异哇啉类生物碱作为预防及治疗宫颈癌药物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种异喹啉类生物碱及其用途，属于天然药物提取物及药学应用技术 领域。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是全世界导致妇女死亡的最主要恶性肿瘤之一，近年来发病率呈明显上升 趋势，发病年龄亦趋于年经化。人乳头瘤状病毒(HPV)感染是导致宫颈癌发病的主要高危因 素，它存在两种编码的亚型嵌合蛋白，即E6和E7，可以促进细胞增殖影响宿主，调控各种相 关蛋白的变化，研究发现，异紫堇碱处理宫颈癌Siha细胞后能诱导Caspase 14表达的上调， 具有时间与剂量依赖性。近年来研究发现，HPV16亚型感染是激发宫颈上皮恶性转化的最主 要因素，HPV16导致宫颈癌的主要致病机理是HPV基因整合到宿主细胞DNA中，其中HPV16E6 的作用非常关键。CaspaseH表达上调抑制了HPVE6的表达，进而抑制其功能，以期为宫颈癌 的早期诊断提供生物标志物。
[0003] 异紫堇定碱，也称异紫堇碱，英文名称：
[0004] 1,2,l〇-trimethoxy-6-methy1-5,6,6a,7-tetrahydr〇-4H-dibenzo[de,g] quinolin-ll-〇l
[0007] 目前，尚未人开发出异紫堇定碱于HPV抑制中的应用。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种异紫堇定碱的新用途， 即作为HPV抑制剂的应用。
[0009] 本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：
[0010] 异紫堇定碱作为HPV抑制剂的应用。
[0011] 进一步的，本发明异紫堇定碱作为HPV抑制剂的应用，利用异紫堇定碱激发 Caspas e 14蛋白表达的上调，从而抑制了 HPVE6的表达。
[0012] 优选的，所述异紫堇定碱为原形或药物可接受的盐或酯形式。
[0013] 进一步优选的，所药物为可接受的盐为药物可接受的无机酸盐。
[0014] 进一步优选的，所述药物可接受的无机酸盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、碳酸 盐、碳酸氢盐、马来酸盐。
[0015] 优选的，所述药物可接受的酯为具有1-6个碳原子的直链烷基酯，或含有3或6个碳 原子的支链烷基酯，或苄基酯。
[0016]进一步优选的，所述药物可接受的酯为甲基酯、乙基酯、丙基酯、丁基酯、2-甲基丙 基酯或1，1_二甲基乙基酯。
[0017]作为HPV抑制剂，异紫堇定碱为活性成分，异紫堇定碱日剂量为0.1至100mg/kg，优 选的日剂量是1 · 〇至l〇mg/kg。
[0018] 一种HPV抑制剂，其主要成分为异紫堇定碱的原形或药物可接受的盐或酯形式。
[0019] 进一步的，所述抑制剂为散剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮液剂、乳液剂、浆剂、酊 剂和醑剂或固液混合制剂。
[0020] 异紫堇定碱的优选的盐形式包括那些与本领域已知的药物可接受的无机和有机 酸所形成的盐。使用无机酸制得的盐形式包括治疗上可接受的卤酸盐及硫酸盐，例如盐酸 盐、马来酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐。
[0021] 异紫堇定碱的酯形式包括具有1-6个碳原子的直链烷基酯或含有3或6个碳原子的 支链烷基酯或苄基酯，包括甲基、乙基、丙基、丁基、2-甲基丙基和1，1_二甲基乙基酯。
[0022] 异紫堇定碱是HPV病毒抑制剂，用于在哺乳动物、优选人体中治疗、抑制、防止或预 防那些涉及HPV病毒感染的过程。
[0023] 治疗、抑制、防止或预防本发明所列出的不同动物每种疾病的方法是本发明的一 部分。每种方法包括给予需要治疗的哺乳动物有效治疗剂量的异紫堇定碱或其药物可接受 的盐或酯形式及各种药物载体赋形剂形式。
[0024] 上述组合为单独含有有效治疗剂量的异紫堇定碱或其药物可接受的盐或酯形式， 或者与一种或多种药物载体或赋形剂相混合形式。异紫堇定碱的治疗有效量是指异紫堇定 碱的量能充分抑制需治疗的哺乳动物中纤溶亢进，从而在相当程度上对所述症状提供改 善，进而防止、抑制或限制所述疾病或症状的病理基础。
[0025] 异紫堇定碱所使用的精确剂量取决于包括所给药对象、所治疗疾病的症状及严重 程度、给药方法及所使用的赋形剂等因素。可以通过任何常规途径给予所述化合物、其盐或 酯形式及含所述化合物、盐或酯形式的药物载体和赋形剂形式。给药形式包括口服给药、静 脉给药、皮肤给药、经肠道给药、外用给药。所给予的异紫堇定碱可以是游离的或以适当的 药物盐或酯的形式。异紫堇定碱在治疗纤溶亢进和出血性疾病时，可以以任何同纤溶酶接 触的方式起作用。它们可以以任何适用于给药的常规方式施用，或者作为单独的治疗剂型、 或者以治疗制剂的组合形式施用。它们可以单独施用，但优选与合适的药物载体或赋形剂 一起施用。药物载体是根据所选择的给药途径选择的，可使是固体、液体或固体和液体的混 合物。
[0026] 固体包括散剂、片剂、胶囊及纳米制剂。固体载体可以是一种或多种可以作为调味 剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、粘合剂或片剂崩解剂的物质。在散剂中，所述载体是精细粉碎 的固体，它与活性成分粉末混合。在片剂中，活性成分与具有必需的粘合特性载体以合适的 比例混合并压制成所需的形状和大小。明胶胶囊含有活性成分和粉末载体，例知乳糖、淀 粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁和硬脂酸等。类似地，可以使用稀释剂压片。可以将片剂和胶囊 制成缓释制剂，以持续数小时连续释放药物。压片可以用糖包衣或膜包衣，以掩盖令人不快 的味造和使片芯与空气播离，或者进行肠溶包衣以在胃肠道中选择性崩解。口服液体剂型 可以含有着色剂和矫味剂以增加患者的依从性。合适的固体载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石 粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、 低熔点蜡、可可脂等。薄膜衣、成囊材料、纳米材料也可以与本发明化合物及其盐或酯形式 一起使用。
[0027]无菌液体组合物包括溶液、悬浮液、乳液、浆剂、酊剂和醑剂。异紫堇定碱可溶于或 悬浮在药物可接受的载体中，例如灭菌注射用水。当异紫堇定碱充分可溶时，它们可直接溶 于使用或不适用合适的有机溶剂如聚乙二醇的生理盐水中。如果需要，异紫堇定碱可分散 在淀粉溶液、羧甲基纤维素钠水溶液或合适的环糊精水溶液中。为无菌溶液或悬浮液的液 体药物组合物，可以通过肌肉、皮下、皮内、腹腔、静脉注射使用。在许多情况下，可以使用液 体组合物形式代替固体口服给药方式。
[0028]优选配制所述化合物的单位剂型进行标准给药。可以将单位剂量配制成包装散 剂、管形瓶或安瓿，并优选为胶囊或片剂形式。活性化合物的日剂量可以根据具体药物的药 效特征、给药途径、患者的体重、年龄和性别、健康状况、疾病状态的性质和严重程度、同时 治疗的其他药物、治疗的频率以及通过对血液药物浓度分析和患者恢复情况及对治疗的反 应而做出相应调整。活性成分的日剂量是0.1至l〇〇mg/kg，优选的日剂量是约1.0至约10mg/ kg。适于给药的组合物剂型包含约lmg至约10mg活性成分/单位。在这些药物组合物中，活性 成分通常的含量占组合物总重量的0.5-95%。活性成分可以以固体剂型例如胶囊、片剂和 粉末的形式，还可以以无菌液体制剂给药。
[0029] 本发明的异紫堇定碱可通过下面的实验方法，确定异紫堇定碱抑制HPV病毒增殖 的能力：
[0030] 1.提取与分离
[0031] 取干燥秃疮花(5.0kg)粉碎，用95%乙醇提取3次(每次7天），减压回收溶剂，得浸 膏200.0g。浸膏混悬于2000ml 2%H2S〇4水溶液中，依次氯仿萃取部分FA(12g)，水溶液PH值 用氨水调制9，氯仿萃取，萃取物FB( 25g)，FB用硅胶25g拌样，500g硅胶上柱，氯仿/甲醇/三 乙胺（10:1:0.1到2:1:0.1)梯度洗脱，流速，10ml/min，薄层色谱检测，合并相同组分，得4个 组分，FBI (5000ml，4 · 0g，100:1)，FB2(4000ml，4 · 0g，50:1)，FB3 (5000ml，2 · 0g，25:1)和FB4 (30001111，3.58,5:1)小81以4(^硅胶，氯仿/甲醇/三乙胺20:1:0.1、10:1:0.1、8:1:0.1、6:1: 0.1为流动相，上柱洗脱，分别得到不同的异喹啉类生物碱化合物。
[0032] 2.基因芯片实验
[0033]原理：利用基因芯片实验检测不同浓度的异喹啉类生物碱异紫堇碱对Siha(携带 16HPV)细胞处理后差异基因表达谱改变，以寻找异紫堇碱抑制宫颈癌SiHa细胞HPV基因表 达的分子机理。
[0034] 步骤:SiHa细胞株生长到对数生长期，密度达80 %时用浓度为800ymol/L的异紫堇 碱处理，将样本分为四组，分别是:①未经异紫堇碱处理的SiHa细胞;②经异紫堇碱处理12 小时后的SiHa细胞;③:经异紫堇碱处理24小时后的SiHa细胞;④经异紫堇碱处理48小时后 的SiHa细胞。。分别以Trizol法裂解后收集样品，采用_GeneChip_?Human Transcriptome Array 2.0表达谱芯片筛选表达差异的mRNA。
[0035] 3.RT-PCR法观察基因表达的变化
[0036] 原理:可用于检测药物干预前后细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直 接克隆及特定基因的cDNA序列，以此来判断异紫堇定碱对HPV病毒的抑制作用。
[0037] 步骤：以5000个/孔将细胞种进96孔板中，培养24h后，弃去旧培养液，加入浓度为 800ymol/L的异紫堇定碱干预，分别培养1211，2411，4811，用扮 〇1^1?5的1?嫩提取试剂盒抽提总 RNA，首先，用枪头吸尽培养基，向各孔中加入125μ1*2的Buffer，再用枪头吸尽Cell AmpTM Washing Buffer，后向各孔中加50μ1的Processing溶液，反复吹打Processing液后，移至微 量离心管中，75°C水浴5min，分装得到的细胞裂解液，以便后续反转录实验，同时每组均设 定复孔。RNA(5yg)被反转录成cDNA 10μ1体系，其反转录体系包括：5XPrimeScript TM Buffer 2μ1,PrimeScript TM RT EnzymeMixIO.5μ1,01igo dT Primer(50yM)0.5μ1, Random 6mers 0.5yl,RNase Free dH20 4.5yl,cDNA 2μ1·反转录条件 37Γ?5π?η,85Γ5 秒。再以cDNA为模板进行特异性扩增，其扩增反应20μ1体系由：Tap酶10μ1 ,Forward primerO · 4μ1,Reverse primer 0.4yl,Rox0.4yl，ddH20 6 ·8μ1,and 2μ1 cDNA模板组成。需 要扩增目的基因的引物序列和退火温度由Table 1给出。β-actin被扩增作为对照，荧光实 时PCR反应结束后，由系统分析软件