专利名称：一种强毒鸡球虫致弱剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及鸡球虫病疫苗的制备，确切地说，是一种强毒鸡球虫致弱剂及制备方法背景技术鸡的球虫病是一种危害性很大的肠道寄生原虫病，它主要由于艾美尔球虫寄生于肠上皮细胞引起的疾病。该病以出血性肠炎、血痢、雏鸡高发病率和死亡率为特征，有时雏鸡感染率高达80％以上，死亡率可达20％-50％，成为危害养鸡业的重要疾病之一。目前，对该病的防治主要有药物防治法和疫苗控制法，其中药物防治球虫病主要是通过在饲料或水中拌混预防或治疗剂量的抗球虫药来达到防治球虫病的作用。常用的球虫药有青霉素、球痢灵、氯苯胍、三字球虫粉等，但长期使用药物防治会造成抗药株产生，防治价格昂贵。随着科学技术的进步，使用疫苗来预防鸡球虫病的发生就成为既科学又经济的防治方法，具有良好的发展前景。目前国内外已研制开发的鸡球虫疫苗有强毒株虫苗、弱毒株虫苗和球虫基因工程苗等。其中，强毒株虫苗以美国Dorn andMitchel动物保健公司的混合卵囊球虫疫苗Coccivac为代表，它在5-10日龄通过饮水或饲料给鸡接种少量含有8种球虫的混合卵囊，通过鸡群繁殖后把子代卵囊播撒到垫料上，使鸡群反复感染而不断增强免疫力。但这种强毒虫苗问世40多年来并没有被广泛使用，主要原因是其存在两大缺陷一是存在于虫苗中的各种球虫株都是完全致病性的；二是由于混入饮水或饲料中的卵囊分布不均匀，造成鸡群摄入卵囊量的不一致，结果有的鸡感染太轻，不足以产生免疫力，有的鸡摄入卵囊过多而引起发病。
由于活的强毒株虫苗未经致弱，如果免疫量不准确或免疫接种经鸡传代后卵囊的数量越来越多，有可能导致球虫病的爆发，于是致弱疫苗应运而生。目前对强毒株球虫的致弱方法主要有三种理化致弱法、鸡胚传代致弱法和早熟卵囊选育法。理化致弱是通过对卵囊进行冷却、加热、超声、离子辐射等物理性处理，而使之减毒。但也有人怀疑这些处理可能是杀灭了部分卵囊使实际接种的卵囊数量减少，并不是降低了球虫的致病性；采用辐射致弱球虫，随辐射剂量增加，对宿主的致病作用随之降低。
鸡胚传代致弱法是将球虫子孢子接种到鸡胚绒毛尿囊膜上培养，连续传代多次后获得对鸡致病性低，但仍保持良好免疫原性的“鸡胚适用株”，其致病力的减弱是由于第2代裂殖体从原来的黏膜固有层转而全部寄生在肠腺上皮细胞的缘故，不引起出血，对组织损伤小，以此致弱虫株免疫的鸡对强毒株的攻击有良好的保护作用。但鸡胚传代致弱方法有四大缺点①致弱性能相对不稳定，当转为鸡传代时毒力返强快；②通过鸡胚生产大量商品化致弱虫株的卵囊比较困难；③随鸡胚传代次数增加，虫体的免疫原性就会减少或丧失，实际上难以获得既保持良好的免疫力，又使毒力较弱的最佳组合；④最主要的局限性在于流行最广的巨型、堆型和早熟艾美耳球虫虽然可以在鸡胚内发育，但卵囊生长不良，因此通过鸡胚传代生产“全价”致弱虫苗就受到了限制。
早熟卵囊选育法是根据柔嫩艾美耳球虫致弱虫株，其致病力的减弱是由于第2代裂殖体没有完全分化或者在成熟时变得非常小的机理，利用这些致弱虫株制成球虫疫苗能够诱导鸡体产生免疫力，同时对鸡保持无害。这种虫苗能防止发病，而不是抵抗感染，尽管用苗后鸡群仍有卵囊排出，但鸡群的球虫病确实得到预防和控制。如由北京农学院段嘉树教授研制并投入生产的口服球虫疫苗，就是采用此方法制成的。
此外，目前人们在努力开发球虫病基因疫苗，尝试用纯化的抗原来免疫鸡以求得保护。如Garker(1982)应用杂交瘤技术产生抗球虫的单克隆抗体来鉴定球虫抗原取得成功，已研制出防治家禽球虫病的亚单位苗；Danforth(1986)首次研制成功球虫病重组苗，即从大肠杆菌中提取了柔嫩艾美耳球虫的抗原(命名为5401)，用5401免疫鸡后用同种卵囊攻击，在体增重、饲料转化率等方面明显地优于对照组，与堆型艾美耳球虫无交叉反应。利用基因工程技术对球虫感染和免疫的基本性质的理解已经取得了进步，但离制作基因工程苗的目标还很遥远，转入实用阶段尚待时日。
发明内容
为克服现有强毒株鸡球虫致弱方法的技术缺陷，本发明公开一种使用安全、操作简便、效果好的鸡球虫致弱剂，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是1、本发明是用下列配比的物质制备而成的重铬酸钾 360-450g，氯化钠 1.5-3.0g，碳酸氢钠 1.0-2.0g，葡萄糖 5.0-10.0g，氯化钾 0.5-1.0g，叠氮钠 0.2-0.4g，蒸馏水 1700-2000mL。
2、本发明是由甲、乙、丙三种液体混合制备而成，其中甲液为重铬酸钾 360-450g，蒸馏水 850-950mL；乙液为氯化钠 1.5-3.0g，碳酸氢钠 1.0-2.0g，葡萄糖 5.0-10.0g，氯化钾 0.5-1.0g，蒸馏水 850-950mL；
丙液为10g/L叠氮钠溶液20-40mL，3、本发明的制备方法是配制甲液称取重铬酸钾360-450g置于1000mL烧杯中，加入蒸馏水400mL，放在磁力搅拌器上边加热边搅拌，直至重铬酸钾完全溶解，倒入1000mL容量瓶中，再加入蒸馏水至1000mL，搅匀。
配制乙液分别称取氯化钠1.5-3.0g、碳酸氢钠1.0-2.0g、葡萄糖5.0-10.0g、氯化钾0.5-1.0g，用蒸馏水溶解至1000mL，搅匀。
配制丙液称取叠氮钠10g，用蒸馏水溶解至1000mL，搅匀。
配制本发明液体制剂将甲液900-1000mL、乙液900-1000mL、丙液20-40mL置入容器中，充分搅匀，装瓶备用。
本发明的使用方法将采集的鸡球虫混合卵囊经分离、增殖、再混合各种艾美耳球虫卵囊后，置于本发明中致弱30-40天，计数卵囊后即可用于雏鸡(口服)免疫。
本发明所取得的有益效果是1、使用本发明致弱的各种球虫均无致病性，接种雏鸡安全可靠，且具有良好的免疫原性。
2、采用本发明致弱剂的致弱方法是直接的，在规定的时间内，可同时致弱多种鸡球虫，如柔嫩、堆型、巨型、毒害和早熟艾美耳球虫等，并且保持良好的免疫原性。
3、本发明致弱剂的所需的化学药品原料种类少，易购得，价格低，生产设施简单，生产成本低廉，一般养殖户和养鸡场均可制备；使得鸡球虫疫苗生产投资少，周期快，方法简易实用，便于农村推广应用。
4、与药物防治鸡球虫病相比，使用本发明制作的疫苗可降低防治成本约0.30元/羽，防治后鸡的死亡率降低、产蛋率提高、生长速度加快。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步地说明。
实施例1取下列原料制备强毒鸡球虫致弱剂重铬酸钾 360g，氯化钠 1.5g，碳酸氢钠 1.0g，葡萄糖 5.0g，氯化钾 0.5g，叠氮钠 0.2g，蒸馏水 1700mL。
实施例2
取下列原料制备强毒鸡球虫致弱剂重铬酸钾 450g，氯化钠 3.0g，碳酸氢钠 2.0g，葡萄糖 10.0g，氯化钾 1.0g，叠氮钠 0.4g，蒸馏水 2000mL。
实施例3取下列原料制备强毒鸡球虫致弱剂重铬酸钾 400g，氯化钠 2.3g，碳酸氢钠 1.5g，葡萄糖 7.5g，氯化钾 0.75g，叠氮钠 0.3g，蒸馏水 1900mL。
实施例4本发明的制备1、配制甲液称取重铬酸钾(K2Cr3O7，分子量294.18，AR)400g，置于1000mL烧杯中，加蒸馏水约400mL，于磁力搅拌器上边加热边搅拌，加热温度40～60℃，搅拌时间20～30min，搅拌转速200r/min，直至重铬酸钾完全溶解为止，倒入容量瓶中，加入蒸馏水至1000mL，搅匀；2、配制乙液称取氯化钠(NaCl，分子量58.45，AR)2.0g、碳酸氢钠(NaHCO3，分子量84.01，AR)1.5g、葡萄糖(C6H12O6，分子量180.16，AR)7.5g、氯化钾(KCl，分子量74.56，AR)、0.75g，分别用少量蒸馏水溶解后，置入容量瓶中，加蒸馏水至1000mL，搅匀。
3、配制丙液精确称取叠氮钠(NaN3，分子量65.02，AR)10g，加蒸馏水至1000mL溶解。
4、配制本发明制剂分别量取甲液1000mL、乙液1000mL、丙液30mL，置入容器瓶中，充分混匀即可装瓶备用。
使用本发明进行强毒球虫致弱试验结果鸡球虫卵囊的致弱过程采集球虫病鸡粪便→收集混合卵囊→单卵囊分离法分离卵囊→增殖各种艾美耳球虫卵囊→按比例混合各种艾美耳球虫卵囊→卵囊置于本发明制剂中致弱40天→计数卵囊→口服接种雏鸡。下面是两组接种免疫试验试验一将90只肉杂鸡饲养至7日龄时，随机分为I、II、III、IV、V、VI 6个组，每组15只，I-IV组为每只鸡分别口服4000个、8000个、16000个、20000个卵囊的经本发明至弱的GC02球虫病疫苗，V组为不免疫感染组，VI组为不免疫不感染组，二免后隔一周每鸡只经口接种1.0×105个卵囊攻虫，攻虫后第8天扑杀全部鸡只，根据病变记分、粪便记分、OPG、ACI、相对增重率、料肉比等判断不同免疫剂量的GC02球虫病疫苗预防鸡球虫病的效果。结果表明，与V组相比，I-IV组成活率分别提高26.67％、33.34％、13.34％、13.34％，相对增重率分别提高16.77％、26.20％、16.22％、14.58％，I-IV组的ACI分别为146.87、164.97、120.99、119.35，而V组仅为69.43。
试验二将180只雏鸡随机均分为A、B、C、D、E、F、G1、G2、G39个组，研究同一剂量不同免疫日龄的免疫效果。A、B、C为三个不同免疫日龄的免疫组，D、E、F和G1、G2、G3分别为A、B、C相对应的阳性对照组和阴性对照组，免疫和攻虫方法同试验一。结果表明，A、B、C组的成活率和相对增重率分别比其相应对照组提高10％、15％、15％和14.00％、11.91％、6.88％，A-F组的ACI分别为184.80、176.61、160.60、139.80、138.00、126.82.。
综合试验一、二可知，使用本发明至弱的GC02球虫病疫苗预防鸡球虫病是安全有效的，每只鸡在以8000个孢子化卵囊在7日龄和14日龄各免疫一次效果最为理想。
权利要求
1.一种强毒鸡球虫致弱剂，其特征在于它是由下列配比的物质制备而成的重铬酸钾 360-450g，氯化钠 1.5-3.0g，碳酸氢钠 1.0-2.0g，葡萄糖 5.0-10.0g，氯化钾 0.5-1.0g，叠氮钠 0.2-0.4g，蒸馏水 1700-2000mL。
2.根据权利要求1所述强毒鸡球虫致弱剂，其特征在于它是由甲、乙、丙三种液体混合制备而成，其中甲液为重铬酸钾360-450g，蒸馏水 850-950mL；乙液为氯化钠 1.5-3.0g，碳酸氢钠1.0-2.0g，葡萄糖 5.0-10.0g，氯化钾 0.5-1.0g，蒸馏水 850-950mL；丙液为10g/L叠氮钠溶液 20-40mL，
3.根据权利要求1所述强毒鸡球虫致弱剂的制备方法其特征在于配制甲液称取重铬酸钾360-450g置于1000mL烧杯中，加入蒸馏水400mL，放在磁力搅拌器上边加热边搅拌，直至重铬酸钾完全溶解，倒入1000mL容量瓶中，再加入蒸馏水至1000mL，搅匀。配制乙液分别称取氯化钠1.5-3.0g、碳酸氢钠1.0-2.0g、葡萄糖5.0-10.0g、氯化钾0.5-1.0g，用蒸馏水溶解至1000mL，搅匀。配制丙液称取叠氮钠10g，用蒸馏水溶解至1000mL，搅匀。配制鸡球虫致弱剂将甲液900-1000mL、乙液900-1000mL、丙液20-40mL置入容器中，充分搅匀，装瓶备用。
全文摘要
本发明涉及一种强毒鸡球虫致弱剂及制备方法，它是由下列配比的物质组分制备而成的重铬酸钾、氯化钠、碳酸氢钠、葡萄糖、氯化钾、叠氮钠、蒸馏水。本发明致弱剂可用来致弱各种强毒株鸡球虫如柔嫩、堆型、巨型、毒害和早熟艾美耳球虫等，经本发明至弱的球虫疫苗接种雏鸡安全可靠，且具有良好的免疫原性。本发明生产设施简单，成本低廉，可使鸡球虫疫苗生产投资少，周期快，方法简易实用，便于农村推广应用，与药物防治鸡球虫病相比，使用本发明制作的疫苗可降低防治成本约0.30元/羽，防治后鸡的死亡率降低、产蛋率提高、生长速度加快。
文档编号A61P33/00GK1666779SQ20041006540
公开日2005年9月14日 申请日期2004年11月29日 优先权日2004年11月29日
发明者顾有方, 陈会良, 金光明, 窦鹏 申请人:顾有方