循环内皮祖细胞与冠状动脉病变相关分析的制作方法

专利名称：：循环内皮祖细胞与冠状动脉病变相关分析的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学领域。更具体地涉及循环内皮祖细胞与冠状动脉病变(尤其是冠状动脉狭窄程度)之间的相关性。本发明还涉及基于该相关性检测冠状动脉病变的方法和试剂盒。
背景技术：
：冠状动脉病变是一种严重危害人们身体健康的疾病。自1997年Asahara等人首次在体外成功诱导人外周血CD34+细胞分化为内皮细胞以来(AsaharaT，MuroharaT，SullivanA.etal.Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis.Science1997；275964-7)，越来越多的证据表明成年骨髓中存在内皮祖细胞(EPCs)，当血管损伤时骨髓EPCs被动员至外周血，分化并整和到损伤部位，参与血管内皮修复过程。完整的血管内膜对维持血管张力和血管动态平衡起重要作用。多种危险因素通过氧化刺激引起内皮损伤，进而引起动脉粥样硬化(LibbyP，RidkerPM，MaseriA.Inflammationandatherosclerosis.Circulation2002；1051135-43)。近年文献报道循环EPCs可以修复损伤内膜(ShiQ，RaffiS，WuMH，etal.Evidenceforcirculatingbonemarrow-derivedendothelialcell.Blood1998；92362-7)。然而，虽然有人推测EPCs数量与内皮细胞功能、心血管危险因素有一定相关性，但在本发明之前，却从未证实过EPCs数量和功能与冠状动脉病变的相关性。综上所述，为了尽早预防和治疗冠状动脉病变，本领域迫切需要寻找冠状动脉病变的相关因素，并开发检测冠状动脉病变的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。
发明内容本发明的目的就是提供一种辅助性诊断(尤其是早期诊断)冠状动脉病变的方法及检测试剂盒。在本发明的第一方面，提供了一种筛选治疗冠状动脉病变的候选治疗剂的方法，包括步骤(a)在测试组中，向循环内皮祖细胞的培养物中添加待筛选的候选物，培养并检测循环内皮祖细胞的数量；并且，在对照组中，在不添加待筛选的候选物的情况下，培养并检测循环内皮祖细胞的数量；(b)将步骤(a)测试组中循环内皮祖细胞的数量与未添加候选物的对照组中循环内皮祖细胞的数量进行比较，如果测试组的循环内皮祖细胞的数量在统计学上显著高于对照组，就表明该候选物是治疗冠状动脉病变的候选治疗剂。在另一优选例中，所述方法还包括步骤(b′)检测测试组中循环内皮祖细胞的迁移能力，并与对照组中循环内皮祖细胞的迁移能力进行比较，其中测试组的循环内皮祖细胞的迁移能力在统计学上显著高于对照组，就表明该候选物是治疗冠状动脉病变的候选治疗剂。在另一优选例中，所述方法还包括步骤(b”)检测测试组中循环内皮祖细胞的粘附能力，并与对照组中循环内皮祖细胞的粘附能力进行比较，其中测试组的循环内皮祖细胞的粘附能力在统计学上显著高于对照组，就表明该候选物是治疗冠状动脉病变的候选治疗剂。在另一优选例中，所述的冠状动脉病变是冠状动脉狭窄。本发明还包括用上述方法筛选获得的候选治疗剂。在本发明的第二方面，提供了一种循环内皮祖细胞的特异性标志物的用途，用于制备检测的冠状动脉病变的试剂或试剂盒。较佳地，所述的特异性标志物选自CD133、KDR或vWF。在另一优选例中，所述的冠状动脉病变是冠状动脉狭窄。在本发明的第三方面，提供了一种促进循环内皮祖细胞数量的促进剂的用途，用于制备治疗冠状动脉病变的药物。在另一优选例中，所述的冠状动脉病变是冠状动脉狭窄。在本发明的第四方面，提供了一种检测冠状动脉狭窄(或易感性)的方法，它包括步骤检测待检测个体中循环内皮祖细胞的数量，并与正常人群(正常对照)的循环内皮祖细胞数量相比较，如果待检测个体中循环内皮祖细胞的数量比正常对照少30％(较佳地少50％，更佳地少70％)，就表明该个体冠状动脉狭窄可能性高于正常人群。图1显示了CD133/KDR阳性细胞数、血清CRP浓度和冠状动脉病变的关系。图2显示了CD133/KDR阳性细胞数、血清CRP浓度和Gensini评分的关系图3显示了EPCs表型鉴定。图4显示了EPCs迁移能力和冠状动脉病变的关系。图5显示了EPCs粘附能力和冠状动脉病变的关系。具体实施例方式本发明人通过广泛而深入的研究，本发明人首次发现和证实了循环内皮祖细胞(EPC)与冠状动脉病变(尤其是冠状动脉狭窄程度)之间的相关性。循环内皮祖细胞的数量与冠状动脉狭窄程度存在极高的相关性，因而可以作为诊断冠状动脉狭窄程度的辅助性参考指标。本发明提供了基于该相关性提供了检测冠状动脉病变的方法和试剂盒。具体而言，本发明人对104例冠状动脉造影患者(排除急性冠脉综合征、心肌梗死)作病变严重程度及危险因素分析；以CD133/KDR作为EPCs标记物，用流式细胞仪检测患者的CD133/KDR双标记细胞数量；对93例患者作外周血单个核细胞分化培养，检测EPCs迁移和粘附能力。试验结果证明，冠状动脉造影阳性者EPCs数量较阴性者显著降低(p＜0.01)；EPCs数量与Gensini评分呈负相关(n＝49，r＝-0.318，p＝0.016)。外周血EPCs数量与年龄、超敏C反应蛋白(hs-CRP)呈负相关(p＝0.001，0.012)；高血压和冠心病家族史患者EPCs数量显著减少(p＝0.042，0.043)。冠心病患者EPCs迁移能力也较正常人显著下降，且多支病变较单支病变下降更显著(p＜0.05)。EPCs迁移能力与Gensini评分呈负相关(n＝55，r＝-0.315，p＝0.021)。冠心病患者EPCs粘附能力较正常人显著下降(p＜0.05)。这表明，在稳定性冠心病患者，循环EPCs数量、迁移和粘附能力较正常人下降，且数量、迁移能力与冠状动脉病变程度相关。EPCs数量与心血管危险因素相关，和血清CRP浓度负相关。由于循环EPCs具有血管修复作用，因此冠心病患者血管新生能力随冠状动脉狭窄程度加重而减弱，多种心血管危险因素尤其是CRP可能通过影响EPCs数量、功能，推动动脉粥样硬化的发生、发展。如本文所用，术语“EPC”指循环内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells)。如本文所用，术语“CRP”指C-反应蛋白，它是一种炎性标志物。基于本发明的新发现，循环内皮祖细胞有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗冠状动脉病变，尤其是冠状动脉狭窄。另外，还可筛选促进循环内皮祖细胞数量的物质，这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够有效治疗冠状动脉病变(尤其是冠状动脉狭窄)的药物。另一方面，循环内皮祖细胞的特异性标志物也可用于本发明，通过检测个体中带有这些特异性标志(物)的循环内皮祖细胞，可以测定循环内皮祖细胞的数量，从而作为早期辅助诊断冠状动脉病变(尤其是冠状动脉狭窄)的辅助性指标。利用循环内皮祖细胞，通过各种常规筛选方法，可筛选出与循环内皮祖细胞发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。促进循环内皮祖细胞数量的激动剂或促进剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可以促进循环内皮祖细胞的数量，进而改善冠状动脉病变(尤其是冠状动脉狭窄)的症状。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、或皮下给药。本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的促进循环内皮祖细胞数量的促进剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。本发明还涉及定量和定位检测循环内皮祖细胞数量水平的诊断试验方法。这些检测结果可用于辅助判断或诊断冠状动脉病变(尤其是冠状动脉狭窄)。一种检测循环内皮祖细胞数量的方法是利用循环内皮祖细胞的特异性标记物进行检测，它包括将样品与抗循环内皮祖细胞特异性标志物的特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在循环内皮祖细胞。结合流式细胞仪等设备可以测定带有这种特异性标志物的细胞(即循环内皮祖细胞)的数量。本发明的主要优点在于首次证实了循环内皮祖细胞(EPC)与冠状动脉病变(尤其是冠状动脉狭窄程度)之间的相关性，因而为冠状动脉病变(尤其是冠状动脉狭窄)诊断(尤其是早期辅助诊断)和治疗提供了新途径。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1方法一.研究对象2004年3月至5月，104例经冠状动脉造影(CAG)的住院患者为研究对象(CAG阳性或阴性)。排除恶性肿瘤、外周血管病变、增生性视网膜病变患者；排除近2个月内患急性冠状动脉综合征、急性心肌梗死、炎症、急性出血或输血史及服用他汀类药物或促红细胞生成素者；排除绝经前妇女。二.一般临床资料收集所有患者基本资料性别、年龄、身高、体重、血压。详细了解病史高血压病、糖尿病、冠心病、脑血管疾病、肾脏病、吸烟史、饮酒史、生活方式(是否运动)、冠心病家族史。并作常规实验室检查空腹及餐后血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、甘油三酯、肌酐、尿酸。三.超声心动图检查应用美国HewlettPackard公司M2410A-M2408A型彩色多普勒超声检查仪对患者进行二维，M型及多普勒超声心动图检查，探头频率2.5MHz。参照美国超声心动图学会推荐标准。按Devereux公式计算左室心肌重量(LVM)，LVM(g)＝1.04[(LVDd+IVST+PWT)3-LVDd3]-13.6。体表面积(BSA)＝0.0061×身高(cm)+0.0128×体重(kg)-0.1529。左室心肌重量指数(LVMI)采用公式LVMI(g/m2)＝LVM/BSA(体表面积)。四.冠状动脉造影以Judkins法作选择性冠状动脉造影。以定量冠脉造影(QCA)估价冠状动脉病变的血管和狭窄程度。以血管狭窄≥50％作为阳性标准。病变累及左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)、右冠状动脉(RCA)之一为单支病变，大于或等于二支者为多支病变。左冠状动脉主干病变为二支病变。以二种方式评价冠脉病变的严重程度1.病变累及的冠状动脉数(分为单支病变、二支病变和三支病变)；2.Gensini评分(按以下文献所述方式进行GensiniGG.Amoremeaningfulscoringsystemfordeterminingtheseverityofcoronaryheartdisease.AmJCardiol1983；51606)。五.血清hs-CRP，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子(VCAM-1)测定血清hs-CRP浓度采用超敏CRP试剂盒(DadeBehringInc.Marburg，German)以免疫散射比浊法测定。灵敏度为0.175mg/L。ICAM-1和VCAM-1血清浓度用sICAM-1和sVCAM-1ELISA试剂盒((DIACLONE，Besancon，France)测定。灵敏度为8ng/ml和0.6ng/ml。六.流式细胞分析测循环EPCs数量冠脉造影前Judkins导管插入股动脉取血150ul，加入PE标记的CD133小鼠抗人单克隆IgG1抗体(MACS，BergischGladbach，Germany)、APC标记的小鼠抗人KDR单克隆IgG1抗体(R&D，Minneapolis，USA)。同型对照为PE标记和APC标记的小鼠IgG1(BectonDickinson，FranklinLakes，USA)。采用BD公司FACSCalibur流式细胞仪以CellQuest软件进行流式细胞分析。在前向角散射光和侧向角散射光双参数点图上对淋巴细胞群设窗，收集细胞数共60000个，以此群体统计KDR/CD133细胞的百分率。七.EPC的分离、培养取空腹外周血10ml，4h内用密度梯度离心法获取单个核细胞。将单个核细胞接种在包被有纤维连接蛋白(FN)培养板(BDBiosciences，CA，USA)。EGM培养基(含10％胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)(Cambrex，Walkersville，MD)培养4天，用PBS洗掉非贴壁细胞，换培养液继续培养至7d，对贴壁细胞进行细胞化学分析。八.EPCs鉴定以0.125％胰蛋白酶处理贴壁细胞，以PE标记的抗人血管内皮生长因子(KDR)单克隆抗体(R&D，Minneapolis，USA)和VonWillebrand因子(vWF)抗体(DAKO，Glostrup，Denmark)标记细胞，进行流式细胞分析。九.EPCs迁移能力检测如上述搜集贴壁细胞并计数。将600μl培养液和血管内皮生长因子(VEGF，50ng/ml)置于transwell(8-μm孔径)(CorningCostarInc.，Corning，NewYork，USA)下室，将2×104EPCs悬浮在200μl培养液注入上室，培养24h，刮去滤膜上面的未移动细胞，用75％冰乙醇固定，HE染色，随机选择5个显微镜视野(×200)计数迁移到低层的细胞。十.EPCs粘附能力检测用0.25％胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，悬浮在EGM培养液，计数，1×105EPCs铺在包被有FN培养板，在37C培养30min，计数贴壁细胞。十一.统计分析所有数据以平均数±标准差表示。用SPSS统计软件作数据处理。CRP浓度转换为自然对数的形式以达到正态分布。用多因素逐步回归方法分析CD133/KDR+细胞的影响因素。用偏回归分析和协方差分析判定CD133/KDR+细胞数量、EPCs迁移、粘附能力和冠状动脉病变严重程度的关系。结果一.入选病人临床资料80例怀疑或临床证实冠心病患者为入选对象。按冠脉造影结果分为三组，即冠状动脉造影阴性、单支病变和多支病变组。三组患者年龄、体重指数、高血压、吸烟、饮酒、冠心病家族史、空腹血糖和血脂水平均无显著差异，但冠心病组男性(p＜0.01)、糖尿病史(p＜0.05)和饮酒者(p＜0.05)显著增加；血清肌酐清除率明显降低(p＜0.01)(见表1)。表1.入选病人临床资料CAD冠状动脉病变；BMI体重指数；LVMI左心室质量指数(leftventricularmassindex)；CAG(-)正常冠脉造影(normalcoronaryangiography)；Ccr肌酐廓清(creatinineclearance)。二.外周血CD133/KDR+细胞与危险因素的关系以多元回归方法分析多种危险因素对EPCs的预测作用。发现年龄、hs-CRP、高血压、冠心病家族史与EPCs数量相关(见表2)。表2心血管危险因素和循环EPCs数量的关系hs-CRP高灵敏度C活性蛋白(Creactiveprotein)；ln自然对数；CAD冠状动脉病变；SE标准差三.CD133/KDR+细胞数量、hs-CRP，与冠状动脉病变程度的关系按病变累及的冠状动脉数量将患者分为三组，以年龄、性别和体表面积校正，作协方差分析。冠脉造影阴性组EPCs数量为(0.064±0.004％)％(n＝44)；单支病变组为(0.043±0.004％)％(n＝35)；多支病变组为(0.030±0.005％)(n＝25)。与冠脉造影阴性组相比，单支病变和多支病变组EPCs数量显著减少(p＜0.05p＜0.01)，多支病变者较单支病变者EPCs数量也显著降低(p＜0.05)。三组患者CRP血清浓度也有显著差别，冠脉造影阴性组lnCRP为0.077±0.015，(n＝44)；单支病变组为0.725±0.125(n＝35)；多支病变组为1.343±0.206(n＝25)(图1)。以年龄、性别和体表面积校正，对冠状动脉造影阳性患者CD133/KDR+细胞数量、hs-CRP和Gensini评分作偏回归分析，发现CD133/KDR+细胞数量和Gensini评分呈负相关关系(n＝60，r＝-0.355，P＝0.006)，hs-CRP与Gensini评分呈正相关关系(n＝49，r＝0.476，P＝0.001)(图2)。四.EPCs表型鉴定对外周血单个核细胞贴壁培养七天，可发现细胞呈梭形，用流式细胞仪对细胞鉴定，发现细胞表达内皮标志物vWF(100％)、KDR(96％)(图3)。五.EPCs迁移能力和冠状动脉病变的关系EPCs对VEGF的迁移能力在血管新生过程中起重要作用。通过对38例冠状动脉造影阴性者和55例冠心病患者循环EPCs迁移能力的检测，发现CAG(-)者(EPCs迁移38.73±1.37/*200，n＝38)EPCs迁移能力显著高于单支病变(EPCs迁移34.33±1.58/*200，n＝27)和多支病变者(EPCs迁移29.46±1.66/*200，n＝27)且EPCs迁移能力与Gensini评分呈反比(n＝55，r＝-0.315，p＝0.021)(图4)。六.EPCs粘附能力和冠状动脉病变的关系冠状动脉造影阳性者EPCs粘附能力显著下降(p＜0.05)，但粘附能力和Gensini评分无相关关系(n＝55，r＝-0.196，p＝0.159)(图5)讨论本发明对稳定性冠心病患者循环EPCs数量、功能活性进行测定，发现稳定性冠心病患者EPCs数量、迁移能力、粘附能力较正常人降低；首次发现EPCs数量和迁移功能与冠状动脉狭窄程度相关；并第一次在临床研究中发现循环EPCs数量与血清hs-CRP水平呈负相关关系。以CD133/KDR为EPCs标志对患者循环EPCs检测，发现冠状动脉造影阳性者循环EPCs数量较冠状动脉造影阴性者显著降低；且多支病变者较单支病变者有降低趋势；EPCs数量和冠脉造影Gensini评分呈负相关。上述结果可以推断冠状动脉病变严重的患者，EPCs产生、动员减少，半衰期缩短。循环EPCs数量极少，血管损伤时，局部释放细胞因子，如VEGF、SDF-1等，对EPCs产生趋化作用，使其得以在缺血部位发挥作用。因此除EPCs数量外，EPCs的迁移功能在血管新生过程中起关键作用，而VEGF被认为是最重要诱导因子。本发明以VEGF为诱导因子，对循环EPCs迁移功能进行检测，发现CAG阴性组、单支病变组、多支病变组EPCs迁移能力有显著差异，且迁移能力与Gensini评分呈负相关。提示循环EPCs迁移能力随冠状动脉病变程度加重而减弱。VEGF通过VEGFR-2(KDR)诱导内皮细胞迁移参与血管新生，因此提示EPCs可能也是通过KDR参与这一过程。但本发明未发现KDR表达与冠状动脉病变相关，因此可能存在下游信号转导途径而使EPCs迁移能力下降。EPCs参与血管新生的另一重要机制为细胞粘附作用，EPCs通过细胞-细胞粘附和细胞-细胞外基质粘附而整合至内皮损伤部位，修复血管。本发明发现冠心病患者EPCs对FN粘附功能显著下降，但未发现其粘附功能与冠状动脉病变严重程度相关。冠心病EPCs数量和生物学功能改变，可能由以下机制介导首先，血管紧张素II和活性氧(ROS)是冠状动脉病变的发病机制中起重要作用的物质，文献报道血管紧张素II通过诱导氧化刺激促进EPCs老化、凋亡(ImanishiT，HanoT，NishioI.AngiotensinIIacceleratesendothelialprogenitorcellsenescencethroughinductionofoxidativestress.JHypertens2005；2397-104.)。其次，eNOs可以加速EPCs动员，而冠心病患者血管内皮产生一氧化氮合成酶(eNOs)功能受损，从而使EPCs数量减少。对冠心病患者，缺氧诱导VEGF释放减少，可能也是减少EPCs动员、分化、迁移的重要因素。此外，在动脉粥样硬化过程中起重要作用的ox-LDL可以抑制EPCs分化，影响EPCs迁移、血管生成能力。另一方面，动脉粥样硬化伴随的慢性血管内皮损伤可以持续消耗循环EPCs参与内皮修补，从而减少循环中较强功能的EPCs。心血管危险因素，包括炎性因子CRP在此过程中可能也起到重要作用。完整的血管内膜维持血管正常功能，内皮损伤可以引起动脉粥样硬化。而循环EPCs是修复损伤内皮的“细胞库”。在正常情况下内皮损伤和EPCs修补之间存在动态平衡，维持内膜完整性，而EPCs数量/功能减少可能影响内皮修复，导致内膜完整性受损，促起动脉粥样硬化发生、发展。本发明发现EPCs数量与冠脉病变严重程度呈显著负相关关系，提示骨髓中动员至外周血的EPCs不足以修复损伤的内皮是诱发冠心病的发病机制之一。本发明发现CD133/KDR阳性细胞数量与血清CRP水平呈负相关。George等(GeorgeJ，GoldsteinE，AbashidzeS，etal.Circulatingendothelialprogenitorcellsinpatientswithunstableanginaassociationwithsystemicinflammation.EurHeartJ2004；251003-8.)在冠心病(包括稳定性冠心病和急性冠脉综合症)EPCs的研究中发现EPCs数量和CRP浓度正相关。急性冠脉综合症产生的心肌组织缺血可能诱导VEGF释放，从而增加EPCs分化、动员，增加循环EPCs数量；而CRP为炎性指标，在急性炎症过程中显著增加。近年文献提示hs-CRP不仅为重要的心血管危险因素，同时还是动脉粥样硬化的重要参与物质。体外试验发现CRP显著减少EPCs数量，延缓内皮特异性标志出现，促进EPCs凋亡，使EPCs血管新生能力受损。另有试验提示CRP通过减少EPCs分泌多种细胞因子而抑制其血管新生能力。本发明人首次从临床研究中发现EPCs和CRP的负相关关系，进一步证实CRP可以减少EPCs数量。由于CRP是心血管事件的重要预测因子，而EPCs又与CRP相关，所以循环EPCs数量可以成为预测心血管疾病的生物学标志。本发明还显示循环EPCs数量和年龄、高血压、冠心病家族史等心血管危险因素相关。因此，这提示传统危险因素和CRP都可以减少循环EPCs数量，阻碍内皮修复，推动动脉粥样硬化病变。由于循环EPCs数量和功能与冠状动脉狭窄严重程度相关，即冠状动脉狭窄程度与EPCs参与的血管新生能力呈负相关，因此这提示，在一部分冠状动脉病变中，包括CRP在内的多种因素，可能通过减少EPCs数量和功能，阻碍内皮修复，加速动脉粥样硬化发生、发展。实施例2筛选促进EPC数量的促进剂取空腹外周血10ml，4h内用密度梯度离心法获取单个核细胞。将相同数量(约1×105)的单个核细胞分别接种于6块包被有纤维连接蛋白(FN)培养板(BDBiosciences，CA，USA)。在对照组的3块培养板中，在未添加任何待测试化合物的EGM培养基(含10％胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)(Cambrex，Walkersville，MD)中培养4天。在对照组的3块培养板中，在添加了浓度为0.1M待测试化合物的EGM培养基(含10％胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)(Cambrex，Walkersville，MD)中培养4天。培养4天后，用PBS洗掉测试组和对照组中的非贴壁细胞，换培养液继续培养至7d，分别对贴壁细胞进行细胞化学分析。以0.125％胰蛋白酶处理贴壁细胞，以PE标记的抗人血管内皮生长因子(KDR)单克隆抗体(R&D，Minneapolis，USA)和VonWillebrand因子(vWF)抗体(DAKO，Glostrup，Denmark)标记细胞，进行流式细胞分析。与对照组的循环内皮祖细胞数量(3块培养板的平均值)相比，如果测试组的循环内皮祖细胞数量(3块培养板的平均值)高出30％，则认为该测试化合物是较有效的促进EPC数量的促进剂；如果测试组的循环内皮祖细胞数量(3块培养板的平均值)高出50％，则认为该测试化合物是很有效的促进EPC数量的促进剂。实施例3筛选促进循环内皮祖细胞迁移和粘附能力的化合物对于实施例2中筛选出的促进EPC数量的促进剂，进一步测定其是否具有促进循环内皮祖细胞迁移和粘附能力(a)EPCs迁移能力检测如实施例2搜集贴壁细胞并计数。将600μl培养液和血管内皮生长因子(VEGF，50ng/ml)置于transwell(8-μm孔径)(CorningCostarInc.，Corning，NewYork，USA)下室，将2×104EPCs悬浮在200μl培养液注入上室，培养24h，刮去滤膜上面的未移动细胞，用75％冰乙醇固定，HE染色，随机选择5个显微镜视野(×200)计数迁移到低层的细胞。(b)EPCs粘附能力检测用0.25％胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，悬浮在EGM培养液，计数，1×105EPCs铺在包被有FN培养板，在37℃培养30min，计数贴壁细胞。结果表明，对于初步筛选所获得的2个促进EPC数量的促进剂，都没有促进循环内皮祖细胞迁移和粘附能力。这提示，促进EPC的增殖与迁移和粘附涉及不同的途径。实施例4利用循环内皮祖细胞特异性标志物来检测冠状动脉狭窄易感性的试剂盒制备一试剂盒，它含有(a)PE标记的CD133小鼠抗人单克隆IgG1抗体(MACS，BergischGladbach，Germany)和(b)APC标记的小鼠抗人KDR单克隆IgG1抗体(R&D，Minneapolis，USA)。对10位冠状动脉狭窄病人和10位正常人自愿者组成的测试组，用Judkins导管插入股动脉取血150ul。在双盲法条件下，加入PE标记的CD133小鼠抗人单克隆IgG1抗体(MACS，BergischGladbach，Germany)、APC标记的小鼠抗人KDR单克隆IgG1抗体(R&D，Minneapolis，USA)。同型对照为PE标记和APC标记的小鼠IgG1(BectonDickinson，FranklinLakes，USA)。采用BD公司FACSCalibur流式细胞仪以CellQuest软件进行流式细胞分析。在前向角散射光和侧向角散射光双参数点图上对淋巴细胞群设窗，收集细胞数共50000个，以此群体统计KDR/CD133双阳性细胞的百分率。同时对所有测试者进行冠状动脉造影。判断标准(a)KDR/CD133双阳性细胞的百分率＞0.05％，表示无冠状动脉狭窄；(b)KDR/CD133双阳性细胞的百分率＜0.045％，表示冠状动脉狭窄或冠状动脉狭窄易感性高于正常人群；(c)KDR/CD133双阳性细胞的百分率位于0.045％和0.05％之间，无明确诊断价值。结果有8位测试者的KDR/CD133双阳性细胞的百分率＜0.045％，其中有7位有冠状动脉狭窄(单支病变或多支病变)。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种筛选治疗冠状动脉病变的候选治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤(a)在测试组中，向循环内皮祖细胞的培养物中添加待筛选的候选物，培养并检测循环内皮祖细胞的数量；并且，在对照组中，在不添加待筛选的候选物的情况下，培养并检测循环内皮祖细胞的数量；(b)将步骤(a)测试组中循环内皮祖细胞的数量与未添加候选物的对照组中循环内皮祖细胞的数量进行比较，如果测试组的循环内皮祖细胞的数量在统计学上显著高于对照组，就表明该候选物是治疗冠状动脉病变的候选治疗剂。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(b′)检测测试组中循环内皮祖细胞的迁移能力，并与对照组中循环内皮祖细胞的迁移能力进行比较，其中测试组的循环内皮祖细胞的迁移能力在统计学上显著高于对照组，就表明该候选物是治疗冠状动脉病变的候选治疗剂。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(b”)检测测试组中循环内皮祖细胞的粘附能力，并与对照组中循环内皮祖细胞的粘附能力进行比较，其中测试组的循环内皮祖细胞的粘附能力在统计学上显著高于对照组，就表明该候选物是治疗冠状动脉病变的候选治疗剂。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的冠状动脉病变是冠状动脉狭窄。5.一种循环内皮祖细胞的特异性标志物的用途，其特征在于，用于制备检测的冠状动脉病变的试剂或试剂盒。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的特异性标志物选自CD133、KDR或vWF。7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的冠状动脉病变是冠状动脉狭窄。8.一种促进循环内皮祖细胞数量的促进剂的用途，其特征在于，用于制备治疗冠状动脉病变的药物。9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的冠状动脉病变是冠状动脉狭窄。10.一种用权利要求1所述方法筛选获得的候选治疗剂。全文摘要本发明公开了循环内皮祖细胞(EPC)与冠状动脉病变(尤其是冠状动脉狭窄程度)之间的相关性。本发明试验证实，循环内皮祖细胞的数量以及迁移和粘附能力与冠状动脉狭窄程度存在极高的相关性，因而可以作为诊断冠状动脉狭窄程度的辅助性参考指标。本发明还基于该相关性提供了检测冠状动脉病变的方法和试剂盒。文档编号A61P9/10GK1928111SQ200510029529公开日2007年3月14日申请日期2005年9月9日优先权日2005年9月9日发明者朱鼎良,高平进,汪海娅,张怡,周晓鸥申请人:中国科学院上海生命科学研究院,上海市高血压研究所