专利名称：预防和治疗痴呆的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防和治疗痴呆的药物组合物，该组合物包含作为有效成分的灵芝提取物、十八碳烯酰胺及其结构类似物。
背景技术：
痴呆是区别于正常老化的一种病态现象，分为阿耳茨海默型痴呆、血管型痴呆、其他酒精中毒和由帕金森氏病的后遗症引起的痴呆等类型。
虽然阿耳茨海默型痴呆的发病机制还不明确，但已知多数患者伴有中枢神经系统中乙酰胆碱的减少。所以用乙酰胆碱前体物或者用阻碍乙酰胆碱分解的药物来提高脑中乙酰胆碱浓度的方法一直用于治疗阿耳茨海默型痴呆。乙酰胆碱酯酶抑制剂或者与已知胆碱酯酶抑制剂并用的药物现用于治疗阿耳茨海默型痴呆。其代表药物有tacrine、donepezil、rivastigmine、galantamine等。
血管型痴呆经常是由于脑血管的硬化使脑内许多部位的供血不足所致的脑细胞损伤引起的。所以需要将作用于脑血管的高血压治疗药物阿司匹林或保护受损脑细胞的药物用于治疗血管型痴呆。
由于痴呆的传统治疗药物主要只有抑制乙酰胆碱酯酶活性的作用。所以很有必要开发与此同时对血管型痴呆也有疗效的药物。
灵芝(Ganoderma lucidum)为蘑菇的一种，是东洋的传统药材，具有抗炎、抗癌、免疫调节功能、抑制艾滋病毒、降低血压等作用。对灵芝效能的研究论文有①灵芝的水和乙酸乙酯提取物，经口服给药，均有效于被卡拉胶(carrageenan)，和巴豆油(croton oil)诱发的小鼠浮肿(参见Stavihovha W and Slama J，The anti-inflammatory Ganoderma LucidumThird International Symposium on Ganoderma lucidum9-21)。②灵芝的水提取物有效抑制癌细胞的成长(参见Wang SY et al，The anti-tumor effectof Ganoderma lucidum is mediated by cytokines related from activatedmacrophages and Tlymphocytes，Int.J Cancer 70699-705)。③从灵芝中分离得到的免疫调节蛋白质LZ-8，在体内(in vitro)实验中促进细胞分裂(mitogenic activity)的作用，在体内(in vivo)实验中则显示免疫调节活性(参见Kino K et al.，Immunomodulator，LZ-8，prevent antibody productionin mice，Int J Immunophamacol 13(8)1109-1115)。
发明内容
本发明者们一直在寻找对阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆均有效且安全无毒性的天然资源。从在韩国的传统药物灵芝中，提取分离出对乙酰胆碱酯酶活性和脑缺血均有抑制作用的化合物，并确定这个化合物及其结构类似物可以用于预防和治疗痴呆。
因此，本发明的目的是提供对预防和治疗阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆均表现出预防和治疗效果的组合物。
本发明提供了一种用于预防和治疗痴呆的药物组合物，该组合物包含作为有效成分的灵芝提取物、十八碳烯酰胺及其结构类似物。
本发明提供的组合物，可抑制乙酰胆碱酯酶活性，恢复脑内乙酰胆碱总量，从而具有预防和治疗阿耳茨海默型痴呆的作用。该组合物同时能保护因脑缺血而受损的脑组织，从而也具有预防和或治疗血管型痴呆的作用。
对本发明提供的组合物详细说明如下。
首先，获得用作本发明组合物中有效成分的灵芝提取物的提取方法如下。
将灵芝用己烷提取，提取残渣再用氯仿提取，其残渣再用甲醇提取。把甲醇提取液减压蒸馏，得到甲醇提取物(以下称为“提取物GL-M”)。提取时，所用的作为提取溶剂的己烷、氯仿、甲醇的量以浸没药材为佳。一般提取每1kg灵芝，所需的溶剂量约为2L的己烷、氯仿和甲醇。
将按上述提取方法得到的灵芝甲醇提取物GL-M，进行一系列硅胶吸附柱层析和高效薄层层析(HPTLC)进一步分离、提纯。即a)灵芝的甲醇提取物GL-M，进行硅胶柱层析，湿法装柱，用氯仿/甲醇(500∶1)洗脱，以高效硅胶薄层层析检查，根据Rf值得到14个组份GL-M-1～GL-M-14；b)把从上述a)中得到的组份GL-M-8，再进行硅胶柱层析，湿法装柱，用氯仿/甲醇(100∶1)洗脱，以高效硅胶薄层层析检查，合并相同的组份，得到7个组份GL-M-8-A～GL-M-8-G)；c)把从上述b)中得到的组份GL-M-8-F，再进行硅胶柱层析，湿法装柱，用氯仿/甲醇(50∶1)洗脱，以高效硅胶薄层层析检查，合并相同的组份，得到5个组份GL-M-8-F-a～GL-M-8-F-e)；d)把从上述c)中得到的组份GL-M-8-F-b，再进行硅胶柱层析，湿法装柱，用氯仿/甲醇(50∶1)洗脱，以高效硅胶薄层层析检查，合并相同的组份，得到4个组份GL-M-8-F-b-I～GL-M-8-F-b-IV)；e)把从上述d)中得到的组份GL-M-8-F-b-III，再进行硅胶柱层析，湿法装柱，用氯仿/甲醇(30∶1)洗脱，以高效硅胶薄层层析检查，合并相同的组份，得到GL-M-8-F-b-III-1。
将按上述方法得到的灵芝提取物GL-M-8、GL-M-8-F、GL-M-8-F-b、GL-M-8-F-b-III、GL-M-8-F-b-III-1抑制乙酰胆碱酯酶活性(后述于实施例)，所以这些灵芝提取物在本发明的组合物中可作为有效成分。
为了确定在本发明的组合物中作为有效成分的灵芝甲醇提取物中所含有的活性成分，对最终得到的GL-M-8-F-b-III-1进行了质谱分析，确定此化合物为十八碳烯酰胺。从而可知，本发明的灵芝提取物中含有作为有效成分的十八碳烯酰胺。十八碳烯酰胺是已知化合物，是一种存在于脑组织中诱导睡眠的物质。
上述十八碳烯酰胺，能用多种化学合成方法合成。十八碳烯酰胺及其结构类似物的制备方法如下把脂肪酸化合物(4)和亚硫酰氯(SOCl2)在70～80℃反应，反应结束后冷却至室温，小心加入凉的氨水。把反应生成物减压过滤后进行重结晶，得到十八碳烯酰胺及其结构类似物(1)。反应式如下面的反应式1。
反应式1上面的反应式1中R1是十八碳烯酰基(9-octadecenoyl)、十六碳烯酰基(9-hexadecenoyl)或十四碳烯酰基(tetradecanoyl)。
把脂肪酸化合物(5)溶于二氯甲烷后，加入二环乙基碳二亚胺(dicyclohe xylcarbodiimide)，二甲氨吡啶(dimethylaminopyridine)和正戊胺(3-aminopentane)。反应一定时间后，滤除生成的固体物，滤液进行浓缩。浓缩物用柱层析分离，得到十八碳烯酰胺结构类似物(2)。反应式如下面的反应式2。
反应式2
反应式2中R2是十八碳烯酰基(9-octadecenoyl)、十八碳二烯酰基(9，12-octadeca dienoyl)或十四碳烯酰(tetradecanoyl)基。
亚油酸(linoleic acid，6)溶于二氯甲烷后，加入二环乙基碳二亚胺(dicyclo hexylcarbodiimide)，二甲氨吡啶(dimethylaminopyridine)和戊醇(3-pentanol)。反应一定时间后，滤除生成的固体物，滤液进行浓缩。浓缩物用柱层析分离，得到十八碳烯酰胺结构类似物(3)。反应式如下面的反应式3。
反应式3反应式3中R3是十八碳二烯酰基(9，12-octadecadienoyl)。
用上述合成方法得到的十八碳烯酰胺及其结构类似物与灵芝提取物一样，对阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆均有预防和治疗效果。
本发明的组合物除了包括灵芝提取物、十八碳烯酰胺及其结构类似物外，还可以包含一种或多种治疗痴呆和其它疾病的有效成分。
另外，除了上述的有效成分外，本发明的组合物还包括药理学上或食品中可接受的一种或多种载体，以便于给药。
药理学上的载体或者食品中能使用的载体可以为生理盐水、灭菌水、林格溶液、生理盐水缓冲液、葡萄糖溶液、麦芽糊精、甘油、乙醇或一种或多种上述成分的混合物。如果有必要也可以附加抗氧化剂、缓冲液、净菌剂等常规辅料。且也可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂，制备成水溶液、悬浮液、乳浊液等注射剂和丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂等多种剂型。另外，优选采用相关领域中的合适方法或根据美国宾夕法尼亚州Easton的Mack Publishing Company出版的Remington’s Pharmaceutical Science(最新版)所公开的方法，并参考疾病的种类或者制剂的成分来制备组合物。
本发明的药物制剂组合物，可非口服给药或者口服给药。虽然给药量是根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄率、疾病严重程度等因素来适当调节。然而每日给药量为0.8～3.2mg/kg，分一次或者数次给药为好。
为了预防和治疗阿耳茨海默型痴呆或血管型痴呆，本发明的药物制剂组合物可以单独使用，也可与手术、放射线治疗、激素治疗、化疗和使用生物反应调节剂的其他方法并用。
本发明的食品组合物的剂型是按常规方法制备。其可以配制成许多剂型，如和载体干燥后的胶囊，或片剂、颗粒剂、粉末、饮料、粥等多种剂型。本发明的组合物除了上述剂型外，还可以包括许多其他可能制备的剂型。
图1本发明的灵芝提取物(GL-H灵芝的己烷提取物，GL-C灵芝的氯仿提取物，GL-M灵芝的甲醇提取物，GL-E灵芝的乙醇提取物)对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。
图2本发明的甲醇提取物中分离、提纯得到的各组分的产率以及各组分对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。
图3合成的十八碳烯酰胺在不同浓度下对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。
图4本发明的甲醇提取物中最终分离提纯得到的组分GL-M-8-F-b-III-1对乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶活性的选择性。
图5施用本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1和合成的十八碳烯酰胺在体内实验中(in vivo assay)对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。
图6、图7、图8施用本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1的被动逃避实验结果。
图9本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1对脑缺血的作用。
具体实施例方式
下面，提供本发明的优选实施例，以便于对本发明的解释。
优选实施例1灵芝提取物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用1(体内实验)1.灵芝提取物的制备1)灵芝提取物GL-H、GL-C、GL-M和GL-E的制备将灵芝3kg粉碎成小片，置于烧瓶中，加入2倍的己烷(约6L)使灵芝被浸没。将混合物于40～50℃加热2小时，提取2次，并过滤。将滤液减压蒸馏并干燥，即得17.6g的提取物GL-H。
向提取物的分离残余物中加入约6L的氯仿使灵芝被浸没，将残余物在40～50℃加热2小时，提取2次，并过滤。将滤液减压蒸馏并干燥，即得55g的提取物GL-C。
然后向提取物的分离残余物中加入约6L的甲醇，然后将它们在常温下混合2天，提取2次，并过滤。将滤液减压蒸馏并干燥，即得65g的提取物GL-M。
向提取物的分离残余物中加入约6L的70％乙醇，然后将混合物在常温下混合2天，加热提取2次，并过滤。将滤液减压蒸馏并干燥，即得59g的提取物GL-E。
2)灵芝提取物GL-M的分离和纯化将上述1)中得到的60g灵芝提取物GL-M用氯仿/甲醇(500∶1)作为溶剂在填充硅胶的10×100cm柱中进行洗脱。收集每100ml洗脱的组分，使用氯仿/甲醇(30∶1)作为展层溶剂在HPTLC中层析，用碘显色，并根据Rf值分离成14个组分。通过对每个分离的组分进行减压蒸馏并干燥获得GL-M-1～GL-M-14。
从上述组分中，用氯仿/甲醇(100∶1)作为溶剂在填充硅胶的4×40cm柱中洗脱出300mg的GL-M-8，收集每50ml洗脱的组分，使用氯仿/甲醇(30∶1)作为展层溶剂在HPTLC中层析，用碘显色，并根据Rf值分离成7个组分。通过对每个分离的组分进行减压蒸馏并干燥获得GL-M-8-A～GL-M-8-G。
然后，用氯仿/甲醇(50∶1)作为溶剂在填充硅胶的1.5×35cm柱中洗脱出86mg的GL-M-8-F。收集每30ml洗脱的组分，使用氯仿/甲醇(30∶1)作为展层溶剂在HPTLC中层析，用碘显色，并根据Rf值分离成5个组分。通过对每个分离的组分进行减压蒸馏并干燥获得GL-M-8-F-a～GL-M-8-F-e。
从上述分离和纯化的提取物中，用氯仿/甲醇(50∶1)作为溶剂在填充硅胶的1.2×30cm柱中洗脱出60mg的GL-M-8-F-b。收集每10ml洗脱的组分，使用氯仿/甲醇(30∶1)作为展层溶剂在HPTLC中层析，用碘显色，并根据Rf值分离成4个组分。通过对每个分离的组分进行减压蒸馏并干燥获得GL-M-8-F-b-I～GL-M-8-F-b-IV。
然后，用氯仿/甲醇(30∶1)作为溶剂在填充硅胶的1×25cm柱中洗脱出40mg的GL-M-8-F-b-III。收集每5ml洗脱的组分，使用氯仿/甲醇(30∶1)作为展层溶剂在HPTLC中层析，用碘显色，并根据Rf值分离成3个组分。通过对每个分离的组分进行减压蒸馏并干燥获得GL-M-8-F-b-III-1～GL-M-8-F-b-III-3。
2.对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用1)乙酰胆碱酯酶的分离乙酰胆碱酯酶是由20～25g的ICR小鼠大脑中分离得到的。将ICR小鼠断头，取出大脑后称重，加入相当于2倍小鼠大脑重量的12.5mM磷酸钠缓冲液(sodium phosphate buffer)。匀浆，并于4℃离心分离(×10,000g)10分钟。取上层液，加入其3倍体积的含有0.5％TritonX-100(triton X-100)的匀浆缓冲液(homogenation buffer)，在4℃混合30分钟，然后离心分离10分钟(×10,000g)。取上层液1ml置1.5ml管中，在速冻冰箱(deep freezer)中保管。
具体操作时要注意小鼠大脑不被损伤，而且分离的全过程要迅速进行。
2)测定对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用向上述得到的50μl各种灵芝提取物中各混入925μl的缓冲液I(0.1M磷酸钠缓冲液，PH8.0)和25μl Tween-20(Tween-20)。加入33μl的Ellman试剂，在25℃下放置10分钟。向该混合物中加入20μl 25mM Acetylthiocholineiodide溶液和和按上述1)的方法制备的33μl乙酰胆碱酯酶。然后在412nm处测定AchE的初始反应速度，测定时间为5分钟。将存在试剂时的初始反应速度和无试剂时的相比较。测定结果用抑制百分率来表示。
公式1
用这种方法测定从实施例1)中得到的各灵芝提取物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。其结果如图1和图2所示。
由图1可见，在各种灵芝提取物中，甲醇提取物GL-M对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用最佳。由图2可见，从灵芝的甲醇提取物GL-M分离、提纯得到的各组份的产率以及各组份对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。
按本发明的方法最终分离得到的GL-M-8-F-b-III-1的分子结构与十八碳烯酰胺相同，其对乙酰胆碱酯酶活性抑制作用的测定结果如图3所示。
由图3可见，随着十八碳烯酰胺的浓度增加，对乙酰胆碱酯酶活性抑制作用也增加。
3)测定对乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶的选择性现使用的治疗阿耳茨海默型痴呆的药物tacrine几乎没有对乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶的选择性，所以tacrine均抑制乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶活性。然而丁酰胆碱酯酶不参与中枢神经系统的胆碱传递(cholinergictransmission)，所以tacrine的治疗效果小且副作用大。据此，对本发明中灵芝提取物的最终分离物质GL-M-8-F-b-III-1的乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶的选择性作了测定。丁酰胆碱酯酶从人的血浆中分离，对丁酰胆碱酯酶的活性抑制测定方法除了把butyrrylcholine iodide作为底物外，其它过程与乙酰胆碱酯酶的活性抑制测定方法一致。测定结果如图4所示。
由图4可见，几乎没有丁酰胆碱酯酶的活性，灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1浓度增加时表现出10％以内的抑制率。与此相反，GL-M-8-F-b-III-1对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用则随着浓度的增加最高可达70％。由此可知，本发明的灵芝提取物只选择性地抑制乙酰胆碱酯酶的活性。
优选实施例2灵芝提取物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用2(体内实验)将溶于10％乙醇的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1和合成的十八碳烯酰胺1mg/kg，10mg/kg，对5周龄的ICR小鼠腹腔注射给药。给药1小时后，从脑组织中分离出乙酰胆碱酯酶。对从脑组织中分离出的乙酰胆碱酯酶活性抑制作用的测定方法与体外实验中的测定方法相同。结果如图5所示。
由图5可见，与对照组相比，在1mg/kg，10mg/kg给药组，乙酰胆碱酯酶活性分别被抑制39％和52％。而且确定了灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1和合成的十八碳烯酰胺对乙酰胆碱酯酶活性的抑制效果相同。
实施例3灵芝提取物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用3(被动逃避实验)为了观察本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1在体内是否能提高记忆力和学习能力，用3种方法(被动逃避实验I、II、III)进行了单次(step-through)被动逃避实验。
体重20-30g(约6周龄)ICR雌性小鼠在室内温度为22℃，相对湿度为50-60％，每12小时自动调节明暗的动物室里适应一周或更长时间后，用于实验。单次被动逃避实验装置(O′HARA Co.Ltd.，Model PAM5，France)用隔板分为两个空间，其隔板中有一个小孔，使小鼠随意通过。箱子的一面(12×10×10cm)用透明有机玻璃板制成，使箱内明亮，另一面(16×10×10cm)则用黑色有机玻璃板制成，使箱内黑暗。暗箱的底部每隔7mm设置一个格子，当小鼠进入暗箱时将触动箱底的格子，受到100伏的电击。
1)被动回避实验第一天，把小鼠放入箱子的亮的一侧。小鼠可通过中间隔板的小孔在暗箱和亮箱之间自由来回，适应环境。这时测定从亮箱进入暗箱的时间(反应潜伏期)，只选择反应潜伏期小于30秒的小鼠进行实验。
第二天，在第一天被选择的小鼠分为溶剂组(给予生理盐水或者10％乙醇)、东莨菪碱组(1mg/kg)、东莨菪碱(1mg/kg)和灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1(0.5mg/kg1,2mg/kg)同时给药组、东莨菪碱(1mg/kg)和tacrine(2mg/kg)同时给药组。通过腹腔注射给药，给药30分钟后，把小鼠放入箱子的亮的一侧，测定反应潜伏期。当小鼠进入暗箱3秒后，给100瓦的电刺激，持续3秒钟。训练15分钟后，再放入实验箱子里面，测定其反应潜伏期，观测至多300秒。
第三天(电刺激24小时后)跟第二天一样，各组小鼠给药30分钟后，测定反应潜伏期。第二天得到的各组小鼠的平均反应潜伏期(15分，第一次training trial)和第三天得到的各组小鼠的平均反应潜伏期(24小时，retention trial)与溶剂组和东莨菪碱组的平均反应潜伏期相对比较，并进行方差检验分析(ANOVA)。
本实验利用被东莨菪碱诱导记忆丧失的小鼠，通过被动逃避实验，观测灵芝提取物对记忆再生能力的效果。观测结果如图6所示。
由图6可见，在电刺激之前适应时6-11分钟的反应潜伏期和各给药组之间没有差异(A)。电刺激训练15分钟后，在生理盐水组(274±17分钟)和作为灵芝提取物的溶剂的10％乙醇溶剂对照组(290±9分钟)的反应潜伏期均显著增加。由此确定，对照组小鼠具有正常记忆能力。与正常对照组相比较，东莨菪碱组的反应潜伏期(103分钟)显著减少(62％)。这一结果表明，在本实验条件下，成功地建立了东莨菪碱诱导的记忆丧失动物模型。给予小鼠灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1，可增加被东莨菪碱抑制的反应潜伏期，这与公知为乙酰胆碱酯酶抑制剂的tacrine给药组相似。作为灵芝提取物溶剂的10％乙醇组中，虽然对第二天的15分钟训练反应潜伏期没有影响，但是对电刺激24小时后，保留潜伏期(retention latency)减少了33％，但与生理盐水对照组相比较没有统计学上有意义的差异。对于0.5mg/kg灵芝提取物给药后24小时的反应潜伏期，由东莨菪碱抑制的单次潜伏期恢复到与10％乙醇对照组相同的水平。
综上所述，本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1具有恢复小鼠中被东莨菪碱抑制的单次被动回避反应的效果，这种效果与阳性对照组tacrine(2mg/ml)的效果相似。
2)被动逃避实验II实验第一天，应用与实验I相同的方法使小鼠适应环境。第二天，将小鼠分为溶剂组(给予生理盐水或者0.2％甲基纤维素)、东莨菪碱组(1mg/kg)、东莨菪碱(1mg/kg)和灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1(0.5mg/kg，2mg/kg，10mg/kg)同时给药组、东莨菪碱(1mg/kg)和tacrine(2mg/kg)同时给药组、东莨菪碱(1mg/kg)和donepezil(Aricept，0.5mg/kg)同时给药组、灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1(0.5mg/kg1,2mg/kg，10mg/kg)单独给药组、tacrine(2mg/kg)单独给药组、donepezil(0.5mg/kg)单独给药组。通过腹腔注射给药，给药30分钟后，把小鼠放入箱子的亮的一侧，测定反应潜伏期。当小鼠进入暗箱3秒后，给电刺激(100瓦，3秒钟)。训练15分钟后，再放入实验箱子里面，测定其反应潜伏期，观测至多300秒。给小鼠电刺激24小时(第三天)后和48小时(第四天)后，在没有给药或电刺激的条件下测定反应潜伏期。测定结果如图7所示。
由图7可见，给予0.2％甲基纤维素(灵芝提取物的溶剂)的溶剂对照组，在电刺激15分钟、24小时、48小时后，反应潜伏期与生理盐水对照组几乎没有差异。东莨菪碱和试验药物同时给药，在电刺激15分钟后，灵芝提取物部分地恢复了由于东莨菪碱导致的反应潜伏期的减少(记忆力减退)(剂量为10mg/kg时恢复效果最好)。灵芝提取物对反应潜伏期的恢复效果与公知为乙酰胆碱酯酶抑制剂的tacrine及donepezil的效果相似。电刺激24小时后，donepezil几乎与对照组水平相同，恢复东莨菪碱诱导的记忆力的减退。灵芝提取物在三个浓度下均有30～50％的恢复效果，与tacrine相似。电刺激24小时后，灵芝提取物2mg/kg组显示最大的恢复效果，其效果与2mg/kg tacrine相似，但低于donepezil的效果。
在本实验中，为了观察灵芝提取物是否影响正常的记忆力，对小鼠只给予受试药物而不给予东莨菪碱，用与上述方法相同的方法进行被动逃避实验。
图7的左边图谱表示，灵芝提取物和阳性对照药物tacrine和donepezil不但均不显著影响正常的记忆力，而且在电刺激24小时后，反而有提高正常记忆力的倾向。
3)被动逃避实验III本实验的目的为观察灵芝的连续给药效果。在实验第一天，应用与实验I，II相同的方法，使小鼠适应环境。第二天，将小鼠分为溶剂组(给予生理盐水或者0.2％甲基纤维素)、东莨菪碱组(1mg/kg)、东莨菪碱(1mg/kg)和灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1(0.5mg/kg1,2mg/kg，10mg/kg)同时给药组、东莨菪碱(1mg/kg)和tacrine(2mg/kg)同时给药组、东莨菪碱(1mg/kg)和donepezil(0.5mg/kg)同时给药组。通过腹腔注射给药，给药30分钟后，用与实验I，II相同的方法进行电刺激训练。电刺激15分钟后，放入实验箱子里面，测定其反应潜伏期，然后进行下一次电刺激训练。实验第三天开始，在没有电刺激的条件下，连续5天给予灵芝提取物(0.5mg/kg1,2mg/kg，10mg/kg)，tacrine(2mg/kg)，donepezil(0.5mg/kg)。结果如图8所示。
由图8可见，连续给予本发明的灵芝提取物后，被东莨菪碱显著降低的记忆力恢复到了对照组的水平。
实施例4灵芝提取物对因脑缺血而引起的脑损伤组织的保护效果为了观察灵芝提取物对因脑缺血而引起的脑组织损伤的保护作用，闭合小鼠中冠状动脉(middle coronary artery occlusion；MCAO)建立了脑缺血动物模型(Longa et al.，1986)。
选用体重为250-300g的雌性大鼠(Sprague-Dawley)，在诱发脑缺血前后允许自由摄取水和食物，经过一周的适应时间后，用于实验。
大鼠在含有N2O和O2混合气体的麻醉槽内通入3.0-3.5％恩氟烷麻醉(Choongwae Pharmaceutical company制造)后固定于手术台上。然后再用1.5-2.0％恩氟烷麻醉，以保证在手术过程中麻醉效果的持续。手术中用加热垫来防止其体温下降，保持大鼠的体温在37±0.5℃。将颈前部去毛消毒后沿颈正中切开约1cm，小心将右侧颈总动脉(common carotid artery)和迷走神经分开，使之暴露。然后小心将外颈动脉(external carotid artery)和内颈动脉(internal carotid artery)和颈总动脉的周围神经分开，预先将线松松地套在所分开的颈总动脉、外颈动脉和内颈动脉上。使套在颈总动脉和外颈动脉上的线结在一起来结扎颈总动脉和外颈动脉，用注射用针在内颈动脉的起始部上扎一小孔，通过切割部分将17mm长的探针插入到内颈动脉中，闭塞中大脑动脉。用套在内颈动脉上的线将探针固定，诱导脑出血。此时，电灼4～0手术用尼龙线的一端，使探针末端直径为0.3mm，将探针用作塞子。将其截成长度为17mm，并涂覆添加有硬化剂(Optosil，Bayer Dental)的硅酮(Xantopren，Bayer Dental)。缝合手术部位，置于新的笼子里，直至从麻醉中苏醒为止。诱发脑缺血30分钟后，确认神经缺损。即揪着白色大鼠尾巴完全将大鼠提起时是否出现左侧不全痳痹(lefthemiparesis)，和向上提起大鼠尾巴时是否自发地出现左侧回旋(circling))(Bederson et al.，1986)。在本实验中，大鼠经腹腔注射灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1(0.5mg/kg1,2mg/kg，10mg/kg)30分钟后，闭塞中大脑动脉9个小时，诱发脑缺血，然后断头，迅速分离出大脑。然后如下所述测定脑梗塞程度利用brain matrix(Neurotec.韩国)从离frontal pole 1mm的位置开始以2mm厚度切成片后的新鲜脑冠侧切片(fresh brain coronal slice)中取第三个切片(5～7)mm，加入用0.9％生理盐水制成的2％TTC(2，3，5-氯化三苯基四唑，2，3，5-triphenyltetrazilium chloride)溶液，37℃染色30分钟。测定结果如图9所示。
图9表示，本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1显著降低因缺血9个小时而引起的大脑皮质和corpus striatum的损伤范围(白色部分)。实施例5十八碳烯酰胺及其结构类似物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用十八碳烯酰胺及其结构类似物，即十六碳烯酰胺[CH3(CH2)5CH＝CH(CH2)7-CONH2]，十四碳烯酰胺[CH3(CH2)12-COMH2]，正戊基十八碳烯酰胺[CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7-CONHCH(CH2CH3)2]，正戊基十八碳二烯酰胺[CH3(CH2)12-CONHCH(CH2CH3)2]，正戊基十四碳烯酰胺[CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7-COOCH(CH2CH3)2]对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用为用实施例1和2相同的方法测定。对照组为donepezil和tacrine。测定结果如表1所示。
由表1可见，十八碳烯酰胺及其结构类似物随着浓度的增加，对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用也增加。
工业使用性本发明的组合物对阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆均表现出预防和治疗效果，因为它能抑制动物脑组织中的乙酰胆碱酯酶活性，从而防止脑内乙酰胆碱的减少，同时保护因脑缺血引起的脑组织的损伤。
虽然本发明从几个优选实施方案的角度描述了本发明，本领域的技术人员将意识到可以在不背离附加的权利要求书的实质和范围的条件下对本发明进行改动。
权利要求
1.预防和治疗痴呆的组合物，含有下列式I所代表的化合物作为有效成分 式I其中，R1是十六碳烯酰或十四碳烯酰基团。
2.预防和治疗痴呆的组合物，含有下列式II所代表的化合物作为有效成分 式II其中，R2是十八碳烯酰、十八碳二烯酰或十四碳烯酰基团。
3.预防和治疗痴呆的组合物，含有下列式III所代表的化合物作为有效成分 式III
4.根据权利要求1-3项中任意一项所述的组合物，其中所述的组合物是能同时预防和治疗阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆的药物组合物。
5.根据权利要求1-3项中任意一项所述的组合物，其中所述的组合物是能同时预防和治疗阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆的食品组合物。
全文摘要
本发明涉及一种用于预防和治疗痴呆的以灵芝提取物、十八碳烯酰胺及其结构类似物作为有效成分的组合物。由于根据本发明的组合物能抑制动物脑组织中的乙酰胆碱酯酶(AchE)活性，从而防止脑内乙酰胆碱的减少并对因脑缺血而引起的脑组织损伤有保护作用，因此本发明的组合物能用作阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆的预防和治疗药物。
文档编号A61K31/215GK1788722SQ20051011739
公开日2006年6月21日 申请日期2002年5月23日 优先权日2001年5月23日
发明者钱吉子, 金禾桢, 韩素叶, 曹贤珍, 朴河希, 李知辛, 金锦宏, 李蓉永, 李明姬, 金兌熹 申请人:钱吉子, 金禾桢, 韩素叶