专利名称：带有抗 DNA lgM－DNA 复合物的植入装置及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因递送体系，属于医疗材料领域。
背景技术：
临床基因治疗存在的共同问题是体内基因转染的效率低，转基因在体内的表达时间不够长，达不到临床治疗效果。目前基因治疗方面存在的主要问题是不能将核酸有效地靶向运送至体内细胞以得到基因的高效表达。心血管内基因治疗的特殊性还在于很难把基因专一性递送到血管组织中的病灶处而不进入血液循环系统，例如，采用球囊导管向血管内灌注转基因病毒的悬浮液，研究表明，灌注到血管中的病毒颗粒大部分随血液进入全身循环系统，最后被阻留在肝和肺中，很难在冠脉病灶局部血管中达到有效的基因浓度，此外病毒在体内器官中的广泛扩散，潜伏着致命的全身毒副作用，无论安全性还是有效性都不符合临床应用要求。虽然目前有许多载体系统在研究和试用，但是没有一个载体可以达到导向、高效地把基因导入体内的靶细胞。不少临床治疗方案失败原因是使用不合要求的载体。注射裸DNA的效果不佳，使用合成高分子或生物大分子包覆DNA的方法也存在各种缺陷，如与高分子接触的细胞发生过度增殖。将质粒DNA包埋在明胶海棉中植入骨中可成功地转入核酸，但大部分的DNA在短时间内(＜1小时)逃逸。其它的DNA运载体系包括包载核酸的的微球和纳米粒子，都存在递送效率的问题。因此缺乏高效、局部的基因导入系统是基因治疗面临的主要技术难关。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种带有抗DNA抗体(IgM)-DNA复合物的植入装置。
本发明的第二个目的是提供一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置的制备方法。
本发明的技术方案概述如下一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置，包括基架，所述基架为血管支架或人工心瓣膜，在所述基架上设置有带有巯基的胶原膜，所述胶原膜上设置有抗DNA IgM，所述抗DNA IgM连接有DNA。
种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置的制备方法，包括如下步骤(1)带有巯基的胶原膜或明胶膜包覆的基架的制备①配制含碳化二亚胺类交联剂的混合液向pH为6～8的重量百分比浓度为0.1～0.5％的胶原溶液或明胶溶液中加入碳化二亚胺类交联剂，混匀，所述加入碳化二亚胺类交联剂的重量为胶原重量或明胶重量的1～20％；②基架涂覆取步骤①制得的混合溶液铺在基架上，所述基架为血管支架或人工心瓣膜，30～50℃，放置10～100分钟，干燥，所述涂覆的次数为5～15次之一，得到胶原膜包覆的基架或明胶膜包覆的基架；③在基架表面偶联N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯将步骤②制得的基架投入到重量百分比为1～5％的N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯的溶液中，所述N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯的英文缩写为SPDP，所述SPDP溶液中的溶剂为溶剂A，所述溶剂A为1∶1体积比的二甲基亚砜和1倍磷酸缓冲液，15～40℃反应1～24小时，使SPDP化学偶联在基架表面上；④还原取出步骤③制成的基架，用1倍磷酸缓冲液漂洗后，投入到重量百分比为0.05～2％的二硫苏糖醇的1倍磷酸缓冲液的溶液中，15～40℃，反应10～240分钟，得到带有巯基的胶原膜或明胶膜包覆的基架，用1倍磷酸缓冲液冲洗干净；(2)抗DNA IgM与SPDP的偶联①将SPDP溶于所述溶剂A中，使每毫升溶液中含有0.5～20毫克SPDP；②取抗DNA IgM，加入到步骤①制成的溶液中，使抗DNA IgM与SPDP的重量比为1∶0.1～1，在15～37℃反应0.5～20小时，通过一根填有5～20ml D-葡聚糖的塑料脱盐柱，以1倍磷酸缓冲液为平衡液，除去未反应的SPDP，收集连接了SPDP的抗DNA IgM组分；(3)将抗DNA IgM固定在基架上取步骤(1)制得的带有巯基的胶原膜或明胶膜包覆的基架，放入重量百分比浓度为0.005～0.05％的连接了SPDP的抗DNA IgM组分中，15～37℃下反应1～24小时，用1倍磷酸缓冲液冲洗基架，去除未结合上的抗DNA IgM。
(4)将核酸通过抗体结合在基架上取步骤(3)得到的带有抗DNA IgM的基架，投入到重量百分比为0.5～5％的核酸的1倍磷酸缓冲液的溶液中，37℃反应30～240分钟，用磷酸缓冲液冲洗，去除未结合的核酸，即得到一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置，4℃保存在磷酸缓冲液中备用。
所述的碳化二亚胺类交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)乙基碳二亚胺或N′ N-二环己基碳二亚胺或N′N-二异丙基碳二亚胺。
本发明的一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置，可以特异性有效地将核酸完整地运送至哺乳动物靶部位并保留在该部位，而使基因专一性与靶细胞结合而不向全身扩散，对人体安全无毒性，同时又能诱导基因高效转染和可控表达。
图1为带有鼠单克隆抗小牛DNA抗体IgM-含表达绿色荧光蛋白的质粒基因的核酸复合物的血管支架在细胞中转染并表达的结果。
图2为不带有鼠单克隆抗小牛DNA抗体IgM的对照血管支架在细胞中转染并表达的结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地说明实施例1一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置的制备方法，包括如下步骤(1)带有巯基的胶原膜包覆的基架(血管支架)的制备
①配制含碳化二亚胺类交联剂的混合液向pH为6的重量百分比浓度为0.3％的胶原溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)乙基碳二亚胺，混匀，1-(3-二甲氨基丙基)乙基碳二亚胺的重量为胶原重量的10％；②基架涂覆取步骤①制得的混合溶液铺在血管支架上，30℃，放置50分种，干燥，如此涂覆5次，得到胶原膜包覆的血管支架；③在基架表面偶联N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯将步骤②制得的血管支架投入到重量百分比为1％的N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)的溶液中，所述SPDP溶液中的溶剂为溶剂A，所述溶剂A为1∶1体积比的二甲基亚砜和1倍磷酸缓冲液，40℃反应1小时，使SPDP化学偶联在血管支架表面上；④还原取出步骤③制成的血管支架，用1倍磷酸缓冲液漂洗后，投入到重量百分比为0.05％的二硫苏糖醇的1倍磷酸缓冲液的溶液中，15℃，反应240分钟，得到带有巯基的胶原膜包覆的血管支架，用1倍磷酸缓冲液冲洗干净；(2)抗DNA IgM与SPDP的偶联①将SPDP溶于所述溶剂A中即1∶1体积比的二甲基亚砜和1倍磷酸缓冲液，使每毫升溶液中含有0.5毫克SPDP；②取鼠单克隆抗小牛DNA抗体IgM，加入到步骤①制成的溶液中，使鼠单克隆抗小牛DNA抗体IgM与SPDP的重量比为1∶1，在15℃反应20小时，通过一根填有5ml D-葡聚糖的塑料脱盐柱，以1倍磷酸缓冲液为平衡液，除去未反应的SPDP，收集连接了SPDP的抗DNA IgM组分；(3)将抗DNA IgM固定在基架上取步骤(1)制得的带有巯基的胶原膜包覆的血管支架，放入重量百分比浓度为0.005％的连接了SPDP的抗DNA IgM组分中，稀释用的溶剂是1倍磷酸缓冲液，15℃下反应24小时，用1倍磷酸缓冲液冲洗血管支架去除未结合上的抗DNA IgM；(4)将表达绿色荧光蛋白的质粒基因的核酸复合物通过抗体结合在基架上取步骤(3)得到的带有抗DNA IgM的血管支架，投入到重量百分比为1％的含绿色荧光蛋白表达基因质粒的核酸的1倍磷酸缓冲液的溶液中，37℃反应240分钟，用磷酸缓冲液冲洗去除未结合的核酸，即得到一种带有抗DNA IgM-表达绿色荧光蛋白的质粒基因的核酸复合物的植入装置，4℃保存在磷酸缓冲液中备用。
实施例2一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置的制备方法，包括如下步骤(1)带有巯基的明胶膜包覆的基架(人工心瓣膜)的制备①配制含碳化二亚胺类交联剂的混合液向pH为7的重量百分比浓度为0.1％的明胶溶液中加入N′N-二环己基碳二亚胺，混匀，N′N-二环己基碳二亚胺的重量为明胶重量的1％；②基架涂覆取步骤①制得的混合溶液铺在聚氨酯人工心瓣膜上，40℃，放置10分钟，干燥，如此涂覆15次，得到明胶膜包覆的聚氨酯人工心瓣膜；③在基架表面偶联N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯将步骤②制得的人工心瓣膜投入到重量百分比为5％的N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)的溶液中，所述SPDP溶液中的溶剂为溶剂A，所述溶剂A为1∶1体积比的二甲基亚砜和1倍磷酸缓冲液，15℃反应24小时，使SPDP化学偶联在人工心瓣膜表面上；④还原取出步骤③制成的人工心瓣膜，用1倍磷酸缓冲液漂洗后，投入到重量百分比为1％的二硫苏糖醇的1倍磷酸缓冲液的溶液中，25℃，反应100分钟，得到带有巯基的明胶膜包覆的人工心瓣膜，用1倍磷酸缓冲液冲洗干净；(2)抗DNA IgM与SPDP的偶联①将SPDP溶于所述溶剂A中，使每毫升溶液中含有10毫克SPDP；②取鼠单克隆抗兔DNA抗体IgM，加入到步骤①制成的溶液中，使抗DNA IgM与SPDP的重量比为1∶0.5，在37℃反应0.5小时，通过一根填有10ml D-葡聚糖的塑料脱盐柱，以1倍磷酸缓冲液为平衡液，除去未反应的SPDP，收集连接了SPDP的抗DNA IgM组分；(3)将抗DNA IgM固定在基架上取步骤(1)制得的带有巯基的明胶膜包覆的人工心瓣膜，放入重量百分比浓度为0.05％的连接了SPDP的抗DNA IgM组分中，稀释用的溶剂是1倍磷酸缓冲液，37℃下反应1小时，用1倍磷酸缓冲液冲洗基架去除未结合上的抗DNA IgM；(4)将核酸通过抗体结合在基架上取步骤(3)得到的带有抗DNA IgM的基架，投入到重量百分比为0.5％的核酸的1倍磷酸缓冲液的溶液中，37℃反应30分钟，用磷酸缓冲液冲洗去除未结合的核酸，即得到一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置，4℃保存在磷酸缓冲液中备用。
实施例3一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置的制备方法，包括如下步骤(1)带有巯基的胶原膜包覆的基架(血管支架)的制备①配制含碳化二亚胺类交联剂的混合液向pH为8的重量百分比浓度为0.5％的胶原溶液中加入N′N-二异丙基碳二亚胺，混匀，N′N-二异丙基碳二亚胺的重量为胶原重量的20％；②基架涂覆取步骤①制得的混合溶液铺在血管支架上，50℃，放置100分钟，干燥，如此涂覆10次，得到胶原膜包覆的血管支架；③在基架表面偶联N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯将步骤②制得的血管支架投入到重量百分比为3％的N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)的溶液中，SPDP溶液中的溶剂为溶剂A，溶剂A为1∶1体积比的二甲基亚砜和1倍磷酸缓冲液，25℃反应10小时，使SPDP化学偶联在血管支架表面上；④还原取出步骤③制成的血管支架，用1倍磷酸缓冲液漂洗后，投入到重量百分比为2％的二硫苏糖醇的1倍磷酸缓冲液的溶液中，40℃，反应10分钟，得到带有巯基的胶原膜包覆的血管支架，用1倍磷酸缓冲液冲洗干净；(2)抗DNA IgM与SPDP的偶联①将SPDP溶于所述溶剂A中，使每毫升溶液中含有20毫克SPDP；②取鼠单克隆抗羊DNA抗体IgM，加入到步骤①制成的溶液中，使抗DNA IgM与SPDP的重量比为1∶0.1，在25℃反应10小时，通过一根填有20ml D-葡聚糖的塑料脱盐柱，以1倍磷酸缓冲液为平衡液，除去未反应的SPDP，收集连接了SPDP的抗DNA IgM组分；(3)将抗DNA IgM固定在基架上取步骤(1)制得的带有巯基的胶原膜包覆的血管支架，放入重量百分比浓度为0.01％的连接了SPDP的抗DNA IgM组分中，稀释用的溶剂是1倍磷酸缓冲液，27℃下反应12小时，用1倍磷酸缓冲液冲洗基架去除未结合上的抗DNA IgM；(4)将核酸通过抗体结合在基架上取步骤(3)得到的带有抗DNA IgM的基架，投入到重量百分比为5％的核酸的1倍磷酸缓冲液的溶液中，37℃反应120分钟，用磷酸缓冲液冲洗去除未结合的核酸，即得到一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置，4℃保存在磷酸缓冲液中备用。
实施例4一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置的制备方法，包括如下步骤(1)带有巯基的明胶膜包覆的基架(人工心瓣膜)的制备①配制含碳化二亚胺类交联剂的混合液向pH为7的重量百分比浓度为0.1％的明胶溶液中加入N′N-二环己基碳二亚胺，混匀，N′N-二环己基碳二亚胺的重量为明胶重量的1％；②基架涂覆取步骤①制得的混合溶液铺在聚氨酯人工心瓣膜上，40℃，放置10分钟，干燥，如此涂覆15次，得到明胶膜包覆的聚氨酯人工心瓣膜；③在基架表面偶联N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯；将步骤②制得的人工心瓣膜投入到重量百分比为5％的N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)的溶液中，所述SPDP溶液中的溶剂为溶剂A，所述溶剂A为1∶1体积比的二甲基亚砜和1倍磷酸缓冲液，15℃反应24小时，使SPDP化学偶联在人工心瓣膜表面上；④还原取出步骤③制成的人工心瓣膜，用1倍磷酸缓冲液漂洗后，投入到重量百分比为1％的二硫苏糖醇的1倍磷酸缓冲液的溶液中，25℃，反应100分钟，得到带有巯基的明胶膜包覆的人工心瓣膜，用1倍磷酸缓冲液冲洗干净；(2)抗DNA IgM与SPDP的偶联①将SPDP溶于所述溶剂A中，使每毫升溶液中含有10毫克SPDP；②取人化的抗DNA抗体IgM，加入到步骤①制成的溶液中，使抗DNA IgM与SPDP的重量比为1∶0.5，在37℃反应0.5小时，通过一根填有5ml D-葡聚糖的塑料脱盐柱，以1倍磷酸缓冲液为平衡液，除去未反应的SPDP，收集连接了SPDP的抗DNA IgM组分；(3)将抗DNA IgM固定在基架上取步骤(1)制得的带有巯基的明胶膜包覆的人工心瓣膜，放入重量百分比浓度为0.05％的连接了SPDP的抗DNA IgM组分中，稀释用的溶剂是1倍磷酸缓冲液，37℃下反应1小时，用1倍磷酸缓冲液冲洗基架去除未结合上的抗DNA IgM；(4)将核酸通过抗体结合在基架上取步骤(3)得到的带有抗DNA IgM的基架，投入到重量百分比为0.5％的核酸的1倍磷酸缓冲液的溶液中，37℃反应30分钟，用磷酸缓冲液冲洗去除未结合的核酸，即得到一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置，4℃保存在磷酸缓冲液中备用。
实施例5由实施例1制备的带有鼠单克隆抗小牛DNA抗体IgM的血管支架的细胞转染试验为了使血管支架三维结构均被覆细胞，首先将本发明实施例1制备的血管支架在1×106A10细胞(大鼠血管平滑肌细胞)悬液中37℃孵育1小时，然后置于35mm细胞培养皿，加入1×105A10细胞悬液，于72小时后在倒置荧光显微镜下观察结果。见图1，图2。
图1为含带有鼠单克隆抗小牛DNA抗体IgM的血管支架细胞转染结果。在图中可见，在血管支架上附着大量表达绿色荧光蛋白的细胞，而血管支架外的细胞未见绿色荧光蛋白表达。
图2为在制备过程中有(1)(2)(4)的步骤，没有步骤(3)的血管支架，细胞转染实验的步骤也同样，结果，仅有极少量细胞表达绿色荧光蛋白。
权利要求
1.一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置，包括基架，所述基架为血管支架或人工心瓣膜，其特征是在所述基架上设置有带有巯基的胶原膜，所述胶原膜上设置有抗DNAIgM，所述抗DNA IgM连接有DNA。
2.一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置的制备方法，其特征是包括如下步骤(1)带有巯基的胶原膜或明胶膜包覆的基架的制备①配制含碳化二亚胺类交联剂的混合液向pH为6～8的重量百分比浓度为0.1～0.5％的胶原溶液或明胶溶液中加入碳化二亚胺类交联剂，混匀，所述加入碳化二亚胺类交联剂的重量为胶原重量或明胶重量的1～20％；②基架涂覆取步骤①制得的混合溶液铺在基架上，所述基架为血管支架或人工心瓣膜，30～50℃，放置10～100分钟，干燥，所述涂覆的次数为5～15次之一，得到胶原膜包覆的基架或明胶膜包覆的基架；③在基架表面偶联N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯将步骤②制得的基架投入到重量百分比为1～5％的N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯的溶液中，所述N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯的英文缩写为SPDP，所述SPDP溶液中的溶剂为溶剂A，所述溶剂A为1∶1体积比的二甲基亚砜和1倍磷酸缓冲液，15～40℃反应1～24小时，使SPDP化学偶联在基架表面上；④还原取出步骤③制成的基架，用1倍磷酸缓冲液漂洗后，投入到重量百分比为0.05～2％的二硫苏糖醇的1倍磷酸缓冲液的溶液中，15～40℃，反应10～240分钟，得到带有巯基的胶原膜或明胶膜包覆的基架，用1倍磷酸缓冲液冲洗干净；(2)抗DNA IgM与SPDP的偶联①将SPDP溶于所述溶剂A中，使每毫升溶液中含有0.5～20毫克SPDP；②取抗DNA IgM，加入到步骤①制成的溶液中，使抗DNA IgM与SPDP的重量比为1∶0.1～1，在15～37℃反应0.5～20小时，通过一根填有5～20ml D-葡聚糖的塑料脱盐柱，以1倍磷酸缓冲液为平衡液，除去未反应的SPDP，收集连接了SPDP的抗DNA IgM组分；(3)将抗DNA IgM固定在基架上取步骤(1)制得的带有巯基的胶原膜或明胶膜包覆的基架，放入重量百分比浓度为0.005～0.05％的连接了SPDP的抗DNA IgM组分中，15～37℃下反应1～24小时，用1倍磷酸缓冲液冲洗基架，去除未结合上的抗DNA IgM。(4)将核酸通过抗体结合在基架上取步骤(3)得到的带有抗DNA IgM的基架，投入到重量百分比为0.5～5％的核酸的1倍磷酸缓冲液的溶液中，37℃反应30～240分钟，用磷酸缓冲液冲洗，去除未结合的核酸，即得到一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置，4℃保存在磷酸缓冲液中备用。
3.根据权利要求2所述的一种带有抗DNA IgM-DNA复合物的植入装置的制备方法，其特征在于所述的碳化二亚胺类交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)乙基碳二亚胺或N′ N-二环己基碳二亚胺或N′N-二异丙基碳二亚胺。
全文摘要
本发明公开了一种带有抗DNA IgM－DNA复合物的植入装置及制备方法，带有抗DNAIgM－DNA复合物的植入装置包括血管支架或人工心瓣膜，在血管支架或人工瓣膜上设置有带有巯基的胶原膜，胶原膜上设置有抗DNA IgM，抗DNA IgM连接有DNA，制备方法是(1)带有巯基的胶原膜包覆的基架的制备；(2)抗DNA IgM与SPDP的偶联；(3)将抗DNA IgM固定在基架上；(4)将核通过抗体结合在基架上，本发明的植入装置，可以特异性有效地将核酸完整地运送至哺乳动物靶部位并保留在该部位，而使基因专一性与靶细胞结合而不向全身扩散，对人体安全无毒性，同时又能诱导基因高效转染和可控表达。
文档编号A61M29/00GK1634597SQ200410072318
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月12日 优先权日2004年10月12日
发明者宋存先, 冷希岗, 孙洪范, 金旭, 王满燕 申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所