专利名称：一种伏生紫堇总碱及其制备方法和其药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种伏生紫堇总碱及其制备方法和其药物组合物，以及在制备治疗和预防急性脑缺血药物中的应用。
背景技术：
罂粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens(Thunb)pers的干燥块茎，为一常用的行气活血、通络止痛药，中药名夏天无。可用于中风偏瘫、跌打损伤、风湿性关节炎、坐骨神经痛等诸多血液循环障碍疾病的治疗。目前国内外已有夏天无片和夏天无注射液生产上市，夏天无片是由原药材夏天无打粉与其醇提浸膏混合、制粒、压片而成；其注射液则是由原药材夏天无经水提醇沉工艺，按常规方法经灌装、封口等步骤制得，但不可静脉给药。这些制剂，工艺粗糙，且内含物不明确，内在质量很难控制，因此不符合现代中药制剂发展之趋势。
1982年《江西省药品标准》首先使用稀盐酸以渗滤法提取，然后收集滤液并通过阳离子交换树脂进行离子交换，用氨水的醇溶液(PH9-10)分次回流洗脱后，收集洗脱液即得到夏天无生物碱提取物。该方法的缺点在于其中使用了对人体和环境有害的试剂，而且生物碱的回收率较低。
中国专利02111103.0所述夏天无总生物碱的成分为夏天无碱、比枯枯灵碱、药根碱、a-四氢掌叶防已碱和原阿片碱等多种生物碱。所说的夏天无总生物碱的纯度在80％以上。但其中主要是原阿片碱，并且其含量约占总生物碱的50％以上。该专利对其他组分的比例无明确说明。剧毒性成分比枯枯灵碱的限量无明确规定，故其安全性存在质疑。提取方法称取并清洗夏天无药材后，加入10倍以上过量的稀盐酸(0.1-1％)水溶液浸泡并煮沸0.5-2小时。简单过滤后，收集药渣并向其中加入5-10倍体积的稀盐酸(0.05-5.5％)水溶液，继续煮沸0.5-2小时。常规过滤后，收集滤液并将上述滤液合并。用氢氧化钠溶液将滤液的PH值调到7，然后过大孔吸附树脂柱(流速5ml/分)。按常规方法监测流出液生物碱为阳性时吸附即已饱和，水洗至无色后，依次用中浓度(30-60％)和高浓度(60-90％)乙醇洗脱。监测生物碱内容物呈阴性反应后，收集并合并洗脱液。然后将洗脱液过氧化铝层板柱(流速5ml/分)以吸附除去杂质。减压回收乙醇后，在酸性条件(PH1-5)下溶出所需的产物并常规过滤。然后使用氢氧化钠溶液将洗脱物的PH值调到8-11，以析出沉淀。合并沉淀物后即得到用于本发明的夏天无总碱。
中国专利03118261.5所述夏天无总生物碱的成分为原阿片碱、比枯枯灵碱、药根碱、a-四氢巴马汀和巴马汀等多种生物碱。所说的夏天无总生物碱的纯度在80％以上。总生物碱组分的比例明确原阿片碱25-65％，延胡索乙素10-25％，比枯枯灵5-10％，巴马丁10-25％，其他生物碱及提取物5-20％。剧毒性成分比枯枯灵碱的限量为5-10％。提取方法以夏天无为原料，加入适量的极性溶剂渗漉提取，收集渗漉液至无生物碱反应，合并滤液，浓缩得到浓缩液，把经上述步骤得到的浓缩液进行大孔吸附树脂吸附层析，以碱水洗脱除去杂质；或以树脂吸附杂质，再以极性洗脱液洗脱夏天无总生物碱，收集洗脱液，回收溶剂，浓缩在醇溶液中结晶即得。
现代药理学研究表明，伏生紫堇含有多种具有显著生理活性的生物碱，但其中一种名为比枯枯灵的生物碱毒性较大，大鼠静脉给药，半数致死量为0.85mg/Kg；且含量约占药材中总生物碱的15％以上。是提取分离时应去除的，制剂中含量越低，用药则越安全。
以上几种方法提取分离所得总生物碱。因工艺不同，故内在组分也有很大差别，无论哪种提取方法都存在毒性成分比枯枯灵含量较高，且不能定量的缺点，因此使得夏天无总生物碱尽管药效显著，但由于其存在安全性隐患，临床应用受到限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对上述现有技术的不足，对夏天无中组份采用特殊提取工艺，将剧毒性成分比枯枯灵降低至5％以下，将几种生物碱的成分富集至纯度在80％以上，并建立提取所述总生物碱的制备方法，提出该总生物碱制成可供静脉给药的冻干粉针制剂的制备方法及其在制备治疗和预防急性脑缺血药物中的应用。
本专利所述伏生紫堇总碱，由夏天无即罂粟科植物伏生紫堇Corydalisdecumbens(Thunb)pers的干燥块茎提取，以重量百分比计，总碱含量80％以上，其中含有原阿片碱(protopine)35-70％、比枯枯灵(bicuculline)≤5％、延胡索乙素(tetrahydropalmatine)、巴马丁(palmatine)、罂粟碱、二氢比枯枯灵、球紫堇碱、空褐鳞碱等。
为有效控制伏生紫堇总碱、原阿片碱、比枯枯灵含量，本发明建立以下含量测定方法。
采用高效液相色谱法测定其原阿片碱的含量色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色谱柱(美国)检测波长290nm，流速1.0ml/min，柱温30℃流动相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)测定时精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20□l，注入高效液相色谱仪，测定即得原阿片碱的含量。
采用高效液相色谱法测定其比枯枯灵的含量仪器设备高效液相色谱仪LC-10ATvp泵、SPD-10Avp检测器(日本岛津公司)；紫外分光光度计UV-1700(日本岛津公司)；2010色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究院)；超声波清洗器CQ-10(广州明珠电器有限公司)测定方法色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色谱柱(美国)检测波长225nm，流速1.0ml/min，柱温30℃流动相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)测定时精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20□l，注入高效液相色谱仪，测定即得比枯枯灵的含量。
采用UV法测定总生物碱的含量仪器设备紫外分光光度计UV-1700(日本岛津公司)；超声波清洗器CQ-10(广州明珠电器有限公司)测定时精密吸取供试品溶液适量，按标准曲线制备项下的方法依法操作，照中国药典2000年版一部附录VB分光光度法试验，在415nm波长处扫描(以相应的溶液为空白)，测定最大吸收度，从相应的标准曲线上读取总生物碱的量。
伏生紫堇总碱的制备方法(1)以伏生紫堇块茎为原料，加入2-20倍的极性溶剂渗漉提取，或强制回流提取，收集提取液至无生物碱反应，合并提取液，用碱液调PH至6-7，浓缩至适量，得到提取浓缩液；(2)把上述步骤得到的提取浓缩液进行大孔树脂吸附层析，以温度40℃以上的1-8mol/l强碱溶液洗涤，用量为柱体积的1-10倍，再50-60％的乙醇溶液洗涤去杂及剧毒性成分比枯枯灵。
(3)以极性洗脱液洗脱伏生紫堇生物碱，收集洗脱液，回收溶剂，浓缩至小体积。
(4)用碱液调PH值至碱性，析出沉淀，滤取沉淀，饱和食盐水洗至中性，干燥。
(5)沉淀用有机溶剂溶解，过滤，滤液回收溶剂至小体积，放置析晶，滤取结晶干燥，即得伏生紫堇总碱。
其中步骤(1)中所用极性溶剂选自1-10％的磷酸、盐酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸溶液，或75-95％的乙醇或甲醇溶液；更好的极性溶剂选用2-3％的磷酸；其中步骤(2)中所用大孔吸附树脂为D101A、DM201、DM301、D301中的一种。
其中步骤(3)中所用的用于洗脱伏生紫堇碱的极性洗脱液酸水为0.1-10％的盐酸、磷酸、乳酸、琥珀酸溶液或浓度为60-95％酸性乙醇或酸性甲醇溶液。
其中步骤(4)中所用碱液是浓度为5-20％的NaOH或KOH溶液。
其中步骤(5)中所用有机溶剂是氯仿或≤C4低级脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯。
含有伏生紫堇总碱的药物组合物
采用本方法提取得到的伏生紫堇总碱，填加常规药用赋形剂，即可制成口服、注射剂型。
一种注射用伏生紫堇总碱冻干粉针的制备方法为1)伏生紫堇总碱冻干粉针处方组成伏生紫堇总碱1～5g，加0.5～10％(重量百分比)酸溶液5～10ml(选自盐酸、磷酸、乳酸或琥珀酸)，赋形剂20～5000g(选自甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖或氯化钠中的一种或两种或两种以上)，加注射用水适量制成1000ml。
最佳配方为伏生紫堇总碱2g，1％酸(磷酸)溶液10ml，甘露醇50g，加注射用水适量制成1000ml。
2)制备工艺取伏生紫堇总碱提取物，用酸溶液溶解，加注射用水适量，搅拌使充分溶解，另取甘露醇加入适量注射用水中搅拌溶解后，合并两溶液，混均用1％NaOH溶液调PH至3～5，再加适量注射用水并定容至1000ml，加入适量针用活性炭搅拌煮沸30min，微孔滤膜分级滤过，滤液定量无菌分装于经无菌处理好的管制抗生素玻璃瓶中，真空冷冻干燥，加塞、轧盖即得。每瓶规格为1mg或2mg。
本发明还提出一种伏生紫堇总碱在制备治疗和预防缺血性脑血管疾病药物中的应用。
1、注射用伏生紫堇总碱对大鼠局灶性脑缺血的影响试验用电凝法阻断大鼠脑中动脉，造成局灶性脑缺血模型，静脉给药，观察注射用伏生紫堇总碱对局灶性脑缺血的治疗作用。结果表明，与模型组比较，注射用伏生紫堇总碱组大鼠梗塞灶明显缩小，脑梗塞后动物的神经行为障碍明显减轻，血清SOD活性明显增强，病理学检查表明给药组大鼠脑水肿明显减轻，神经组织病变明显改善。说明注射用伏生紫堇总碱对大鼠局灶性脑缺血有治疗作用。
2、注射用伏生紫堇总碱对大鼠全脑缺血的影响试验用结扎双侧颈总动脉合并放血降低血压的方法，造成大鼠全脑缺血模型，观察注射用伏生紫堇总碱对大鼠脑指数、脑含水量的影响。结果表明，静脉注射该药后，大鼠脑指数、脑含水量明显降低，与模型组比较差异显著(p＜0.05-0.01)。说明注射用伏生紫堇总碱对大鼠脑缺血有保护作用。
3、注射用伏生紫堇总碱对麻醉犬脑血流量的影响本试验以颈内动脉血流量为主要观测指标，观察注射用伏生紫堇总碱对动物脑血流量的影响。结果表明，注射用伏生紫堇总碱可显著增加犬脑血流量，降低脑血管阻力，对动脉血压、心率、心电图无明显影响。
4、注射用伏生紫堇总碱对小鼠急性脑缺血的影响试验用断送法造成小鼠急性脑缺血模型，观察药物的作用。试验结果表明，静脉给予注射用伏生紫堇总碱后，小鼠呼吸时间明显延长。提示该药对急性脑缺血有保护作用。
5、注射用伏生紫堇总碱对小鼠软脑膜微循环的影响试验通过注射15％高分子右旋糖酐造成大鼠软脑膜微循环障碍，观察注射用伏生紫堇总碱对大鼠微循环障碍的影响。结果表明，注射用伏生紫堇总碱静脉注射给药后0.4mg/kg、0.2mg/kg组在所观察10、20、30min时间点均可明显增加血液流速，改善血液流态，0.1mg/kg组在30min有明显改善血液流速和流态作用，呈现出一定的量效关系。提示注射用伏生紫堇总碱具有改善大鼠软脑膜微循环障碍的作用。
6、注射用伏生紫堇总碱对家兔血小板聚集的影响试验采用Born氏比浊法，观察注射用伏生紫堇总碱对家兔血小板聚集的影响。结果表明连续3天给家兔耳缘静脉注射给药，注射用伏生紫堇总碱明显降低二磷酸腺苷(ADP)和胶原诱导的家兔血小板聚集率(P＜0.05～0.01)，对花生四烯酸(AA)诱导的家兔血小板聚集率有降低趋势。提示注射用伏生紫堇总碱具有抑制血小板聚集的作用。
7、注射用伏生紫堇总碱对大鼠体外血栓形成及血液粘度的影响试验观察注射用伏生紫堇总碱对大鼠体外血栓形成及血液粘度的影响。结果表明大鼠连续3天尾静脉注射给药，注射用伏生紫堇总碱可明显缩短血栓长度(P＜0.05～0.01)、明显减轻血栓湿重和干重(P＜0.01～0.001)；明显降低切变率30S-1和5S-1下的全血粘度(P＜0.05)。提示注射用伏生紫堇总碱具有抑制血栓形成、降低血液粘度的作用。
本发明采取1-10％酸水提取或75-95％乙醇、甲醇提取，大孔吸附树脂吸附，40℃以上5％左右的碱液洗脱去除比枯枯灵和杂质后，制得一纯度较高的伏生紫堇总碱。它们可有效地除去氨基酸及糖类、鞣质等杂质，特别是降低有毒成分比枯枯灵的含量，明显提高了伏生紫堇总碱的纯度，本发明的方法制备所得的伏生紫堇总生物碱均无氨基酸和游离糖及鞣质反应，采用UV法及HPLC法测得其含量≥80％；其薄层色谱图均可见与对照品原原阿片碱、延胡索乙素、巴马丁、罂粟碱、二氢比枯枯灵、球紫堇碱等相应位置轮廓清晰的斑点，比枯枯灵碱≤5％，提示本发明的伏生紫堇总碱纯度高，剧毒成分含量低，用药更安全，应用更广泛，且此法操作简便，易于掌握，是有效、可行的伏生紫堇总碱制备方法。
图1和图2是表明本发明(实施例1)总生物碱有效成份存在的指纹图，其中图1是伏生紫堇总碱薄层色谱，图2是高效液相HPLC指纹图。
图1中1-原阿片碱，2-比枯枯灵，3-延胡索乙素，4-伏生紫堇总碱，5-巴马丁，6-二氢比枯枯灵，7-球紫堇碱.
薄层色谱条件吸附剂硅胶G板；展开剂环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(16∶3∶1)；显色剂碘化铋钾试液图2中a-原阿片碱，b-巴马丁，c-比枯枯灵，d-延胡索乙素，e-球紫堇碱，f-二氢比枯枯灵液相色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙睛-甲醇-0.1％磷酸溶液(15∶10∶75)，用三乙胺调pH3.0。
检测波长282nm色谱峰结果
具体实施例方式
实施例1 制备伏生紫堇总碱(1)取1千克伏生紫堇块茎生药粗粉，加2％的磷酸溶液3千克浸泡过夜，装入渗滤筒，用2％的磷酸溶液渗滤，收集渗滤液至生物碱反应呈阴性反应为止。渗滤液用10％的氢氧化钠调PH值至6左右，浓缩至1克生药/毫升即可。以备分离用；(2)取浓缩液，上柱床体积为2000毫升的大孔吸附树脂DM301，以45℃2N NaOH的溶液(2000-4000ml)洗涤至色浅，再用蒸馏水(5000-10000ml)洗至中性。再改用50％乙醇(1000-3000ml)洗涤至无比枯枯灵下来；(3)再用含0.3％的磷酸的95％乙醇洗脱(2000-3000ml)，收集洗脱液洗至生物碱反应为阴性即可，洗脱液回收乙醇至无醇；(4)用10％的氢氧化钠溶液调PH至12左右，并加NaCl使成饱和食盐水溶液，放置使完全沉淀，收集沉淀，饱和食盐水溶液至中性，干燥粉碎。
(5)用粗品量4-8倍的无水乙醇精制，即得伏生紫堇总碱精品。
精密称取原阿片碱对照品10.0mg，置10ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(1.0mg/ml)，精密量取2ml至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述对照品溶液1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，分别置100ml具塞锥形瓶中，水浴挥干甲醇。依次精密加入溴钾酚绿溶液2.0ml及醋酸-醋酸钠缓冲溶液5.0ml，75℃水浴加热30分钟，放冷，精密加入三氯甲烷10ml，具塞。强力振摇2分钟，放置5分钟，移至分液漏斗中，稍放置使分层，取三氯甲烷液，通过一装有2g无水硫酸钠的小漏斗。取三氯甲烷液，照中国药典2000年版一部附录VB分光光度法试验，进行光谱扫描(狭缝2.0，中速扫描)。以相应的溶液为空白。结果对照品溶液在415nm波长处有最大吸收。以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。
取本品约17mg，精密测定，置100ml量瓶中，加50％甲醇超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，精密量取上述供试品溶液0.50ml，置100ml具塞锥形瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“依次加入溴钾酚绿溶液2.0ml”起，依法在415nm波长处测定吸收度，从标准曲线读取生物碱的量，计算，即得伏生紫堇总生物碱含量为85.6％。
用高效液相色谱法选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色谱柱(美国)检测波长290nm，流速1.0ml/min，柱温30℃流动相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)测定原阿片碱含量取本品约40mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，得原料供试品溶液。精密称取原阿片碱对照品5.00mg，置25ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，再取5ml溶液至50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得对照品溶液为(20μg/ml)。分别取上述溶液各20ul进样，记录色谱图，计算即得原阿片碱含量为38.1％。
用高效液相色谱法选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色谱柱(美国)检测波长225nm，流速1.0ml/min，柱温30℃流动相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)测定比枯枯灵含量取本品约40mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得原料供试品溶液.精密称取比枯枯灵对照品6.00mg，置10ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得比枯枯灵储备溶液(0.6mg/ml)；精密量取储备溶液1ml至100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(6μg/ml)。分别取上述溶液各20ul进样，记录色谱图，计算即得比枯枯灵含量为3.6％。
实施例2 制备伏生紫堇总碱将实施例1中步骤(1)所用极性溶剂改用2％的盐酸溶液，其他步骤(2)、(3)、(4)、(5)完全同实施例1。
按实施例1中含量测定方法测定计算得伏生紫堇总生物碱为84.2％，原阿片碱含量为35.6％，比枯枯灵含量为4.5％
实施例3 制备伏生紫堇总碱将实施例1中步骤(1)所用极性溶剂改用2％的硫酸溶液，其他步骤(2)、(3)、(4)、(5)完全同实施例1。
按实施例1中含量测定方法测定计算得伏生紫堇总生物碱为82.5％，原阿片碱含量为35.7％，比枯枯灵含量为4.8％实施例4 制备伏生紫堇总碱将实施例1中步骤(1)所用极性溶剂改用2％的醋酸溶液，其他步骤(2)、(3)、(4)、(5)完全同实施例1。
按实施例1中含量测定方法测定计算得伏生紫堇总生物碱为83.4％，原阿片碱含量为35.1％，比枯枯灵含量为4.6％实施例5 制备伏生紫堇总碱步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同实施例2，其中步骤(2)中的大孔吸附树脂改用DM201。
按实施例1中含量测定方法测定计算得伏生紫堇总生物碱为79.5％，原阿片碱含量为33.8％，比枯枯灵含量为5.1％。
实施例6 制备伏生紫堇总碱步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同实施例4，其中步骤(2)中的大孔吸附树脂改用D101A。
按实施例1中含量测定方法测定计算得伏生紫堇总生物碱为79.1％，原阿片碱含量为31.5％，比枯枯灵含量为4.2％。
实施例7 制备伏生紫堇总碱步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同实施例1，其中步骤(2)中的大孔吸附树脂改用D301。
按实施例1中含量测定方法测定计算得伏生紫堇总生物碱为80.9％，原阿片碱含量为36.3％，比枯枯灵含量为4.9％实施例8 制备伏生紫堇总碱步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同实施例1，其中步骤(1)中的极性溶剂改用95％的乙醇溶液，步骤(2)中的大孔吸附树脂改用DM201。
按实施例1中含量测定方法测定计算得伏生紫堇总生物碱为75.3％，原阿片碱含量为31.4％，比枯枯灵含量为4.2％。
实施例9 制备伏生紫堇总碱步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同实施例8，其中步骤(1)中的极性溶剂改用95％的甲醇溶液。
按实施例1中含量测定方法测定计算得伏生紫堇总生物碱为74.8％，原阿片碱含量为32.6％，比枯枯灵含量为4.3％。
实施例10 注射用伏生紫堇总碱制备及含量测定伏生紫堇总碱(实施例1) 2克甘露醇 100g制成1000瓶制法取伏生紫堇总碱提取物2g，用1％HCI溶液溶解，加注射用水适量，搅拌使充分溶解，另取甘露醇100g加入适量注射用水中搅拌溶解后，合并两溶液，混均用1％NaOH溶液调PH至3～5，再加适量注射用水并定容至1000ml，加入适量针用活性炭搅拌煮沸30min。微孔滤膜分级滤过，滤液定量无菌分装于经无菌处理好的安瓿中。冻干、加塞、轧盖即得。每瓶规格为2mg。同样的制备方法，在合理调整处方的情况下制得每瓶规格为1mg。
含量测定总生物碱精密称取原阿片碱对照品10.0mg，置10ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(1.0mg/ml)，精密量取2ml至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述对照品溶液1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，分别置100ml具塞锥形瓶中，水浴挥干甲醇。依次精密加入溴钾酚绿溶液2.0ml及醋酸-醋酸钠缓冲溶液5.0ml，75℃水浴加热30分钟，放冷，精密加入三氯甲烷10ml，具塞。强力振摇2分钟，放置5分钟，移至分液漏斗中，稍放置使分层，取三氯甲烷液，通过一装有2g无水硫酸钠的小漏斗。取三氯甲烷液，照中国药典2000年版一部附录VB分光光度法试验，进行光谱扫描(狭缝2.0，中速扫描)。以相应的溶液为空白。结果对照品溶液在415nm波长处有最大吸收。以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。
取本品数瓶，研细，取约0.2g，精密测定，置100ml量瓶中，加50％甲醇超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，精密量取上述供试品溶液0.50ml，置100ml具塞锥形瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“依次加入溴钾酚绿溶液2.0ml”起，依法在415nm波长处测定吸收度，从标准曲线读取生物碱的量，计算，即得伏生紫堇总生物碱含量为85.1％。
原阿片碱选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色谱柱(美国)检测波长290nm，流速1.0ml/min，柱温30℃流动相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定制剂中原阿片碱含量取本品数瓶，研匀，取约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，得原料供试品溶液。精密称取原阿片碱对照品5.00mg，置25ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，再取5ml溶液至50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得对照品溶液为(20μg/ml)。分别取上述溶液各20ul进样，记录色谱图，计算即得原阿片碱含量为36.8％。
比枯枯灵选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色谱柱(美国)检测波长225nm，流速1.0ml/min，柱温30℃流动相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定制剂中比枯枯灵含量取本品数瓶，研匀，取约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得原料供试品溶液.精密称取比枯枯灵对照品6.00mg，置10ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得比枯枯灵储备溶液(0.6mg/ml)；精密量取储备溶液1ml至100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(6μg/ml)。分别取上述溶液各20ul进样，记录色谱图，计算即得比枯枯灵含量为3.8％。
实施例11(注射用伏生紫堇总碱制备及含量测定)伏生紫堇总碱(实施例1)1克(2g)甘露醇 50克制成 1000瓶制法取伏生紫堇总碱提取物2g，用1％H3PO4溶液溶解，加注射用水适量，搅拌使充分溶解，另取甘露醇50g加入适量注射用水中搅拌溶解后，合并两溶液，混均用1％NaOH溶液调PH至3～5再加适量注射用水并定容至1000ml，加入适量针用活性炭搅拌煮沸30min。微孔滤膜分级滤过，滤液定量无菌分装于经无菌处理好的安瓿中。冻干加塞、轧盖即得。每瓶规格为1mg或2mg。
含量测定总生物碱精密称取原阿片碱对照品10.0mg，置10ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(1.0mg/ml)，精密量取2ml至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述对照品溶液1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，分别置100ml具塞锥形瓶中，水浴挥干甲醇。依次精密加入溴钾酚绿溶液2.0ml及醋酸-醋酸钠缓冲溶液5.0ml，75℃水浴加热30分钟，放冷，精密加入三氯甲烷10ml，具塞。强力振摇2分钟，放置5分钟，移至分液漏斗中，稍放置使分层，取三氯甲烷液，通过一装有2g无水硫酸钠的小漏斗。取三氯甲烷液，照中国药典2000年版一部附录V B分光光度法试验，进行光谱扫描(狭缝2.0，中速扫描)。以相应的溶液为空白。结果对照品溶液在415nm波长处有最大吸收。以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。
取本品数瓶，研细，取约0.2g，精密测定，置100ml量瓶中，加50％甲醇超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，精密量取上述供试品溶液0.50ml，置100ml具塞锥形瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“依次加入溴钾酚绿溶液2.0ml”起，依法在415nm波长处测定吸收度，从标准曲线读取生物碱的量，计算，即得伏生紫堇总生物碱含量为86.3％。
原阿片碱选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色谱柱(美国)检测波长290nm，流速1.0ml/min，柱温30℃流动相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定制剂中原阿片碱含量取本品数瓶，研匀，取约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，得原料供试品溶液。精密称取原阿片碱对照品5.00mg，置25ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，再取5ml溶液至50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得对照品溶液为(20μg/ml)。分别取上述溶液各20ul进样，记录色谱图，计算即得原阿片碱含量为37.6％。
比枯枯灵选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂AichromBond-AQ C185□m(4.6×150mm)色谱柱(美国)检测波长225nm，流速1.0ml/min，柱温30℃流动相乙腈-0.1％三氟醋酸(24∶76)照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定制剂中比枯枯灵含量取本品数瓶，研匀，取约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得原料供试品溶液.精密称取比枯枯灵对照品6.00mg，置10ml量瓶中，加流动相超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得比枯枯灵储备溶液(0.6mg/ml)；精密量取储备溶液1ml至100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(6μg/ml)。分别取上述溶液各20ul进样，记录色谱图，计算即得比枯枯灵含量为3.7％。
实施例12小鼠尾静脉注射及腹腔注射注射用伏生紫堇急性毒性试验摘要本实验研究了小鼠尾静脉注射及腹腔注射注射用伏生紫堇的急性毒性。结果表明小鼠尾静脉注射注射用伏生紫堇的LD50为6.889mg/kg，95％的可信限是6.475～7.315mg/kg；小鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50为48.015mg/kg，95％的可信限是44.886～51.332mg/kg。
目的观察小鼠尾静脉注射和腹腔注射注射用伏生紫堇后，所产生的急性毒性反应及死亡情况，测定LD50值，为临床应用提供安全性依据。
1 实验材料1.1 动物NIH小鼠120只，雌雄各半，广东省卫生厅实验动物中心提供，合格证号SCXK(粤)2003-0002，粤监证字2005A011。
1.2 药物注射用伏生紫堇，来源于实施例10，试验前用生理盐水稀释至所需浓度。注射用生理盐水，广西裕源药业有限公司，批号C20050520。
2.方法2.1 尾静脉给药急性毒性取体重18～22g NIH小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，即I、II、III、IV、V组(剂量分别为10.00mg/kg，8.50mg/kg，7.22mg/kg，6.14mg/kg，5.22mg/kg)和空白对照组，每组10只。尾静脉注射给药，给药容量均为0.2ml/10g体重，空白对照组给等容量的生理盐水。给药后观察小鼠体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等，观察时间14天。对濒死及死亡动物及时进行尸检，其他动物在观察期结束之后进行尸检，观察内脏器官体积、颜色及质地有无改变，若有肉眼可见病变需进行病理组织学检查。
2.2 腹腔注射给药急性毒性取体重18～22g NIH小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组，即I、II、III、IV、V组(剂量分别为60.00mg/kg，54.00mg/kg，48.60mg/kg，43.74mg/kg，39.37mg/kg)和空白对照组，每组10只。腹腔注射给药，给药容量均为0.2ml/10g体重，空白对照组给等容量的生理盐水。给药后观察小鼠体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等，观察时间14天。对濒死及死亡动物及时进行尸检，其他动物在观察期结束之后进行尸检，观察内脏器官体积、颜色及质地有无改变，若有肉眼可见病变需进行组织病理学检查。
3 数据处理数据统计采用新药统计软件(NDST，5.1版本)处理，Bliss法计算LD50及95％的可信限。
4 结果4.1 尾静脉给药急性毒性小鼠尾静脉注射注射用伏生紫堇后，可见剂量相关性活动减少、竖毛、舔足、前肢互相摩擦、呼吸急促、流涎、小便失禁、惊厥、抽搐、肌肉强直性收缩、最后出现跳跃性死亡，动物死亡开始于给药后5秒，动物死亡大多发生于给药后1min以内。动物中毒反应和死亡率与性别无明显相关。生理盐水组小鼠未见明显异常。死亡动物及观察期结束处死动物经尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑等器官，未见明显病理改变。结果见表1。
表1注射用伏生紫堇尾静脉注射给药急性毒性实验结果
LD50为6.889mg/kg，95％的可信限是6.475～7.315mg/kg；4.2 腹腔注射给药急性毒性小鼠腹腔注射注射用伏生紫堇后，可见剂量相关性活动减少、竖毛、舔足、前肢互相摩擦、呼吸急促、流涎、小便失禁、惊厥、抽搐、跳跃性死亡，动物死亡开始于给药后2分钟，动物死亡大多发生于给药后1小时以内。动物中毒反应和死亡率与性别无明显相关。生理盐水组小鼠未见明显异常。死亡动物及观察期结束处死动物经尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑等器官，未见明显病理改变。结果见表2。
表2注射用伏生紫堇腹腔注射给药急性毒性实验结果
LD50为48.015mg/kg，95％的可信限是44.886～51.332mg/kg。
5 结果分析5.1 小鼠尾静脉注射注射用伏生紫堇的LD50为6.889mg/kg，按公斤体重计算，相当于70kg成人每日用量(0.057mg/kg)的120倍以上。
5.2 小鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50为48.015mg/kg，按公斤体重计算，相当于70kg成人每日静脉给药量(0.057mg/kg)的842倍以上。
6 结论小鼠尾静脉注射注射用伏生紫堇的LD50为6.889mg/kg，95％的可信限是6.475～7.315mg/kg；小鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50为48.015mg/kg，95％的可信限是44.886～51.332mg/kg。
参考文献1.国家食品药品监督管理局药品审评中心.中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则.2005.32.王北婴，李仪奎.中药新药研制开发技术与方法.上海上海科学技术出版社，2002788～790.
3.中华人民共和国卫生部药政管理局.中药新药研究指南.1993203.
实施例13、大鼠尾静脉注射及腹腔注射注射用伏生紫堇急性毒性试验摘要本实验研究了大鼠尾静脉注射及腹腔注射注射用伏生紫堇的急性毒性。结果表明大鼠尾静脉注射注射用伏生紫堇的LD50为8.617mg/kg，95％的可信限是8.258～9.104mg/kg；大鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50为55.079mg/kg，95％的可信限是52.302～58.733mg/kg。
目的观察大鼠尾静脉注射和腹腔注射注射用伏生紫堇后，所产生的急性毒性反应及死亡情况，测定LD50值，为临床应用提供安全性依据。
1 实验材料1.1 动物SD大鼠120只，雌雄各半，广东省卫生厅实验动物中心提供，合格证号SCXK(粤)2003-0002，粤监证字2005A010。
1.2 药物注射用伏生紫堇，来源于实施例10，试验前用生理盐水稀释至所需浓度。注射用生理盐水，广西裕源药业有限公司，批号C20050520。
2.方法2.1 尾静脉给药急性毒性取体重130～150g SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，即I、II、III、IV、V组(剂量分别为12.00mg/kg，9.60mg/kg，7.68mg/kg，6.14mg/kg，4.92mg/kg)和空白对照组，每组10只。尾静脉注射给药，给药容量均为0.5ml/100g体重，空白对照组给等容量的生理盐水。给药后观察大鼠体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等，观察时间14天。对濒死及死亡动物及时进行尸检，其他动物在观察期结束之后进行尸检，观察内脏器官体积、颜色及质地有无改变，若有肉眼可见病变需进行病理组织学检查。
2.2 腹腔注射给药急性毒性取体重130～150g SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，即I、II、III、IV、V组(剂量分别为70.00mg/kg，59.50mg/kg，50.58mg/kg，42.99mg/kg，36.54mg/kg)和空白对照组，每组10只。腹腔注射给药，给药容量均为0.5ml/100g体重，空白对照组给等容量的生理盐水。给药后观察大鼠体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等，观察时间14天。对濒死及死亡动物及时进行尸检，其他动物在观察期结束之后进行尸检，观察内脏器官体积、颜色及质地有无改变，若有肉眼可见病变需进行组织病理学检查。
3 数据处理数据统计采用新药统计软件(NDST，5.1版本)处理，Bliss法计算LD50及95％的可信限。
4 结果
4.1 尾静脉给药急性毒性大鼠尾静脉注射注射用伏生紫堇后，可见剂量相关性活动减少、竖毛、舔足、前肢互相摩擦、呼吸急促、流涎、眼眶出血、小便失禁、惊厥、抽搐、肌肉强直性收缩、最后出现跳跃性死亡，动物死亡开始于给药后25秒，动物死亡大多发生于给药后30分钟以内。动物中毒反应和死亡率与性别无明显相关。生理盐水组大鼠未见明显异常。死亡动物及观察期结束处死动物经尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑等器官，未见明显病理改变。结果见表1。
表1 注射用伏生紫堇大鼠尾静脉注射给药急性毒性实验结果
LD50为8.617mg/kg，95％的可信限是8.258～9.104mg/kg；4.2 腹腔注射给药急性毒性大鼠腹腔注射注射用伏生紫堇后，可见剂量相关性活动减少、竖毛、舔足、前肢互相摩擦、呼吸急促、流涎、眼眶出血、小便失禁、惊厥、抽搐、跳跃性死亡，动物死亡开始于给药后5分钟，动物死亡大多发生于给药后1小时以内。动物中毒反应和死亡率与性别无明显相关。生理盐水组大鼠未见明显异常。死亡动物及观察期结束处死动物经尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑等器官，未见明显病理改变。结果见表2。
表2注射用伏生紫堇大鼠腹腔注射给药急性毒性实验结果
LD50为55.079mg/kg，95％的可信限是52.302～58.733mg/kg。
5 结果分析5.1 大鼠尾静脉注射注射用伏生紫堇的LD50为8.617mg/kg，按公斤体重计算，相当于70kg成人每日用量(0.057mg/kg)的150倍以上。
5.2 大鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50为55.079mg/kg，按公斤体重计算，相当于70kg成人每日静脉给药量(0.057mg/kg)的966倍以上。
6 结论大鼠尾静脉注射注射用伏生紫堇的LD50为8.617mg/kg，95％的可信限是8.258～9.104mg/kg；大鼠腹腔注射注射用伏生紫堇的LD50为55.079mg/kg，95％的可信限是52.302～58.733mg/kg。
参考文献1.国家食品药品监督管理局药品审评中心.中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则.2005.32.王北婴，李仪奎.中药新药研制开发技术与方法.上海上海科学技术出版社，2002788～790.
3.中华人民共和国卫生部药政管理局.中药新药研究指南.1993203.
权利要求
1.一种伏生紫堇总碱，由伏生紫堇干燥块茎提取，其特征是以重量百分比计，总碱含量80％以上，其中含有原阿片碱(protopine)35-70％、比枯枯灵(bicuculline)≤5％、延胡索乙素(tetrahydropalmatine)、巴马丁(palmatine)、罂粟碱、二氢比枯枯灵、球紫堇碱、空褐鳞碱等。
2.一种伏生紫堇总碱的制备方法，其特征是(1)以伏生紫堇块茎为原料，加入2-20倍的极性溶剂渗漉提取，或强制回流提取，收集提取液至无生物碱反应，合并提取液，用碱液调PH至6-7，浓缩至适量，得到提取浓缩液；(2)把上述步骤得到的提取浓缩液进行大孔树脂吸附层析，以温度40℃以上的1-8mol/l强碱溶液洗涤，用量为柱体积的1-10倍，再用50-60％乙醇溶液洗涤去杂及剧毒性成分比枯枯灵；(3)以极性洗脱液洗脱伏生紫堇生物碱，收集洗脱液，回收溶剂，浓缩至小体积；(4)用碱液调PH值至碱性，析出沉淀，滤取沉淀，饱和食盐水洗至中性，干燥；(5)沉淀用有机溶剂乙醇或甲醇溶解，过滤，滤液回收溶剂至小体积，放置析晶，滤取结晶干燥，即得伏生紫堇总碱。
3.根据权利要求2所述的伏生紫堇总碱的制备方法，其特征是步骤(1)中所用极性溶剂选自1-10％的磷酸、盐酸、柠檬酸、酒石酸或琥珀酸溶液，或75-95％的乙醇或甲醇溶液。
4.根据权利要求2所述的伏生紫堇总碱的制备方法，其特征是步骤(2)中所用大孔吸附树脂为D101A、DM201、DM301、D301中的一种。
5.根据权利要求2所述的伏生紫堇总碱的制备方法，其特征是步骤(3)中所用的用于洗脱伏生紫堇总碱的极性洗脱液酸水为0.1-10％的盐酸、磷酸、乳酸或琥珀酸溶液，或浓度为60-95％的酸性乙醇或酸性甲醇溶液。
6.根据权利要求2所述的伏生紫堇总碱的制备方法，其特征是步骤(4)中所用碱液是浓度为5-20％的NaOH或KOH溶液。
7.根据权利要求2所述的伏生紫堇总碱的制备方法，其特征是步骤(5)中所用有机溶剂是氯仿或≤C4低级脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯。
8.一种含有伏生紫堇总碱的药物组合物，其特征是填加常规药用赋形剂，即可制成口服、注射剂型。
9.一种含有伏生紫堇总碱的药物组合物，其特征是伏生紫堇总碱冻干粉针，处方组成伏生紫堇总碱1～5g，0.5～10％盐酸、磷酸、乳酸或琥珀酸溶液5～10ml，赋形剂甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖或氯化钠中的一种或两种或两种以上20～5000g，加注射用水适量制成1000ml。
10.根据权利要求9所述的含有伏生紫堇总碱的药物组合物，其特征是伏生紫堇总碱2g，1％磷酸溶液10ml，甘露醇50g，加注射用水适量制成1000ml。
11.根据权利要求9所述的含有伏生紫堇总碱药物组合物的制备方法，其特征是取伏生紫堇总碱提取物，用酸溶液溶解，加注射用水适量，搅拌使充分溶解，另取甘露醇加入适量注射用水中搅拌溶解后，合并两溶液，混均用1％NaOH溶液调PH至3～5，再加适量注射用水并定容，加入适量针用活性炭搅拌煮沸30分钟，微孔滤膜分级滤过，滤液定量无菌分装于经无菌处理好的管制抗生素玻璃瓶中，真空冷冻干燥，加塞、轧盖即得。
全文摘要
本发明涉及一种伏生紫堇总碱及其制备方法和其药物组合物，以及在制备治疗和预防急性脑缺血药物中的应用。伏生紫堇总碱由伏生紫堇干燥块茎提取，其特征是以重量百分比计，总碱含量80％以上，其中含有原阿片碱(protopine)35－70％、比枯枯灵(bicuculline)≤5％、延胡索乙素(tetrahydropalmatine)、巴马丁(palmatine)、罂粟碱、二氢比枯枯灵、球紫堇碱、空褐鳞碱等。该方法可有效地除去氨基酸及糖类、鞣质等杂质，特别是降低有毒成分比枯枯灵的含量，明显提高伏生紫堇总碱的纯度。
文档编号A61P9/10GK1785261SQ200510012978
公开日2006年6月14日 申请日期2005年11月15日 优先权日2005年11月15日
发明者夏彤, 魏兵, 黄国胜, 胡竹梅, 王海强 申请人:河北智源医药科技有限公司, 石家庄华康制药有限公司