专利名称：海洋甲壳类动物支原体培养基及分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及到一种支原体培养基及分离纯化方法。
背景技术：
现有的支原体属于原核细胞生物，是目前能在无活性细胞培养基中独立生存、 自我繁殖的最小微生物，无细胞壁结构，有高度的多形性，可透过微孔滤膜。支原体除了 能引起人类传染病外，还能引起家畜、家禽和作物病害(Razin S. Peculiar properties ofmycoplasmas :the smallest self-replicating prokaryotes. FEMS Microbiol Lett, 1992,79(1-3) :423_431.)。自1937年分离出第一株人系支原体以来，迄今已有120余种 支原体被陆续报道，且多见于哺乳动物和节支动物昆虫纲种类(Razin S. Yogev D. Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiol Mol Biol Rev. 1998,62(4) :1094_1156.)。然而有关甲壳纲的支原体，目前国内外均极少报道。杨季 芳等(杨季芳，中国对虾枝原体超微结构及宿主的主要超微病理变化，海洋与湖沼，1997， Vol. 28，No. 2 ；杨季芳，中国对虾流行性肝胰腺坏死综合症研究I病毒和类枝原体合并感染 对虾肝胰腺，1993，东海海洋，Vol 11，N03，34-39.)从养殖中国对虾肠道结节病和白斑综合 症中发现支原体与细菌及支原体与白斑综合症病毒的混合感染。无致病性支原体在环境中 大量存在并在健康动物体内长期存在，携带支原体的动物在没有受到应激胁迫之前并不会 表现任何症状。然而，从患病死亡的对虾眼、鳃、脑中分离的支原体纯培养物能够使健康对 虾发病，或使健康动物更容易受到病毒和细菌的感染(Ghadersohi A5Leigh 0. Isolation, charactersation and DNA analysis of Mycoplasma spp. from moribund prawnsPenaeus monodon cultured in Austualia. Dis Aquat Org, 1999, 35 :53_61)。对甲壳动物支原体进行科学研究，首要要解决的瓶颈问题是制备适合甲壳动物支 原体体外生长繁殖的培养基。目前用于人类及畜禽支原体培养的培养基均不能满足甲壳动 物支原体的生长需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种海洋甲壳类动物支
原体培养基。本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种海洋甲壳类 动物支原体培养基分离纯化方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为该海洋甲壳类动物支原体培养 基，包括液体培养基和固体培养基，其特征在于将支原体肉汤培养基12. O 15. Og0.4_lwt%苯酚红2. 35 3. OOmL重蒸水470 600mL
在pH为7. 0-8. OUlO0C _121°C的条件下灭菌10_20min后，加入5_30mL小牛血 清在56°C灭活30min，然后再加入10_4(^%新鲜酵母浸出液5-20mL、5-10wt %葡萄糖溶液 0. 5-3mL、5-15wt%醋酸铊水溶液0. 1-0. 5mL和5_20mg/mL青霉素0. 5_2mL混合均勻得到所 述的液体培养基；将 支原体肉汤培养基12.0 15. Og重蒸水470 600mL琼脂粉0.94 1.2wt%在ρΗ7· 0-8. OUlO0C _121°C条件下灭菌10_20min，待冷却至55 60°C后，加入 已过滤除菌的小牛血清5-301^、10-4(^%新鲜酵母浸出液5-20mL、5-15wt%醋酸铊水溶液 0. 1-0. 5mL和5-15mg/mL青霉素0. 5_2mL，混合均勻后将混合液倾注到灭菌平板上制成固体 培养基；上述琼脂粉的用量为每IOOmL固体培养基加入0. 94-1. 2g。其中，所述新鲜酵母浸出液的制备方法如下称取高活性干活酵母，悬浮于2-6倍的蒸馏水中，在20-40°C搅拌5-30min后，在 室温下发酵15-60min，然后加热至沸点，冷却得到发酵液；将发酵液以2000-4000rpm离心 15-30min,取上清液，用NaOH调pH值至7. 0 8. 0，然后将上清液置于90 95°C水浴中 10-20min ；冷却后，再以7000 8000rpm离心15_30min，取上清液用0. 22-0. 45 μ m膜过滤 除菌即得到新鲜的酵母浸出液。使用上述液体培养基和固体培养基进行海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法， 其特征在于包括下述步骤1)无菌剪取病样器官，加3 6倍病样器官体积的支原体肉汤培养基及0. 5-1 倍病样器官体积的石英砂，无菌研磨成乳剂，3000-5000rpm离心10-20min，将上清液经 0. 22-0. 45 μ m膜无菌过滤，除去杂菌，得到无菌上清液；2)取无菌上清液接种于10倍体积所述的液体培养基中，置于22-41°C、浓度为 5% 10v%的二氧化碳培养箱中培养，48-72h盲传，将盲传代接种到所述的固体培养基上 进行菌落生长，得到特征菌落；3)将所述的特征菌落再接种到所述的液体培养基上培养生长，将得到的培养物接 种到所述固体培养基上进行菌落生长；重复该步骤，直至得到所需支原体的特征菌落；4)用无菌刀片挑取所述的特征菌落接种于所述的液体培养基，于22-41°C、 50-100rpm震荡培养，至液体培养基颜色由红变黄时取出培养物；对该培养物与所述液体 培养基进行10倍稀释法，稀释至所需浓度，得到稀释液；取0. I-ImL上述稀释液接种于固体 培养基继续培养，分离出支原体特征病菌；5)重复步骤4三次以上，得到纯化的海洋甲壳类支原体。另一种海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法，其特征在于包括下述步骤1)无菌剪取病样器官，加3 6倍病样器官体积的支原体肉汤培养基及0. 5-1 倍病样器官体积的石英砂，无菌研磨成乳剂，3000-5000rpm离心10-20min，将上清液经 0. 22-0. 45 μ m无菌滤器过滤，除去杂菌，得到无菌上清液；2)取0. 2-lmL无菌上清液涂布于所述的固体培养基上，22_41°C下置于二氧化碳 培养箱的潮湿环境中培养，CO2浓度范围为5% 10v%，培养3 5天，得到支原体特征菌落；用无菌刀片选取所述的特征菌落接种于液体培养基，在22-4rC、50-100rpm条件下震 荡培养，至液体培养基的颜色变黄时得到培养物；向该培养物中加入所述的液体培养基进 行10倍稀释法，得到所需浓度的稀释液；将该稀释液接种至所述固体培养基继续培养，分 离出支原体特征菌落；3)对得到的特征菌落 重复步骤2三次以上，得到纯化的海洋甲壳类支原体。再一种海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法，其特征在于包括下述步骤1)用接种环无菌沾取取3_5mm3大小的病样组织块在所述的固体培养基上直接划 线接种，置于潮湿环境、22-41°C的二氧化碳培养箱中培养，CO2浓度范围为5% 10v%，培 养3 14天，生长出菌落；2)用无菌刀片选取所需菌落接种于液体培养基，置22-4rC、50-100rpm震荡培 养，至液体培养基颜色变黄时得到支原体培养物；向该培养物中加入所述的液体培养基进 行10倍稀释法，得到所需浓度的稀释液；将该稀释液接种至所述固体培养基继续培养，分 离出支原体特征菌落；3)对得到的特征菌落重复步骤2三次以上，得到纯化的海洋甲壳类支原体。又一种海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法，其特征在于包括下述步骤1)取活体病样，无菌条件下剪切病样，将流出的组织液接种于10倍体积所述的液 体培养基中，置于22-41°C、浓度为5% 10v%的二氧化碳培养箱中培养，48-72h盲传，将 盲传代接种到所述的固体培养基上进行菌落生长，得到特征菌落；2)将所述的特征菌落再接种到所述的液体培养基上培养生长，将得到的培养物接 种到所述固体培养基上进行菌落生长；重复该步骤，直至得到所需支原体的特征菌落；3)用无菌刀片挑取所述的特征菌落接种于所述的液体培养基，于22-41°C、 50-100rpm震荡培养，至液体培养基颜色由红变黄时取出培养物；对该培养物与所述液体 培养基进行10倍稀释法，稀释至所需浓度，得到稀释液；取0. I-ImL上述稀释液接种于固体 培养基继续培养，分离出支原体特征病菌；4)重复步骤4三次以上，得到纯化的海洋甲壳类支原体。与现有技术相比，本发明提供了一种用于甲壳动物、尤其是青蟹支原体体外培养 的培养基及使用该培养基对甲壳动物支原体的分离纯化方法。该液体及固体培养基能有效 促进支原体体外生长，本方明分离方法所分离出甲壳类动物体内支原体的成功率较高。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1培养基制备1、液体培养基的制备称取支原体肉汤培养基2. 04g溶于SOmL重蒸水中，力口 0. 4mL0. 4%苯酚红，用IM NaOH调pH至7. 8，121°C灭菌15min ；将得到的液体培养基冷却 55°C后加入已过滤除菌的小牛血清201^，25￥%新鲜酵母浸出液10mL，10wt%葡萄糖溶液 ImL, IOwt %醋酸铊水溶液0. 2mL, 10mg/mL青霉素lmL，混合均勻后用5mL试管分装备用。2、固体培养基的制备称取支原体肉汤培养基2. 04g溶于SOmL重蒸水中，用 IMNaOH调pH至7. 8，加入终浓度为1. 02wt%的琼脂粉，121°C灭菌15min，待冷却至57°C左右，加入已过滤除菌的小牛血清201^、25￥%新鲜酵母浸出液10mL、IOwt%醋酸铊水溶液 0. 2mL和lOmg/mL青霉素lmL，混合均勻后倾注到IOmL灭菌平板上制成固体培养基备用。上述新鲜酵母浸出液的制备方法 为称取250g高活性干活酵母，悬浮于IOOOmL 蒸馏水中，在37°C搅拌20min后，在室温下发酵40min，然后加热至沸点，冷却得到发酵液； 将发酵液以3000rpm离心20min，取上清液，用IM NaOH调pH值至7. 8，然后将上清液置于 90 95°C水浴中15min ；冷却后，再以7500rpm离心20min，取上清液用0. 25 μ m膜过滤除 菌即得到新鲜的酵母浸出液。本实施例中制备的培养基供实施例2-6使用。实施例21)无菌条件下，采取青蟹腮组织约5. 7g加入15mL支原体肉汤培养基研磨液及 3mL石英砂，无菌研磨成乳剂，4000rpm离心15min ；将上清液吸入注射器中经0. 45 μ m滤膜 过滤除去杂菌，得到无菌上清液。2)取0. 5ml上清液接种于5mL液体培养基中，置于37°C、5v% CO2的二氧化碳培 养箱中培养。72h盲传一代，将盲传代一分为二分别接种到液体培养基和固体培养基。液 体培养基用于保存并生长该盲传代培养物；固体培养基上在37°C、5v% CO2条件下培养3天 后在显微镜下每日观察固体培养基上菌落的生长情况。选择菌落生长分布均勻的固体培养 基，在低倍显微镜下记号典型的单个支原体特征菌落。如果经过一代盲传不能得到特征菌 落，可以进行多代盲传，直至得到特征菌落。通常情况下，经过三代盲传后即会分离出特征 菌落，如果三代盲传后还没有发现特征菌落，那该培养物中可能不含有支原体。实施例2至实施例5中固体培养基上特征菌落的分离、纯化条件以及菌落在液体 培养基中的生长培养均是在22-41°C、浓度为5% 1(^%的二氧化碳培养箱中进行的。3)用无菌刀片挑取得到的特征菌落接种于液体培养基，在37°C、80rpm震荡培养， 至液体培养基颜色由红变黄；取培养物10倍稀释至10_6后，得到稀释液；将该稀释液接种 到固体培养基上，在潮湿环境下、37°C、5%C02条件下继续培养，5d后观察到固体培养基上 出现均勻分布的、大小如针尖状的菌落，在低倍显微镜下观察，这些菌落呈典型的“油煎蛋” 样，菌落呈圆形，直径均小于ΙΟΟμπι，中间部分较厚，为陷入琼脂内部的生长部分；边缘整 齐，周边为一层薄薄的透明区，此为菌落在琼脂表面散开的生长部分。菌落较小时常为无 色，陈旧后变成淡黄色或棕黄色，部分菌落分布密集呈珍珠状，圆形表面圆润光滑，深入琼 脂中，大小约50μπι左右。挑取单个菌落，在无菌条件下接种于液体培养基，37°C潮湿环境 下SOrpm震荡培养，至液体培养基颜色变黄后再10倍稀释至10_6，涂布于固体培养基上培 养，得到支原体特征菌落。4)挑取单个支原体特征菌落，依次重复步骤3三次以上，即可得到纯化的海洋甲 壳类动物支原体，可于-80°C超低温甘油中保存。实施例31)无菌剪取病样器官，可以是海洋甲壳类动物的腮、胃、肠、肝胰腺或心脏等器官， 加4倍体积的支原体肉汤培养基及0. 5 Ig石英砂，用NaOH调节pH为8，无菌研磨成乳 齐IJ，3000rpm离心20min取上清液，吸入注射器中经0. 45 μ m膜无菌过滤，除去杂菌，得到无 菌上清液。2)取0. 5mL无菌上清液接种于5mL液体培养基中，置于37°C的二氧化碳培养箱中培养，CO2浓度范围为7%，72h后盲传，盲传接种在液体培养基的同时也接种固体培养基，接 种在液体培养基上的培养物用于保留并生长该盲传菌种，接种在固体培养基上的培养物用 于分离、纯化所需要的支原体菌落。
3)接种在固体培养基上的培养物在37°C、5v% CO2条件下培养3天后(培养条 件？)在显微镜下每日观察菌落生长情况。选择菌落生长分布均勻的固体培养基，在低倍 显微镜下记号典型的单个菌落，用无菌刀片挑取记号部位菌落接种于液体培养基，置37°C、 80rpm震荡培养，至液体培养基颜色由红变黄时，取培养物10倍法稀释至10_4，得到稀释物。 取0. 2mL该稀释液接种至固体培养基继续培养。重复步骤3至少三次，得到纯化的海洋夹克类动物支原体，可于-80°C超低温甘油 中保存备用。实施例41)用接种环无菌沾取病蟹腹水接种于固体培养基，取约3mm3大小的组织块在固体 培养基上直接划线接种，置于潮湿环境、37°C的二氧化碳培养箱中培养，CO2浓度为6v%，培 养3d后在显微镜下每日观察菌落生长情况。2)选择菌落生长分布均勻的固体培养基，在低倍显微镜下记号典型的单个菌落 后，用无菌刀片挑去记号部位菌落接种于液体培养基，置37°C、80rpm震荡培养，至液体培 养基颜色由红变黄时取培养物10倍稀释法稀释至10_4，得到稀释液；取0. 2mL稀释液接种 至固体培养基继续培养，得到纯化的支原体特征菌落。3)挑取支原体特征菌落，重复步骤2三次以上，得到纯化的海洋夹克类动物支原 体，可于-80°C超低温甘油中保存备用。实施例51)取活体病样，用酒精棉消毒外部，无菌条件下剪切病样，将病样流出的组织液滴 入液体培养基中进行生长培养。同时将样品组织液滴于固体培养基上，涂布后置于潮湿环 境、37°C的二氧化碳培养箱中培养，CO2浓度范围为5v%。72小时后盲传，将盲传代接种到 所述的固体培养基平板上进行培养，3天后每日在显微镜下观察固体培养基上菌落的生长 情况，选择菌落生长分布均勻的固体培养基，在低倍显微镜下记号典型的单个支原体特征 菌落。如果经过一代盲传不能得到特征菌落，可以进行多代盲传，直至得到特征菌落。通常 情况下，经过三代盲传后即会分离出特征菌落，如果三代盲传后还没有发现特征菌落，那该 培养物中可能不含有支原体。2)选择菌落生长分布均勻的固体培养基，在低倍显微镜下记号典型的单个菌落 后，用无菌刀片挑去记号部位菌落接种于液体培养基，置37°C、80rpm震荡培养，至液体培 养基颜色由红变黄时取出培养物10倍稀释法稀释至10_4，得到稀释液；取0. 2mL该稀释液 接种至固体培养基平板继续培养，得到纯化的支原体特征菌落。3)重复步骤2，对依次得到的支原体菌落进行纯化，重复三次以上，得到纯化的海 洋夹克类动物支原体，可于-80°C超低温甘油保存备用。上述各实施例中未涉及到的内容部分与现有技术相同。
权利要求
一种海洋甲壳类动物支原体培养基，包括液体培养基和固体培养基，其特征在于将支原体肉汤培养基 12.0～15.0g0.4-1wt％苯酚红 2.35～3.00mL重蒸水470～600mL在pH为7.0-8.0、110℃-121℃的条件下灭菌10-20min，冷却至50-60℃后加入5-30mL小牛血清在56℃灭活30min，然后再加入10-40v％新鲜酵母浸出液5-20mL、5-10wt％葡萄糖溶液0.5-3mL、5-15wt％醋酸铊水溶液0.1-0.5mL和5-20mg/mL青霉素0.5-2mL混合均匀得到所述的液体培养基；将支原体肉汤培养基12.0～15.0g重蒸水 470～600mL琼脂粉 0.94～1.2wt％在pH7.0-8.0、110℃-121℃条件下灭菌10-20min，待冷却至55～60℃后，加入已过滤除菌的小牛血清5-30mL、10-40v％新鲜酵母浸出液5-20mL、5-15wt％醋酸铊水溶液0.1-0.5mL和5-15mg/mL青霉素0.5-2mL，混合均匀后将混合液倾注到灭菌平板上制成固体培养基；其中，所述新鲜酵母浸出液的制备方法如下称取高活性干活酵母，悬浮于2-6倍的蒸馏水中，在20-40℃搅拌5-30min后，在室温下发酵15-60min，然后加热至沸点，冷却得到发酵液；将发酵液以2000-4000rpm离心15-30min，取上清液，用NaOH调pH值至7.0～8.0，然后将上清液置于90～95℃水浴中10-20min；冷却后，再以7000～8000rpm离心15-30min，取上清液用0.22-0.45μm膜过滤除菌即得到新鲜的酵母浸出液。
2.一种海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法，其特征在于包括下述步骤1)无菌剪取病样器官，加3 6倍病样器官体积的支原体肉汤培养基及0.5-1倍 病样器官体积的石英砂，无菌研磨成乳剂，3000-5000rpm离心10-20min，将上清液经 0. 22-0. 45um膜无菌过滤，除去杂菌，得到无菌上清液；2)取无菌上清液接种于10倍体积所述的液体培养基中，置于22-41°C、浓度为5% 10v%的二氧化碳培养箱中培养，48-72h盲传，将盲传代接种到所述的固体培养基上，置于 22-41°C、浓度为5% 1(^%的二氧化碳培养箱中培养，进行菌落生长，得到特征菌落；3)将所述的特征菌落再接种到所述的液体培养基上培养生长，将得到的培养物接种到 所述固体培养基上进行菌落生长；重复该步骤，直至得到所需支原体的特征菌落；4)用无菌刀片挑取所述的特征菌落接种于所述的液体培养基，于22-4rC、50-100rpm 震荡培养，至液体培养基颜色由红变黄时取出培养物；对该培养物与所述液体培养基进行 10倍稀释法，稀释至所需浓度，得到稀释液；取0. 1-lmL上述稀释液接种于固体培养基继续 培养，分离出支原体特征病菌；5)重复步骤4三次以上，得到纯化的海洋甲壳类支原体。
3.一种海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法，其特征在于包括下述步骤1)无菌剪取病样器官，加3 6倍病样器官体积的支原体肉汤培养基及0. 5-1倍病样器官体积的石英砂，无菌研磨成乳剂，3000-5000rpm离心10-20min，将上清液经 0. 22-0. 45um无菌滤器过滤，除去杂菌，得到无菌上清液；2)取0.2-lmL无菌上清液涂布于所述的固体培养基上，22-41°C下置于二氧化碳培养 箱的潮湿环境中培养，C02浓度范围为5% 10v%，培养3 5天，得到支原体特征菌落； 用无菌刀片选取所述的特征菌落接种于液体培养基，在22-41°C、50-100rpm条件下震荡培 养，至液体培养基的颜色变黄时得到培养物；向该培养物中加入所述的液体培养基进行10 倍稀释法，得到所需浓度的稀释液；将该稀释液接种至所述固体培养基继续培养，分离出支 原体特征菌落；3)对得到的特征菌落重复步骤2三次以上，得到纯化的海洋甲壳类支原体。
4.一种海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法，其特征在于包括下述步骤1)用接种环无菌沾取取3-5mm3大小的病样组织块在所述的固体培养基上直接划线接 种，置于潮湿环境、22-41°C的二氧化碳培养箱中培养，C02浓度范围为5% 10v%，培养 3 14天，生长出菌落；2)用无菌刀片选取所需菌落接种于液体培养基，置22-4rC、50-100rpm震荡培养，至 液体培养基颜色变黄时得到支原体培养物；向该培养物中加入所述的液体培养基进行10 倍稀释法，得到所需浓度的稀释液；将该稀释液接种至所述固体培养基继续培养，分离出支 原体特征菌落；3)对得到的特征菌落重复步骤2三次以上，得到纯化的海洋甲壳类支原体。
5.一种海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法，其特征在于包括下述步骤1)取活体病样，无菌条件下剪切病样，将流出的组织液接种于10倍体积所述的液体培 养基中，置于22-41°C、浓度为5% 10v%的二氧化碳培养箱中培养，48-72h盲传，将盲传 代接种到所述的固体培养基上进行菌落生长，得到特征菌落；2)将所述的特征菌落再接种到所述的液体培养基上培养生长，将得到的培养物接种到 所述固体培养基上进行菌落生长；重复该步骤，直至得到所需支原体的特征菌落；3)用无菌刀片挑取所述的特征菌落接种于所述的液体培养基，于22-4rC、50-100rpm 震荡培养，至液体培养基颜色由红变黄时取出培养物；对该培养物与所述液体培养基进行 10倍稀释法，稀释至所需浓度，得到稀释液；取0. 1-lmL上述稀释液接种于固体培养基继续 培养，分离出支原体特征病菌；4)重复步骤4三次以上，得到纯化的海洋甲壳类支原体。
全文摘要
本发明涉及到一种海洋甲壳类动物支原体培养基及支原体的分离纯化方法。其特征在于将支原体肉汤培养基、苯酚红和重蒸水灭菌后加入小牛血清灭活然后再加入新鲜酵母浸出液、葡萄糖溶液、醋酸铊水溶液和青霉素混合均匀得到所述的液体培养基；将支原体肉汤培养基、重蒸水和琼脂粉灭菌后加入小牛血清、新鲜酵母浸出液、醋酸铊水溶液和青霉素，混合均匀后将混合液倾注到灭菌平板上制成固体培养基。利用上述培养基进行海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法是在固体培养基上分离菌落，将分离的菌落置于液体培养基中进行培养生长后在放置到固体培养基上纯化，重复上述步骤直至得到纯化的支原体。本发明所分离出甲壳类动物体内支原体的成功率高。
文档编号C12R1/35GK101864387SQ20101017503
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者杨季芳, 楼丹, 陈吉刚 申请人:杨季芳