专利名称：利用纤溶性金属蛋白酶处理留置导管阻塞的方法
技术领域：
本发明涉及纤溶性金属蛋白酶的治疗性施用，并且更具体地涉及在体内通过局部递送向血管血栓施用此类制剂，以实现血凝块溶解的方法。本发明也涉及溶解留置导管、旁路或其它血管通路装置中的血凝块，以恢复该血管通路装置功能的方法。
背景技术：
由血凝块导致的血管阻塞如栓塞及栓子是严重的医学疾病，如不即时治疗可具断肢或生命威胁。用于处理和消除血管血凝块的装置和方法业已建立。作为举例说明，参见1984年5月8日公布的美国专利No.4,447,236(Quinn)；1987年9月8日公布的美国专利No.4,692,139(Stiles)；1988年7月5日公布的美国专利No.4,755,167(Thistle等)；1992年12月1日公布的美国专利No.5,167,628(Boyles)；1993年6月29日公布的美国专利No.5,222,941(DonMichael)；1993年10月5日公布的美国专利No.5,250,034(Appling等)；1994年12月6日公布的美国专利No.5,370,653(Cragg)；1995年1月10日公布的美国专利No.5,380,273(Dubrul等)；1996年3月12日公布的美国专利No.5,498,236(Dubrul等)；1997年5月6日公布的美国专利No.5,626,564(Zhan等)；1998年1月20日公布的美国专利No.5,709,676(Alt)；1999年2月2日公布的美国专利No.5,865,178(Yock)以及WO 90/07352(1990年7月12日出版)。此类方法和装置包括用于将溶栓剂或纤维蛋白溶解剂递送到血凝块并使之溶解的输注导管。输注导管典型地与能够降解血凝块中的纤维蛋白的酶促活性制剂联用，从而有效溶解血凝块。此类酶典型地被称之为“溶栓剂”或“纤维蛋白溶解剂”。
纤溶酶(fibrolase)是已知的纤维蛋白溶解活性锌金属蛋白酶，其首次分离自南方铜头蛇(Agkistrodon contortrix contortrix)的毒液。参见Guan等，Archives of Biochemistry and Biophysics，289卷，2期，197-207页(1991)；Randolph等，Protein Science，Cambridge University Press(1992)，590-600页；1989年7月12日出版的欧洲专利申请No.0 323 722(Valenzuela等)以及1986年9月9日公布的美国专利No.4,610,879(Markland等)。已证明纤溶酶具有纤维蛋白溶解活性，且已有文献记载该金属蛋白酶对纤维蛋白原Aα-链具有蛋白水解活性，对Bβ-链的蛋白水解切割减弱，而对纤维蛋白原γ-链没有活性；Ahmed等，Haemostasis，20卷，147-154页(1990)。由于纤维蛋白是血凝块的主要组分，纤溶酶的纤维蛋白溶解活性特点表明了其作为血凝块溶解剂用于体内溶栓剂的用途的潜力；参见Markland等，Circulation，9卷，5期，2448-2456页(1994)以及Ahmed等，同上。
新型作用溶栓剂(NAT)为修饰形式的纤溶酶，其与纤溶酶的差异在于NAT含201个氨基酸，其N-端序列为SFPQR，而天然纤溶酶的N-端序列以EQRFPQR起始，且长度为203个氨基酸。设计所述氨基端修饰是用来防止能够形成可变量的环化谷氨酰胺(焦谷氨酸)的氨基酸残基处的化学反应，该反应具有造成产品质量及均一性批间偏差的可能性。因而，NAT可视作更为稳定的分子。
尽管存在这些结构差异，NAT和纤溶酶就酶促(纤维蛋白溶解)活性而言是相似的。这种生物活性的相似性与如Manning在Toxicon，33卷，1189-1200页(1995)中所述的表明纤溶酶分子的活性位点跨越氨基酸139-159、且其在三维空间中推测的定位远离氨基端的数据相一致。纤溶酶和NAT分子的活性位点含锌原子，其络合三个组氨酸残基。
有关蛇毒液来源的纤溶酶的公开文献已证明了其对纤维蛋白原Lys413-Leu414位点处以及对胰岛素氧化β-链Ala14-Leu15位点处的蛋白水解活性；Retzios和Markland，Thrombosis Research，74卷，355-367页(1994)；Pretzer等，Pharmaceutical Research，8卷，1103-1112页(1991)以及Pretzer等，Pharmaceutical Research，9卷，870-877页(1992)。也已经确定了NAT对这些底物的相同切割位点处具有蛋白水解活性。
与纤溶性金属蛋白酶如纤溶酶和NAT形成对照，血凝块溶解剂如链激酶、尿激酶和组织型纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)为纤维蛋白溶酶原激活剂，其通过激活内源性纤维蛋白溶解系统而促进血栓溶解。更具体地，纤维蛋白溶酶原活化剂催化纤维蛋白溶酶原转化为纤维蛋白溶酶，一种丝氨酸蛋白酶。纤维蛋白溶酶能够在精氨酰-赖氨酰键切割纤维蛋白原和纤维蛋白，并且正是通过纤维蛋白溶酶的产生，纤维蛋白溶酶原活化剂最终实现了纤维蛋白的降解和血凝块的溶解。当前商业上可获得的溶栓剂为纤维蛋白溶酶原活化剂如尿激酶、链激酶或tPA。
与纤维蛋白溶酶原活化剂类的溶栓剂不同，纤溶性金属蛋白酶如纤溶酶和NAT并不依赖于内源性纤维蛋白溶解系统(纤维蛋白溶酶原转化为纤维蛋白溶酶)。因此，这类血凝块溶解剂可因其独特的作用模式而有别于纤维蛋白溶酶原活化剂，并被定义为“直接”纤维蛋白溶解剂。
α2-巨球蛋白是普遍存在于哺乳动物血清中的蛋白酶抑制剂，并且是最大的血清蛋白之一(具有725千道尔顿的分子量)。α2-巨球蛋白的蛋白酶特异性很广，涵盖丝氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸及金属蛋白酶类。α2-巨球蛋白分子为相同亚基的四聚体，它们以二硫键连接成对，半个分子之间以非共价键结合。因而，在还原条件下，天然α2-巨球蛋白可解离为四个单体亚基。
α2-巨球蛋白的每个亚基都拥有极易于被蛋白水解切割的区域(“诱饵”区)。诱饵区的蛋白水解诱导α2-巨球蛋白的构象改变，这俘获了位于α2-巨球蛋白分子结构之内的蛋白酶。该过程在文献中被描述为“捕蝇草”相互作用。一旦蛋白酶被俘获，其在空间上受阻，因此不能接近其高分子底物。
另外，在α2-巨球蛋白和许多其俘获的蛋白酶之间可形成共价键。如所提到的那样，蛋白酶的俘获诱导了α2-巨球蛋白分子的构象改变。据推测，经此构象改变，α2-巨球蛋白分子内部的硫酯键具有反应性，并可与俘获蛋白酶的亲核残基(例如赖氨酸)形成共价键。因而，在体循环内，α2-巨球蛋白能够有效地中和多种蛋白酶。
而且，由蛋白酶俘获带来的α2-巨球蛋白的构象改变产生了可被网状内皮系统识别的形式。α2-巨球蛋白俘获的蛋白酶的清除通常用以分钟计的半衰期值描述，并且据信是通过表达于巨噬细胞、肝细胞和成纤维细胞之上的低密度脂蛋白(LDL)-受体相关蛋白发生的。有关α2-巨球蛋白更多的内容，参见Methods in Enzymology，A.J.Barrett编辑，Academic Press，Inc.，Philadelphia，(1981)，pages737-754。
α2-巨球蛋白能够与纤溶酶、NAT及其它蛋白酶形成络合物。不同于能够与α2-巨球蛋白形成可解离络合物的某些蛋白，纤溶酶及NAT为在生理条件下形成不能从α2-巨球蛋白上解离的络合物的纤溶性金属蛋白酶的两个实例。例如，当纯化的人类α2-巨球蛋白和NAT在一起温育时，络合物的形成起始于数秒之内，并且在数分钟之内几乎完成。这种现象表明在体外络合物形成可以是极为快速的，并且暗示了在体内α2-巨球蛋白与NAT或其它纤溶性金属蛋白酶之间的络合物形成的潜在速度。
尽管α2-巨球蛋白是主要的血浆蛋白之一，可是仍存在有限量的α2-巨球蛋白将会结合并中和纤溶性金属蛋白酶。因此所述α2-巨球蛋白的结合能力是可饱和的。一旦超过α2-巨球蛋白的结合能力，则未结合的纤溶性金属蛋白酶随着样品中附加纤溶性金属蛋白酶的加入而成指数地上升。
患者体循环中α2-巨球蛋白的存在对系统(例如静脉内)施用可被全身血循环中的α2-巨球蛋白结合的纤溶酶、NAT及其它纤溶性金属蛋白酶构成了挑战。除非内在α2-巨球蛋白的可饱和水平被此类纤溶性金属蛋白酶的系统施用剂量超过，否则后者将被有力地中和并致使其对于治疗目的而言无效。
在于兔子中进行的一个体内研究中，在系统静脉内施用后检测了来源于蛇毒液的纤溶酶的生物学效力。Ahmed等，Haemostasis，见上文。所用的纤溶酶剂量为3.7毫克每公斤，这估计会在3.0公斤的兔子中产生约为60微克每毫升的最终血液浓度。这种含量是基于在血液或血浆，很可能是归因于α2-巨球蛋白的存在下酶失活检测的研究而选择的(见第336和339页)。
在另一个体内研究中，在犬中检测了重组纤溶酶对血凝块溶解的生物学效应。Markland等，Circulation，见上文。在5分钟内在接近左颈动脉预先诱导的血栓处通过导管装置向每公斤(动物体重)灌输4毫克这种物质(见第2450页)。再一次地，注意到纤溶酶的失活发生在全身血循环中，很可能是归因于α2-巨球蛋白的存在(见第2454页第二栏最后一段)。
正如这两个研究所证明的那样，α2-巨球蛋白的灭活效应可通过施用或系统投药超过内在α2-巨球蛋白可饱和水平的纤溶性金属蛋白酶(兔子的研究)或者通过将酶局部递送到血凝块位点处(狗的研究)避免系统施用而克服。在另一方面，超过α2-巨球蛋白可饱和水平的纤溶性金属蛋白酶剂量，无论是系统或是局部递送的，有可能超过安全且为待治疗受试者良好耐受的水平。特别是，纤溶性金属蛋白酶不仅能够破坏纤维蛋白，而且他们也可以降解其它结构蛋白，因此在体内当超过α2-巨球蛋白的可饱和水平而大量存在时是具有潜在毒性的。
当使用留置导管或其它血管通路装置时，血凝块的形成或其它基于纤维蛋白的阻塞也是关注的问题。存在许多需要反复或延长使用血管通路装置的情况，例如导管、通路移植、套、针、动静脉瘘管或旁路。例如，与血透、化疗、输血或换血相关的各种操作、以及涉及反复静脉内或动脉内药物递送(或体液抽取)的其它操作可能涉及使用留置导管或其它永久性或半永久性植入的医学装置。血凝块可形成在已被引入血管空间之内的任何装置之中、周围或附着在其上，当装置在血管空间中保留一段延长的时间周期时或者当装置具有一个或多个极小的孔时尤为如此。另外，其它基于纤维蛋白的阻塞可附着在留置血管通路装置的任何部分，这将防止或妨碍所述装置的正常运转。
拥有处理即破坏、分解或溶解已形成在留置血管通路装置之中、周围或附着在其上的血凝块或其它阻塞的快速而有效的方法将是有益的。在不存在处理已形成在血管通路装置之中或周围的血凝块的有效方法时，留置装置将不得不由医师替换，招致额外的花费和患者的风险。
因此，本发明的目的在于提供处理留置血管通路装置之中或周围的血凝块或阻塞的安全且有效的方法。
本发明的目的也在于提供恢复完全或部分阻塞的留置血管通路装置的开放性的方法。
本发明的另一目的在于提供恢复其功能被基于纤维蛋白的阻塞改变的留置血管通路装置的功能的方法。
本发明的目的也在于提供使用局部施用的纤溶性金属蛋白酶在体内溶解血凝块的安全且生物学有效的方式。
发明概述在某些实施方案中，本发明为经由所述血管通路装置施用一定量的处于药学上可接受的溶液中的纤溶性金属蛋白酶治疗性处理留置血管通路装置之中的血凝块的方法，其中所述含量为每公斤待治疗人类受试者体重不超过1.7毫克纤溶性金属蛋白酶。在某些实施方案中，血管通路装置留置在人类受试者的动脉或静脉之中。在某些实施方案中，留置血管通路装置为导管、旁路、通路移植、针或套。在某些实施方案中，血管通路装置被用来引入或从血管区取液。在某些实施方案中，本发明的血管通路装置与血透、输血、取血或换血、化疗或者需要引入或从静脉或动脉取液的任何其它操作联合使用。
在某些实施方案中，本发明为通过向所述血凝块局部施用一定量的处于药学上可接受的溶液中的与α2-巨球蛋白络合的纤溶性金属蛋白酶溶解留置血管通路装置之中的血凝块的方法，所述含量足以促进血凝块溶解、同时水平又不超过明显高出所述人类受试者中α2-巨球蛋白的可饱和水平。
在某些实施方案中，本发明为恢复完全或部分阻塞的留置血管通路装置的开放性的方法。在某些实施方案中，本发明为恢复留置血管通路装置功能的方法。
附图简述
图1A-1C.图1A为在充气囊导管诱导的损伤和阻塞性血栓形成前成年猪颈动脉的基线血管造影照片。图1B为在第四天在按照本发明的方法施用NAT之前对同一动物拍的血管造影照片。图1C为在经由″PRO″导管施用30mg NAT后2小时的血管造影照片(有关该装置的举例说明，参见图3)。
图2举例说明了被设计用于在血管中局部递送溶栓剂的一类导管装置。
图3为用于在血管中局部递送溶栓剂的一类备选导管装置的代表性侧视图。
图4为估计的周围血管阻塞患者中NAT的最大剂量的柱形图。
图5举例说明了NAT在体外导管阻塞模型中的用途。
图6举例说明了众多试验结果的总结，所得平均值数据显示NAT在体外溶解阻塞比用于导管清除的商业尿激酶产品AbbokinasesOpen Cato快达40％。
发明详述在某些实施方案中，本发明为在人类受试者中通过纤溶性金属蛋白酶在体内处理血凝块的方法，包括向血凝块局部施用安全、生物学有效量的纤溶性金属蛋白酶，例如通过使用导管或其它血管通路装置。典型的，静止的纤维蛋白血凝块将分布于人类受试者的血管(动脉或静脉、天然或合成的(如移植物))之中。在某些实施方案中，本发明为处理位于留置导管、旁路、针或其它血管通路装置之中、周围或附着在其上的血凝块的方法。在某些实施方案中，本发明为恢复完全或部分阻塞的留置血管通路装置的开放性的方法。在某些实施方案中，本发明为恢复功能已因基于纤维蛋白的阻塞改变或在某种程度上受损的血管通路装置的功能的方法。
“安全、生物学有效”量是指足以降解纤维蛋白并促进血凝块(如血栓)溶解、同时水平又不明显高于待治疗患者循环系统中α2-巨球蛋白可饱和水平(即可能对血管壁造成损伤的水平)的含量。典型地，该含量将在每公斤待治疗人类受试者体重0.025和1.7毫克之间的范围，正如由来自于已研究了体外α2-巨球蛋白含量和结合能力的人类受试者的血样进行的研究所确定的那样。根据这种研究的体外结果，实际上已有可能限定α2-巨球蛋白的体内可饱和水平，从而使得能够对生物学有效量进行描绘，它不仅考虑了生物学效力所需纤溶性金属蛋白酶的最低水平，而且考虑到良好耐受施用的最高水平。这种研究进一步在下文的实施例中详细描述。
适用于纤溶性金属蛋白酶递送方式的术语“局部地”或“局部化的”在文中是指动脉内或静脉内施用，或者直接向血凝块本身(如血栓内)，或者在血凝块附近(相对于血流的远端或者近端)，且足够近以使多数纤溶性金属蛋白酶为血凝块所吸收。为了处理血管通路装置之中、周围或附着在其上的血凝块，或者为了恢复血管通路装置的开放性或功能，纤溶性金属蛋白酶的递送通常藉由血管通路装置本身完成，因而固有地为局部(递送)。在某些实施方案中，可使用第二血管通路装置如导管，以向植入的医学装置如支架递送纤溶性金属蛋白酶。
术语“导管递送工具”或“血管通路装置”在文中以约定俗成的含义使用，是指为输注或抽液或保持通道开放之目的用以插入到管道、血管、通道或体腔之中的管状医学装置。一般而言，此类工具将典型地包括含有一个或多个内部通道(或“内腔”)的延伸的柔性管体；允许将物质(即血凝块溶解剂)引入到管体并使之穿过所述内腔流动的近端；具有任选地锥形端的远端；以及位于远端处或附近的一个或多个出口，以允许物质相应外加压力离开导管。
术语“蛋白水解性地降解”、“分解”、“溶解”和“治疗性处理”在文中都用来指血凝块或基于纤维蛋白的其它阻塞的降解、瓦解、分解、破碎或其它形式的消除。血凝块可能部分或者完全堵塞血管或医学装置的内腔。类似地，“恢复开放性”是指因其中血凝块分解而致的通过血管或装置内腔或出口的血流(例如，以流量或流速计)的任何可测的增加。
如文中所用的术语“血凝块”或“阻塞”是指任何基于纤维蛋白的块、簇、堵塞或生长。典型地当血液在动脉或静脉内凝固并完全或部分地阻止、阻隔、阻碍或封阻其中的血液流动时，血凝块就形成了。血凝块也能够在引入到血管空间的任何外来物件之中或周围形成。血凝块可以是静止的，例如血栓(在血管中形成并保留在其中的血凝块)，或者它可以是可移动的，例如栓子(自其形成部位移动到身体另一场所的血凝块)。血凝块也可以在大小、形状和组成方面广泛变化，并且可包括团块以及瓣片或其它平面结构。有时，动脉粥样硬化斑、小块肿瘤、脂肪球、空气、羊水或见于血中的其它物质可象血凝块一样以相同的方式起作用。就此类物质含有纤维蛋白或易于被纤溶性金属蛋白酶降解的其它物质而言，本发明的一种方法将可用于处理之。
本发明的另一种方法进一步在下文就周围动脉阻塞(PAO)而言进行举例说明。PAO由于动脉硬化症而起源于外周血管病。症状在多年的动脉硬化进程中缓慢形成，下肢疾病患者的临界局部缺血水平约达15到20％。医学治疗是有限的，并且主要是利用诸如降脂或抗血小板制剂的药物治疗、戒烟计划以及体育运动旨在预防或降低风险。Jackson和Clagett，Chest，114卷，666S-682S页(1998)。
外周血管病的临床表现可能包括威胁肢体的局部缺血的急性发作或者更为慢性的血管病迹象(如间歇性跛行)的出现。除上述预防措施之外，慢性PAO典型地在严重的生活方式缺陷或威胁肢体的局部缺血发作之前不予治疗。视患病血管区段和阻塞程度而定，可用的医学干预包括经皮腔内血管成形术、外科手术血管再造以及血栓溶解术。研究表明血凝块溶解剂的动脉内输注，尤其是在阻塞早期，能够避免外科手术干预的需要。如在急性PAO将纤维蛋白溶酶原活化剂尿激酶的血栓溶解与外科手术治疗相比较的Rochester试验中所证明的那样(Ouriel等，Journal of Vascular Surgery，1994，19卷，1021-1030页)，该研究中处于血栓溶解武器之下的大约33％的患者仅用医学干预就得到了成功的治疗，从而避免了更为侵入性的操作。相反，处于手术武器之下的98％的患者经历血管内或外科手术操作。
能够以类似的方式通过本方法有效治疗的涉及阻塞性血凝块的其它医学紊乱包括但不限于急性心肌梗塞、局部缺血性中风、深静脉血栓形成和肺栓塞。在某些实施方案中，也可使用本发明的方法以溶解伴随长期植入的医学装置如留置导管和血透通路移植出现的血凝块。其它示例性的植入医学装置包括旁路、通路部件、针、套或其它血管通路装置。
在某些实施方案中，本发明适用于治疗性递送能够与α2-巨球蛋白络合的任何纤溶性金属蛋白酶。此类纤溶性金属蛋白酶如果是天然存在的话，可从其天然来源纯化，例如来自蛇毒液的纤溶酶。备选地，其核酸和氨基酸序列已知的多肽纤溶性金属蛋白酶制剂可利用重组表达和纯化的常规方法制备。
一般而言，重组方法使用编码目的纤溶性金属蛋白酶的DNA分子，其被插入到合适的载体中用以在合适的宿主细胞中表达。挑选在特定宿主细胞中具有功能，即与宿主细胞及其相容的载体，从而DNA的表达得以发生。载体也可以含5′侧翼序列(也称之为“启动子”)和可操作地连接于待表达DNA的其它表达调控元件，以及其它已知的元件，例如复制起点元件、转录终止元件、含供体和受体剪接位点的完整内含子序列、信号肽序列、核糖体结合位点元件、多聚腺苷酰化序列、用以插入编码核酸的多聚接头区以及可选标记元件。载体也可以任选地含有“标签”序列，即位于多肽编码序列5′或3′端的寡核苷酸序列，其编码多聚His或另外的小免疫原性序列。这种标签将与目的蛋白一同表达，并且可作为亲和标签用于从宿主细胞中纯化该多肽。如果期望，所述标签随后可通过多种手段从纯化的多肽上去除，例如使用选择性肽酶。
在期望多肽从宿主细胞中分泌出来的那些情况下，可使用信号序列以将多肽引导到合成它的宿主细胞之外。典型地，信号序列位于核酸序列的编码区中，或者直接位于编码区的5′端。已鉴定到许多信号序列，并且可以使用任一在所选宿主细胞中有功能的(信号序列)。
在已构建了载体且核酸已被插入到合适的载体位点之中后，可将完成的载体插入到合适的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。宿主细胞可以是原核的(如大肠杆菌)或真核的(例如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。
合适的宿主细胞或细胞系可以是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或3T3细胞。合适哺乳动物宿主细胞的选择以及用于转化、培养、扩增、筛选和产物生产及纯化的方法是本领域公知的。其它合适的哺乳动物细胞系有猴COS-1和COS-7细胞系，以及CV-1细胞系。另外示例性的哺乳动物宿主细胞系包括灵长类动物细胞系和啮齿类动物细胞系，包括转化的细胞系在内。正常的二倍体细胞、来源于体外原代组织培养物的细胞株、以及原代外植块也适用。候选细胞可以是选择基因基因型缺陷性的，或者可以含有显性作用的选择基因。还有其它合适的哺乳动物细胞系，包括但不限于HeLa、小鼠L-929细胞、来源于Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK仓鼠细胞系。
同样可作为宿主细胞的有细菌细胞，例如，多种大肠杆菌菌株以及多种酵母细胞菌株。
将载体插入(也称之为“转化”或“转染”)到所选宿主细胞中可利用诸如磷酸钙、电穿孔、微注射、脂质体转染或DEAE-葡聚糖法等方法实现。所选方法将部分地为待用宿主细胞类型的函数。这些方法及其它合适的方法是熟练技术人员众所周知的。
当在合适的条件下培养时，宿主细胞能够合成目的纤溶性金属蛋白酶。宿主细胞可利用熟练技术人员众所周知的标准培养基培养。培养基通常将含有细胞生长和存活必需的所有营养。例如，用于培养大肠杆菌细胞的合适的培养基为Luria肉汤(LB)和/或Terrific肉汤(TB)。用于培养真核细胞的合适的培养基为RPMI 1640、MEM、DMEM，它们都可按培养中的特定细胞系所需补充血清和/或生长因子。
典型地，用于转化细胞选择性生长的抗生素或其它化合物仅作为培养基补充物添加。待用化合物将由用于转化宿主细胞的质粒上存在的可选标记元件决定。例如，当可选标记为卡那霉素抗性时，添加到培养基中的化合物将为卡那霉素。
宿主细胞中产生的蛋白量可利用本领域公知的标准方法进行评价，包括蛋白质印迹分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、HPLC分离、免疫沉淀和/或活性测定如DNA结合凝胶移位测定。
如果蛋白由除革兰氏阴性细菌以外的宿主细胞分泌，则多数将很可能见于细胞培养基中。如果不分泌，它将存在于胞质之中。对于胞内蛋白，宿主细胞典型地首先被机械破碎。对于定位于周质的蛋白，可利用机械破碎或渗透处理将周质内含物释放到缓冲液中，然后从该溶液中分离多肽。之后可利用多种技术实现自溶液中的纯化。
如果蛋白已被合成从而含有标签，例如在其羧基或氨基端的六聚组氨酸或其它小肽，则通过使溶液穿过其中柱基质对所述标签或直接对所述多肽具有高亲和力(如单克隆抗体)的亲和柱，其可以基本上以一步操作纯化。当多肽无标签且抗体不存在时，可使用其它众所周知的纯化操作，例如离子交换层析、分子筛层析、反相色谱、HPLC、自然凝胶电泳联合凝胶洗脱、以及制备性等电聚焦(″Isoprime″machine/technique，Hoefer Scientific)。在有些情况下，可结合两种或多种这些技术以获得增加的纯度。
在文中用于举例说明本发明的实施的新型作用溶栓剂(NAT)多肽一般是指SEQ ID NO1的纤维蛋白溶解活性金属蛋白酶。所述NAT多肽由SEQ ID NO2的cDNA分子编码，尽管根据进一步在下文提及的特定方法，编码同一多肽的变体序列的DNA分子也可用于表达和生产。
纤溶酶在科技和专利文献中已有描述，参见上文的参考文献。典型地，在本发明的实施中所用的纤溶酶形式将是SEQ ID NO3，其由SEQ ID NO4的cDNA分子或编码相同氨基酸序列的其变体编码。
优选地，采用酵母表达系统用于NAT的重组表达。特别提及的是毕赤氏酵母属菌株，例如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)，是最为有利和优选使用的。此系统的详细描述可见于美国专利No.4,855,231(Stroman等)、美国专利No.4,812,405(Lair等)、美国专利No.4,818,700(Cregg等)、美国专利No.4,885,242(Cregg)以及美国专利No.4,837,148(Cregg)，特此将其公开内容并入作为参考。此系统中纤溶酶的表达将典型地涉及SEQ ID NO5的DNA分子，除“成熟”多肽(核苷酸784-1392)外，其还编码“前原”序列(核苷酸1-783)。此系统中NAT的表达将典型地涉及SEQ ID NO6的DNA分子，除“成熟”多肽(核苷酸784-1386)外，其还编码“前原”序列(核苷酸1-783)。
根据本发明使用的纤溶性金属蛋白酶，无论它是NAT、纤溶酶、或是某些其它纤溶性金属蛋白酶，都以药学上可接受的溶液施用，单独或含附加的药学上可接受的成分。如果期望，除纤溶性金属蛋白酶和溶剂(即蒸馏水或生理盐水)外，此类溶液可包含常规量的标准成分如稳定剂(以防止蛋白聚集或在水性介质中的物理或化学降解)、膨胀剂(以提供体积)、稀释剂、抗菌剂、粘度调节剂、抗氧化剂等等。可包括在制剂中的已知赋形剂包括聚醇(包括甘露醇、山梨糖醇和丙三醇)、糖(包括葡萄糖和蔗糖)以及氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。例如参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania。也见WO01/24817 A2(特此将其全文并入作为参考)，其公开了可用于本发明的纤溶制剂的多种组合物。
期望在施用前药物组合物将被缓冲(用生物相容性缓冲剂，例如柠檬酸或柠檬酸盐)至处于或接近中性(7.0)的pH，并且通常在约6.5和约8.0的pH(±0.5)之间。
如果纤溶性金属蛋白酶的金属离子为锌，如纤溶酶或NAT那样，可优选包括水溶性锌盐(例如硫酸锌或醋酸锌)作为稳定剂。为进一步增强组合物的长期稳定性和保存限期，也可以有利地冷冻溶液或将其转变为冻干(冷冻-干燥)品，其在用前融化或重构，视情形而定。
作为举例说明，本发明的方法中可用的可冷冻液体医学组合物包含纤溶酶或NAT、水溶性锌盐、柠檬酸缓冲液、任选地选自水溶性钙盐的附加稳定剂、以及任选地膨胀剂(例如甘露醇)。也可以添加表面活性剂如Tween80(BASF，Gurnee，Illinois)以增进冻融稳定性。可添加Tris缓冲液(Sigma，St.Louis，Missouri)或另外的缓冲能力高于pH7.0的缓冲液以使pH稳定在或高于pH7.4。这些成分多数将以从0.001到2.0毫摩尔(mM)或小于10％(w/v)的范围小量存在。缓冲剂将以足以达到期望pH的量添加，且该量可根据特定制剂而变。
作为进一步的举例说明，本发明的方法中可用的可冻干或冻干药物组合物包含纤溶酶或NAT、锌稳定剂(如诸如上述的水溶性锌盐)、以及柠檬酸缓冲液，有或无其它赋形剂(如膨胀剂，例如甘露醇、甘氨酸等)。冻干组合物也可以含二糖如蔗糖或海藻糖作为冻干保护剂。可添加表面活性剂如Tween80以防护作用于纤溶性金属蛋白酶(如纤溶酶或NAT)的冻干压力。pH理想地将维持在pH8.0±0.5，使用pKa在此范围内的合适缓冲液(例如Tris)。成分的用量依据上文。
如所提到的那样，在某些实施方案中，使用本发明的方法局部施用生物学有效量的在0.025和1.7mg/kg之间的剂量范围内的纤溶性金属蛋白酶。优选地，此含量将在从约0.1到约0.5mg/kg的范围中。溶液浓度将据此配制，在施用时按需施行稀释。
与天然动脉或静脉如PAO中的血栓治疗不同，发生在植入或留置血管通路装置中的血凝块处理构成了额外的挑战。例如，在阻塞的中央静脉线中，导管的“死容量”(即导管内径乘以其长度)限定了导管内可容纳的最大容量。例如，具有1.0mm内径和40.0cm长度导管拥有约0.3ml的死容量。由于容量可如此有限，限定合适的溶液强度是很重要的。因此，提高溶液强度或浓度是提高可溶解靶标血凝块的用药量的有效手段。
在某些实施方案中，本发明的方法涉及纤溶性金属蛋白酶治疗与血管通路装置相关的阻塞的用途。此类血凝块可发生在血管通路装置之中、周围或附着在其上。典型地，血凝块将形成在装置如导管的内腔或出口，并且可能干扰导管的功能。血凝块也可以发生在血管通路装置的外部，例如瓣片，其有可能覆盖出口并因而阻止药物的引入或血液的移取。血凝块也可以附着在血管通路装置之上，干扰装置的正确运作。所述干扰可以因部分阻塞或封阻(也就是说有些流体可能通过)或者其中无流体可通过的完全阻塞而引起。
为示范本发明的一种方法，使用体外导管阻塞模型来模拟留置导管型装置中的血凝块。在这种模型中，使用胶原涂敷的巴斯德移液管模拟导管的留置部分。通过毛细管作用由指刺将人血抽至3.0mm的长度并使之凝固。将一个移液管头插入到含盐水的瓶中，而另一个插入到4mg NAT(40mg/ml溶液浓度100ul)的NAT溶液中。图5举例说明了这种体外导管阻塞模型的结果，其显示盐水中的血凝块保持完好，而40mg/ml中的血凝块在溶解血凝块方面是活跃的。
在另一个实验中，将不同的一组移液管(在头部每一个都含血凝块)插入并在含如下100ul盐水、100ul尿激酶溶液(5000IU/ml)以及100ul NAT溶液的瓶中温育，其中通过将溶液浓度从5mg/ml提高到40mg/ml而使药量从0.5变化到4mg。图6举例说明了众多实验的总结结果，所得平均值数据证明NAT在体外溶解阻塞比AbboknnaseOpenCath，一种用于导管清除的商业尿激酶产品快达40％(第二柱，UK 500I.U.)。图6也证明了NAT就NAT通过蛋白水解起降解血凝块作用的速度而言的剂量依赖性质。
为处理相对小的留置导管阻塞，如由体外导管阻塞模型所模拟的阻塞，优选的处理范围将会是大约5到40mg/ml纤溶酶、NAT或其它纤溶性金属蛋白酶。然而，根据血管通路或其它医学装置的类型和大小、还有血凝块或阻塞的位置、大小以及程度，可能需要小得多或大得多的剂量。例如，处于相对大的血透旁路中的血凝块很可能将会比封阻1.0mm直径导管出口的血凝块需要更高浓度的纤溶性金属蛋白酶。因此，用于该适应症的浓度无论在何处可在从0.1mg/ml或更小到80mg/ml以上的范围内变化。
对于位于留置血管通路装置之中、周围或附着在其上的血凝块，有效剂量可通过多种方式递送，包括脉动输注、连续输注、团块施用或者所有三种的组合。考虑到由“死容量”束缚所造成的困难，团块施用通常是优选的。
在典型的情况下，本发明的方法与导管引导的血栓溶解操作联合实施。此类操作包括使用预先灭菌的导管型药物递送装置，其侧壁可由薄的半刚性或柔性生物适应性材料(例如聚烯烃、含氟聚合物或其它惰性聚合物)制成。一般而言，合适的导管含有至少一个沿装置长度延伸的内部腔(或内腔)。构造导管的材料足够柔韧，从而可在脉管系统内部移动而不会对血管壁造成损伤，但是又足够刚硬，从而可朝治疗部位延伸一段距离，而装置的内腔保持充分扩张。典型地，此类导管装置将在导管直径French标度从2到20(1/3毫米等于1French)、而长度从2到6英尺或更长的范围内变化。
根据本发明的用于血管内递送血栓溶解药物的示例性的导管装置在图2和3中举例说明，其实际应用在下文的实施例中详细说明。不过，可以使用任何适用于该方法的普通导管递送或血管通路装置，包括但不限于文中提及的特定装置。
例如，图2举例说明了设计用于在血管中局部递送溶栓剂的一类导管装置。所述装置以侧向截面角度显示，在递送终端含有“侧孔”，在外加液压下浸剂(infusate)(溶栓剂)通过该侧孔释放出来。该图及其后图中相对于总尺寸的导管直径被扩大以更好地显示细节。同时参见图3，其举例说明了侧向截面角度的用于在血管中局部递送溶栓剂的另一类导管装置。所述装置含有细的裂缝，称之为“压力感应出口”(PRO)，其以规则的间距在导管壁上切割而成，从而当导管内的液压达到临界点、导致裂缝开启时，浸剂溢出。所述装置可与能够递送药物输注脉冲的自动化活塞驱动脉冲输注装置(未显示，但在下文进一步例示)联合使用。
对于发生在静脉或动脉中且与血管通路或其它医学装置的引入无关的血凝块，有效剂量的纤溶性金属蛋白酶可通过脉动输注、连续输注、团块施用或者所有三种的组合经由导管向局部治疗部位递送。对于这些类别的血凝块，治疗液中纤溶性金属蛋白酶的溶液强度(即浓度)也是重要的参数。更具体地，应选择在效力低端纤溶性金属蛋白酶最小稀释度(这对于团块施用尤为重要)和在高端纤溶性金属蛋白酶最大溶解度之间的范围。一般地，采用从约0.1到约80mg/ml范围内的溶液强度。然后据此选择团块的体积(或者在“脉冲”递送的情况下为多个团块的总体积)，以递送有效量的在上文规定的范围之内的纤溶性金属蛋白酶。
具体实施方案的描述本发明在下列实施例中进一步举例说明，所述实施例是示例性的，而并非将本发明限制为所述实施方案。在这些实施例中，并且在本发明描述的始终，“kg”表示每个测试受试者体重的千克数，“mg”表示毫克数，“mL”表示毫升数，而“min”表示分钟数。举例说明的纤溶性金属蛋白酶，即新型作用溶栓剂(NAT)是重组来源的，并且根据上文所提及的方法制备。
实施例1成年猪颈总动脉亚急性血栓症的血栓溶解
NAT已在合同实验室(Charles River Laboratories，Southbridge，Massachusetts)中在体重平均75kg的成年猪颈动脉亚急性血栓症模型中进行了研究。该研究的目的在于确定NAT在与人类外周动脉阻塞相关的血栓症模型中的纤维蛋白溶解活性。
在这种动物模型中，通过联合充气囊损伤、凝血酶和停滞沿颈动脉整个长度(从主动脉起点到颈动脉分岔大约为20厘米)形成血栓。血栓大小接近于临床上遇到的外周动脉阻塞的人类的血栓大小。在血栓形成成功之后，使动物进行为期四天的恢复。选择四天周期以允许广泛的纤维蛋白交联、血栓重塑以及细胞浸润。特别地，这种模型中血栓的大小和时期都是多数近来发表的纤维蛋白溶酶原活化剂在人类外周动脉阻塞血栓溶解TOPAS试验中报道的缺血症状大小和持续时间的合理体现。有关参考文献，参见Ouriel等，New England Journalof Medicine，338卷，1105-1111页(1998)。
简要地，颈总动脉可通过荧光镜检指导的充气囊损伤沿其整个长度形成血栓。所用的充气囊为特大型的且不易屈从。所述充气囊在高达12个大气压的压力下充气，这导致血管内膜层的压伤。当给充气囊充气时，前后移动之以便揭掉血管内皮。
充气囊操作极为有害并造成高度血栓形成的血管表面，并且沿颈总动脉的整个长度上重复。在彻底损害整个动脉之后，将充气囊撤回到靠近主动脉的近位，并充气以堵塞血液沿血管的流动。在堵塞的同时，通过充气囊导管的远侧端口注射50单位的牛凝血酶以刺激凝固。充气囊在为期30分钟的时间内保持充气，这引起血管的血栓形成性阻塞。30分钟后，对充气囊放气，并进行血管造影以确认血管已被堵塞。利用这些操作，在大于90％的情况下实现了血管阻塞。
图1A为在充气囊导管诱导的损伤和阻塞性血栓形成前成年猪颈动脉的基线血管造影照片。箭头表示左颈总动脉中对照介质的位置和存在，标志着动脉中的血流未被阻塞(即血管是“开着的”)。图1B为在第4天在按照本发明的方法施用NAT之前对同一动物拍的血管造影照片。箭头表示左颈总动脉的位置，然而，由于阻塞性血栓的存在对照介质不在动脉中流动。图1C为在经由″PRO″导管施用30mg NAT后2小时的血管造影照片(有关该装置的举例说明，参见图3)。箭头表示血管中对照介质的存在，证明左颈总动脉已恢复了开放性。在动脉内腔中可见最小限度的残留血栓。
一旦血栓形成，则取出充气囊导管、引导导管和通路套，并允许动物进行为期四天的恢复。在第四天，重新麻醉动物，重新形成阻塞，并在荧光镜检指导下推进并安置一多侧孔药物递送导管(见图2和3)，从而使侧孔位于血栓之内。使用从10到30mg范围内变化的固定NAT剂量(或者基于体重调整的大约0.1到0.4mg/kg)，通过血管造影术观察NAT的血栓溶解，如图1A-1C所示。
如图1B中图像所举例说明的那样，如通过血管造影术评估的那样，NAT可有效地恢复靠前等级的流动。更为定量地，靶标血管中的流动被定性地按照4-分的等级(从0到3的范围内变化)计分，其中0＝没有流动1＝流动估计小于对侧(无血栓形成的)颈动脉的30％2＝流动估计为对侧颈动脉的30-80％3＝流动与对侧颈动脉无差别图1B所示图像得分为等于3的流动等级，在由固定30mg剂量的NAT(在75kg猪中大约为0.4mg/kg)治疗的血栓形成血管中这是常见的结果。下文下列实施例中的表1-3举例说明了治疗方案和来源于连续血管造影照片的平均流动得分。在所有研究中，持续监测呼吸、体温、心率和动脉血压，并且保持在生理范围之内，在施用NAT后未观察到变化。
实施例2PRO导管的选择和脉冲-喷雾递送在外周动脉阻塞的临床处理中，溶栓剂经由置于血栓附近或植入其中的导管递送。如图2和3所示，存在两类常用导管。
一种“侧孔”导管(图2)在靠近封闭远端6处具有在导管(4)上切割而成的微小圆侧孔(2)，并在近端12所附的配对环中具有入口8(为纤溶性金属蛋白酶溶液之用)。导管4由柔性延长的生物适应性聚合物管材构造，它中空薄壁，且具有2到20French的统一直径，并且优选3到5French。所述导管在靠近远端6的外表面上含有两个不透射线的标记14，这划分出了含侧孔2的导管部分的界限。在实践中，所述导管被插入到阻塞的动脉或静脉的外科手术开口中，并且在按照标准认可操作经由荧光镜检观察的同时，小心地使之穿过血管移动，从而将远端6置于血栓之中或附近。在荧光镜图像中清晰显示的标记14可作为安置该导管部分的向导，从而由侧孔2出现的浸剂将直接与血栓接触。然后在轻压下将纤溶性金属蛋白酶药液自注射器样贮液器16注射到入口8中，并朝远端6推进，穿过孔2进入到血栓中，导致纤维物质的降解。
当利用这类导管进行纤溶性金属蛋白酶输注时，多数含纤维蛋白溶解剂的溶液倾向于从近侧孔(即离药物入口8最近的孔)溢出，这对于治疗部位药物递送的均一性具有负面影响。也存在血液在负压下经由侧口2逆流到导管中的可能性。
另外一种导管也是由中空薄壁的生物适应性聚合物材料组成的，如图3所示，具有极其细的裂缝2，它是在柔性导管4上以规则间隔在靠近封闭远端6处由激光切割而成的。所述裂缝称之为压力感应出口(“PRO”)，它足够紧密，浸剂不会溢出，除非导管内的液压达到临界点并同时导致裂缝扩张从而临时开启。所述导管也可以含有外部不透射线的标记8，以有助于将装置安置在血栓部位。
理想地，此类“PRO”输注导管与能够将低容量调节的药物输液脉冲递送到导管4近端14处所附配对环12上的入口10中的自动化活塞驱动脉冲输注装置(未显示)联合使用。当递送脉冲时，导管内的压力即刻升高。作为响应，压力感应出口(裂缝2)即刻开启，并允许浸剂(如纤溶性金属蛋白酶药液)溢出。浸剂脉冲递送和PRO型导管的理论优势在于浸剂沿导管整个长度经由裂缝均一地递送，而经由“侧孔”导管(图2)递送的浸剂如所说的那样，沿最小阻力的路径而行，并以非均一的方式流出近端侧孔。
利用固定剂量的30mg NAT(在75kg猪中大约为0.4mg/kg)，使用四天史颈动脉血栓症的猪模型评估上述两种导管类型的性能。结果总结于表1。
表1利用侧孔和PRO输注导管由NAT获得的血管造影流动得分的比较
CMCragg-McNamaraTM阀式输注“侧孔”型导管(MicroTherapeutics，Inc.，San Clemente，CaLfornia)。PS如由通过使用压力感应(PRO)出口导管(Uni*Fuse CatheterTM，AngioDynamics，Inc.，Queensbury，New York)所限定的“脉冲喷雾”递送与自动化脉冲输注装置(PULSE*SPRAY INJECTOR Model PSI-1，AngioDynamics，Inc.，Queensbury，New York)联合使用。
如表1所示，由脉冲喷雾形式治疗的组中血管造影流动得分在30分钟血管造影照片处表现出略高的初始流动得分，并持续到四小时的时间点。尽管未获得统计学差异，血管造影结果一般被判断为较优越。所以，PRO型导管联合脉冲喷雾递送是根据本发明的纤溶性金属蛋白酶优选的递送模式。
实施例3药物递送时间的评估急性外周动脉阻塞典型地由纤维蛋白溶酶原活化剂如尿激酶治疗，其作为输液递送，持续时间通常为24小时，并偶见长达48小时。漫长的输注据推测可在延长的时间周期内维持低水平的纤维蛋白溶酶原活化剂产生，以有效地溶解阻塞的血栓。由于NAT和纤溶酶都是纤溶性金属蛋白酶，此种延长的输注可能不是必要的。为评估递送速率是否影响血管造影血凝块溶解，利用PRO导管和脉冲喷雾装置递送固定30mg剂量的NAT(在75kg猪中大致为0.4mg/kg)。使用0.1mL脉冲体积，在6分钟(每分钟10个脉冲)或60分钟(每分钟1个脉冲)内递送5mg/mL NAT溶液。结果示于表2。
表2由PRO导管和脉冲喷雾注射器递送的NAT药物递送时间的比较
如表2所示，在6分钟之内递送30mg NAT在30分钟的血管造影照片中在三只动物中产生2.7的平均流动得分，其持续到四小时时间点之外。相反，在60分钟之内通过脉冲输注递送30mg NAT远不及它可观。尽管这些数据未经统计学比较，结果似乎支持以更为快速的脉冲方案递送NAT。
实施例4脉冲体积的优化脉冲喷雾输注装置可设计用于递送每个脉冲0.1到0.5mL的脉冲体积。为确定是否脉冲体积对猪模型的血管造影结果有任何影响，将0.2mL的脉冲体积与0.4mL的体积进行了比较。NAT以10mg的固定剂量(在75kg猪中相当于0.15mg/kg)递送。结果示于表3。
表3使用以0.2mL或0.4mL脉冲体积递送的NAT的血管造影结果的比较
如表3所示，在30分钟处，0.4mL脉冲体积组的平均血管造影得分略高。不过，在四小时时间点，0.2mL脉冲体积的组平均值略高。既如此，由这些研究无法得出一种脉冲体积优于另一种的结论。
前文和表中的结果提示几乎所有这些NAT治疗方案用本发明的递送方法可有效治疗外周动脉阻塞，并且这些结果至少与纤维蛋白溶酶原活化剂如尿激酶治疗相当，它是目前溶栓剂的治疗选择。
结果证明脉冲喷雾递送的PRO导管似乎提供更优越的血管造影结果。考虑到这些研究中的动物体重(70-100kg)，30mg的固定剂量基于体重调整大致相当于0.3-0.4mg/kg。
将固定剂量的NAT降至10mg导致四小时处组平均血管造影得分的下降，并且在有些动物中，无法获得开放性。这表明在这种模型中10mg剂量的NAT似乎是生物活性的阈值剂量。考虑到这些研究中的动物体重(70-100kg)，10mg的固定剂量基于体重调整大致相当于0.1-0.15mg/kg。将脉冲体积由0.2mL变为0.4mL，似乎对血管造影开放性得分并无深刻影响。
实施例5人类安全、良好耐受、生物学有效剂量范围的确立有关α2-巨球蛋白在外周血管疾病(PVD)老年患者中的血清浓度或生化活性不存在令人满意的文献。由于α2-巨球蛋白浓度为安全性的关键性决定因素，并且很可能与体内纤溶性金属蛋白酶的耐受有关，在PVD患者中进行了代表性的流行病学研究，以评价血清α2-巨球蛋白浓度和纤溶性金属蛋白酶结合能力(利用NAT作为测试制剂)。
征集了两个中心(Cleveland Clinic Foundation，Cleveland，OH和Rochester General Hospital，Rochester，NY)的216名患者。收集人口统计学信息及其它患者特征，并获取血清用于检测α2-巨球蛋白、NAT结合能力(通过利用检测未结合NAT的HPLC测定法滴定个体患者的血清样品)及其它血清化学参数。主要目的在于确定α2-巨球蛋白血清浓度和能够在体外被中和(NAT结合能力)的NAT含量(以每毫升血清中的毫克计)之间的关系。
本研究中患者特征与两个最大的已发表的PAO血栓溶解研究(即STILE和TOPAS研究)中患者特征的比较显示本研究中的患者群具有先前的PAO血栓溶解研究的代表性；有关先前研究的更多详情，分别参见Annals of Surgery，220卷，251-266页(1994)和Ouriel等，NewEngland Journal of Medicine，338卷，1105-1111页(1998)。
利用NAT结合能力和每个患者血浆体积的估计值计算了每个患者估计的NAT最大剂量(EMD)。研究结果预测普通患者可接受1.7mg/kg(局部或系统递送)的剂量，而不会超过α2-巨球蛋白结合和中和NAT的能力。来自该研究的结果总结于图4。
在图4中，计算了该研究中216名受试者每人估计的NAT最大剂量。研究结果描绘为上文的柱形图，其中通过目测可观察到钟形分布。该研究中的普通患者据推测能够耐受1.7mg/kg的NAT(钟形分布的峰)。动物研究中施用的剂量用作参考(右手边)，并且可看出对于99％的研究人口而言超过了估计的最大NAT剂量。
因而，本发明规定的0.025到1.7mg/kg范围代表了投药患者能够安全接受(基于血浆体积和α2-巨球蛋白的NAT结合能力)而循环中不会出现游离NAT的合理估计。
总而言之，来自示例性的药理学研究，即上文实施例1-4的结果显示了纤溶性金属蛋白酶在血栓症动物模型中作为血凝块溶解剂的生物学效力，其中血栓在大小和时期上与人类外周动脉阻塞中频繁遇到的相当。在所述动物模型中确定的剂量是未考虑或评估动物中的潜在毒性而获得的。如Ahmed等和Markland等(上文)描述的在兔子和狗中的有效剂量(分别为3.7和4.0mg/kg)可能使得纤溶性金属蛋白酶的兽用成为可能。然而，当在人类数据存在下考虑时，施用3.7和4.0mg/kg的剂量将会对99％的研究人口过量投药。因此，已公开的动物研究不能使得纤溶性金属蛋白酶在人类中安全且生物学有效方式的治疗应用成为可能。而在另一方面，实施例5中所提供的数据确实使得这种人类应用成为可能。
序列表<110>Toombs，Christopher F.
<120>利用纤溶性金属蛋白酶处理留置导管阻塞的方法<130>A-627A<140>N/A<141>2002-06-20<150>09/466,276<151>1999-12-17<160>6<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>201<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述NAT(南方铜头蛇纤溶酶的类似物)<400>1Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp His Arg1 5 10 15Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln Trp Val20 25 30His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Asn Ile35 40 45Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp Leu Ile50 55 60Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp65 70 75 80Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln Leu85 90 95
Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val100 105 110Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln Asp His115 120 125Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu Gly130 135 140His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly Ala145 150 155 160Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu165 170 175Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn180 185 190Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro195 200<210>2<211>603<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述编码NAT(纤溶酶类似物)<400>2tctttcccac aaagatacgt acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa 60tacaacggtg actctgacaa aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac 120gaaatctaca gaccactgaa catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac 180caagatttga tcaccgttac ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg 240cgtgaaaccg acctgctgcg tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc 300gacttcgacg gtgatactgt tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat 360tctactggtg ttatccagga ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca 420cacgaactgg gtcataacct gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca 480aactcctgtg ttatggctgc tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc 540tctaagaaag actaccagac cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa 600ccg 603
<210>3<211>203<212>PRT<213>南方铜头蛇<220>
<223>南方铜头蛇固有纤溶酶<400>3Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp1 5 10 15His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln20 25 30Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Ash Glu Ile Tyr Arg Pro Leu35 40 45Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp50 55 60Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly65 70 75 80Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala85 90 95Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala100 105 110Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln115 120 125Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu130 135 140Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys145 150 155 160Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser165 170 175
Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr180 185 190Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro195 200<210>4<211>609<212>DNA<213>南方铜头蛇<220>
<223>编码南方铜头蛇固有纤溶酶<400>4caacaaagat tcccacaaag atacgtacag ctggttatcg ttgctgacca ccgtatgaac 60actaaataca acggtgactc tgacaaaatc cgtcaatggg tgcaccaaat cgtcaacacc 120attaacgaaa tctacagacc actgaacatc caattcactt tggttggttt ggaaatctgg 180tccaaccaag atttgatcac cgttacttct gtatcccacg acactctggc atccttcggt 240aactggcgtg aaaccgacct gctgcgtcgc caacgtcatg ataacgctca actgctgacc 300gctatcgact tcgacggtga tactgttggt ctggcttacg ttggtggcat gtgtcaactg 360aaacattcta ctggtgttat ccaggaccac tccgctatta acctgctggt tgctctgacc 420atggcacacg aactgggtca taacctgggt atgaaccacg atggcaacca gtgtcactgc 480ggtgcaaact cctgtgttat ggctgctatg ctgtccgatc aaccatccaa actgttctcc 540gactgctcta agaaagacta ccagaccttc ctgaccgtta acaacccgca gtgtatcctg 600aacaaaccg 609<210>5<211>1392<212>DNA<213>南方铜头蛇<220>
<223>南方铜头蛇固有前纤溶酶<400>5atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360
aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380ctgaacaaac cg 1392<210>6<211>1386<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述前NAT(南方铜头蛇前纤溶酶类似物)<400>6atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg ctgaccaccg tatgaacact 840aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc accaaatcgt caacaccatt 900
aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg ttggtttgga aatctggtcc 960aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca ctctggcatc cttcggtaac 1020tggcgtgaaa ccgacctgct gcgtcgccaa cgtcatgata acgctcaact gctgaccgct 1080atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgttg gtggcatgtg tcaactgaaa 1140cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc tgctggttgc tctgaccatg 1200gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg gcaaccagtg tcactgcggt 1260gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac catccaaact gttctccgac 1320tgctctaaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca acccgcagtg tatcctgaac 1380aaaccg 138权利要求
1.溶解人用留置血管通路装置之中、周围或附着在其上的血凝块的方法，包括通过所述血管通路装置施用一定量的纤溶性金属蛋白酶，其数量为每公斤人体重不超过1.7毫克纤溶性金属蛋白酶。
2.蛋白水解性地降解人用留置血管通路装置之中、周围或附着在其上的血凝块的方法，包括通过所述血管通路装置施用一定量的与α2-巨球蛋白络合的纤溶性金属蛋白酶，其量足以促进血凝块溶解、同时不超过明显高于所述人体中α2-巨球蛋白可饱和水平的水平。
3.权利要求1或2的方法，包括0.1到80mg/ml纤溶性金属蛋白酶。
4.权利要求1或2的方法，包括0.1到50mg/ml纤溶性金属蛋白酶。
5.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置为导管。
6.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置为旁路。
7.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置为通路移植。
8.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置为针。
9.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置用于向人类动脉或静脉之中引入液体组合物。
10.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置用于从人类动脉或静脉中取血。
11.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置与血液透析操作结合使用。
12.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置与输血操作结合使用。
13.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置与化疗结合使用。
14.权利要求1或2的方法，其用于治疗周围动脉阻塞。
15.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置与取血结合使用。
16.权利要求1或2的方法，其中所述血凝块位于留置血管通路装置的内表面。
17.权利要求1或2的方法，其中所述血凝块位于留置血管通路装置的外表面。
18.权利要求1或2的方法，其中所述血凝块附着在留置血管通路装置上。
19.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置位于动脉之中。
20.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置位于静脉之中。
21.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置包括“侧孔”导管装置。
22.权利要求1或2的方法，其中所述血管通路装置包括“压力感应出口”(PRO)导管递送装置。
23.权利要求1或2的方法，其中所述纤溶性金属蛋白酶溶液通过团块施用。
24.权利要求1或2的方法，其中所述纤溶性金属蛋白酶包括新型作用溶栓剂(NAT)。
25.权利要求1或2的方法，其中所述纤溶性金属蛋白酶包括纤溶酶。
26.恢复具有以纤维蛋白为基础的阻塞的人用留置血管通路装置开放性的方法，包括通过所述血管通路装置施用一定量的与α2-巨球蛋白络合的纤溶性金属蛋白酶，其量足以促进血凝块溶解、同时水平不超过明显高于所述人体中α2-巨球蛋白可饱和水平，其中所述量为每公斤人体重不超过1.7毫克纤溶性金属蛋白酶。
27.恢复具有以纤维蛋白为基础的阻塞的人用留置血管通路装置功能的方法，包括通过所述血管通路装置施用一定量的与α2-巨球蛋白络合的纤溶性金属蛋白酶，其量足以促进血凝块溶解、同时水平不超过明显高于所述人体中α2-巨球蛋白可饱和水平，其中所述量为每公斤人体重不超过1.7毫克纤溶性金属蛋白酶。
28.每公斤人类受试者体重不超过1.7毫克数量的、药学上可接受的溶液中的纤溶性金属蛋白酶在生产用于治疗性处理留置血管通路装置之中、周围或附着在其上的血凝块的药剂中的用途。
29.含量足以促进留置血管通路装置之中、周围或附着在其上的血凝块溶解、同时水平不超过明显高于α2-巨球蛋白可饱和水平的、药学上可接受的溶液中的与α2-巨球蛋白络合的纤溶性金属蛋白酶在生产用于蛋白水解性地降解所述留置血管通路装置之中、周围或附着在其上的血凝块的药剂中的用途。
30.权利要求28或29的用途，其中所述纤溶性金属蛋白酶浓度为0.1到80mg/ml。
31.权利要求28或29的用途，其中所述纤溶性金属蛋白酶浓度为0.1到50mg/ml。
32.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置为导管。
33.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置为旁路。
34.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置为通路移植。
35.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置为针。
36.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置用于向人类动脉或静脉之中引入液体组合物。
37.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置用于从人类动脉或静脉中取血。
38.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置与血液透析操作结合使用。
39.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置与输血操作结合使用。
40.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置与化疗结合使用。
41.权利要求28或29的用途，其用于治疗周围动脉阻塞。
42.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置与取血结合使用。
43.权利要求28或29的用途，其中所述血凝块位于留置血管通路装置的内表面。
44.权利要求28或29的用途，其中所述血凝块位于留置血管通路装置的外表面。
45.权利要求28或29的用途，其中所述血凝块附着在留置血管通路装置上。
46.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置位于动脉之中。
47.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置位于静脉之中。
48.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置包括“侧孔”导管装置。
49.权利要求28或29的用途，其中所述血管通路装置包括“压力感应出口”(PRO)导管递送装置。
50.权利要求28或29的用途，其中制备所述药剂用于团块施用。
51.权利要求28或29的用途，其中所述纤溶性金属蛋白酶包括新型作用溶栓剂(NAT)。
52.权利要求28或29的用途，其中所述纤溶性金属蛋白酶包括纤溶酶。
53.每公斤人类受试者体重不超过1.7毫克纤溶性金属蛋白酶数量的、其量足以促进血凝块溶解、同时水平不超过明显高于所述人类受试者中α2-巨球蛋白可饱和水平的、药学上可接受的溶液中的与α2-巨球蛋白络合的纤溶性金属蛋白酶在生产用于恢复具有以纤维蛋白为基础的阻塞的留置血管通路装置开放性的药剂中的用途。
54.每公斤人类受试者体重不超过1.7毫克纤溶性金属蛋白酶数量的、其量足以促进血凝块溶解、同时水平不超过明显高于所述人类受试者中α2-巨球蛋白可饱和水平的、药学上可接受的溶液中的与α2-巨球蛋白络合的纤溶性金属蛋白酶在生产用于恢复具有以纤维蛋白为基础的阻塞的留置血管通路装置功能的药剂中的用途。
全文摘要
本发明提供了以安全且有效溶解阻塞的含纤维蛋白的血凝块的含量向人类受试者局部血管内施用纤溶性金属蛋白酶、同时也避免循环血中α
文档编号A61K38/43GK1674928SQ03819829
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月23日 优先权日2002年6月21日
发明者C·F·图布斯 申请人:安姆根有限公司