专利名称：携带人pf4基因的减毒沙门氏菌在化疗保护及促造血重建中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种携带人PF4基因的减毒沙门氏菌在化疗保护及促造血重建中的用途，尤其是通过喂服给小鼠携带人血小板第四因子(PF4)基因的减毒沙门氏菌，治疗因化疗引起的小鼠造血被抑制，起到对大剂量化疗小鼠的保护及促造血重建。
背景技术：
化疗通常指肿瘤的化学治疗，化疗与手术、放疗并列成为肿瘤三大治疗手段。现有化疗药物绝大多数对人体都有较大毒性，它们在杀伤或抑制癌细胞的同时，对正常组织、器官，尤其是对骨髓造血细胞的毒性作用，成为限制化疗药物用量、阻碍疗效发挥的主要障碍。
血小板第四因子(PF4)属于趋化因子CXC家族成员，PF4能够增加5-FU化疗小鼠骨髓造血干/祖细胞数量，减少造血细胞对化疗药物的敏感性。PF4显示对CD34+细胞是一种可逆的抑制效应，它保护比较不成熟的和5-Fu抵抗的细胞群，作用机制是它把细胞阻止在S期，这时细胞仍是生存的，只是细胞处于一个相对安静的状态。虽然PF4被证明能够增加放/化疗小鼠骨髓造血干/祖细胞数量，但对于化疗后骨髓受抑制的动物来说，外源性加入的因子在其体内会很快被代谢掉，发挥作用时间短。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，将PF4基因构建到减毒沙门氏菌中，通过口服途径喂食携带人PF4基因的减毒沙门氏菌，将PF4基因导入体内的细胞，分布于全身，达到对大剂量化疗小鼠造血重建的促进作用，给出用于临床的最佳治疗方式及最适给药时间。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种携带人PF4基因的减毒沙门氏菌在化疗保护及促造血重建中的用途。
通过口服携带人PF4基因的减毒沙门氏菌进行给药。
在化疗前和化疗后均给药。
给药时间为每三天一次。
本发明的有益效果是本发明建立使用携带PF4基因的减毒沙门氏菌，治疗因化疗引起的患者的骨髓抑制以及减小患者因化疗受到的损伤。并且减毒沙门氏菌扩增简单，容易得到大量菌体，服用方便、安全，治疗效果显著。
图1为小鼠在化疗前、后均喂服携带PF4基因的减毒沙门氏菌，化疗小鼠的存活状况。1.controlPBS对照组；2.blank vector-1化疗前、后均喂食SL3261/PIRES2组；3.PF4-1化疗前后均喂食SL3261/PF4组。
图2为小鼠在化疗前喂服携带PF4基因的减毒沙门氏菌，化疗小鼠的存活状况。1.controlPBS对照组；2.blank vector-2化疗前均喂食SL3261/PIRES2组；3.PF4-2化疗前均喂食SL3261/PF4组。
图3为小鼠在化疗后喂服携带PF4基因的减毒沙门氏菌，化疗小鼠的存活状况。1.controlPBS对照组；2.blank vector-3化疗后均喂食SL3261/PIRES2组；3.PF4-3化疗后喂食SL3261/PF4组。
图4为携带人PF4基因的减毒沙门氏菌对大剂量化疗小鼠外周血白细胞(WBC)的作用。1.正常鼠；2.PBS对照组化疗前后均喂食PBS组；3.blank vector化疗前后均喂食SL3261/PIRES2组；4.PF4化疗前后均喂食SL3261/PF4组。
图5为携带人PF4基因的减毒沙门氏菌对大剂量化疗小鼠外周血血小板(PLT)的作用。1.正常鼠；2.PBS对照组化疗前后均喂食PBS组；3.blankvector化疗前后均喂食SL3261/PIRES2组；4.PF4化疗前后均喂食SL3261/PF4组。
图6为喂服携带PF4基因的减毒沙门氏菌对化疗小鼠股骨中骨髓细胞数的影响。1.正常鼠；2.PBS对照组化疗前后均喂食PBS组；3.blank vector化疗前后均喂食SL3261/PIRES2组；4.PF4化疗前后均喂食SL3261/PF4组。
图7为喂服携带PF4基因的减毒沙门氏菌对化疗小鼠骨髓细胞中CD117+，Sca-1细胞数的作用。1.PBS对照组化疗前后均喂食PBS组；2.化疗前后均喂食sal/PIRES2空载体组；3.化疗前后均喂食sal/PIRES2/PF4。
具体实施例方式
下面，结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。
沙门氏菌侵入机体的途径可分为两种，一种为具有侵袭力的沙门氏菌可选择性地穿过小肠黏膜上皮细胞侵入肠壁的淋巴组织，并沿淋巴管至肠系膜淋巴结。在这些淋巴组织中，沙门氏菌被吞噬细胞吞噬，并在其中繁殖。另一方面，经胸导管进入血液，细菌很快被全身单核系统中的巨噬细胞吞噬。沙门氏菌对鼠无致病性，所以减毒沙门氏菌成为一种有价值的基因治疗载体。
本发明公开了一种携带人PF4基因的减毒沙门氏菌在化疗保护及促造血重建中的用途。通过口服携带人PF4基因的减毒沙门氏菌进行给药。可以在化疗前和化疗后均给药。给药时间为每三天一次。
实施例1携带PF4基因的减毒沙门氏菌的扩增培养SL3261用LB液体培养基培养，37℃振荡，收集细菌，制备感受态菌(CaCl2法)，通过电穿孔方法将PIRES2-EGFP/PF4、及空载体PIRES2分别转化到感受态菌SL3261中，将转化的菌液在LB固体培养基中培养。挑取单克隆菌落接种于含有50ug/ml卡那霉素的液体LB培养基中培养。
实施例2口服携带PF4基因的减毒沙门氏菌的动物实验转化有PF4基因片段的减毒沙门氏菌SL3261/PF4培养至用紫外/可见光分光光度计测定光密度(OD600)0.4时，收集菌体，PBS清洗后，PBS溶液悬浮调整细菌数为1×109个/ml，每三天一次分别给各组小鼠喂食细菌100ul，对照组喂食等量的PBS、SL3261/PIRES2。
实施例3口服携带PF4基因的减毒沙门氏菌化疗小鼠存活的观察在本发明的实施例中，我们设计了在化疗前或化疗后以及化疗前、后等多种时间将携带PF4基因的减毒沙门氏菌喂服给大剂量化疗后的小鼠，将PF4基因导入小鼠体内的细胞，从而达到对大剂量化疗小鼠造血重建的促进作用，获得一系列小鼠存活的结果。
如图1至图3所示，将携带转化克隆基因片段载体的减毒菌株培养至OD600＝0.4，PBS将细菌数调整到1×109/ml，取100ul通过食管喂服。健康雄性Balb/c小鼠随机分为五组化疗前喂服携带PF4基因的减毒沙门氏菌组，实验为每三天喂服细菌一次(1×108个/mouse)，在喂食第二次后第三天给小鼠注射5-氟脲嘧啶(5-FU)进行化疗，化疗后不再喂食菌体组；给小鼠注射5-氟脲嘧啶进行化疗，化疗后每三天喂食细菌一次(1×108个/mouse)，共喂食细菌两次组；每三天喂食细菌一次(1×108个/mouse)，在喂食第二次后的第三天给小鼠注射5-氟脲嘧啶进行化疗，化疗后继续喂食细菌两次组；空载体对照组；PBS对照组。经过PF4基因治疗的化疗小鼠的存活率与对照组相比明显增高。
实施例4化疗小鼠外周血血常规的测定。
在本发明的实施例中，对于高存活率的治疗方式及给药时间即每三天喂食细菌一次(1×108个/mouse)，在喂食第二次后三天给小鼠注射5-氟脲嘧啶进行化疗，化疗后继续喂食携带PF4基因的减毒沙门氏菌的小鼠与对照组进行了不同时间外周血血常规的测定。方法取化疗前后均喂食组的各组小鼠分别在化疗后第5天、9天、12天取小鼠尾静脉外周血，检测外周血的血常规的变化。结果红细胞数和血色素含量各组小鼠化疗前后差异不显著；在小鼠化疗后第5天、9天、12天，白细胞数一直高于对照组，尤其到12天时喂食携带PF4基因的减毒沙门氏菌的小鼠代偿性反应最为明显，白细胞的变化结果见图4；在小鼠化疗后第5天、9天、12天，血小板数一直明显高于对照组，血小板的变化结果见图5。
实施例5化疗小鼠骨髓细胞数的比较。
如图6所示，化疗前后均喂食菌体组的各组小鼠，在化疗后第5天、9天、12天，分别取各组小鼠3只，断颈处死，取股骨，分别剪断两端，用含2％FCS的IMDM冲出骨髓细胞，显微镜下计数每只小鼠股骨骨髓有核细胞数。口服携带PF4基因的减毒沙门氏菌的化疗小鼠骨髓有核细胞数比对照组明显增加(P＜0.05)。
实施例6化疗小鼠骨髓细胞中Sca-1+、CD117+细胞含量的比较。
如图7所示，化疗前后均喂食菌体组的各组小鼠，在化疗后9天，分别取各组小鼠3只，断颈处死，取股骨，分别剪断两端，用含2％FCS的IMDM冲出骨髓细胞，分别取1×105的骨髓细胞，标记抗鼠Sca-1-PE、CD117-FITC抗体，4℃，避光标记30min，然后用流式裂解液去除红细胞，用PBS洗两次，1％多聚甲醛固定，通过用流式细胞仪测定。结果口服携带PF4基因的减毒沙门氏菌的化疗小鼠骨髓单个核细胞中Sca-1+、CD117+细胞数比对照组明显增高(P＜0.05)。
实施例7化疗小鼠骨髓细胞集落形成的分析。
如表1、2、3所示，化疗前后均喂食菌体组的小鼠，在化疗后第5天、9天、12天，分别取小鼠股骨，冲出骨髓细胞，将骨髓细胞用红细胞裂解液(EDTA 10-4mol/L，KHCO310-3mol/L，NH4Cl 0.17mol/L)处理，然后接种到甲基纤维素半固体培养基中(MethoCult GFM 3434 Stme CellTechnologies)，12天时计数各只小鼠每根股骨生成的CFU-GM、CFU-M、CFU-mix、BFU-E集落数。口服携带PF4基因的减毒沙门氏菌组的小鼠在化疗后第5天、9天、12天时，每根股骨生成的Mix集落数均明显高于对照组(P＜0.05)。
表1.化疗5天时各只小鼠每根股骨生成的各种集落数
表2.化疗8天时各只小鼠每根股骨生成的各种集落数
表3.化疗12天时各只小鼠每根股骨生成的各种集落数
通过小鼠体内实验结果证明，口服携带PF4基因的减毒沙门氏菌能够保护化疗小鼠并促进造血重建作用。
权利要求
1.一种携带人PF4基因的减毒沙门氏菌在化疗保护及促造血重建中的用途。
2.根据权利要求1所述的携带人PF4基因的减毒沙门氏菌在化疗保护及促造血重建中的用途，其特征在于通过口服携带人PF4基因的减毒沙门氏菌进行给药。
3.根据权利要求2所述的携带人PF4基因的减毒沙门氏菌在化疗保护及促造血重建中的用途，其特征在于在化疗前和化疗后均给药。
4.根据权利要求3所述的携带人PF4基因的减毒沙门氏菌在化疗保护及促造血重建中的用途，其特征在于给药时间为每三天一次。
全文摘要
本发明公开了一种携带人PF4基因的减毒沙门氏菌在化疗保护及促造血重建中的用途。通过口服携带人PF4基因的减毒沙门氏菌进行给药。可以在化疗前和化疗后均给药。给药时间为每三天一次。本发明建立使用携带PF4基因的减毒沙门氏菌，治疗因化疗引起的患者的骨髓抑制以及减小患者因化疗受到的损伤，并且减毒沙门氏菌扩增简单，容易得到大量菌体，服用方便、安全，治疗效果显著。
文档编号A61P7/00GK1775226SQ20041007271
公开日2006年5月24日 申请日期2004年11月15日 优先权日2004年11月15日
发明者韩忠朝, 闫凤英, 卢士红 申请人:中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心