用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物及其施用方法

专利名称：用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物及其施用方法
技术领域：
本发明涉及水产动物养殖领域，尤其涉及一种可有效降低甲壳类动物，特别是虾蟹类动物的病毒感染发生率，且可作为预防及/或治疗病毒感染的组合物与方法。
背景技术：
随着人工养殖技术的发展，以及市场需求与高获利，使得水产养殖业已成长为一种重要的生产行业。根据联合国粮农组织(FoodAgriculture Organism，FAO)研究指出，由于全世界海洋水产捕获量减少以及人口快速增加，因此未来陆上水产养殖需求将大量提升，以弥补海洋水产捕获量的不足。2001年全世界虾产量为127万吨，其中草虾就占了61万吨。
然而，由于水产养殖场的环境污染问题，以及一些无法或难以控制的微生物感染，特别是病毒感染问题，在病毒感染的蔓延及无法控制的情况下，导致全世界养殖业者均面临束手无策、产量大减的困境。因此如何有效克服病毒感染问题，是刻不容缓的课题。
一般来说，水产养殖业者基于经济效率上的考虑，皆期望养殖场可于高密度下进行养殖，藉以于相同养殖单位面积下获取较高的经济利益。但由于由病原体所造成的感染十分严重，加上环境污染的问题，致使养殖的水产动物有很高的死亡率。例如，养殖的甲壳类动物(例如，虾与蟹)极易受到病毒的感染，且甲壳类动物大都会受到相同病毒的威胁，一但发生病毒感染即会于甲壳类动物间互相传染(例如，感染蟹的病毒传染给虾)，并会造成极高的死亡率。
以最受欢迎的海鲜食品之一-虾子，举例来说，养殖业者会于怀孕的雌虾产卵后，将虾卵收集起来，之后以氯消毒(chlorinated)并以水清洗。约12-18小时后，位于孵化池中的受精卵会孵化出虾子的无节幼虫(nauplii)，接着进入五个时期的生长阶段，分别为水蚤状幼虫(zoea)期、糠虾期幼虫(mysis)期、后期幼虫(postlarvae)期、幼虾(juvenile)期及成虾期。虾子的养殖期间一但感染疾病，通常会造成全部或大部分的虾子生病或死亡，致使虾子的生产被迫终止，造成水产养殖业者莫大的损失。
已知有约20种病毒与虾子疾病有关，例如传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal hematopoietic necrosis virus，IHHNV)、对虾杆状病毒(baculovirus penaei，BP)、中肠腺坏死杆状病毒(baculoviral midgut GI and necrosis virus，BMN)、草虾杆状病毒(monodon baculovirus，MBV)、肝胰腺类微小病毒(hepatopancreaticparvo-like virus，HPV)、肠呼吸道病毒(reo-like virus)、桃拉病毒(Taura syndrome virus)、黄头病毒(yellow head virus，YHV)，以及白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)等。然而，这些疾病却难以藉由已知的水产养殖药物来处理，例如硫酸铜、高锰酸钾(potassium permanganate)、福尔马林(formalin)、孔雀石绿(malachitegreen)、羟四环霉素(oxytetracycline)、碘仿(iodoform I-500)、呋喃药物(furyl drug)或磺胺剂(sulfa drug)等。而且上述药物尚有容易引起药物残留或是引起抗药菌产生的问题。此外，从已感染病毒的病虾检体中常会被检验出带有两种或两种以上之病毒，即所谓的混合感染(mixed infection)，此种状况使得虾子的病毒感染防治问题变得更加的复杂与困难(Diseases of Aquatic Organisms，48，p233-236，2002；FishPathology，35(1)，1-10，2000；Fish Pathology 24(2)，p89-100，1989)。
为解决存在于甲壳类动物间严重的病毒感染问题，先前已有人提出多种的解决方法，来提高甲壳类动物对病毒的抵抗能力，藉以增加甲壳类动物的养殖存活率。例如，Manohar等人于美国第US 6,440,466号专利中揭示一种含有多种植物萃取物，用以处理水产动物的病毒或细菌疾病的组合物。另外，Laramore于美国第US 6,705,556号专利中则揭示一种用以诱发水产动物对病毒感染耐受性的组合物及方法，其是将包含有失去活性的(inactivated)白斑综合症病毒的病毒颗粒的组合物投入包含有幼虾的水溶液中，藉以使幼虾暴露于该组合物下，以达到增加幼虾对病毒感染耐受性的目的。但此种诱发幼虾对病毒感染耐受性所得的效果并不佳，因幼虾免疫系统不是很健全时，此种处理方式并无法使幼虾获得足够保护，且诱发幼虾产生足够的免疫反应需要时间，并无法立即获得想要的治疗效果。为获得较为直接的治疗效果，有人提出直接使用可与病毒表面蛋白反应的多株抗体，藉以提高水产动物对抗病毒的能力，例如Van Hulten等人曾揭示使用多株抗体对抗白斑综合症病毒，藉以使虾子不会为白斑综合症病毒所感染。Van Hulten等人所揭示的方法是以肌肉注射的方式将多株抗体注入虾子体内(Van Hulten et al.White spotsyndrome virus envelop protein VP28 is involved in the systemicinfection of shrimp.2001；Virplogy 285，228-233)。然而，对虾子进行肌肉注射是一件极为费时费力的工作，因此这种方法并不适合用于养殖培养。此外，该篇文献中并未提及如何处理或预防具有高流行率的幼虾病毒感染。另外，在Lee等人依专利合作条约(Patent CooperationTreaty，PCT)申请的WO 03/070258专利申请中，揭示一种以免疫蛋黄体(IgY)来大量生产对抗白斑综合症病毒的抗体，通过将虾子白斑综合症病毒的抗原(失活性的病毒、减毒的病毒或病毒蛋白)施用于鸡或鸭等动物，使其产生免疫反应，之后于该鸡或鸭所排出的蛋中进一步分离出所需的抗体。虽然此种方法可生产出所要的抗体，但此种方式所获得的蛋中所含有的抗体量并不稳定，且自蛋中分离出抗体十分费时与费力。此外，在Hulten等人依专利合作条约申请WO 01/09340的专利申请中，则揭示了白斑综合症病毒的特异性病毒蛋白(VP19，VP24，VP26与VP28)，此病毒蛋白可用以生成能辨识该病毒蛋白并与其反应的抗体，以及含有该病毒蛋白的疫苗。另外，该申请还揭示了将该病毒蛋白注入兔子体内以产生多株抗体，并将此多株抗体施用于虾子以提高其对抗病毒的能力。本技术领域的技艺者均了解多株抗体对抗病毒的效果并不如单株抗体，且多株抗体除会与目标病毒反应外，亦同时会引不必要的免疫反应。
因此，本发明致力于提供一种用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物及其施用方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用于预防及/或治疗病毒感染的组合物，以控制甲壳类动物的病毒感染率。该组合物包含至少一种可与病毒专一性相结合的单株抗体。本发明所述组合物可用于制备医药组合物、营养剂组合物、饲料添加剂或饲料组合物。
本发明的另一目的在于提供一种由融合瘤细胞株，通过生物反应器或注入老鼠腹部的方式，有效地大量生产该单株抗体的方法。
其中，上述甲壳类动物尤指虾或蟹。
另一方面，本发明还提供了一种用以治疗及/或预防虾子病毒感染的方法，其通过将包含至少一种可与病毒专一性相结合的单株抗体的组合物，根据虾子的不同生长时期，分别与一介质混合后施用于该虾子，其中该介质为养殖用水或饲料。例如(a)将种母虾浸泡于一含有该组合物的溶液中；(b)将受精卵浸泡于一含有该组合物的溶液中；(c)将无节幼虫浸泡于一含有该组合物的溶液中；(d)将水蚤状幼虫浸泡于一含有该组合物的溶液中，及喂食含有该组合物的饲料组合物于该水蚤状幼虫；(e)将糠虾期幼虫浸泡于一含有该组合物的溶液中，及喂食含有该组合物的饲料组合物于该糠虾期幼虫；(f)将后期幼虫浸泡于一含有该组合物的溶液中，及喂食含有该组合物的饲料组合物于该后期幼虫；(g)给幼虾施用一包含该组合物的饲料组合物；以及(h)给成虾施用一包含该组合物的饲料组合物。
本发明所述的单株抗体较佳为可对抗感染甲壳类动物病毒的单株抗体，该病毒选自传染性皮下及造血组织坏死病毒、对虾杆状病毒、中肠腺坏死杆状病毒、草虾杆状病毒、肝胰腺类微小病毒、肠呼吸道病毒、桃拉病毒、黄头病毒，及白斑综合症病毒所组成的族群。本发明的组合物较佳为包含至少一种可用以对抗上述病毒的单株抗体，更佳为包含至少两种以上单株抗体的复合式组合物，以增加该组合物治疗及/或预防虾子病毒感染的效果。当组合物中包含两种或两种以上单株抗体时，此两种或两种以上单株抗体可为用以对抗同一种病毒或不同种病毒的抗体。其中较佳为不同种病毒的抗体，以有效对抗虾子的多种病毒混合感染状况，从而增加虾子的存活率。
本发明的再一目的在于提供一种用以制造可供作为预防及/或治疗药剂，以控制甲壳类动物病毒感染的组合物的步骤，该组合物包含至少一种可与病毒专一性相结合的单株抗体，其中该单株抗体可由生物反应器(bioreactor)大量培养一种可产生该单株抗体的融合瘤细胞株(hybridoma cell)，之后收集培养上清液来获得。用大型培养槽大规模生产该抗体时，该生物反应器的体积较佳为1公升以上。另一种大量生产单株抗体的方式，是将可产生该单株抗体的融合瘤细胞株注入老鼠腹部，以诱发生成肿瘤，然后再以针头收集含有高浓度抗体的老鼠腹水，通常每只老鼠可取得约15毫升左右的腹水。由本发明所揭示的方法，可经济、有效的大量生产出所需的单株抗体。


熟习相关技艺者可通过下列较佳实施例及参阅所附图式而了解本发明内容，所附图式如下图1为传染性皮下及造血组织坏死病毒的VP37基因PCR片段，长约1038bp。
图2为大肠杆菌BL21 pLysS内表达VP37的SDS PAGE电泳胶片照相图。栏1及栏2分别显示将pET28a-vp37转型入BL21 pLysS菌株内后进行表达，其中栏2为添加IPTG的表达量。箭头指出VP37重组蛋白于胶体上的位置。
图3为抗白斑综合症病毒(WSSV)VP28抗体针对白斑综合症病毒颗粒检体及VP28重组蛋白的西方墨点法测试。栏1为经过CsCl不连续梯度超高速离心所纯化的WSSV病毒颗粒；栏2为vp28重组蛋白；栏3为蛋白质分子量标记(protein marker)。箭头处所指即为WSSV VP28蛋白。本图显示为抗白斑综合症病毒VP28抗体经1∶2000倍稀释所进行的实验。
图4为虾饲料分别浸泡病虾萃取液、白斑综合症病毒单株抗体以及病虾萃取液加白斑综合症病毒单株抗体后的喂食测试结果统计图；-◆-白斑综合症病毒单株抗体-▲-病虾萃取液+白斑综合症病毒单株抗体-■-病虾萃取液图5为大虾(虾体大小3.92±0.28cm，平均体重0.45克/只)的浸泡喂食试验结果统计图；-◆-白斑综合症病毒单株抗体-▲-病虾萃取液+白斑综合症病毒单株抗体-■-病虾萃取液图6为中虾(虾体大小3.32±0.32cm，平均体重0.25克/只)的浸泡喂食试验结果统计图；以及-◆-白斑综合症病毒单株抗体-▲-病虾萃取液+白斑综合症病毒单株抗体-■-病虾萃取液图7为小虾组(虾体大小2.48±0.29cm，平均体重0.15克/只)的浸泡喂食试验结果统计图。
-◆-白斑综合症病毒单株抗体-▲-病虾萃取液+白斑综合症病毒单株抗体-■-病虾萃取液图8为HTWC对虾子感染病毒后的处理效果。
-◆-对照组，感染病毒不喂食添加抗体-▲-感染病毒一天后，开始喂食添加抗体-■-感染病毒三天后，开始喂食添加抗体-●-感染病毒五天后，开始喂食添加抗体-*-感染病毒七天后，开始喂食添加抗体具体实施方式
本发明将参考下列的实施例做进一步的说明，这些实施例并不限制本发明前面所揭示的内容。熟习本发明的技艺者，可做些许改良与修饰，但仍不脱离本发明的范畴。
本发明提供了一种可用于预防及/或治疗病毒感染的组合物，以控制甲壳类动物的病毒感染。该组合物包含至少一种可与病毒专一性相结合的单株抗体。本发明所述的组合物可通过浸泡或喂食的方式施用于甲壳类动物。本发明在此还提供了一种方便且经济，用以治疗感染及/或预防感染的方法。
本发明前述的甲壳类动物较佳为养殖于高密度水产养殖场中的甲壳类动物，更佳为遭受严重感染的甲壳类动物，且无任何已知的方法可以处理的。其中，该甲壳类动物较佳为虾或蟹。
本发明所述的感染与病原体有关，例如原核生物(prokaryotes)或真核生物(eukaryotes)。其中，该感染较佳为与病毒有关，且更佳为该病毒是选自传染性皮下及造血组织坏死病毒、对虾杆状病毒、中肠腺坏死杆状病毒、草虾杆状病毒、肝胰腺类微小病毒、肠呼吸道病毒、桃拉病毒、黄头病毒，及白斑综合症病毒所组成的族群。
本发明所述的单株抗体为可与上述病原体(例如，感染的病毒)专一性相结合的单株抗体。
本发明所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，可依需要制备成各种形式的产品，只要不破坏所含的单株抗体，皆可被应用于本发明中，在此并没有特别的限制。例如，被制成医药组合物、营养剂组合物、饲料添加剂，或饲料组合物，但并不仅限于此。
本发明所述的医药组合物，包含至少一种可与病毒专一性相结合的有效剂量的单株抗体。在此“有效剂量”是指能提供足以使甲壳类动物得以对抗病毒感染的剂量，其会因单株抗体种类、给药方式、给药时间、养殖温度、以及甲壳类动物的年龄与健康状况的不同而有所差异。
本发明所述的营养剂组合物或饲料添加剂组合物，是包含至少一种可与病毒专一性相结合的有效剂量的单株抗体，其可与营养剂或饲料一同进行喂食，能有效的治疗及/或预防水产养殖场中的甲壳类动物的病毒感染，以提高养殖存活率并增加产量。在此“有效剂量”是指能提供足以使甲壳类动物得以对抗病毒感染的剂量，其会因单株抗体种类、给药方式、给药时间、养殖温度、以及甲壳类动物的年龄与健康状况的不同而有所差异。
另一方面，本发明还提供了一种用以治疗及/或预防虾子病毒感染的方法，其是在虾子的特定成长时期，将含有至少一种可与病毒专一性相结合的单株抗体的组合物与一介质混合后施用于虾子，其中该介质包含养殖用水与饲料。该特定生长时期是指种母虾期、受精卵期、无节幼虫期、水蚤状幼虫期、糠虾期幼虫期、后期幼虫期、幼虾期或成虾期。做为本发明治疗及/或预防虾子病毒感染的方法的实施例，例如(1)在种母虾阶段将种母虾定期2至3天，移至含有本发明所述的组合物的预设池子中，浸泡一给定时间后，再将种母虾移回育种池。
(2)在受精卵阶段产卵后8-10小时收集该受精卵以氯消毒(chlorinated)后，再以干净的海水经多次水洗。之后，将该受精卵移至孵化池并浸泡于干净的海水中。将本发明所述的组合物加入干净的海水中并注入孵化池中。
(3)在无节幼虫阶段无节幼虫会于产卵后约12-18小时于孵化池中孵化。由于在蜕变过程(metamorphosis)中无节幼虫可自卵黄获得足够的营养供给，因此于此阶段中无需额外供给饲料。因此，本发明所述的组合物是直接被加入干净的海水中，用以浸泡无节幼虫。
(4)在水蚤状幼虫阶段水蚤状幼虫开始会摄食饲料。一般来说，饲料会包含3-5μm的浮游植物(phytoplankton)、牡蛎的受精卵，以及人工浮游生物(plankton)。此时，将本发明所述的组合物，可以浸泡的方式直接加入干净的海水中，或是加入饲料中施用于水蚤状幼虫。
(5)在糠虾期幼虫阶段糠虾期幼虫所食用的饲料通常包含浮游植物、人工浮游生物、丰年虾无节幼虫(artemia nauplii)，及轮虫(rotifera)。此时，将本发明所述的组合物，以浸泡的方式直接加入干净的海水中，或是加入饲料中施用于糠虾期幼虫。
(6)在后期幼虫阶段后期幼虫所食用的饲料通常包含浮游植物、人工浮游生物，及丰年虾。此时，将本发明所述的组合物，以浸泡的方式直接加入干净的海水中，或是加入饲料中施用于后期幼虫。
(7)在幼虾阶段幼虾所食用的饲料通常包含人工饲料、大豆肉、牡蛎、鱼肉，及虾肉。此时，本发明所述的组合物是被直接加入饲料中施用于幼虾。
(8)在成虾阶段成虾会持续长大直到被贩卖至市场。在此阶段中，饲料通常包含人工饲料、大豆肉、牡蛎、鱼肉及虾肉。此时，将本发明所述的组合物直接加入饲料中施用于成虾。
上述方法中，也可直接使用本发明所述的单株抗体替代包含单株抗体的组合物。
本发明所述方法的步骤可以连续执行或是当有需要时才执行，其中以从受精卵至成虾的每一个阶段中皆进行处理为较佳。根据本发明所述的方法，提供了一种方便且有效的治疗及/或预防虾子感染的方法。以此提高其存活率，进而使得虾子的水产养殖生产量获得大幅的提升。
本发明所述的单株抗体可通过任何已知方法或熟习本技术领域者所知悉的方法而制备。作为本发明的一实施例，单株抗体可通过融合瘤细胞技术来制备。例如，使用已知病毒的表达蛋白(例如，套膜蛋白)或病毒颗粒作为抗原，注入老鼠动物体内产生抗体，再以融合瘤技术进行选殖，以筛选出本发明所述的可产生抗特定病毒抗原的单株抗体的融合瘤细胞。之后，仅需使用此融合瘤细胞通过生物反应器或注入老鼠腹部，即可快速且大量的制备所需的高效价单株抗体。根据本发明所述的单株抗体的制造方法所制得的单株抗体，无须经进一步的分离处理，即可直接使用，由此可有效减少单株抗体的生产成本。
以下为制备传染性皮下及造血组织坏死病毒和白斑综合症病毒单株抗体的实施例，同时就极易造成虾子病毒感染的白斑综合症病毒举例说明。通过本发明所述的融合瘤细胞HTWC28所制备出的白斑综合症病毒的套膜(envelope)蛋白VP28的单株抗体，可被直接加入至干净的海水中，或混入饲料中喂食虾子，由此即可有效控制虾子受到病毒感染的状况。
实施例一(1)制备白斑综合症病毒抗原解剖呈现白斑综合症症状的草虾，取其肝胰脏和表皮，经研磨后以0.45μm孔隙的滤膜过滤去杂质，再以不连续的氯化铯(CsCl)梯度20％、30％、40％氯化铯，溶于1X TNE缓冲液(20mM Tris Base，400mM氯化钠，5mM EDTA，ph7.4)进行超高速离心(39,000rpm，18小时，4℃)，以萃取出白斑综合症病毒。
接着，将病毒萃取液以1/10X体积的溶解缓冲液(lysis buffer)(100mM Tris-HCl(ph8.0)，100mM EDTA，2.5％SDS)及100μg/ml之蛋白酶(proteinase k)，于55℃下作用24小时后，以苯酚/氯仿混合液(phenol/chloroform)萃取病毒的脱氧核糖核酸(DNA)。
接着，以已知的聚合酶链反应(PCR)技术，放大位于白斑综合症病毒DNA上可编码出套膜(envelope)蛋白VP28的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。白斑综合症病毒的套膜(envelope)蛋白VP28包含615个核苷酸(SEQ IDNO1)，可编码成204个胺基酸(SEQ ID NO2)，约28kDa。
接着，以已知洋菜胶电泳法纯化前述PCR产物的核苷酸片段，并将其切割出。之后，将此核苷酸片段由接合酶(Ligase)接入pET28a载体内。此一重组质体，在此命名为pET28a-VP28。
将pET28a-VP28重组质体转形(transform)至大肠杆菌BL21 pLysS菌株内，随即进行VP28蛋白质的表达。将已通过转形插入pET28a-VP28重组质体的BL21 pLysS菌株，于37℃下培养3小时后，加入0.5M异丙基硫代半乳糖吡喃苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside，IPTG)以启动蛋白质表达，再于37℃下继续培养3小时，使其持续表达VP28蛋白质，最后以His-taq管柱纯化VP28蛋白(抗原蛋白)。
(2)制备传染性皮下及造血组织坏死病毒抗原解剖经PCR反应证实感染传染性皮下及造血组织坏死病毒的草虾，取其肝胰脏，经研磨后以0.45μm孔隙的滤膜过滤去杂质。此过滤液随后以不连续CsCl梯度20％、30％、40％CsCl，溶于1X TNE(20mM TrisBase，400mM NaCl，5mM EDTA，ph7.4)，于4℃下以39k rpm之离心转速离心18小时，进行超高速离心以萃取、纯化病毒。
接着将病毒萃取液以1/10X体积的溶解缓冲液100mMTris-HCl(ph8.0)，100mM EDTA，2.5％SDS及100μg/ml的蛋白酶(proteinase k)，于55℃作用24小时后以苯酚/氯仿混合液萃取传染性皮下及造血组织坏死病毒织的DNA。
接着，以已知聚合酶链反应(PCR)技术，放大位于传染性皮下及造血组织坏死病毒DNA上可编码出外壳(Capside)蛋白VP37的核苷酸序列，如图1所示。传染性皮下及造血组织坏死病毒的外壳蛋白VP37包含990个核苷酸(SEQ ID NO3)，可编码成329个胺基酸(SEQ ID NO4)。
接着，以已知洋菜胶电泳法纯化前述PCR产物的核苷酸片段，并将其切割出。之后，将此核苷酸片段通过接合酶(Ligase)接入pET28a载体内。此一重组质体，在此命名为pET28a-VP37。
将pET28a-VP37重组质体转形(transform)至大肠杆菌BL21 pLysS菌株内，随即进行VP37蛋白质的表达。将已通过转形插入pET28a-VP37重组质体的BL21 pLysS菌株，于37℃下培养3小时后，加入0.5M异丙基硫代半乳糖吡喃苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside，IPTG)以启动蛋白质表达，再于37℃下继续培养3小时，使其持续表现VP37蛋白质，如图2所示。最后，以His-taq管柱纯化VP37蛋白(抗原蛋白)。
(3)制备单株抗体选择6-8周，健康BALB/C小鼠以佛氏完全佐剂(Freund’s completeaajuvant，FCA)乳化上述纯化的抗原蛋白。之后，分别于每只小鼠腹腔中注射约100μg乳化后的抗原蛋白，2-3周后以佛氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)乳化抗原蛋白，同样以腹腔进行注射。2-3周后重复佛氏不完全佐剂的免疫操作。再过一周后，于小鼠尾部静脉采血，并以酶联免疫吸附分析(enzyme-link immunosorbentassay，ELISA)的方式测定小鼠血清效价。于最后一次加强免疫时，直接腹腔注射100μg的纯化抗原蛋白，3-4天后进行细胞融合。
在进行细胞融合前，先将未经上述免疫操作处理的BALB/C小鼠采血后牺牲，放入75％酒清中5分钟。之后，于小鼠腹部以碘酒消毒，剪一小口撕开腹部皮肤，腹腔内注射5ml用胎牛血清配制的HAT选择性培养基，吸出后再用5ml该HAT培养基稀释，然后滴加到96孔ELISA板内，每孔1滴，放入37℃、5％CO2培养箱内过夜(饲养细胞)。
另外，将免疫好的小鼠采血后放入75％酒精中5分钟后，取出脾脏用洗液(无血清RPMI1640培养基)冲洗。之后，将脾脏放在无菌铜网上，用灭菌的注射器反复抽吸，吸出上清液。之后，以1500rpm离心8分钟，沉淀即为制备好的脾细胞。
将骨髓瘤细胞(SP2/0)及上述预先制备好的脾细胞用洗液作适当稀释后计数，两种细胞按1∶5的比例混合，接着以1500rpm离心8-10分钟。去除上清液，缓慢加入1ml 50％的聚乙二醇作用1-2分钟，再缓慢加入20-30ml洗液。以1500rpm离心8-10分钟。去除上清液后，加入HAT培养液，新悬浮细胞，并轻轻混匀(融合瘤细胞悬浮液)。
在前述预先准备好饲养细胞的96孔板上，于每孔加入1-2滴融合瘤细胞悬浮液后，放置于37℃、5％的CO2培养箱中培养。融合后的第三天，每孔补加1滴HAT培养液，至第四天换液。
最后以ELISA筛选抗体分泌阳性的融合瘤细胞，以选殖出可产生抗上述抗原(VP28与VP37)的单株抗体的融合瘤细胞。
首先，用pH9.6的包被液0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液0.159％(w/v)碳酸钠+0.293％(w/v)碳酸氢钠稀释经纯化后的上述抗原蛋白(VP28与VP37)，使浓度达到10μg/ml，并于4℃下包被过夜。再以1％胎牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)于37℃下封闭1小时。之后，用洗液(磷酸盐缓冲溶液，pH7.4)洗涤三次，每次3-5分钟。从含有融合瘤细胞的孔中吸取100μl上清后，原孔内补加等量RPMI1640培养基，于37℃下恒温培养1-2小时。再用洗液洗涤三次，每次3-5分钟。之后，于每孔中加入预先用抗体稀释液稀释好的抗鼠IgG酶标记的次级抗体各100μl，再于37℃下恒温培养1-2小时。最后，再用洗液洗涤三次后，加入底物溶液邻苯二胺(OPD)-过氧化氢混合溶液100μl，于室温下避光30分钟。待显色后，于每孔滴加50μl终止液(2M硫酸溶液)，测定OD490值。阳性对照孔为免疫小鼠的血清(100倍稀释)，阴性对照为骨髓瘤细胞(SP2/0)的血清。
以健康的Balb/c小鼠的腹水制备饲养细胞板。再将阳性孔中的融合瘤细胞稀释至每100μl中含有一个细胞。然后，将稀释的融合瘤细胞悬浮液滴入已铺有饲养细胞的培养板内，每孔100μl。将培养板置入5％CO2温箱37℃培养，三天左右换液一次，待细胞生长至8-10天时，检测抗体，标出阳性孔，对所有的细胞孔换新液。换液2天后，再检测，对两次检测都是阳性的孔再次选殖二次，直到所有的孔都为阳性，最后选择OD值高、细胞活力好、只有一株细胞的孔，扩大培养。藉此，即可获得能产生抗上述抗原蛋白(VP28与VP37)的单株抗体的融合瘤细胞株。
实施例二为测试实施例一中通过融合瘤细胞所分泌至培养基中的单株抗体的力价。在此将所收取含抗白斑综合症病毒的VP28抗原蛋白的单株抗体(以下简称HTWC)的培养液分别以1×10-2、2×10-2、1×10-3、2×10-3与1×10-4的稀释倍数以西方墨点法(Western blot)进行检测，藉以确认所得单株抗体的专一性与力价。
首先，将经由SDS-PAGE分析的检体以半湿式转置器(The PantherTMSemidry Electroblotter)在120mA、70分钟的条件下，转置于尼龙膜(nylon paper)上。转置后的尼龙膜置于阻隔缓冲液blocking buffer含有5％脱脂奶粉的TBST(20mM Tris-HCl、150mM NaCl，及0.05％Tween-20)中，在室温下反应1小时。再以25ml的TBST溶液洗5分钟，然后加入5ml含有初级抗体的阻隔缓冲液，在室温中进行2小时杂合反应。再以25ml的TBST溶液洗5分钟，然后加入5ml含有次级抗体的阻隔缓冲液，在室温中进行1小时杂合反应。然后以25ml的TBST溶液洗10分钟二次，再以25ml的TBS溶液(不含0.05％Tween-20的TBST)洗5分钟三次。最后将尼龙膜置于含有0.5％氮蓝四唑试剂(Nitro bluetetrazolium，NBT)与5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯试剂(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，BCIP)的APB呈色剂(10ml)中，于室温中进行呈色，待呈色后再以二次水清洗即可。
经测试所得的结果显示HTWC28可以精确且专一地侦测到重组白斑综合症病毒的rVP28抗原蛋白与纯化白斑综合症病毒的VP28抗原蛋白。另外，经由序列稀释试验，可得知由培养融合瘤细胞所产生的HTWC，其在西方墨点法上的力价可高达1×104以上，并具极高的专一性，结果如图3所示。
实施例三取虾体大小2.9±0.3cm，平均重量约0.16克/只的草虾，每组取15只接受测试。饲养海水盐度调整至16度(1.6％)。受试草虾先分置于饲育箱(每组15只)，于2公升海水中饲养至隔夜，以令其适应新置环境。将已证实有白斑综合症病毒感染的病虾的研磨萃取液、白斑综合症病毒单株抗体(HTWC)以及TNE缓冲液分别混合(待测液)以供饲料浸泡，其处理方式如下表所示病虾萃取液 单株抗体TNE缓冲液第一组125μl 125μl第二组125μl 12μl第三组125μl 125μl接着，将混合均匀的待测液静置于室温(约23-25℃)下作用1小时。反应后的待测液分别加入0.1克饲料，混匀后于室温下静置1小时，令其吸附待测液。
受试草虾在进行喂食试验前先将饲养海水水量调整至500ml，并进行饥饿12小时。饥饿处理后随即加入浸泡后的饲料喂食。喂食隔夜后补海水至2公升，进行一般性饲养。两天后再进行相同处理一次。第一次喂食后即每天记录存活虾只数并进行统计。
经测试21天后所得结果如图4所示。由图中所得结果可得知，于实验第5天后，喂食浸泡病虾萃液饲料的实验组开始持续死亡，直至第18天后，其存活率剩33％。而喂食抗体与病虾萃液加抗体的实验组，其存活率虽略有下降，但仍维持在高达93％与80％以上。实验结果显示，有添加白斑综合症病毒单株抗体，可以多增加虾子47-60％的存活率。
实施例四测试方式同实施例三，只是喂食的次数由实施例三的两次改为连续喂食，即每次均喂食浸泡待测液后的饲料。第一次喂食后即每天记录存活虾只数并进行统计。
受试虾体依生长期之不同分三组分别进行试验。第一组草虾的虾体大小3.92±0.28cm，平均体重0.45克/只；第二组草虾的虾体大小3.32±0.32cm，平均体重0.25克/只；第三组草虾的虾体大小2.48±0.29cm，平均体重0.15克/只，测试方法采用连续喂食已浸泡待测液的饲料的试验方式。第一次喂食后即每天记录存活虾只数并进行统计。
经测试21天后所得的结果如图5、图6及图7所示。由于受试虾体依生长期不同而分成三组进行试验，为叙述方便以下简称第一受试组为大虾组(虾体大小3.92±0.28cm，平均重量0.45克/只)参见图5，第二受试组为中虾组(虾体大小3.32±0.32cm，平均重量0.25克/只)参见图6，第三受试组为小虾组(虾体大小2.48±0.29cm，平均重量0.15克/只)参见图7。由结果得知，大虾组于实验第16天后，喂食浸泡病虾萃液饲料的实验组才开始有显著的死亡，直至21日，其存活率仅剩6.7％。而喂食抗体与病虾萃液加抗体的实验组，于实验第18天后，其存活率也开始下降，但最终仍然分别有60％与73.3％之存活率。实验结果显示，有添加抗体较没添加抗体的存活率高出约53％-66％。
中虾组于实验第14天，喂食浸泡病虾萃液饲料的实验组开始大量死亡，直至实验第19天，其存活率已降至0％。而喂食病虾萃液加抗体的实验组，虽然于实验第18天后其存活率也持续下降，但止于60％。喂食抗体的对照组最终仍然维持在90％以上。实验结果显示，有添加抗体较没添加抗体的存活率高出约60％-90％。
小虾组的实验结果与喂食两次的实验相似。于实验第4天后，喂食浸泡病虾萃液饲料的实验组就开始持续死亡，直至第21天，其存活率降至20％。而喂食抗体与病虾萃液加抗体的实验组，其存活率均维持在80％以上。实验结果显示，有添加抗体则较没添加抗体的存活率高出约60％左右。
由上述喂食试验所得结果可以发现，无论试验方法如何，喂食病虾萃液饲料的实验组都会持续且大量地死亡，而使存活率最后都降至30％以下，但是若有加入根据本发明所指出的单株抗体，则虾子存活率相对均可增加47％-60％左右。
由上述活体试验中均可以证实，根据本发明所研发的单株抗体能够成功地结合病毒，并且抑制病毒持续扩散感染虾体，相对地提高虾群存活率达约47％以上。
实施例五为测试HTWC治疗已感染病毒的虾子的效果，在此选用虾体大小2.16±0.28cm，平均重量0.14g/只的虾子进行测试。每组虾子数目为11只，分别以2公升的养殖用水进行养殖。
进行测试时，各组均喂食预先浸泡病虾萃取液的饲料一天，早晚各一次。饲料浸泡条件为每次食量0.1g饲料加入250μl病虾萃液，置于室温中浸泡1小时。隔天为处理感染测试的第一天，将病虾分成四组，分别于第一天、第三天、第五天与第七天喂食预先浸泡100倍力价的HTWC饲料两次，浸泡条件为每次食量0.1g的饲料加入250μl待试的HTWC，置于室温中浸泡1小时。除测试当天外，均喂食不经处理的一般饲料。试验期为21天，每天观察并记录受试虾子的存活率。
实验所得结果如图8所示，不喂食HTWC浸泡饲料的对照组在试验第五天开始持续死亡，直至21天时其存活率降至18.2％；感染第七天后才开始追加喂食HTWC浸泡饲料的实验组，其存活率与对照组相似，最后同为降至18.2％。而分别于感染第三天与第五天后才开始追加喂食HTWC浸泡饲料的实验组，其21天最终存活率则均维持在54.5％，虽然如此，第三天喂食试验的死亡速率仍较第五天喂食试验者为缓慢。感染第一天后即开始追加喂食含HTWC饲料的实验组，于第十二天其存活率为90.9％，并且在实验21天后其存活率仍高达72.7％。本实验结果显示，于感染第一天后，喂食含有HTWC饲料的虾群，可相对地提高存活率达54.5％，并且在喂食病毒之后的第三与第七天喂食相同处理的饲料，仍可以提高36.3％的存活率，此实验结果表示HTWC拥有良好的病毒感染处理效果。而且HTWC在处理病毒感染上有其时效性，进行处理的时间愈早其所获得的效果愈好，也就是虾群的存活率越高。
虽然，本发明已通过参考前述较佳实施例而揭露，熟悉本发明技术领域者可轻易的据此做些许的改变或修饰，但此将不脱离本发明申请专利范围所界定的范畴。
序列表<110>汉德生物科技股份有限公司<120>用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物及其施用方法<150>US 60/514,036<151>2003-10-24<160>4<210>1<211>615<212>DNA<213>白斑综合症病毒(white spot syndrome virus)<400>1atggatcttt ctttcactct ttcggtcgtg tcggccatcc tcgccatcac tgctgtgatt 60gctgtattta ttgtgatttt taggtatcac aacactgtga ccaagaccat cgaaacccac 120acagacaata tcgagacaaa catggatgaa aacctccgca ttcctgtgac tgctgaggtt 180ggatcaggct acttcaagat gactgatgtg tcctttgaca gcgacacctt gggcaaaatc 240aagatccgca atggaaagtc tgatgcacag atgaaggaag aagatgcgga tcttgtcatc 300actcccgtgg agggccgagc actcgaagtg actgtggggc agaatctcac ctttgaggga 360acattcaagg tgtggaacaa cacatcaaga aagatcaaca tcactggtat gcagatggtg 420ccaaagatta acccatcaaa ggcctttgtc ggtagctcca acacctcctc cttcaccccc 480gtctctattg atgaggatga agttggcacc tttgtgtgtg gtaccacctt tggcgcacca 540attgcagcta ccgccggtgg aaatcttttc gacatgtacg tgcacgtcac ctactctggc 600actgagaccg agtaa 615<210>2<211>204<212>PRT<213>白斑综合症病毒(white spot syndrome virus)<400>2Met Asp Leu Ser Phe Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Ile Leu Ala Ile1 5 10 15Thr Ala Val Ile Ala Val Phe Ile Val Ile Phe Arg Tyr His Asn Thr20 25 30Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu Thr Asn Met35 40 45Asp Glu Asn Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly Tyr50 55 60Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly Lys Ile65 70 75 80Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu Asp Ala85 90 95Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr Val100 105 110Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn Thr115 120 125Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Pro Lys Ile Asn130 135 140Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe Thr Pro145 150 155 160Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr Thr165 170 175Phe Gly Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe Asp Met180 185 190Tyr Val His Val Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu195 200
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1.一种用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其包含至少一种可与病毒专一性相结合的单株抗体，该单株抗体由下列步骤所制得(1)取得能用以辨识该病毒的基因的核苷酸序列，该核苷酸序列能表达出该病毒的特异性抗原蛋白；(2)通过该核苷酸序列所表达的该特异性抗原蛋白或包含该特异性抗原蛋白的病毒颗粒制备融合瘤细胞；(3)筛选出能分泌出该单株抗体的融合瘤细胞，该单株抗体可专一性辨识该病毒并可与其反应；以及(4)通过该融合瘤细胞产生该单株抗体。
2.如权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中该甲壳类动物为虾或蟹。
3.如权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中该病毒选自传染性皮下及造血组织坏死病毒、对虾杆状病毒、中肠腺坏死性杆状病毒、草虾杆状病毒、肝胰腺类微小病毒、肠呼吸道病毒、桃拉病毒、黄头病毒，及白斑综合症病毒所组成的族群。
4.如权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中该病毒为传染性皮下及造血组织坏死病毒。
5.如权利要求4所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中该核苷酸序列用以表达VP37抗原蛋白，并具有如SEQ ID NO3所示的序列。
6.如权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中该病毒为白斑综合症病毒。
7.如权利要求6所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中该核苷酸序列用以表达VP28抗原蛋白，并具有如SEQ ID NO1所示的序列。
8.如权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中步骤(2)中制备融合瘤细胞时是使用骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合。
9.如权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中步骤(3)是以ELISA法进行筛选的。
10.如权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中步骤(4)是通过生物反应器大量繁殖该融合瘤细胞以产生该单株抗体。
11.如权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中步骤(4)是通过将该融合瘤细胞注入哺乳动物腹部诱发生成肿瘤后，再自该哺乳动物的腹水中收集该单株抗体。
12.如权利要求11所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，其中该哺乳动物为老鼠。
13.一种用以降低虾子病毒感染率的方法，其为将权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物，在该虾子的特定生长时期，与一介质混合后施用于该虾子。
14.如权利要求13所述的用以降低虾子病毒感染率的方法，其中该特定生长时期选自种母虾期、受精卵期及无节幼虫期所组成的族群。
15.如权利要求14所述的用以降低虾子病毒感染率的方法，其中该介质为养殖用水。
16.如权利要求13所述的用以降低虾子病毒感染率的方法，其中该特定生长时期选自水蚤状幼虫期、糠虾期幼虫期及后期幼虫期所组成的族群。
17.如权利要求16所述的用以降低虾子病毒感染率的方法，其中该介质为养殖用水及饲料。
18.如权利要求13所述的用以降低虾子病毒感染率的方法，其中该特定生长时期选自幼虾期及成虾期所组成的族群。
19.如权利要求18所述的用以降低虾子病毒感染率的方法，其中该介质为饲料。
20.如权利要求13所述的用以降低虾子病毒感染率的方法，其中该病毒选自传染性皮下及造血组织坏死病毒、对虾杆状病毒、中肠腺坏死性杆状病毒、草虾杆状病毒、肝胰腺类微小病毒、肠呼吸道病毒、桃拉病毒、黄头病毒，及白斑综合症病毒所组成的族群。
21.如权利要求13所述的用以降低虾子病毒感染率的方法，其中该病毒为白斑综合症病毒。
22.一种用以降低甲壳类动物病毒感染率的医药组合物，其包含一有效剂量的权利要求1所述的用以降低该甲壳类动物病毒感染率的组合物，以及一药学上可接受的载体。
23.一种用以降低甲壳类动物病毒感染率的饲料组合物，其包含权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物。
24.一种用以降低甲壳类动物病毒感染率的营养添加剂，其包含权利要求1所述的用以降低甲壳类动物病毒感染率的组合物。
全文摘要
本发明提供了一种用以降低甲壳类动物病毒感染的组合物，以有效预防及/或治疗甲壳类动物的感染病症，进而提高其存活率。该组合物包含至少一种可与病毒专一性相结合的单株抗体，该单株抗体可通过融合瘤细胞株以生物反应器或是注入老鼠腹部的方式来大量生产。该组合物可以治疗药剂、营养剂或饲料添加剂形式与饲料混合喂食，或是采用浸泡方式施用于甲壳类动物，以达到治疗及/或预防甲壳类动物病毒感染的目的。
文档编号A61P31/00GK1636596SQ20041008618
公开日2005年7月13日 申请日期2004年10月22日 优先权日2003年10月24日
发明者陈智育, 隋婉君, 蔡昌晏, 杨泰鑫, 张铭传 申请人:汉德生物科技股份有限公司