fwd与CεH3rev。在装配PCR反应中，第一个PCR步骤分离的两个片段首先通过3个PCR循环装配，这不使用外部引物，之后添加到反应混合物中进行下25个循环。外部引物HBcAg-wtEcoRI fwd和HBcAg-wt Hind III rev。
为了在大肠杆菌中表达，利用EcoRI和HindIII位点将PCR产物克隆到pKK223.3中(见实施例2)。嵌合VLP在大肠杆菌中表达，如实施例2所述纯化。凝胶过滤洗脱出HBcAgl-185-CεH3的洗脱体积显示融合蛋白已装配为嵌合VLP。
引物序列CεH3fwd5′GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC 3′V N L T W S R A S G A80 S RD L V V86CεH3rev5′ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3′D78 E L N N G V72HBcAg-wt EcoRI fwd5’CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAGHBcAg-wt Hind III rev5’CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG实施例7RANKL肽表位在HBcAg的MIR区中的融合将HBcAgl-185的残基79和80置换为序列为SIKIPSSH的RANKL肽表位。使用与实施例6所述相同的策略设计两条重叠引物，通过装配PCR构建融合蛋白。将PCR产物克隆到pKK223.3载体中，在大肠杆菌K802中表达。如实施例3所述表达并纯化嵌合VLP。
实施例8RANKL肽表位与Qβ A1蛋白(在CP延伸位点19处截短)C端的融合在以pQβ10为模板的PCR反应中使用可与Qβ A1基因5’端退火的一条引物和可与A1基因3’端退火的一条引物，后者还包含编码序列为SIKIPSSH的RANKL肽表位的额外序列元件。将PCR产物克隆到pQβ10中(Kozlovska T.M.等人，Gene 137133-37(1993))，如实施例1所述表达并纯化嵌合VLP。
实施例9RANKL肽表位向fr外壳蛋白位点2与3之间的插入利用标准分子生物学技术，在pFrd8载体(Pushko，P.等人，Prot.Eng.6883-91(1993))的Bsp119I位点中插入互补引物，该引物编码序列为SIKIPSSH的RANKL肽表位序列，并含有Bsp119I相容的末端和允许框内插入的其它核苷酸。或者，在Bsp119I消化后，用Klenow补平pFrd8载体的突出端，Klenow处理后，将编码RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽序列的寡核苷酸和用于框内克隆的其它核苷酸连接到pFrd8中。通过测序对含有正确方向插入片段的克隆进行分析。嵌合融合蛋白在大肠杆菌JM109或大肠杆菌K802中的表达和纯化如Pushko，P.等人，Prot.Eng.6883-91(1993)中所述进行，不同之处在于用Sepharose CL-4B或Sephacryl S-400(Pharmacia)进行层析步骤。类似于实施例1中所述关于Qβ的方法，细胞裂解液用硫酸铵沉淀，通过连续两次凝胶过滤纯化步骤纯化。
实施例10RANKL肽表位向载体pOGS8111中Ty1蛋白p1的位点67与68之间的插入合成两条编码序列为SIKIPSSH的RANKL肽表位的互补寡核苷酸，其末端与pOGS8111的NheI位点相容。根据EP06777111所述添加额外核苷酸，用以框内插入编码RANKL表位的序列。位于插入表位侧翼的氨基酸AS和SS由改变的NheI位点(由于在pOGS8111的TyA(d)基因中插入寡核苷酸造成的)编码。
为了如EP0677111和此处的参考文献所述表达嵌合Ty VLP，用pOGS8111转化酿酒酵母MC2株。如EP0677111所述，通过蔗糖梯度超速离心纯化嵌合Ty VLP。
实施例11RANKL肽表位向1型乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1内的插入如Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.USA 962373-2378(1999)中所述，用编码RANKL肽表位(序列为SIKIPSSH)的序列置换克隆于pFastBac1(GIBCO/BRL)载体内编码BPV-1 L1中氨基酸130-136的基因序列。通过核苷酸序列分析证实该构建体的序列。利用GIBCO/BRL杆状病毒系统，如厂商所述产生重组杆状病毒。如Kirnbauer，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 8912180-84(1992)和Greenstone，H.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 951800-05(1998)所述，从杆状病毒感染的Sf9细胞中纯化嵌合VLP。
实施例12含有半胱氨酸的N端接头的引入，RANKL的表达与纯化重组表达一个RANKL片段，为了与VLP偶联，其包含含有一个半胱氨酸的N端接头。
表达质粒的构建使用oligos RANKL-UP和RANKL-DOWN(oligos RANKL-UP5’-CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAG-3’；RANKL-DOWN5’-CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3’)，PCR扩增RANKL基因的C端编码区。RANKL-UP含有一个内部ApaI位点，RANKL-DOWN含有一个内部XhoI位点。PCR产物用ApaI和XhoI消化，连接到pGEX-6p1(Amersham Pharmacia)中。获得的质粒被命名为pGEX-RANKL。所有步骤均按照标准分子生物学方法进行，并鉴定其序列。质粒pGEX-RANKL编码一种融合蛋白谷胱甘肽S-转移酶-Prescission切割位点-含半胱氨酸的氨基酸接头-RANKL(GST-PS-C-RANKL)。含半胱氨酸的氨基酸接头的序列为GPGCGGG。该构建体也在含半胱氨酸的氨基酸接头与RANKL序列之间含有一个六组氨酸序列。获得的cDNA和蛋白质构建体的序列如SEQ ID NO94和SEQ ID NO95所示。
C-RANKL的表达与纯化用质粒pGEX-RANKL转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)GoldpLys细胞。来自含氨苄青霉素琼脂平板的单一菌落在液体培养基(LB培养基，含100μg/ml氨苄青霉素)中增殖，在30℃、220rpm振摇下温育过夜。然后用过夜培养物以1∶100v/v接种1升LB(含100μg/ml氨苄青霉素)，在24℃下生长至OD600＝1。以0.4mM IPTG诱导表达。16小时后以5000rpm离心收集细胞。细胞沉淀悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0；25％蔗糖；1mM EDTA，1％NaN3；10mM DTT；5mM MgCl2；1mg/ml溶菌酶；0.4U/ml DNAse)中30分钟。然后添加2.5倍体积的缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH8.0；1％ Triton X100；100mM NaCl；0.1％ NaN3；10mM DTT；1mM PMSF)，37℃温育15分钟。超声处理细胞，以9000rpm离心沉淀15分钟。对上清液立即进行GST-亲和层析。
用PBS pH7.3(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4)平衡5ml GST-Trap FF柱(Amersham Pharmacia)。将上清液上样到5ml GST-Trap FF柱上，随后用5倍柱体积的PBS洗柱。用含有10mM还原谷胱甘肽的50mM Tris-HCl(pH8.0)洗脱蛋白质GST-PS-C-RANKL。
纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白用蛋白酶PreScission(AmershamPharmacia)消化。消化在37℃下进行1小时，GST-PS-C-RANKL与PreScission的摩尔比为500/1。
此外，也使用HiPrep 26/10脱盐柱(Amersham Pharmacia)，对蛋白酶消化反应更换缓冲液，合并含有蛋白质的级分，立即使用与前述相同的条件进行再一次GST亲和层析。C-RANKL的纯化在还原条件下用SDS-PAGE凝胶分析，结果显示于图1中。切割的C-RANKL存在于流出液中(未结合的级分)，而未切割的GST-PS-C-RANKL、切割的GST-PS和PreScission仍然与柱结合。获得高纯度的预期大小为22kDa的C-RANKL蛋白(SEQ ID NO96)。
实施例13含有半胱氨酸的C端接头的引入，RANKL的表达与纯化重组表达一个RANKL片段，为了与VLP偶联，其包含含有一个半胱氨酸的C端接头。
表达质粒的构建通过将NdeI位点到XhoI位点间的原始序列替换为退火的oligos引物MCS-lF和引物MCS-lR(在15mM TrisHCl pH8缓冲液中退火)，使pET22b(+)(Novagen，Inc.)的MCS改变为GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACC。获得的质粒被命名为pMod00，在其MCS中含有NdeI、BamHI、NheI、XhoI、PmeI和NotI限制性酶切位点。退火的oligos Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EKNhe-R对和退火的oligolF-C-甘氨酸-接头和oligolR-C-甘氨酸-接头对被一起连接到BamHI-NotI消化的pMod00质粒中，获得pModEC1，它含有一个N端六组氨酸尾、一个肠激酶切割位点和含有一个半胱氨酸残基的C端氨基酸甘氨酸接头。
使用寡核苷酸GST-UP和GST-EK，从质粒SP-GST-EK-pCEP-Pu(Wuttke，M.等人，J.Biol.Chem.，27636839-36848)中PCR扩增包含谷胱甘肽S转移酶基因以及一个C端肠激酶切割位点的DNA片段，用NheI和BamHI消化该DNA片段并克隆到pModEC1载体中。
获得的质粒pMod-GST-EK-C1包含与肠激酶切割位点融合的编码谷胱甘肽S转移酶的基因，和一个含半胱氨酸的C端接头。然后用寡核苷酸mRANKL-1和mRANKL-2 PCR扩增RANKL的C端编码序列，扩增产物用NheI和XhoI消化并被克隆到质粒pMod-GST-EK-C1中。获得的质粒pMod-GST-EK-mRANKL-C1编码一种融合蛋白，该融合蛋白由谷胱甘肽S转移酶、肠激酶切割位点、RANKL片段和含半胱氨酸的氨基酸接头(GST-EK-RANKL-C)组成。获得的DNA和蛋白质构建体的序列如SEQ ID NO97和SEQ ID NO98所示。
寡核苷酸的序列GST-UP5’-ATATATGGATCCTATACTAGGTTATTGGAAAAT-3’GST-EK5’-ATATATGCTAGCTTATCGTCATCGTCG-3’mRANKL-15’-ATATATGCTAGCAAAGCCTGAGGCCCAGCCATTTG-3’mRANKL-25’-ATATATCTCGAGGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3’RANKL-C的表达与纯化用质粒pMod-GST-EK-mRANKL-C1转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)Gold pLys细胞。来自含氨苄青霉素琼脂平板的单一菌落在100ml液体培养基(LB培养基，含200μg/ml氨苄青霉素)中增殖，在30℃、220rpm振摇下温育过夜。然后用过夜培养物以1∶100v/v接种1升培养基(SB，含150mM MOPS，pH7.0，200μg/ml氨苄青霉素)，在30℃、125rpm振摇下生长至OD600＝2.5。然后将培养物的温度降至18℃，30分钟后加入0.1mM IPTG诱导蛋白质表达。18℃培养过夜后离心(SLA-3000，15min，4℃，6000rpm)收集细菌，重悬浮于40ml裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA，0.25％ Tween-20)中，在冰上与0.8mg/ml溶菌酶温育30分钟。然后超声处理裂解细菌，在室温下与0.2mM MgCl2和8μl Benzonase温育30分钟。离心(SS-34，30min，4℃，20000rpm)清除裂解液中的不溶物质，立即对裂解液进行谷胱甘肽sepharose亲和层析。
用裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA，0.25％ Tween-20)平衡5ml GST-Trap FF柱(Amersham Pharmacia)，以0.5ml/min的恒定流速上样澄清的裂解液。然后用5倍柱体积的裂解缓冲液洗柱3次，蛋白质GST-EK-RANKL-C被洗脱到9个1ml的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM还原谷胱甘肽)级分中。如图2A所示，纯化产生约45kDa的GST-EK-RANKL-C融合蛋白，含有少量GST-EK。
合并洗脱级分，纯化的GST-EK-RANKL-C蛋白用肠激酶MaxTM(Invitrogen)消化。消化在4℃下进行16小时，每毫克纯化的GST-EK-RANKL-C使用10单位肠激酶Max。图2B显示，切割反应产生表观分子量约为16kDa的RANKL-C。
切割后，蛋白质溶液用PBS pH7.2(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4)透析，并且通过再次谷胱甘肽sepharose亲和层析除去谷胱甘肽S转移酶。用PBS(pH7.2)平衡5ml GST-Trap FF柱，蛋白质溶液以0.5ml/min的恒定流速上柱。用SDS凝胶分析谷胱甘肽sepharose层析之前及之后的蛋白质级分。如图2C所示，切割的RANKL-C蛋白(SEQ ID NO99)以高纯度包含于流出液中，而GST-EK蛋白仍然与柱结合。
实施例14C-RANKL与Qβ衣壳蛋白的偶联1.48ml 6mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes、150mM NaCl(pH7.2)中的溶液与14.8μl SMPH(Pierce)(来自溶于DMSO的100mM贮存液)在25℃下反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mMHepes，150mM NaCl，pH7.0透析两次各3小时。230μl 9.8mg/mlC-RANKL蛋白在20mM Hepes、150mM NaCl(pH7.2)中的溶液与1.7μl 100mM TCEP溶液(Pierce)在25℃下反应30分钟。为了偶联，80μl衍化并透析的Qβ与24μl还原的C-RANKL和96μl 20mMHepes、150mM NaCl(pH7.0)溶液混合，在25℃下温育过夜。
偶联产物在还原条件下用16％ SDS-PAGE凝胶分析。凝胶用考马斯亮蓝染色或印迹到硝酸纤维素膜上。在后一种情况中，封闭膜，并与多克隆兔抗Qβ抗血清(1∶2000稀释)随后与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG(1∶5000稀释)温育，或者与单克隆小鼠抗RANKL抗体(1∶2000稀释)随后与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体(1∶5000稀释)温育。然后用ECLTMWestern Blotting检测试剂(AmershamPharmacia)显色印迹。结果显示在图3A和图3B中。偶联产物能够用考马斯染色的凝胶检测到(图3A)，以及用抗-Qβ抗血清和抗-RANKL抗体检测到(图3B)，这清楚地证实了C-RANKL与Qβ衣壳蛋白的共价偶联。
实施例15用与Qβ衣壳蛋白偶联的C-RANKL免疫小鼠总共8只雌性Balb/c小鼠接种与Qβ衣壳蛋白偶联的C-RANKL。每种样品的25μg总蛋白用PBS稀释为200μl，在第0、16、64天皮下注射(腹部两侧100μl)。4只小鼠接受不加佐剂的疫苗，而另外4只接受添加明矾的疫苗。对小鼠在第0、16、23、64、78天眼眶后放血，用RANKL特异性ELISA分析其血清。
实施例16对RANKL特异性抗体的ELISA检测ELISA板用浓度为10μg/ml的C-RANKL包被。封闭平板，然后与连续稀释的第16、23、64、78天的小鼠血清一起温育。用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。也检测同一小鼠的免疫前血清作为对照。图4显示，用含或不含明矾的Qβ-C-RANKL免疫小鼠后，在其血清中能够检测到的RANKL特异性抗体的平均滴度。ELISA滴度表示为在ELISA测定中获得半数最大OD的血清稀释度。在不加明矾免疫的小鼠中，平均滴度达到28000，而在添加明矾免疫的小鼠中，平均滴度为160000。免疫前血清不显示与C-RANKL有任何反应性。这清楚地证实，RANKL-VLP偶联物能够诱发抗自身蛋白质的高抗体滴度。
实施例17用Qβ-C-RANKL免疫的小鼠血清对RANKL-RANK相互作用的抑制为了检测接种Qβ-C-RANKL的小鼠产生的抗体是否具有中和活性，建立一种RANKL及其同源受体RANK的体外结合试验。用浓度为10μg/ml的C-RANKL蛋白包被ELISA板，与连续稀释的纯化RANK-Fc融合蛋白一起温育，或者与无关Fc融合蛋白一起温育作为阴性对照。结合的蛋白质用辣根过氧化物酶偶联的抗Fc抗体检测。图5A显示该分析的结果。发现纯化的RANK-Fc融合蛋白与其配体RANKL以高亲和力结合(在1-3nM时有半数最大结合)，而在使用无关Fc融合蛋白时基本上没有观察到结合。
然后检测接种与Qβ偶联的C-RANKL的小鼠的血清，检测其抑制RANKL与RANK-Fc结合的能力。用浓度为10μg/ml的C-RANKL蛋白包被ELISA板，与连续稀释的第78天的小鼠血清共温育，该血清与1nM RANK-Fc融合蛋白混合。RANK-Fc融合蛋白与C-RANKL的结合用辣根过氧化物酶偶联的抗Fc抗体检测。图5B显示接受疫苗的全部8只小鼠都产生可特异性抑制RANK-Fc与C-RANKL结合的抗体。平均在使用1∶90的血清稀释度时达到半数最大抑制。这清楚地证实，用RANKL-VLP偶联物免疫确实诱导了能够抑制RANKL与其受体RANK相互作用的高滴度抗体。因此，通过注射本发明的具体实施方案抑制RANK-RANKL相互作用可以逆转或预防以骨吸收增加为特征的骨病。
实施例18重组AP205 VLP的表达与纯化A.重组AP205 VLP的表达用质粒pAP283-58转化大肠杆菌JM109。将单一菌落接种于含有20μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基中，不加振摇37℃温育16-24小时。
制备的接种物用含有20μg/ml氨苄青霉素的100-300ml LB培养基1∶100稀释，不加振摇37℃温育过夜。产生的二次接种物用含有0.2％葡萄糖和缓冲用磷酸盐的2TY培养基1∶50稀释，在摇床上37℃温育过夜。离心收集细胞，冻存于-80℃。
B.重组AP205 VLP的纯化溶液与缓冲液1.裂解缓冲液50mM Tris-HCl pH8.0，含5mM EDTA，0.1％tritonX100和5mg/mlPMSF。
2.SAS饱和硫酸铵水溶液。
3.缓冲液NET20mM Tris-HCl，pH7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEG40％(w/v)聚乙二醇6000，溶于NET。
裂解冷冻的细胞以2ml/g细胞的浓度重悬浮于裂解缓冲液中。混合物以22kH超声处理5次各15秒，间隔1分钟，在冰上冷却该溶液。然后用F34-6-38转头(Ependorf)以12000rpm离心裂解液20分钟。除非另外说明，以下描述的离心步骤全都用相同的转头进行。上清液贮存于4℃，而细胞碎片用裂解缓冲液洗涤2次。离心后合并裂解液的上清液和洗涤级分。
分级分离可进一步利用硫酸铵沉淀纯化AP205 VLP。第一步，选择AP205VLP不沉淀的硫酸铵浓度。弃去产生的沉淀。下一步，选择AP205 VLP定量沉淀的硫酸铵浓度，通过离心(14000rpm，20min)从该沉淀步骤的沉淀中分离AP205 VLP。将获得的沉淀溶解于NET缓冲液中。
层析将来自合并上清液的衣壳蛋白上样到Sepharose 4B柱(2.8×70cm)上，用NET缓冲液以4ml/小时/级分的速度洗脱。收集级分28-40，用60％饱和的硫酸铵沉淀。在沉淀前通过SDS-PAGE和使用AP205特异性抗血清的Western Blot分析这些级分(图6A和图6B)。将离心分离的沉淀重新溶解于NET缓冲液中，上样到Sepharose 2B柱(2.3×65cm)上，以3ml/小时/级分的速度洗脱。通过SDS-PAGE分析这些级分，收集级分44-50并合并，用60％饱和的硫酸铵沉淀。将离心分离的沉淀重新溶解于NET缓冲液中，用Sepharose 6B柱(2.5×47cm)纯化，以3ml/小时/级分的速度洗脱。通过SDS-PAGE分析这些级分。收集级分23-27，调节盐浓度至0.5M，用PEG6000沉淀(添加40％贮存水溶液至终浓度为13.3％)。离心分离的沉淀重新溶解于NET缓冲液中，上样到与上述相同的Sepharose 2B柱上，以相同的方法洗脱。图6C中显示用SDS-PAGE对这些级分的分析。收集级分43-53，用60％饱和的硫酸铵沉淀。将离心分离的沉淀重新溶解于水中，获得的蛋白质溶液用水充分透析。每克细胞能够分离约10mg纯化的蛋白质。
用电子显微镜对病毒样颗粒的检查显示它们与噬菌体颗粒相同(图7A和7B)。
图6A的上图显示第一个Sepharose 4B层析步骤获得的级分在还原条件下SDS-PAGE电泳的银染色。1-13道的样品是分别来自级分20-44，按顺序每隔一个级分上样。级分50加样到14道中。第二块凝胶上加样相同的级分，使用AP205特异性抗血清通过Westernblotting分析，结果在下图中显示(图6B)。
图6C显示最后的Sepharose 2B层析步骤获得的级分在还原条件下SDS-PAGE电泳的银染色。级分38-54加样到1-16道中。
图7A显示AP205噬菌体颗粒的EM照片，而自装配的重组AP205VLP颗粒的EM照片在图7B中显示。
实施例19用Qβ-C-RANKL免疫的小鼠的血清对RANKL诱导的破骨细胞形成的抑制为了检测用Qβ-C-RANKL免疫的小鼠产生的抗体是否能够抑制RANKL的生物活性，建立了一种体外破骨细胞分化测定法。从Balb/c小鼠(4周龄)中分离骨髓细胞，以106/ml的密度与重组小鼠M-CSF(5ng/ml)在α-MEM/10％FCS中温育16小时。然后收集漂浮的细胞，与M-CSF(30ng/ml)、PGE2(1μM)和不同浓度的C-RANKL进一步培养。第4天根据抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色阳性的多核细胞数评价破骨细胞的形成。发现浓度为100-1000ng/ml的C-RANKL诱导显著数量的TRAP阳性多核细胞。
然后检测接种Qβ-C-RANKL的小鼠的血清，检测其抑制C-RANKL处理的骨髓细胞形成破骨细胞的能力。从Balb/c小鼠中分离破骨细胞前体细胞，与M-CSF(30ng/ml)、PGE2(1μM)、C-RANKL(1000ng/ml)和连续稀释的来自免疫小鼠的血清在α-MEM/10％ FCS中温育4天。然后计数TRAP阳性的多核细胞，并且与单独与C-RANKL温育、以及与C-RANKL和免疫前血清一起温育的对照相比较，由此评价破骨细胞的形成。
实施例20在鼠卵巢切除模型中接种Qβ-C-RANKL对骨损失的抑制为了检测接种Qβ-C-RANKL是否能够保护小鼠免于雌激素缺陷诱导的骨损失，建立了小鼠卵巢切除(ovx)模型。将总共40只12周龄的C57/BL6小鼠随机分为4组，并且按如下处理第1组不免疫，进行假手术，第2组不免疫，进行ovx，第3组用不含明矾的25μgQβ-C-RANKL免疫，并进行ovx，第4组用含有明矾的25μgQβ-C-RANKL免疫，也进行ovx。第3组和第4组的动物在第0、14、21、42天接受免疫，所有动物均在第28天手术(假手术或ovx)，并在第63天杀死。在第0、28、63天称量体重，在第0、14、21、28、42、63天采集血样。连续监测抗体滴度、以及骨形成和骨降解标志，在杀死动物后，通过在一个远点和一个中间点DXA扫描切断的脊柱、pQCT扫描切断的股骨，评价骨矿物质密度。
为了便于明确理解，现在已经通过举例说明和实施例全面详细地描述了本发明，本领域技术人员应当理解，在不影响本发明或其任何具体实施方案的范围的情况下，能够在较广或等同范围的条件、制剂和其它参数范围内修饰或改变本发明，这些修饰或改变包括在所附权利要求书的范围之内。
本说明书中提到的所有公开文件、专利和专利申请表明了本发明所属领域中技术人员的水平，均在此引用作为参考，如同具体、单独地引用每个公开文件、专利和专利申请作为参考。
序列表SEQ ID NO1Met Lys Lys Thr Leu Leu Gly Ser Leu Ile Leu Leu Ala Phe Ala Gly1 5 10 15Asn Val Gln Ala Ala Ala Asn Ala Asp Thr Ser Gly Thr Val Thr Phe20 25 30Phe Gly Lys Val Val Glu Asn Thr Cys Gln Val Asn Gln Asp Ser Glu35 40 45Tyr Glu Cys Asn Leu Asn Asp Val Gly Lys Asn His Leu Ser Gln Gln50 55 60Gly Tyr Thr Ala Met Gln Thr Pro Phe Thr Ile Thr Leu Glu Asn Cys65 70 75 80Asn Val Thr Thr Thr Asn Asn Lys Pro Lys Ala Thr Lys Val Gly Val85 90 95Tyr Phe Tyr Ser Trp Glu Ile Ala Asp Lys Asp Asn Lys Tyr Thr Leu100 105 110Lys Asn Ile Lys Glu Asn Thr Gly Thr Asn Asp Ser Ala Asn Lys Val115 120 125Asn Ile Gln Leu Leu Glu Asp Asn Gly Thr Ala Glu Ile Lys Val Val130 135 140Gly Lys Thr Thr Thr Asp Phe Thr Ser Glu Asn His Asn Gly Ala Gly145 150 155 160Ala Asp Pro Val Ala Thr Asn Lys His Ile Ser Ser Leu Thr Pro Leu165 170 175Asn Asn Gln Asn Ser Ile Asn Leu His Tyr Ile Ala Gln Tyr Tyr Ala180 185 190Thr Gly Val Ala Glu Ala Gly Lys Val Pro Ser Ser Val Asn Ser Gln195 200 205Ile Ala Tyr Glu210
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Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys180SEQ ID NO73Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu1 5 10 15Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp20 25 30Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu50 55 60Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln65 70 75 80
Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys85 90 95Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln100 105 110His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser145 150 155 160Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro165 170 175Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Thr Asn Cys180 185SEQ ID NO74Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro1 5 10 15Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp20 25 30Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe35 40 45Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala50 55 60Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro65 70 75 80His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr85 90 95Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg100 105 110
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SEQ ID NO77Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Aru Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185SEQ ID NO78Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30
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SEQ ID NO82RANKL_人TrEMBLO14788胞外区YFRAQMDPNRIS EDGTHCIYRI LRLHENADFQ DTTLESQDTK LIPDSCRRIK QAFQGAVQKE LQHIVGSQHIRAEKAMVDGS WLDLAKRSKL EAQPFAHLTI NATDIPSGSH KVSLSSWYHD RGWAKISNMT FSNGKLIVNQDGFYYLYANI CFRHHETSGD LATEYLQLMV YVTKTSIKIP SSHTLMKGGS TKYWSGNSEF HFYSINVGGFFKLRSGEEIS IEVSNPSLLD PDQDATYFGA FKVRDIDSEQ ID NO83RANKL_人TrEMBLO14788TACE样蛋白酶切割形成区IRAEKAMVDG SWLDLAKRSK LEAQPFAHLT INATDIPSGS HKVSLSSWYH DRGWAKISNMTFSNGKLIVN QDGFYYLYAN ICFRHHETSG DLATEYLQLM VYVTKTSIKI PSSHTLMKGGSTKYWSGNSE FHFYSINVGG FFKLRSGEEI SIEVSNPSLL DPDQDATYFG AFKVRDIDSEQ ID NO84RANKL_人 TrEMBLO14788TNFa-同源区KLEAQPFAHLTI NATDIPSGSH KVSLSSWYHD RGWAKISNMT FSNGKLIVNQ DGFYYLYANICFRHHETSGD LATEYLQLMV YVTKTSIKIP SSHTLMKGGS TKYWSGNSEF HFYSINVGGFFKLRSGEEIS IEVSNPSLLD PDQDATYFGA FKVRDIDSEQ ID NO85RANKL_小鼠 TrEMBLO35235胞外域YFRAQMDPNRI SEDSTHCFYR ILRLHENAGL QDSTLESEDT LPDSCRRMKQ AFQGAVQKEL QHIVGPQRFSGAPAMNEGSW LDVAQRGKPE AQPFAHLTIN AASIPSGSHK VTLSSWYHDR GWAKISNMTL SNGKLRVNQDGFYYLYANIC FRHHETSGSV PTDYLQLMVY VVKTSIKIPS SHNLMKGGST KNWSGNSEFH FYSINVGGFFKLRAGEEISI QVSNPSLLDP DQDATYFGAF KVQDIDSEQ ID NO86RANKL_小鼠 剪接同工型TrEMBLQ9JJK8MKQAFQGAVQ KELQHIVGPQ RFSGAPAMME GSWLDVAQRG KPEAQPFAHL TINAASIPSGSHKVTLSSWY HDRGWAKISN MTLSNGKLRV NQDGFYYLYA NICFRHHETS GSVPTDYLQLMVYVVKTSIK IPSSHNLMKG GSTKNWSGNS EFHFYSINVG GFFKLRAGEE ISIQVSNPSLLDPDQDATYF GAFKVQDIDSEQ ID NO87RANKL肽AA``环NATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWASEQ ID NO88
RANKL肽DE环SIKIPSSHSEQ ID NO89RANKL肽b-链DYLQLMVYVTKTSEQ ID NO90RANKL肽CD环HETSGDLATESEQ ID NO91RANKL肽EF环KYWSGNSEFHFSEQ ID NO92RANKL肽B链-B`B环TFSNGKLISEQ ID NO93RANKL肽GH环DPDQDASEQ ID NO94GST-PS-C-RANKL cDNA序列(小鼠RANKL)1 atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaa76 gaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttg151 gagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatata226 gctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttg301 gatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaag376 ctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccat451 cctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaa526 ttagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagca601 tggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggatctggaagttctgttc676 cagGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAGCTCCAGCTATGATGGAA751 GGCTCATGGTTGGATGTGGCCCAGCGAGGCAAGCCTGAGGCCCAGCCAATTGCACACCTCACCATCAATGCTGCC826 AGCATCCCATCGGGTTCCCATAAAGTCACTCTGTCCTCTTGGTACCACGATCGAGGCTGGGCCAAGATCTCTAAC901 ATGACGTTAAGCAACGGAAAACTAAGGGTTAACCAAGATGGCTTCTATTACCTGTACGCCAACATTTGCTTTCGG976 CATCATGAAACATCGGGAAGCGTACCTACAGACTATCTTCAGCTGATGGTGTATGTCGTTAAAACCAGCATCAAA
1051 ATCCCAAGTTCTCATAACCTGATGAAAGGAGGGAGCACGAAAAACTGGTCGGGCAATTCTGAATTCCACTTTTAT1126 TCCATAAATGTTGGGGGATTTTTCAAGCTCCGAGCTGGTGAAGAAATTAGCATTCAGGTGTCCAACCCTTCCCTG1201 CTGGATCCGGATCAAGATGCGACGTACTTTGGGGCTTTCAAAGTTCAGGACATAGACTAACTCGAGCGGSEQ ID NO95GST-PS-C-RANKL 蛋白质序列(小鼠RANKL)1 M S P I L G Y W K I K G L V Q P T R L L L E Y L26 E K Y E E H L Y E R D E G D K W R N K K F E L G L51 E F P N L P Y Y I D G D V K L T Q S M A I I R Y I76 A D K H N M L G G C P K E R A E I S M L E G A V L101 D I R Y G V S R I A Y S K D F E T L K V D F L S K126 L P E M L K M F E D R L C H K T Y L N G D H V T H151 P D F N L Y D A L D V V L Y M D P M C L D A F P K176 L V C F K K R I E A I P Q I D K Y L K S S K Y I A201 W P L Q G W Q A T F G G G D H P P K S D L E V L F226 Q G P G C G G G H H H H H H Q R F S G A P A M M E251 G S W L D V A Q R G K P E A Q P F A H L T I N A A276 S I P S G S H K V T L S S W Y H D R G W A K I S N301 M T L S N G K L R V N Q D G F Y Y L Y A N I C F R326 H H E T S G S V P T D Y L Q L M V Y V V K T S I K351 I P S S H N L M K G G S T K N W S G N S E F H F Y376 S I N V G G F F K L R A G E E I S I Q V S N P S L401 L D P D Q D A T Y F G A F K V Q D I D *SEQ ID NO96RANKL-C蛋白质序列(小鼠RANKL)G P G C G G G H H H H H H Q R F S G A P A M M EG S W L D V A Q R G K P E A Q P F A H L T I N A AS I P S G S H K V T L S S W Y H D R G W A K I S NM T L S N G K L R V N Q D G F Y Y L Y A N I C F RH H E T S G S V P T D Y L Q L M V Y V V K T S I KI P S S H N L M K G G S T K N W S G N S E F H F YS I N V G G F F K L R A G E E I S I Q V S N P S L
L D P D Q D A T Y F G A F K V Q D I D *SEQ ID NO97GST-EK-RANKL-C cDNA序列(小鼠RANKL)1ATGGATCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTT61 TTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAA121 TGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGAT181 GGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAAC241 ATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTG301 GATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTT361 GATTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAA421 ACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGAT481 GTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAA541 AAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTATGAAAGTACTTGAAATCAGCAAGTATATAGCA601 TGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAAGCTAGT661 ATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGCTAGCAAAG721 CCTGAGGCCCAGCCATTTGCACACCTCACCATCAATGCTGCCAGCATCCCATCGGGTTCC781 CATAAAGTCACTCTGTCCTCTTGGTACCACGATCGAGGCTGGGCCAAGATCTCTAACATG841 ACGTTAAGCAACGGAAAACTAAGGGTTAACCAAGATGGCTTCTATTACTGTTACGCCAAC901 ATTTGCTTTCGGCATCATGAAACATCGGGAAGCGTACCTACAGACTATCTTCAGCTGATG961 GTGTATGTCGTTAAAACCAGCATCAAAATCCCAAGTTCTCATAACCTGATGAAAGGAGGG1021 AGCACGAAAAACTGGTCGGGCAATTCTGAATTCCACTTTTATTCCATAAATGTTGGGGGA1081 TTTTTCAAGCTCCGAGCTGGTGAAGAAATTAGCATTCAGGTGTCCAACCCTTCCCTGCTG1161 GATCCGGATCAAGATGCGACGTACTTTGGGGCTTTCAAAGTTCAGGACATAGACCTCGAG1221 GGTGGTGGTGGTGGTTGGCCTSEQ ID NO98GST-EK-RANKL-C蛋白质序列(小鼠RANKL)1MDPILGYWKIKGLVQPTRLILEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYID61 GDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKV121 DFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFK181 KRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKASMTGGQQMGRDLYDDDDKLAK241 PEAQPFAHLTINAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGMAKISNMTLSNGKLRVNQDGFYYLYAN301 ICFRHHETSGSVPTDYLQLMVYVVKTSIKIPSSHNLMKGGSTKNWSGNSEFHFYSINVGG361 FFKLRAGEEISIQVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVQDIDLEGGGGGCGSEQ ID NO99
RANKL-C蛋白质序列(小鼠RANKL)LAKPEAQPFAHLTINAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKISNMTLSNGKLRVNQDGFYYLYANICFRHHETSGSVPTDYLQLMVYVVKTSIKIPSSHNLMKGGSTKNWSGNSEFHFYSINVGGFFKLRAGEEISIQVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVQDIDLEGGGGGCGSEQ ID NO100人-C-RANKL相当于小鼠C-RANKL 96QHIRAEKAMVDGSWLDLAKRSKLEAQPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMTFSNGKLIVNQDGFYYLYANICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIRIPSSHTLMKGGSTKYWSGNSEPHFYSINVGGFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDIDSEQ ID NO101人-C-RANKL相当于小鼠RANKL-C 99LEAQPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMIFSNGKLIVNQDGFYYLYANICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKYWSGNSEFHFYSINVGGFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDIDSEQ ID NO102具有相当于小鼠C-RANKL96的接头的人C-RANKLGCGGGGGQHIRAEKAMVDGSWLDLAKRSKLEAQPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMTFSNGKLIVNQDGFYYLYANICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKYWSGNSEFHFYSINVGGFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDIDSEQ ID NO103具有相当于小鼠RANKL-C99的接头的人C-RANKLLEAQPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMTFSNGKLIVNQDGFYYLYANICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKYWSGNSEFHFYSINVGGFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDIDGGGGGCGSEQ ID NO104RANKL肽AA``环CGGNATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWASEQ ID NO105RANKL肽DE环CGGSIKIPSSHSEQ ID NO106RANKL肽b-链DCGGGGYLQLMVYVTKTSEQ ID NO107RANKL肽CD环CGGHETSGDLATESEQ ID NO108
RANKL肽EF环CGGKYWSGNSEFHFSEQ ID NO109RANKL肽B链-B`B环CGGTFSNGKLISEQ ID NO110RANKL肽GH环CGGDPDQDASEQ ID NO111CGAGCTCGCCCCTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCCTCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACATGGCAAATAAGCCAATGCAACCGATCACATCTACAGCAAATAAAATTGTGTGGTCGGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTTTCAGCAAGTCTGTTACGCCAACGTGTTAAAGTTGGTATAGCCGAACTGAATAATGTTTCAGGTCAATATGTATCTGTTTATAAGCGTCCTGCACCTAAACCGGAAGGTTGTGCAGATGCCTGTGTCATTATGCCGAATGAAAACCAATCCATTCGCACAGTGATTTCAGGGTCAGCCGAAAACTTGGCTACCCTAAAAGCAGAATGGGAAACTCACAAACGTAACGTTGACACACTCTTCGCGAGCGGCAACGCCGGTTTGGGTTTCCTTGACCCTACAGCGGCTATCGTATCGTCAGATACTACTGCTTAAGCTTGTATTCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGTGTATGATACATAAGGTTATGTATTAATTGTAGCCGCCTTCTAACGACAATATGTACAAGCCTAATTGTGTAGCATCTGGCTTACTGAAGCAGACCCTATCATCTCTCTCGTAAACTGCCGTCAGAGTCGGTTTGGTTGGACGAACCTTCTGAGTTTCTGGTAACGCCGTTCCGCACCCCGGAAATGGTCACCGAACCAATCAGCAGGGTCATCGCTAGCCAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGCCCGGCATCACGGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGGGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAAAGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCATAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTGGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGG
CTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGCGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGTGGTGTCATGGTCGGTGATCGCCAGGGTGCCGACGCGCATCTCGACTGCATGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCCGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGCGGAATTSEQ ID NO112MANKPMQPITSTANKIVWSDPTRLSTTFSASLLRQRVKVGIAELNNVSGQYVSVYKRPAPKPEGCADACVIMPNENQSIRTVISGSAENLATLKAEWETHKRNVDTLFASGNAGLGPLDPTAAIVSSDTTASEQ ID NO113MANKTMQPITSTANKIVWSDPTRLSTTFSASLLRQRVKVGIAELNNVSGQYVSVYKRPAPKPEGCADACVIMPNENQSIRTVISGSAENLATLKAEWETHKRNVDTLFASGNAGLGFLDPTAAIVSSDTTASEQ ID NO114CGAGCTCGCCCCTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCCTCTAGATTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCATGGCAATTAAGACAATGCAACCGATCACATCTACAGCAAATAAAATTGTGTGGTCGGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTTTCAGCAAGTCTGTTACGCCAACGTGTTAAAGTTGGTATAGCCGAACGGAATAATGTTTCAGGTCAATATGTATCTGTTTATAAGCGTCCTGCACCTAAACCGGAAGGTTGTGCAGATGCCTGTGTCATTATGCCGAATGAAAACCAATCCATTCGCACAGTGATTTCAGGGTCAGCCGAAAACTTGGCTACCTTAAAAGCAGAATGGGAAACTCACAAACGTAACGTTGACACACTCTTCGCGAGCGGCAACGCCGGTTTGGGTTTCCTTGACCCTACTGCGGCTATCGTATCGTCTGATACTACTGCTTAAGCTTGTATTCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGTGTATGATACATAAGGTTATGTATTAATTGTAGCCGCGTTCTAACGACAATATGTACAAGCCTAATTGTGTAGCATCTGGCTTACTGAAGCAGACCCTATCATCTCTCTCGTAAACTGCCGTCAGAGTCGGTTTGGTTGGACGAACCTTCTGAGTTTCTGGTAACGCCGTTCCGCACCCCGGAAATGGTCACCGAACCAATCAGCAGGGTCATCGCTAGCCAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATA
AATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCGTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGCGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCCCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTTTTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGTGGTGTCATGGTCGGTGATCGCCAGGGTGCCGACGCGCATCTCGACTGCATGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCCGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGCGGAATT
权利要求
1.一种组成物，其包含(a)一种病毒样颗粒；和(b)至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或所述抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
2.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒(a)是一种重组病毒样颗粒。
3.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒包含选自下组的重组蛋白或其片段(a)重组乙型肝炎病毒蛋白；(b)重组麻疹病毒蛋白；(c)重组辛德毕斯病毒蛋白；(d)重组轮状病毒蛋白；(e)重组口蹄疫病毒蛋白；(f)重组逆转录病毒蛋白；(g)重组诺瓦克病毒蛋白；(h)重组甲病毒蛋白；(i)重组人乳头瘤病毒蛋白；(j)重组多瘤病毒蛋白；(k)重组噬菌体蛋白；(l)重组RNA噬菌体蛋白；(m)重组Ty蛋白；(n)重组Qβ-噬菌体蛋白；(o)重组GA-噬菌体蛋白；(p)重组fr-噬菌体蛋白；和(q)(a)-(p)的任何一种重组蛋白的片段。
4.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心抗原。
5.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段。
6.权利要求5的组成物，其中所述RNA-噬菌体选自(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(j)噬菌体f2；(k)噬菌体PP7；和(l)噬菌体AP205。
7.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段。
8.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体fr的重组蛋白或其片段。
9.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
10.权利要求1的组成物，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇通过至少一个共价键与所述病毒样颗粒结合。
11.权利要求1的组成物，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇通过至少一个共价键与所述病毒样颗粒结合，其中所述共价键是一种非肽键。
12.权利要求1的组成物，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒融合。
13.权利要求1的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白或RANKL片段。
14.权利要求1的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种人RANKL蛋白或人RANKL片段。
15.权利要求1的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇具有一种选自下组的氨基酸序列a)SEQ ID NO79的氨基酸序列；b)SEQ ID NO80的氨基酸序列；c)SEQ ID NO81的氨基酸序列；d)SEQ ID NO82的氨基酸序列；e)SEQ ID NO83的氨基酸序列；f)SEQ ID NO84的氨基酸序列；g)SEQ ID NO100的氨基酸序列；h)SEQ ID NO101的氨基酸序列；i)SEQ ID NO79-84、100、101中任一种的片段的氨基酸序列。
16.权利要求1的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL肽。
17.权利要求16的组成物，其中所述RANKL肽是一种人RANKL肽。
18.权利要求1的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是包含至少一个RANKL蛋白抗原位点的一种RANKL肽。
19.权利要求1的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是包含一种选自下组的氨基酸序列的一种RANKL肽a)SEQ ID NO87的氨基酸序列；b)SEQ ID NO88的氨基酸序列；c)SEQ ID NO89的氨基酸序列；d)SEQ ID NO90的氨基酸序列；e)SEQ ID NO91的氨基酸序列；f)SEQ ID NO92的氨基酸序列；g)SEQ ID NO93的氨基酸序列；h)SEQ ID NO87-93中任一种的片段的氨基酸序列。
20.权利要求1的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇进一步包含至少一个选自下组的第二附着位点(i)所述抗原或抗原决定簇中非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中自然存在的附着位点。
21.权利要求20的组成物，其中具有所述至少一个第二附着位点的所述抗原或抗原决定簇包含一种选自下组的氨基酸序列a)SEQ ID NO104的氨基酸序列；b)SEQ ID NO105的氨基酸序列；c)SEQ ID NO106的氨基酸序列；d)SEQ ID NO107的氨基酸序列；e)SEQ ID NO108的氨基酸序列；f)SEQ ID NO109的氨基酸序列；g)SEQ ID NO110的氨基酸序列；h)SEQ ID NO104-110中任一种的片段的氨基酸序列。
22.一种组成物，其包含(a)含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；和(b)含有至少一个第二附着位点的至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，并且其中所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇中非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中自然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；并且其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。
23.权利要求22的组成物，其中所述第二附着位点能够通过至少一个非肽键与所述第一附着位点连接。
24.权利要求22的组成物，其中所述核心颗粒选自i)一种病毒；ii)一种病毒样颗粒；iii)一种噬菌体；iv)一种细菌菌毛；v)一种病毒衣壳颗粒；和vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的重组形式。
25.权利要求22的组成物，其中所述核心颗粒选自i)一种病毒样颗粒；ii)一种细菌菌毛；和iii)RNA噬菌体的一种病毒样颗粒。
26.权利要求22的组成物，其中所述病毒样颗粒(a)是一种重组病毒样颗粒。
27.权利要求22的组成物，其中所述病毒样颗粒包含选自下组的重组蛋白或其片段(a)重组乙型肝炎病毒蛋白；(b)重组麻疹病毒蛋白；(c)重组辛德毕斯病毒蛋白；(d)重组轮状病毒蛋白；(e)重组口蹄疫病毒蛋白；(f)重组逆转录病毒蛋白；(g)重组诺瓦克病毒蛋白；(h)重组甲病毒蛋白；(i)重组人乳头瘤病毒蛋白；(j)重组多瘤病毒蛋白；(k)重组噬菌体蛋白；(l)重组RNA噬菌体蛋白；(m)重组Ty蛋白；(n)重组Qβ-噬菌体蛋白；(o)重组GA-噬菌体蛋白；(p)重组fr-噬菌体蛋白；和(q)(a)-(p)的任何一种重组蛋白的片段。
28.权利要求22的组成物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心抗原。
29.权利要求22的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段。
30.权利要求29的组成物，其中所述RNA-噬菌体选自(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(j)噬菌体f2；(k)噬菌体PP7；和(l)噬菌体AP205。
31.权利要求22的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段。
32.权利要求22的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体fr的重组蛋白或其片段。
33.权利要求22的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
34.权利要求22的组成物，其中所述第二附着位点能够通过至少一个共价键与所述第一附着位点连接。
35.权利要求22的组成物，其中所述第二附着位点能够通过至少一个共价键与所述第一附着位点连接，并且其中所述共价键是一种非肽键。
36.权利要求22的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白或RANKL片段。
37.权利要求22的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种人RANKL蛋白或人RANKL片段。
38.权利要求22的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇包含一种选自下组的氨基酸序列a)SEQ ID NO79的氨基酸序列；b)SEQ ID NO80的氨基酸序列；c)SEQ ID NO81的氨基酸序列；d)SEQ ID NO82的氨基酸序列；e)SEQ ID NO83的氨基酸序列；f)SEQ ID NO84的氨基酸序列；g)SEQ ID NO100的氨基酸序列；h)SEQ ID NO101的氨基酸序列；i)SEQ ID NO79-84、100、101中任一种的片段的氨基酸序列。
39.权利要求22的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL肽。
40.权利要求39的组成物，其中所述RANKL肽是一种人RANKL肽。
41.权利要求22的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种含有RANKL蛋白的至少一个抗原位点的RANKL肽。
42.权利要求22的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种包含选自下组的氨基酸序列的RANKL肽a)SEQ ID NO87的氨基酸序列；b)SEQ ID NO88的氨基酸序列；c)SEQ ID NO89的氨基酸序列；d)SEQ ID NO90的氨基酸序列；e)SEQ ID NO91的氨基酸序列；f)SEQ ID NO92的氨基酸序列；g)SEQ ID NO93的氨基酸序列；h)SEQ ID NO87-93中任一种的片段的氨基酸序列。
43.权利要求22的组成物，其中具有所述至少一个第二附着位点的所述抗原或抗原决定簇包含一种选自下组的氨基酸序列a)SEQ ID NO104的氨基酸序列；b)SEQ ID NO105的氨基酸序列；c)SEQ ID NO106的氨基酸序列；d)SEQ ID NO107的氨基酸序列；e)SEQ ID NO108的氨基酸序列；f)SEQ ID NO109的氨基酸序列；g)SEQ ID NO110的氨基酸序列；h)SEQ ID NO104-110中任一种的片段的氨基酸序列。
44.一种药物组合物，其包含(a)权利要求1的组成物；和(b)一种药物可接受的载体。
45.一种药物组合物，其包含(a)权利要求22的组成物；和(b)一种药物可接受的载体。
46.一种疫苗组合物，其包含含有下述成分的组成物(a)一种病毒样颗粒；和(b)至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
47.权利要求46的疫苗组合物，它进一步包含一种佐剂。
48.权利要求46的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒(a)是一种重组病毒样颗粒。
49.权利要求46的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心抗原。
50.权利要求46的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段。
51.权利要求46的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段。
52.权利要求46的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体fr的重组蛋白或其片段。
53.权利要求46的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
54.权利要求46的疫苗组合物，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇通过至少一个共价键与所述病毒样颗粒结合，其中所述共价键是一种非肽键。
55.权利要求46的疫苗组合物，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒融合。
56.权利要求46的组合物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白或RANKL片段。
57.权利要求46的疫苗组合物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种人RANKL蛋白或人RANKL片段。
58.权利要求46的疫苗组合物，其中所述抗原或抗原决定簇具有一种选自下组的氨基酸序列a)SEQ ID NO79的氨基酸序列；b)SEQ ID NO80的氨基酸序列；c)SEQ ID NO81的氨基酸序列；d)SEQ ID NO82的氨基酸序列；e)SEQ ID NO83的氨基酸序列；f)SEQ ID NO84的氨基酸序列；g)SEQ ID NO100的氨基酸序列；h)SEQ ID NO101的氨基酸序列；i)SEQ ID NO79-84、100、101中任一种的片段的氨基酸序列。
59.权利要求46的疫苗组合物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL肽。
60.权利要求59的疫苗组合物，其中所述RANKL肽是一种人RANKL肽。
61.权利要求46的疫苗组合物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种含有RANKL蛋白至少一个抗原位点的RANKL肽。
62.权利要求46的疫苗组合物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种包含选自下组的氨基酸序列的RANKL肽a)SEQ ID NO87的氨基酸序列；b)SEQ ID NO88的氨基酸序列；c)SEQ ID NO89的氨基酸序列；d)SEQ ID NO90的氨基酸序列；e)SEQ ID NO91的氨基酸序列；f)SEQ ID NO92的氨基酸序列；g)SEQ ID NO93的氨基酸序列；h)SEQ ID NO87-93中任一种的片段的氨基酸序列。
63.权利要求46的疫苗组合物，其中所述抗原或抗原决定簇进一步包含至少一个选自下组的第二附着位点(i)所述抗原或抗原决定簇中非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中自然存在的附着位点。
64.权利要求63的疫苗组合物，其中具有所述至少一个第二附着位点的所述抗原或抗原决定簇包含一种选自下组的氨基酸序列a)SEQ ID NO104的氨基酸序列；b)SEQ ID NO105的氨基酸序列；c)SEQ ID NO106的氨基酸序列；d)SEQ ID NO107的氨基酸序列；e)SEQ ID NO108的氨基酸序列；f)SEQ ID NO109的氨基酸序列；g)SEQ ID NO110的氨基酸序列；h)SEQ ID NO104-110中任一种的片段的氨基酸序列。
65.一种生产权利要求1的组成物的方法，包括(a)提供一种病毒样颗粒；和(b)提供至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽；(c)混合所述病毒样颗粒和所述至少一个抗原或抗原决定簇，使得所述至少一个抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
66.一种生产权利要求22的组成物的方法，包括(a)提供含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；(b)提供含有至少一个第二附着位点的至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽，并且其中所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇中非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中自然存在的附着位点；其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；和(c)混合所述核心颗粒和所述至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇和所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。
67.一种免疫方法，包括对动物或人施用权利要求1的组成物。
68.权利要求67的免疫方法，其中所述抗原或抗原决定簇是一种自身抗原。
69.权利要求67的免疫方法，其中所述动物是人，并且其中所述抗原或抗原决定簇是一种人RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽。
70.用作药物的权利要求1的组成物。
71.用作药物的权利要求22的组成物。
72.权利要求1的组成物在生产用于治疗骨病的药物中的应用。
73.权利要求22的组成物在生产用于治疗骨病的药物中的应用。
74.权利要求1的组成物的应用，其中所述组成物与至少一种适用于治疗骨病的药物联合使用。
75.权利要求22的组成物的应用，其中所述组成物与至少一种适用于治疗骨病的药物联合使用。
全文摘要
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种组成物，其包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列，具体的是一种RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽－VLP阵列。更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含一种病毒样颗粒和至少一个与之结合的RANKL蛋白、RANKL片段或RANKL肽。本发明还提供一种分别生产偶联物和有序、重复阵列的方法。本发明的组成物可用于生产治疗骨病的疫苗，作为预防或治疗骨病、有效地诱导免疫应答特别是抗体应答的药物疫苗。而且，本发明的组成物尤其可用于在所述情形下有效诱导自身特异性免疫应答。
文档编号A61K39/385GK1582164SQ02821838
公开日2005年2月16日 申请日期2002年11月7日 优先权日2001年11月7日
发明者马丁·巴赫曼, 帕特里克·毛雷尔, 贡特尔·施波恩 申请人:赛托斯生物技术公司