自由基疾病预防治疗用组合物的制作方法

专利名称：自由基疾病预防治疗用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及对于与自由基有关的各种疾病、显示预防效力或者治疗效力，制剂具有稳定性、在生物体内的副作用少、安全性高的自由基疾病预防治疗用组合物。

背景技术：
近年来，以富勒烯为代表的碳纳米结构体作为开拓碳材料的新的展望的材料而受到关注，以电子材料和电极材料为基础，对其在医疗、医学上的应用和以增进健康等为目的的应用的关注日益增加。
富勒烯分子，由碳原子构成，在各球体中含有32～1000个或其以上的碳原子。关于富勒烯的进一步详细信息参照下述的文献(i)スマリ一(R.E.Smalley)、“原子ぉょび分子クラスタ一にぉける超音波性炭素クラスタ一ビ一ム”、ベルシュタィン(E.R.Berstein)编、物理理論化学、第68卷、ェルセビ一ル·サィェンス(ニュ一ョ一ク)、第1页～第68页(1990年)、(ii)カ一ル(R.F.Curl)ら、“フラ一レン類”、サィェンティフィック·ァメリカン、第32页～第41页(1991年10月)、(iii)ディ一デリッヒ(F.Diederich)ら、“高级フラ一レン類分離と特性决定”、サィェンス、第252卷、第548页～第551页(1991年4月)、ぉょび(iv)スマリ一、“巨大炭素球バックミンスタ一フラ一レンの歴史”、ザ·サィェンシズ、第31卷、第2号、第22页～第28页(1991年3月～4月)。
在这样的富勒烯类中，最具有代表性的是C60富勒烯，其结构使人联想到足球。也存在其它的富勒烯类，特别是作为高级富勒烯的C70以及C84。而且富勒烯类现在一般作为“巴基球(buckyball)”而被熟知。予以说明的是，C60富勒烯分子，一般含有少量的C70富勒烯和C84富勒烯作为杂质。富勒烯类的制备方法及其溶解度、结晶度和色特性记载于许多文献中，特别是クレッチュマ一(W.Kraetschmer)等人的文章[ネィチャ一、第347卷、第354页～第358页(1990年)、以及ケミカル·ァンド·ェンジニァリング·ニュ一ス、第22页～第25页(1990年10月)]。
随着对富勒烯的关注日益增加，在过去对富勒烯在药品和化妆品中的应用进行了研究，也提出了具体的方案。例如，将富勒烯或者富勒烯混合物配混到化妆品中(专利文献1)、利用富勒烯的紫外线吸收效果制成防晒用化妆品组合物(专利文献2)、以富勒烯作为光敏感剂光学地使病毒失去活性的方法(专利文献3)、以及本发明人提出的以富勒烯作为抗氧化剂在皮肤外用剂等中应用等(专利文献4)。
另一方面，因老龄化社会的发展导致成人病发生率增加，其中伴随着老化的各种疾病变得越来越严重。在与成人病相关的疾病中，心率不齐、动脉硬化、缺血性心疾病、心衰竭、心肌梗塞、肝损伤、缺血性肝损伤、消化器官损伤、血管疾病、胰脏损伤、胆囊损伤、内脏器官移植损伤、糖尿病、高血压、内脏器官衰竭等为成人病的具有代表性的疾病，因此开发了用于这些疾病的预防和治疗的许多药品。
另外，作为其它的疾病，也有因肺癌、胃癌、大肠癌等的各种癌、肝炎或HIV引起的后天性免疫缺陷综合症(AIDS)等的各种感染病引起的症状等，对于这些疾病，作为其基本原因或者其原因因素之一，有人指出是因生物体内自由基而引起的疾病(在本发明中称其为自由基疾病)(非专利文献1和2)。实际上，以预防或者治疗这些自由基疾病为目的，自由基疾病预防治疗用、以及治疗用药物的开发与以前相比进步很大，已经提出了以下的数量众多的药物成分。
可例举例如，SOD相关物质(非专利文献3)、泛醌(ubiquinone)制剂(专利文献5)、苯并亚庚因(benzoazepine)衍生物(专利文献6)、吡咯烷酮衍生物(专利文献7)、取代乙烯基衍生物(专利文献8)、草酰胺(oxamide)衍生物(专利文献9)、呋喃羧酰胺(furancarboxamide)(专利文献10)、酞酰亚胺(phthalimide)衍生物(专利文献11)、二十二碳六烯酸(docosahexaeneoic acid)衍生物(专利文献12)、亚油酸衍生物(专利文献13)、喹啉氧化物(quinoline oxide)衍生物(专利文献14)、杂芳香族胺衍生物(专利文献15)、喹喏酮(carbostyril)衍生物(专利文献16)、异吲哚衍生物(专利文献17)、菌体产物(专利文献18)、咪唑硫代羧酰胺(imidazolethiocarboxamide)衍生物(专利文献19)、ジペンゾォキセピン衍生物(专利文献20)、丙基酰胺衍生物(专利文献21)、ファニルフタラジン衍生物(专利文献22)、丹宁酸衍生物(专利文献23)、甘草亭酸(glycyrrhetic acid)衍生物(专利文献24)以及癌转移抑制剂(例如专利文献25-31)等。
但是，虽然这些化合物的一部分具有自由基消除作用，但在制剂化的过程中或者生物体中的稳定性上存在问题，存在以下问题，即特别是在到达疾病部位之前，因为在其它的内脏器官中消除自由基而失活，故不能以高浓度向必要的内脏器官输送有效成分。另外，也存在以下问题，即如果向体内给药上述的药物成分，伴随有头痛、嗳气、呕吐、食欲不振、恶心、出疹、肌肉痉挛等的副作用。
另一方面，作为副作用少、具有高的自由基消除活性的物质，已知有L-抗坏血酸和生育酚等的单体或者其衍生物，用于自由基疾病的预防、治疗。但是，这些抗氧化物质也极其容易被氧化、不稳定，在制剂化过程中或者即使制剂化后也容易受到氧化分解，因此难以作为药品制剂长时间的保持品质，另外，即使制成含有它们的注射液制剂等，因为不能进行高压釜处理等的加热灭菌处理，因此存在不能采用静脉注射等的方法以稳定的状态进入生物体内的问题。另外，即使经口或者静脉注射给药这些现有的抗氧化剂，也存在以下问题，即在生物体内活性容易消失，而且容易迅速地被代谢到体外、不能充分发挥自由基消除效果。
因此本发明的课题是根据以富勒烯作为抗氧化剂在皮肤外用剂等的应用这样的本发明人目前的知识见解，提供新型自由基疾病预防治疗用组合物，该组合物解决了与上述的现有的自由基疾病的预防、治疗相关的药物、药剂的问题，副作用少，在体内具有高的自由基消除活性，而且制药稳定性也优异。
专利文献1特开平6-192039号公报
专利文献2特开平9-278625号公报
专利文献3特开平9-322767号公报
专利文献4特开2004-250690号公报
专利文献5特开昭57-42616号公报
专利文献6特开昭57-193462号公报
专利文献7特开昭59-27823号公报
专利文献8特开昭60-28963号公报
专利文献9特开昭59-163353号公报
专利文献10特开昭59-190991号公报
专利文献11特开昭61-37766号公报
专利文献12特开平4-273817号公报
专利文献13特开昭61-44853号公报
专利文献14特开昭61-65869号公报
专利文献15特开昭61-282377号公报
专利文献16特开昭63-301821号公报
专利文献17特开昭63-150276号公报
专利文献18特开平1-143868号公报
专利文献19特开平1-146820号公报
专利文献20特开平3-176487号公报
专利文献21特开平3-236378号公报
专利文献22特开平4-211666号公报
专利文献23特开平1-25726号公报
专利文献24特开平4-330088号公报
专利文献25特开昭54-4401号公报
专利文献26特开平2-308799号公报
专利文献27特开平4-312531号公报
专利文献28特开平6-72871号公报
专利文献29特开平6-107693号公报
专利文献30特开平8-291075号公报
专利文献31特开平10-330261号公报
非专利文献1“活性酸素と病态”井上编、学会出版センタ一、1992
非专利文献2“抗酸化物质”二木他、学会出版センタ一、1994
非专利文献3Inoue，et al.，Biochemistry，28，6619-6624，1989

发明内容
最近，本发明人作为成人病模型，在体外培养血管内皮细胞，通过使其临时处于低氧状态而产生自由基，使富勒烯类作用于其的情况下，证明了在细胞中产生的自由基被抑制至现有的维生素C以上。进而发现，富勒烯类稳定性特别好，在生物体内毒性低，可充分发挥效果，从而完成了本发明。
即，本发明的自由基疾病预防治疗用组合物，作为解决上述问题的组合物，具有以下的特征， 第1自由基疾病预防治疗用组合物，其特征在于，含有富勒烯、富勒烯衍生物或者通过有机化合物修饰或者包合的富勒烯或者富勒烯衍生物的复合体中的1种以上作为有效成分。
第2上述第1的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯衍生物是结合含氧基、含氮基、烃基中的1种以上的富勒烯，所述烃基可以具有取代基。
第3上述第1的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯类是选自富勒烯的多聚体、碳纳米管、以及它们的衍生物和它们的盐类的1种以上。
第4上述第1的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯类是选自富勒烯的开裂体、富勒烯的分裂体、以及它们的衍生物和它们的盐类的1种以上。
第5上述第3或第4的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯类的盐类是钠、钾、镁、钙、以及铝盐中的1种以上。
第6上述第1-第5任意一项的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯类是富勒烯以及富勒烯衍生物中的1种以上、和有机低聚物、有机聚合物、环糊精以及冠醚和它们的类似化合物中的1种以上的复合体。
第7上述第6的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，是富勒烯以及富勒烯衍生物中的1种以上和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的复合体。
第8上述第1-第5任意一项的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯类由下式表示， R1m-F-R2m (式中，F是Cn(C是碳原子，n是32以上的整数)表示的富勒烯、碳纳米管、以及它们的多聚体、开裂体、分裂体或者它们的混合物，R1m是结合到Cn上的m个的取代基，分别独立，相同或者不同，表示羟基、其羟基和无机酸或者有机酸的酯基、其羟基和糖的配糖体基、其羟基和酮的酮缩醇基、或者其羟基和醛的缩醛基，R2m是结合到Cn上的m个原子，分别独立，相同或者不同，或者1个原子结合到2个位置以上的不同的碳，m表示0或者1以上的整数)。
第9上述第4或者第8的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯开裂体、分裂体是下式的任何一个表示的富勒烯类或者内部具有其结构的分子的单体或者复合体，

(式中，C是以碳原子表示的富勒烯的部分结构体，可以是2个以上的碳原子通过共价键结合(在没有共价键合的碳存在的情况下，即使式中没有表示Rn，也表示和Rn结合)，Rn是结合到C上的n个的取代基，分别独立，可相同也可不同，表示氢原子、碳原子、氧原子、氮原子、磷原子、羟基、其羟基和无机酸或者有机酸的酯基、其羟基和糖的配糖体基、其羟基和酮的酮缩醇基、或者其羟基和醛的缩醛基，n是0或者1以上的整数。) 第10上述第1-第9任意一项的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，进一步含有抗肿瘤药的1种以上。
第11上述第10的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，抗肿瘤药为以下物质中的一种以上，氧氮芥(nitromin)(R)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、美法仑(melphalan)、噻替哌(thiotepa)、卡波醌(carboquone)、Protecton(R)、白消安(busulfan)、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇(mitobronitol)、异环磷酰胺、巯嘌呤(mercaptopuvin)、巯嘌呤苷(thioinosine)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、替加氟(tegafur)、盐酸安西他滨(ancitabine hydrochloride)、氨甲嘌呤(methotrexate)、卡莫氟、UFT(R)、衣诺他滨(enocitabine)、硫酸长春碱(vinplastine sulfate)、硫酸长春新碱(vincristinesulfate)、硫酸长春地辛(vindesine sulfate)、放线菌素(D)、丝裂菌素C(mitomycin C)、色霉素A3(chromomycin A3)、盐酸博莱霉素(bleomycin hydrochloride)、硫酸博莱霉素(bleomycinsulfate)、盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)、盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride)、新制癌霉素(neocarcinostatin)、硫酸培洛霉素(peplomycin sulfate)、盐酸阿克拉霉素(aclarubicin hydrochloride)、美雄烷(mepitiostane)、环硫雄醇(epitiostanol)、柠檬酸他莫昔芬(citricacid tamoxifen)、二磷酸己烯雌酚四钠(Honvan)、溶血性链球菌制剂(picibanil)(R)、云芝多糖(krestin)、香菇多糖(lentinan)、L-天冬酰胺酶、醋葡醛内酯(aceglatone)、盐酸丙卡巴肼(procarbazinehydrochloride)、氟尿苷(floxuridine)、MDSKOWA3000(R)、顺铂(cisplatin)、艾去适(Estracyt)(R)、西佐喃(sizofiran)、鱼精蛋白(protamin)、肝素共存下的angiostatic steroid、抗癌多糖、层粘连蛋白肽(laminin peptide)、含有Arg-Gly-Asp-(RGD)序列的抗癌多肽、以及抗癌血小板因子。
第12上述第1-第11任意一项的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，自由基疾病为心肌梗塞、缺血性心疾病、心衰竭、心绞痛、心率不齐、动脉硬化症、肝脏脂质代谢紊乱、高血脂症、原发性高血压、高血压症、动脉硬化症、冠动脉硬化症、血栓症、闭塞性动脉硬化症、血管疾病、外周血管疾病、胆汁郁滞症、高胆固醇血症、胰损伤、内脏器官衰竭、急慢性肝炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、溃疡性大肠炎、消化器官损伤、胆囊症、糖尿病、关节炎治疗剂、风湿症、肝衰竭、肝损伤、缺血性肝损伤、肝脏脂质代谢紊乱、胆囊损伤、内脏器官移植损伤、糖尿病、中毒症、内脏器官移植损伤、癌、缺血性再注损伤、组织的老化、皮肤组织的色素沉积、皮肤组织的皱纹、齿根骨膜炎(periodontitis)、皮肤组织的皮脂溢(seborrhea)、皮肤组织的晒黑、皮肤组织的粉刺、烧烫伤、肥胖、脱发、精神病、痴呆症、帕金森病、或者感染症。
第13上述第12的自由基疾病治疗预防用组合物，其中癌是肿瘤、良性肿瘤、或者恶性肿瘤。
第14上述第12的自由基疾病治疗预防用组合物，其中，癌是恶性黑素瘤、恶性淋巴瘤、消化道癌、肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、尿道肿瘤、胆囊癌、胆管癌(bile duct cancer)、胆道癌(biliary tract cancer)、乳腺癌、肝脏癌、胰脏癌、睾丸肿瘤、上颚癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽头癌、喉头癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑肿瘤、卡伯希(kaposi)肉瘤、血管瘤、白血病、红细胞增多(polycythemia)、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、骨髓瘤、膀胱瘤、肉瘤、骨肉瘤、或者肌肉瘤。
第15上述第12的自由基疾病治疗预防用组合物，其中，癌是皮肤癌、基底细胞癌、皮肤附件癌、皮肤转移癌(skin metastasiscancer)、或者皮肤黑素瘤。
第16上述第12的自由基疾病治疗预防用组合物，其中，缺血性再灌注损伤是缺血性心疾病、缺血性再灌注心肌损伤、缺血性肝损伤、缺血性再灌注肝脏损伤、缺血性再灌注肾脏损伤、缺血性再灌注胰脏损伤、缺血性再灌注胆囊损伤、缺血性再灌注循环器官损伤、缺血性再灌注消化器官损伤、缺血性再灌注肌肉损伤、缺血性再灌注血管损伤、缺血性再灌注眼损伤、缺血性再灌注皮肤损伤。
第17上述第12的自由基疾病治疗预防用组合物，其中，感染病是细菌性感染病、病毒性感染病、真菌性感染病、或者寄生虫性感染病。
第18上述第17的自由基疾病治疗预防用组合物，其中，病毒性感染病是肝炎、后天性免疫缺陷综合症(AIDS)、感冒、或者流感。



图1是例示实施例5中的PVP·富勒烯对皮肤癌的转移抑制效果的图。
图2是例示实施例6中的PVP·富勒烯对癌细胞的转移抑制效果的图。

具体实施例方式 本申请发明具有如上所述的特征，以下对其实施方式进行说明。
在本发明的自由基疾病预防治疗组合物中，有效成分或者有用成分是如上所述的富勒烯类，包括富勒烯、富勒烯含氧衍生物、以及通过有机化合物改性或者包合的上述的富勒烯或者富勒烯含氧衍生物、及其它们的盐类中的至少一种。
该富勒烯类中的富勒烯，是以Cn(n是60以上的整数)表示的富勒烯，以C60、C70或者它们的混合物为代表，进而可以是以碳管富勒烯等的具有球面状、管等的碳骨架结构的现有公知的物质为代表的各种富勒烯。例如，本申请发明的富勒烯，可以是通过亚烷基链等的亚烷基链结合了多个富勒烯的富勒烯、也可以是亚烷基链结合到富勒烯骨架的不同位置的碳原子的富勒烯等。作为富勒烯60的衍生物，相对于一个富勒烯分子可以结合1-40个改性基，例如作为富勒烯70的衍生物，相对于一个富勒烯分子可以结合1-50个改性基，该改性基，各自独立，可以是羟基或者其羟基和无机或者有机酸的酯基或者和糖的配糖体基、或者羟基和酮的酮缩醇基、或者和醛的缩醛基，可以是该富勒烯修饰化合物或者其盐以及选自它们的至少一种。而且，本申请发明的富勒烯，也可以是C60富勒烯、C70富勒烯、或者纳米管富勒烯，也可以是选自它们的一种以上的混合物。另外，也可以是残存有富勒烯未生成物即碳黑(含有富勒烯类的煤)的富勒烯，富勒烯中的碳黑的浓度以0～98％重量为宜。
而且，本申请发明的富勒烯类，也包括以下所述的富勒烯衍生物，即在其碳骨架结构上具有各种取代基，例如可以具有取代基的烃基，氧交联基、羟基、酰基、醚基、羧基等的含氧基，氨基、氰基等的含氮基等。
对于富勒烯含氧衍生物，认为是在富勒烯骨架的碳原子上直接或者通过亚烷基链等的碳链结合氧原子的物质。可例示例如羟基化率达到50/摩尔·富勒烯左右的-OH基直接结合的羟基化富勒烯等。
作为可在本发明中使用的富勒烯类的例子，可使用以下的化学式表示的富勒烯类。
R1m-F-R2m (式中，F是Cn(C是碳原子、n是32以上的整数)表示的富勒烯、碳纳米管、以及它们的多聚体、开裂体、分裂体或者它们的混合物，R1m是结合到Cn上的m个的取代基，分别独立，相同或者不同，表示羟基、该羟基和无机酸或者有机酸的酯基、该羟基和糖的配糖体基、该羟基和酮的酮缩醇基、或者该羟基和醛的缩醛基。R2m是结合到Cn上的m个的原子，分别独立，相同或者不同，表示1个原子在2个地方以上的不同的碳上结合，m表示0或者1以上的整数。) 另外，可在本发明中使用的富勒烯类，也可以是富勒烯的多聚体、碳纳米管、以及选自它们的衍生物和它们的盐类的1种以上的单体或者混合物、对它们进行修饰或者包合的有机化合物。
作为富勒烯的多聚体的例子，可例示例如下式的物质。即，有京大的小松的团队将氰化钾和粉碎用铁球加入到钢铁的反应器(capsule)中，赋予每分钟3500次的高速振动而成功合成的、C60的二聚体(C120)和三聚体(C180、下图)、Rubin等人合成的C62、Wudl等人合成的富勒烯的氮原子结合体(C59N)2等。
另外，作为可在本发明中使用的富勒烯类的衍生物的例子，有使氟作用于富勒烯而形成的C60F、C60F18等。


另外，在本发明中也可使用在石墨粉中混入金属、进行激光处理、使其蒸发而合成的，例如下式那样的金属内包富勒烯(式中的M表示金属原子)。作为可在本发明中使用的金属内包富勒烯的具体例子，有钪、镧、铯、钛内包富勒烯等，但不受此限定。

金属内包富勒烯(M@C60) 可在本发明中使用的富勒烯类，也可以使用例如下式那样的原子内包富勒烯(式中的小球体表示原子)。
作为具体例子，有包入了Sc3N、Sc2C2等的(Sc3N)@C80和(Sc2C2)@C84等。

(Sc2C2)@C84和(Sc3N)@C80 作为可在本发明中使用的富勒烯类，是选自富勒烯的开裂体、富勒烯的分裂体、以及它们的衍生物和它们的盐类的1种以上的单体或者混合物。
例如，作为可在本发明中使用的开裂富勒烯的例子，有下式那样的Rubin等人制备的开口富勒烯(open cage fullerene)、小松等人合成的具有空穴的富勒烯(穴ぁきフラ一レン)等。

开口富勒烯
具有空穴的富勒烯 可在本发明中使用的富勒烯类，也包括和修饰或者包合、络合化富勒烯的有机化合物的复合体。作为该有机化合物，作为优选的，可以例示有机低聚物、有机聚合物以及可形成包合化合物或者包合络合物的环糊精(CD)或者冠醚或者它们的类似化合物的1种或者2种以上。
作为有机低聚物或者有机聚合物，优选例如，羧酸酯类、醇类、糖类、多糖类、多元醇类、聚乙二醇、丁二醇、聚丙二醇、聚乙烯基醇等的聚亚烷基二醇或者多元醇类的聚合物、葡聚糖、改性淀粉(pullulan)、淀粉、含羟乙基淀粉以及羟丙基淀粉这样的淀粉衍生物的非离子性水溶性高分子、褐藻酸、透明质酸、壳聚糖、甲壳质衍生物、以及它们的高分子阴离子性或者阳离子性衍生物以及它们的高分子甘油以及脂肪酸类、油类、碳酸亚丙酯、月桂醇、乙氧基化蓖麻油、聚山梨酸酯类、以及它们的酯类或者醚类、以及它们的聚合物、以及它们的聚酯聚合物类、聚乙烯吡咯烷酮等的吡咯烷酮聚合物类、不饱和醇聚合物类的酯类或者醚类以及聚氧亚乙基聚氧亚丙基嵌段共聚物等的物质结合到富勒烯或者其衍生物上，也可以是它们的一种以上的混合物。其中，优选的可例示聚乙二醇(PEG)等的聚亚烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等的各种物质。在PEG、PVP等的聚合物的情况下，对于其平均分子量，通常优选2000～100000左右，作为富勒烯或者富勒烯含氧衍生物的比例，认为摩尔比为10/1以下左右。
所谓的本申请发明的富勒烯类的盐类，可从例如从羟基化富勒烯类，富勒烯酯类的盐类，多羟基化富勒烯类，富勒烯二酯、富勒烯三酯、富勒烯聚酯等的盐类中选择，只要其盐类形成生理学上可接受的盐就可以，作为这些盐的例子，可例举无机盐或者有机盐。
作为这些盐，也可以是碱金属(例如钠、钾等)、碱土类金属(例如钙、镁等)等的金属的盐，或者也可以是和三甲基胺、三乙基胺、吡啶、皮考啉(picoline)、N，N-二苄基乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、三羟基甲基氨基甲烷、二环己基胺等的有机碱的盐。从安全性高、经济性等的观点考虑，作为羟基化富勒烯类以及富勒烯单酯类的盐类，优选从钠、钾、镁、钙、铝选择的一种或者二种以上的金属盐。
另外，可在本发明中使用的富勒烯类，也可包括例如下式表示的环糊精等的包合体或者Boyd等人合成的卟啉络合物(ジョ一ズポルフィリン)、双纳米环环芳(double nanoring cyclophane)富勒烯络合物、中村等人合成的富勒烯-二茂铁(ferrocene)衍生物、富勒烯-苯基衍生物Ph5C60、富勒烯-联苯衍生物等。
作为富勒烯类，具有水溶性的富勒烯衍生物和通过有机化合物得到的改性体或者包合体、以及富勒烯类的盐类，其稳定性高、易溶于水、而且pH可调整，因此细胞毒性低、生物体适应性高，故更适合在本申请发明中使用。例如，富勒烯和通过作为高分子聚合物的PEG(聚乙二醇)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、或CD(环糊精)得到的改性或者包合体、以及1价的盐类，与2价的盐类相比，对水的溶解性还要高，因此优选。富勒烯-PVP、羟基化富勒烯类和富勒烯酯类的钠盐、羟基化富勒烯类和富勒烯单酯类的钠盐是特别合适的。
例如，作为受到关注的富勒烯类的一种，有水溶性的PVP-富勒烯复合体，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)如下式表示，
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 认为在本申请发明中，其重均分子量(Mw)为3000～3000000左右的范围、更优选6000～1500000左右的范围。PVP，可以是合成的，也可以是市售品。此情况下的富勒烯也可以是如上所述的富勒烯衍生物。
另外，可在本发明中使用的富勒烯类，也包括例如下式表示的那样的环糊精等的包合体或者Boyd等人合成的卟啉络合物(ジョ一ズポルフィリン)、双纳米环环芳富勒烯络合物、中村等人合成的富勒烯-二茂铁衍生物和富勒烯-苯基衍生物Ph5C60、富勒烯-联苯衍生物等。

双纳米环环芳富勒烯络合物
ジョ一ズポルフィリン
富勒烯-二茂铁衍生物
富勒烯-苯基衍生物Ph5C60
富勒烯-联苯衍生物复合物
富勒烯-环糊精包合体 另外，可在本发明中使用的富勒烯衍生物，可认为是氧原子直接或者通过亚烷基链等的碳链结合到富勒烯骨架的碳原子上的富勒烯衍生物。可例示例如羟基化率达到50/摩尔·富勒烯以上的-OH基直接结合的羟基化富勒烯等。
作为可在本发明中使用的富勒烯的开裂体、分裂体，可以是以下的化学式表示的富勒烯类的开裂体、分裂体或者内部具有该结构的分子的单体或者复合体。


式中，C是以碳原子表示的富勒烯的部分结构体，2个以上的碳原子可以通过共价键结合(在没有共价键结合的碳存在的情况下，即使式中没有表示出Rn，也表示和Rn结合)，Rn是结合到C上的n个的取代基，分别独立，可相同也可不同，表示氢原子、碳原子、氧原子、氮原子、磷原子、羟基、其羟基和无机酸或者有机酸的酯基、其羟基和糖的配糖体基、其羟基和酮的酮缩醇基、或者其羟基和醛的缩醛基，n是0或者1以上的整数。) 进而作为可在本发明中使用的分裂富勒烯的例子，例如有下式所示的具有C60富勒烯的断片结构的二苯并荧蒽(corannulene)(C20H10)等。

在本申请发明中，含有例如以上所示的作为有效成分、有用成分的富勒烯类的同时，还含有碳数为10以上的长链羧酸、或者其酯或盐也是有效的。而且也可以配混如后所述的油剂、表面活性剂、颜料、保湿剂、赋形剂和基剂、细胞赋活剂等。
在含有富勒烯的外用组合物中含有水分的情况下，其pH因富勒烯、富勒烯衍生物、富勒烯包合化合物、或者其盐类的原体的pH不同而不同，但是在通常情况下，如果pH在3～10的范围内可稳定地配混富勒烯及其衍生物，因此优选。
测定富勒烯、富勒烯衍生物、富勒烯包合化合物或者其盐类的原体在20℃、0.5重量％水溶液的pH，对小数点以下的数字进行四舍五入得到数字设为n(n是0～14的整数)时，在n为3～10的情况下，稳定的外用组合物的pH在n±2的范围内而且pH为3～10的范围内调整pH为宜。另外，将富勒烯、富勒烯衍生物、富勒烯改性或者包合化合物、或者其盐类的原子在20℃、0.5重量％水溶液的pH四舍五入得到数字设为n时，在n为3以下的情况下，稳定的富勒烯外用剂的pH为3～4的范围，在n的pH为10以上的情况下pH为9～10为宜。在任何情况下稳定的含富勒烯外用组合物的pH优选3～10的范围。
本发明的自由基疾病预防治疗组合物可发挥效果的适用症，有以下的自由基直接或者间接相关的部分原因的自由基疾病。具体而言，自由基疾病为心肌梗塞、缺血性心疾病、心衰竭、心绞痛、心率不齐、动脉硬化症、肝脏脂质代谢紊乱、高血脂症、原发性高血压、高血压症、动脉硬化症、冠动脉硬化症、血栓症、闭塞性动脉硬化症、血管疾病、外周血管疾病、胆汁郁滞症、高胆固醇血症、胰损伤、内脏器官衰竭、急慢性肝炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、溃疡性大肠炎、消化器官损伤、胆囊症、糖尿病、关节炎治疗剂、风湿症、肝衰竭、肝损伤、缺血性肝损伤、肝脏脂质代谢紊乱、胆囊损伤、内脏器官移植损伤、糖尿病、中毒症、内脏器官移植损伤、癌、缺血性再灌注损伤、组织的老化、皮肤组织的色素沉积、皮肤组织的皱纹、皮肤组织的皮脂溢、皮肤组织的晒黑、皮肤组织的粉刺、烧烫伤、肥胖、脱发、精神病、痴呆症、帕金森病、感染症等。
本发明的自由基疾病预防治疗用组合物，如上所述，在患有癌(肿瘤)的哺乳动物(例如小鼠、大白鼠、猪、貉、狐狸、猫、家兔、狗、牛、马、山羊、猴、人)的治疗以及预防方面也是有用的。在这些患癌动物的寿命延长和癌转移抑制方面有显著的效果。具体而言，作为本发明的自由基疾病预防治疗用组合物的适用症的癌，指的是肿瘤、良性肿瘤或者恶性肿瘤。而且也可以列举恶性黑素瘤、恶性淋巴瘤、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、尿道肿瘤、胆囊癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝癌、胰脏癌、睾丸肿瘤、上颚癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽头癌、喉头癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑肿瘤、卡伯希肉瘤、血管瘤、白血病、真性红细胞增多、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、骨髓瘤、膀胱瘤、肉瘤、骨肉瘤、或者肌肉瘤，进而也有皮肤癌、基底细胞癌、皮肤附件癌、皮肤转移癌、皮肤黑素瘤等。
此时，从本发明的自由基疾病预防治疗组合物还发挥癌的治疗和癌的预防(也包括抑制转移)的效果的方面考虑，通过进一步含有1种以上的抗肿瘤药，可进一步提高癌的治疗和癌的预防(也包括转移抑制)的效果。作为该抗肿瘤药，可使用例如氧氮芥(R)、环磷酰胺、美法仑、噻替哌、卡波醌、Protecton(R)、白消安、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、异环磷酰胺、巯嘌呤、巯嘌呤苷、阿糖胞苷、达卡巴嗪、氟尿嘧啶、替加氟、盐酸安西他滨、氨甲嘌呤、卡莫氟、UFT(R)、衣诺他滨、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、放线菌素(D)、丝裂菌素C、色霉素A3、盐酸博莱霉素、硫酸博莱霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、新制癌霉素、硫酸培洛霉素、盐酸阿克拉霉素、美雄烷、环硫雄醇、柠檬酸他莫昔芬、二磷己烯雌酚四钠、溶血性链球菌制剂(R)、云芝多糖、香菇多糖、L-天冬酰胺酶、醋葡醛内酯、盐酸丙卡巴肼、氟尿苷、MDSKOWA3000(R)、顺铂、艾去适(R)、西佐喃、鱼精蛋白、肝素共存下的angiostatic steroid、抗癌多糖、层粘连蛋白肽、含有Arg-Gly-Asp-(RGD)序列的抗癌多肽、以及抗癌血小板因子等。
另外，在并用最近报道的抗肿瘤药、鱼精蛋白、肝素共存下的angiostatic steroid、肽聚糖复合体等的多糖、Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH2(CDPGYIGSR-NH2)等的层粘连蛋白肽(laminin peptide)、含有Arg-Gly-Asp-(RGD)序列的肽、血小板因子-4(Platelet factor-4)以及天然型或者基因工程的方法得到的干扰素等的抗癌药和本发明的有效成分的情况下，也可提高癌转移抑制效果。
进而，如果将上述的已有的癌转移抑制剂给予生物体，在人的情况下有时候出现白细胞减少、血小板减少、出血、贫血、食欲不振、恶心、呕吐、口内炎症、腹泻、出疹、脱发、皮肤的色素沉积、发热、倦怠感、头痛、肝功能障碍、蛋白尿、浮肿、过敏症等的副作用，但如果并用本申请发明的有效成分、即富勒烯类，可减轻这些副作用。
另外，作为本发明的自由基疾病预防治疗组合物的适用症的缺血性再灌注损伤，具体而言，指的是缺血性心脏病、缺血性再灌注心肌损伤、缺血性肝损伤、缺血性再灌注肝脏损伤、缺血性再灌注肾脏损伤、缺血性再灌注胰脏损伤、缺血性再灌注胆囊损伤、缺血性再灌注循环器损伤、缺血性再灌注消化器损伤、缺血性再灌注肌肉损伤、缺血性再灌注血管损伤、缺血性再灌注眼损伤、缺血性再灌注皮肤损伤。
而且，作为本发明的自由基疾病预防治疗组合物的适用症的感染症，有大肠杆菌等引起的肠内细菌感染症等的细菌性感染症、肝炎病毒引起的肝炎、HIV引起的后天性免疫缺陷综合症(AIDS)、鼻病毒(Rhinovirus)引起的感冒、流感病毒引起的流感等的病毒性感染症、念珠菌(candida)属真菌引起的念珠菌症等的真菌性感染症、疟疾(malaria)原虫引起的疟疾等的寄生虫性感染症。
这些疾病或者以下所示的疾病由自由基引起的或者其原因因素之一是生物体内的自由基，在以下的文献中有所报道，“活性氧素と病態”井上编、学会出版センタ一、1992以及“抗酸化物質”二木他编、学会出版センタ一、1994以及“现代医療”vol.25，No.10,1993以及这些书籍中记载的文献等。
在作为本发明的自由基疾病预防治疗用组合物的对象的自由基疾病之一中，有为了交换组织而进行的内脏器官移植时的内脏器官衰竭以及组织障碍。即、可例举心脏、肝脏、肾脏、胰脏、胆囊、胸腺、胃、肺、肠、皮肤等的内脏器官移植手术、冠动脉再疏通手术等的血管及其旁路(bypass)手术以及以下记载的疾病或事情而引起的流入细胞或者组织中的血流停止或者停滞所伴随的内脏器官障碍以及这些血流停止后再灌注时或其后发生的细胞或组织的损伤、弊死、或者对内脏器官衰竭的损伤等，对这些疾病也有效果。另外，作为本发明的自由基疾病预防治疗用组合物对象的其它的自由基疾病，可例举在作为本发明的对象的上述内脏器官中附带的血管的血栓症、贫血症、阻血症、血管硬化症、血管收缩症、出血(OBAYASHI，PROC.SOC.EXP.BIOL.WED.，196，196，164-169，1990)等引起的血流速度的物理性降低或者停止而伴有的细胞或者组织的损伤、弊死或包含血管的内脏器官的疾病以及衰竭等，对它们也有效果。
另外，作为本发明的自由基疾病预防治疗用组合物的对象的其它的自由基疾病，也包括因血管内的氧压力下降等引起的缺氧以及农药或者一氧化碳中毒症等的因化学物质而引起的细胞或者组织的缺氧障碍组织的临时缺氧等，可例举根据此后的输血等的适当处置或者事情的状态，血流重新以正常或者接近于正常的状态输送到细胞或者组织时出现的细胞或者组织的损伤、弊死或包含血管的内脏器官的疾病以及衰竭等，对它们也有效果。
另外，本发明的自由基疾病预防治疗用组合物，特别有效果，作为成为其对象的自由基疾病的缺血性再灌注疾病类的具体例子，可例举缺血再灌注心肌损伤(NARITA.W.J，J.LAB.CLIN.MED.，110，153-158，1987、Smith，L.L.Phil.Trans.R.Soc.Lond.，311，647-657，1985)、缺血再灌注肝脏损伤(INOUE，M，INMUCOSALIMMUNOLOGY，527-530，ELSEVIER，AMSTERDAM，1990、中浜、肝臓，321110-1123，1991、竹川、肝臓，30459-467，1989、白杉、日消外会誌、26358，1993)缺血再灌注肾脏损伤、缺血再灌注胰脏损伤(ISAJI，S.MIE MED.J.，35109-123，1985)、缺血再灌注胆囊损伤(TAOKA，GASTROENT.JPN.，26633-644，1991)、缺血再灌注循环器损伤、缺血再灌注消化器损伤(岩井、日消会誌，871662-1669，1990、NAITO，Y.，FREE RED.RES.COMMS.，1613.5，1992)、缺血再灌注肌肉损伤、缺血再灌注血管损伤、缺血再灌注眼损伤等的缺血再灌注皮肤障碍等的缺血再灌注损伤等。在其预防、治疗的任何一方面都有效果。
而且，本发明的自由基疾病预防治疗用组合物，对因活性氧诱发的以下的各种损伤也有效果。作为其具体的例子，有贝且特病(behchetdisesase)、放射线损伤、抗癌药的副作用、细菌性休克、恶病质(cachexia)、自免疫疾病、烧伤、疱疹病毒、成人T细胞白血病、硫氧还蛋白(thioredoxin)综合症、外伤性休克、菌萎缩性侧索(lateral funiculus)硬化症、无性心肌梗塞等。
本发明的自由基疾病预防治疗用组合物，低毒性、可对包括人的哺乳动物经口或者非经口给药。
本发明的自由基疾病预防治疗用组合物，不受特别的限定，可例举经口给药剂、点滴液剂、片剂、粉剂、液剂栓剂、外用剂、软膏、贴剂、滴眼剂、静脉注射液、散剂、颗粒剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、丸剂、悬浮剂、液剂、安瓿剂、注射液、等渗液等，也可在其它的任何形状的药物中应用。其主要有效成分为富勒烯类，有环糊精包合C60富勒烯、羟基化率为50/摩尔·富勒烯以上的-OH基直接结合了的羟基化C60以及C70富勒烯、及其碱金属盐。作为碱金属盐，可例举钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等。
也可以组成和药物上可接受的惰性载体或者稀释剂以及或者其它的药理作用物质的混合物，另外也可以以给药量单位形状进行组合。
另外，也可以根据公知的制剂学的制造方法制成复合体而制剂化。例如，以提高对水的溶解度、促进吸收、提高药理活性为目的，也可以将本发明的主要成分制成和环糊精或者麦芽糖基-环糊精的复合体使用。
本发明的自由基疾病预防治疗用组合物，通常，将这些有效成分和药理学上可接受的载体或者赋形剂混合而形成药物组合物，经口或者非经口使用。
可例举例如，预先将各有效成分制成水溶液，通过冷冻干燥各有效成分制成固形状的混合物，通过对形成了各有效成分的水溶液后的物质进行冷冻干燥分别形成固体形状，有效成分的任一种为水溶液、其它有效成分通过冷冻干燥形成固体形状，分别使各有效成分形成制剂而形成试剂盒等的形状。
本发明，根据公知的制剂学的制造方法，根据需要使用制剂学上可接受的第十二版日本药局方平成三年(广皮书店)等收录的稀释剂、赋形剂等混合这些有效成分，使它们作为一种制剂给药。
另外，采用别的方法，根据需要使用药剂学上可接受的稀释剂、赋形剂等对每一种有效成分进行制剂化，使用要用的稀释剂等制成一种制剂而给药。而且，也可以如上所述将分别进行制剂化了的物质制成试剂盒，将它们分别、同时或者有时间差、制成对于相同的对象通过相同的路径或者不同的路径给药的剂型。
在本发明的组合物是溶液的情况下，也可以使用水溶性剂(例如蒸馏水等)、水溶性制剂(例如生理盐水、林格氏(Ringer)液等)、油性溶剂(例如芝麻油、玉米油、橄榄油等)等溶剂、通过常规方法进行调整。此时，也可以根据需要添加溶解辅助剂(例如水杨酸钠、乙酸钠等)、缓冲剂(例如柠檬酸钠、甘油等)、等渗剂(例如葡萄糖等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如苯甲醇、苯酚等)、无痛化剂(例如氯代苄烷铵、盐酸普鲁卡因等)等的添加剂。
根据需要也可混合药理学上、制剂学上可接受的添加剂(例如、稀释剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、着色剂、稳定剂、增重剂、湿润化剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、矫味剂、矫臭剂、香料、保存剂、溶解辅助剂、溶剂、包衣剂、糖衣剂等)或者使用它们进行制剂化而形成的制剂。
可在本发明的自由基疾病预防治疗用组合物的调制中使用的稀释剂，是制药上可接受的稀释剂，但也指的是指本申请发明化合物以外的材料，可以是固体、半固体、液体或者可吸收的胶囊，可列举各种物质。
例如，通过本发明得到的自由基疾病预防治疗用组合物，可采用已知的任何方法制造，例如将活性成分和稀释剂混合，例如制成颗粒，然后对该组合物进行成形，例如也可以制成片剂。
非经口给药剂应该无菌，或者根据需要应该和血液等渗。作为非经口给药，包括通过注射(例如包括肌肉静脉注射点滴)、经肛门(栓剂)的给药。
本发明的组合物其自身也可成为癌转移抑制剂，因此在制剂以及组合物中作为活性成分的富勒烯类或者其盐类通常优选含有0.001～100重量％。
作为用于经口给药的组合物，进一步可例举片剂、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、喷雾剂等。该组合物可通过自身公知的方法制造，作为载体或者赋形剂，可使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸单酯镁等。
可制成例如注射剂、栓剂、贴剂、滴眼剂、外用剂等用于非经口给药，作为注射剂，例如可作为静脉注射剂、皮下注射剂、肌肉内注射剂、点滴注射剂等使用。注射剂通常以填充到适当的安瓿中而被提供。作为赋形剂，可例举例如直肠栓剂、阴道栓剂等。作为外用剂可例举例如软膏、经鼻给药剂、经皮制剂等。
例如，在制成外用剂时，可根据自身公知的方法将本申请发明的组合物制成固体状、半固体状或者液体状的外用剂。例如，作为上述固体状的外用剂，使本申请发明的组成原封不动或者添加混合赋形剂(例如甘油、甘露醇、淀粉、微晶、纤维素等)、增稠剂(例如天然橡胶类、纤维素衍生物、丙烯酸聚合物等)等制成粉状的组合物。
作为上述液体状的外用剂，和注射剂的情况大体相同，制成油性或者水性悬浮剂。在半固体的情况下，可以是水性或者油性的凝胶剂、或者软膏状的外用剂。
另外，这些制剂的任何一种，也可以加入pH调节剂(例如碳酸、单酯、柠檬酸、盐酸、氢氧化钠等)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、氯代苄烷铵等)等。在制成栓剂时，可根据自身公知的方法，将本申请发明的组合物制成油性或者水性的固体状、半固体状或者液体状的栓剂。
已经明确的是，使本发明的自由基疾病预防治疗用组合物、注射剂等的溶液中的富勒烯类的分子团的直径为10纳米以下，可得到均匀的解离性溶液，由此可避免在外周血管等中的血流停止的危险性。含有本发明的富勒烯类的自由基疾病预防治疗用组合物，在小鼠、大白鼠、比格(beagle)狗的急性毒性试验中，LD50＝1000mg/Kg以上，毒性低，另外在大白鼠上进行的亚急性毒性试验中即使最大为500mg/Kg/day的给药，也没有发现异常，从这些结果证明了本发明的自由基疾病预防治疗用组合物的安全性高。
而且，在本发明的组合物中配混的富勒烯类的浓度，相对于本发明的富勒烯疾病预防治疗用组合物，相对于全部重量配混0.01～1000ppm，但如果考虑在血液中的良好溶解性，优选0.1～100ppm。
根据稳定剂、效果活性剂等的目的可配混到本发明的自由基疾病预防治疗用组合物中的物质的例子，可例举选自通常作为添加剂而使用的以下物质的1种或者2种以上的混合物，即米特腊唑(metrazole)、ェトプシド、胆酸类、二甲基亚砜、磷酸腺苷类、聚乙二醇类、聚丁二醇类等的水溶性高分子化合物类，氯化钠、氯化钾、氯化镁等的无机的盐类，柠檬酸、苹果酸、磷酸、乙二胺四乙酸、草酸、乳酸、丁酸、乙酸、抗坏血酸、异抗坏血酸、氰酸、氨基酸等的有机酸类以及它们的有机酸盐类，或者丙二醇、丁二醇、甘油等的多元醇类。
上述的胆汁酸类可从胆汁酸、脱氢胆汁酸、脱氧胆汁酸或者其钠、钾等的碱土类金属盐选择。上述的腺苷磷酸类，可从腺苷-5′3磷酸、腺苷-5′2磷酸、腺苷酸(adenylic acid)等的腺苷的磷酸酯类中选择。
作为本发明的自由基疾病预防治疗用组合物的剂型，从给药方法的简便性、效果考虑，优选经口剂、外用剂和注射剂。本发明的药剂，可将上述的纯物质或者他们的混合物和公知的药物用载体组合进行制剂化，优选采用效果最好、给药方法简便的注射剂、点滴用剂的静脉注射给药法。
此处，如果考虑作为注射剂或者经口给药剂使用，优选对水溶解性高的物质，因此富勒烯类的水合物或者结晶水附加物对水的溶解性比其无水物高，因此是有用的。
本发明的富勒烯类的水附加物或者结晶水附加物的水分或者结晶水的含量，不受特别的限定，但为了保持更良好的溶解性，水分含量保持在1％～50重量％、更优选5％～20重量％，在结晶水的情况下保持1～20水盐、更优选1～10水盐的范围的水分子的富勒烯类的水分附加物或者结晶水附加物是优选的。
对本发明的富勒烯类的给药量进行说明，因症状、年龄、性别、体重、剂型、给药方式的不同而不同，例如在经口给药、栓剂给药、外用剂等的情况下，通常成人每天每1kg为0.001～8500mg。优选1～100mg的范围。另外在静脉注射、点滴的情况下，通常成人每天每1kg体重可1次或者分为数次给药0.025～200mg、优选0.25～100mg的范围。
另外，在通过静脉注射给予本发明的药剂的情况下，使本发明的注射液中的溶解物质的总量为1g/kg/小时以下的速度向静脉等静脉注射或者点滴本发明的注射液，其量为人的每1kg体重为0.1～50cc。在注射液的溶解物质量的合计达到20％以上的高浓度时，也可以从低浓度的液体开始，慢慢地提高浓度进行给药。本发明的富勒烯类的给药量因制剂种类、给药方法不同而不同，但通常1次或者分数次以1μmg/kg体重/day～10mg/kg体重/day进行给药。另外，特别是在伴随着内脏器官移植、心脏的血管旁路手术等手术的手术时的重度的缺血再灌注时以及重度的贫血、低血压、心脏停止、缺氧症等之后的再灌注、再氧化等的全身性的缺血再灌注时，如果给药本发明的富勒烯类以及开裂富勒烯类及其衍生物盐为100mg/kg体重/day以上，可获得更好的效果。
本发明的自由基疾病预防治疗用组合物，通过调整本发明的富勒烯类以及开裂富勒烯类及其衍生物盐的种类和量而添加该组合物，或者向本发明的富勒烯类以及开裂富勒烯类及其衍生物盐中添加可调整渗透压的添加物，可增大液体剂的主要成分即富勒烯类以及开裂富勒烯类及其衍生物盐对组织细胞的渗透压，得到更好的效果。作为可调整渗透压的添加物，可以是选自氯化钠、氯化钾等的无机盐类，ATP、苹果酸、柠檬酸等的有机酸类或者其钠等的有机酸盐类，葡萄糖、果糖等的糖类等的1种或者2种以上的复合物等，只要是生理上可接受的添加物，就不受特别限定。
另外，通过在本发明的自由基疾病预防治疗用组合物中添加抗氧化剂可提高成人病治疗或者预防效果。作为抗氧化剂，可以并用从以下物质中选择的1种或者2种以上的混合物进行添加，即维生素B、L-抗坏血酸、生育酚以及L-抗坏血酸-2-磷酸或其它的サッカロ-是L-抗坏血酸这样的抗氧化微生素衍生物，泛醌、尿酸、半胱氨酸(cysteine)、谷胱甘肽(glutathione)、谷胱氨肽过氧化酶、SOD、柠檬酸类、磷酸类、多酚类、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠、噻二丙酸二月桂酸酯、コトコリェノ一ル、硫辛酸(lipoic acid)、甲苯基双胍、降二氢愈疮木酸、对羟基苯甲醚、丁基羟基苯甲醚、二丁基羟基甲苯、硬脂酸抗坏血酸酯、棕榈酸抗坏血酸酯、没食子酸辛酯、没食子酸丙酯、类胡萝卜素、黄酮类(flavonoid)、丹宁、木聚糖、皂苷、苹果提取物、丁香提取物等、核酸类、汉方药类、海草类、无机物以及在日本药局方中有保持抗氧化功能的记载的已有的抗氧化剂。
作为本发明的自由基疾病预防治疗用组合物的有效成分的富勒烯类，在用于抑制这样的抗氧化剂、特别是抗坏血酸的氧化分解、使其稳定化的制剂的制造时、保存期间、在消化道中几乎不随着时间分解。另外，通常如果抗坏血酸进入生物体内，被生物体中、特别是消化道中的食物等中含有的自由基分解、在到达目标细胞之前水解而失活，但本申请发明的有效成分即富勒烯类稳定，因此不失活、被营养吸收细胞吸收到体内。
而且，根据本发明人等的研究结果，富勒烯类显示出极其高的细胞吸收性。由此证明了可以提高细胞内抗坏血酸浓度，与富勒烯比较最大约30倍、与抗坏血酸比较最大也约2倍。由此可推定，本发明的自由基疾病预防治疗用组合物，如上所述，可发挥抗坏血酸没有被确认的癌转移抑制作用。
而且，根据以前所没有报道的新的机理可证明富勒烯类发挥癌转移抑制作用。通常，因为癌细胞具有移动性能，因此癌细胞可以从病灶侵入血管进行移动，向广范围的内脏器官中转移进行增殖，因此显著缩短寿命。
另一方面，本发明的富勒烯类的抗肿瘤作用经确认证明，特别是通过抑制癌细胞从病灶向血管内皮的移动性能、结果抑制癌的转移，由此发挥癌转移抑制作用。发现给药了本申请发明的富勒烯类的癌细胞，显示出对血管内皮极其低的浸润率。确认该作用是富勒烯类独有的作用。
如上所述，作为本发明的自由基疾病预防治疗用组合物的有效成分的富勒烯类，抑制抗坏血酸的氧化分解使其稳定化。另外富勒烯类显示出极其高的细胞吸收性，可高效率地提高细胞内抗坏血酸浓度，因此可最大限度地发挥抗坏血酸的抗肿瘤作用。可认为富勒烯类的抗肿瘤作用，是通过特别是抑制肿瘤细胞向血管内皮的浸润、结果抑制癌细胞的转移，由此发挥抗癌作用。
本发明的自由基疾病预防治疗用组合物可以应用于药物、准药物、化妆品、功能性食品。本发明的组合物，可制成粉剂、液剂、片剂、凝胶剂、乳剂、胶囊剂等全部的剂型、具体而言，可应用于饮用药、注射药、软膏、栓剂、外用剂等。更具体而言，可作为洗剂(lotion)、乳液(milk lotion)、膏(cream)、膜(pack)、洗发剂(shampoo)、洗涤用品、生发剂、护发剂、染发剂、整发剂、牙膏、含簌剂、沐浴剂等的产品利用，不受特别限定。
本发明中的化妆品，可作为分类为粉底霜、底粉(power)、眼影粉、眼线笔、眉黛(eyebrow)、腮红(cheek)、口红、指甲油(nailcolor)等的彩状化妆品；乳液、膏、洗剂、炉甘石洗剂(calaminelotion)、防晒剂、晒黑剂(suntan agent)、刮脸后洗剂(after shavelotion)、刮脸前洗剂(pre shave lotion)、面膜剂、针对粉刺化妆品、精华液(essence)等的基础化妆品；洗发剂、洗剂用品、护发素(conditioner)、染发剂(hair color)、生发油(hair tonic)、定型剂(set agent)、护发剂、长效剂(permanent-agent)等的头发化妆品；爽身粉(body power)、除臭剂、脱毛剂、肥皂、洗澡液(body shampoo)、沐浴剂、洗手皂(hand soap)、香水等，作为各种化妆品使用。
作为本发明的剂型，没有特别限定，可使用二层状、油包水型乳剂、水包油型乳剂、凝胶(gel)状、喷雾状(spray)、摩丝状(mosse)、油性、固体状、片状、粉末状等现有公知的剂型。
如上所述，本发明提供自由基疾病预防治疗用组合物，其通过以作为有效成分的在生物体内显示高的自由基清除活性的富勒烯类为主要成分，在制剂中以及保存中稳定、对生物体副作用少、安全、有效。
实施例 以下举出实施例、比较例对本发明进行说明。当然，本发明不受这些例子的限定。
A自由基疾病预防治疗用组合物对各种疾病的效果 A-1组合物的制造 实施例1注射溶液A 将环糊精包合C60富勒烯和环糊精包合C70富勒烯以重量比8∶2均匀混合了的混合物，以178ppm的浓度完全溶于1000cc的医药用林格氏液后，用注射液制造用除菌过滤器进行灭菌过滤，制造注射溶液作为本发明的静脉注射用自由基疾病预防治疗药。
实施例2注射溶液B 将羟基化率为87％(摩尔换算)的羟基化C60富勒烯以及羟基化率为61％(摩尔换算)的羟基化C70富勒烯以重量比8∶2均匀混合了的混合物，以5ppm的浓度完全溶于1000cc的医药用林格氏液后，用注射液制造用除菌过滤器进行灭菌过滤，制造注射溶液作为本发明的静脉注射用自由基疾病预防治疗药。
实施例3注射溶液C 以1％的浓度将ビタミン C60バィォリサ一チ公司制造的商品名为ラジカルポンジ(富勒烯浓度为200ppm)的富勒烯完全溶于1000cc的医药用林格氏液后，用注射液制造用除菌过滤器进行灭菌过滤，制造注射溶液作为本发明的静脉注射用自由基疾病预防治疗药。
实施例4注射溶液D 以1％的浓度将分别配混了10ppm的ビタミン C60バィォリサ一チ公司制造的富勒烯衍生物C60、C70、C120、(C59N)2、C180、C62、C60F、C60F18、开口富勒烯、有空穴富勒烯、11种二苯并荧蒽的浓度110ppm的PVP富勒烯复合物完全溶于1000cc的医药用林格氏液后，用注射液制造用除菌过滤器进行灭菌过滤，制造注射溶液作为本发明的静脉注射用自由基疾病预防治疗药。
实施例5水溶性外用剂以及化妆品洗剂(lotion) 以将环糊精包合C60富勒烯以及环糊精包合C70富勒烯以重量比8∶2均匀混合了的混合物的25重量％、羟基化率为87％(摩尔换算)的羟基化C60富勒烯以及羟基化率为61％(摩尔换算)的羟基化C70富勒烯以重量比8∶2均匀混合了的混合物的25重量％、ビタミンC60バィォリサ一チ社制造的商品名为ラジカルスポンジ(富勒烯浓度为200ppm)的富勒烯的50重量％的组成进行混合而形成的富勒烯类的复合物，以1重量％使其分散溶解于精制水90％、甘油4％、丁二醇5重量％中，制成富勒烯类的水溶性外用剂以及化妆品洗剂。
实施例6经口给药用粉剂 以将环糊精包合C60富勒烯以及环糊精包合C70富勒烯以重量比8∶2均匀混合了的混合物的25重量％、羟基化率为87％(摩尔换算)的羟基化C60富勒烯以及羟基化率为61％(摩尔换算)的羟基化C70富勒烯以重量比8∶2均匀混合了混合物的25重量％、ビタミンC60バィォリサ一チ社制造的商品名为ラジカルスポンジ(富勒烯浓度为200ppm)的富勒烯45重量％以及二苯并荧蒽(C20H10)的5重量％的组成进行混合而形成的富勒烯类的复合物，以1％重量浓度在甘露醇中进行稀释，制成以下疾病的预防治疗用的经口用粉剂，即心肌梗塞、心脏衰竭、心绞痛、心率不齐、动脉硬化症、肝脏脂质代谢紊乱、高血脂症、原发性高血压、高血压症、动脉硬化症、冠动脉硬化症、血栓症、闭塞性动脉硬化症、血管疾病、外周血管疾病、胆汁郁滞症、高胆固醇血症、胰损伤、内脏器官衰竭、急慢性肝炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、溃疡性大肠炎、消化器官损伤、胆囊症、糖尿病、关节炎治疗剂、风湿症、肝衰竭、肝损伤、肝脏脂质代谢紊乱、胆囊损伤、内脏器官移植损伤、糖尿病、中毒症、内脏器官移植损伤、癌、组织的老化、皮肤组织的色素沉积、皮肤组织的皱纹、齿根骨膜炎、皮肤组织的皮溢脂、皮肤组织的晒黑、皮肤组织的粉刺、烫伤、肥胖、脱发、精神病、痴呆症、帕金森病、HIV引起的AIDS、感冒、流感。
A-2评价 (效果试验) 使用由上述的实施例的自由基疾病预防治疗药组成的试验区和对照区(仅仅林格氏液)的注射液，通过以下的实验对本发明的药物用组合物的效果进行比较确认。
1)对心疾病的效果试验 对大白鼠开胸，对左冠动脉前降支(anterior descending branch)结扎15分钟后，再开通血流。预先在冠动脉闭塞15分钟前对大白鼠静脉内给药5mg/kg的本发明实施例1的药物用组合物作为试验区，作为对照区，和试验区同样只注入林格氏液。从实验前开始采用化学发光法(chemical luminescence)测定末梢血中的自由基依存性化学发光，结果确认再灌注后就立即有显著的自由基上升。虽然冠脉闭塞中在心电图检测器上没有发现明显的心率不齐，但如果再开通血流，在数秒以内只在对照区中出现了心疾病的指标即明确的心率不齐。但是在静脉内给药了本发明的实施例1的注射液的区中，在对照区看到的心率不齐明确地受到抑制，证明了本发明的自由基疾病预防治疗用组合物对心疾病的效果。
2)对肝障碍的效果试验 阻断大白鼠门脉以及冠动脉20分钟后再开通60分钟血流后，用戊二醛对肝脏灌注固定、用电子显微镜观察。另外，从实验前开始用化学发光法测定末梢血中的自由基依存性化学发光，结果确认血流再开通后就立即有显著的自由基上升。预先在阻断大白鼠门脉和冠动脉15分钟前对大白鼠静脉内给药5mg/kg的本发明的实施例2的注射液作为试验区，作为对照区和试验区同样只注入林格氏液。电子显微镜观察的结果可知，在对照区中Disse腔、肝细胞间隔以及微小胆管显著增大，细胞内出现许多空胞、明显确认在肝脏细胞中出现病态，但在给药了本发明的注射液的试验区的电子显微镜观察中，肝脏的组织结构保持正常，证明了本发明的自由基疾病预防治疗用组合物对肝疾病的效果。
3)对胰脏疾病的效果试验 阻断大白鼠冠动脉20分钟后再开通60分钟血流后，制作胰脏疾病模型，测定冠动脉阻断前以及血流再开通后第4小时时血液中的淀粉酶。从实验前开始用化学发光法测定末梢血中的自由基依存性化学发光，结果确认血流再开通后就立即有显著的自由基上升。预先在阻断大白鼠冠动脉15分钟前对大白鼠静脉内给药5mg/kg的本发明的自由基疾病预防治疗组合物即实施例3的注射药作为试验区，作为对照区和试验区同样只注入林格氏液。血中淀粉酶测定的结果表明，在对照区中血中淀粉酶水平与阻断前的水平比较，非常高，有最大为6000U/dl的个体，出现了胰脏疾病的病态。但给药了本发明的注射药的试验区的血中淀粉酶水平最大个体为1000U/dl，和阻断前的正常的状态比较，出现若干的淀粉酶的上升倾向，但和对照区比较，非常低，证明了本发明的自由基疾病预防治疗用组合物对胰脏疾病的效果。
4)对肾损伤的效果试验 阻断大白鼠冠动脉20分钟后再开通60分钟血流后，制作导致了肾脏组织障碍的肾疾病模型，测定冠动脉阻断前以及血流再开后5天的平均尿中蛋白。从实验前开始用化学发光法测定末梢血中的自由基依存性化学发光，结果表明血流再开通后就立即有显著的自由基上升。预先在大白鼠冠动脉阻断15分钟前静脉内给药5mg/kg的实施例4的注射药作为试验区，作为对照区和试验区一样只注入林格氏液。再灌注后5天的平均尿中蛋白测定的结果表明，在对照区中尿中蛋白水平与阻断前的水平相比非常高，明显出现了肾疾病的病态，但给药了本发明的注射药的试验区的尿中蛋白水平与阻断前的正常的状态比较，虽出现了若干的尿中蛋白的上升倾向，但和对照区比较非常低，证明了本发明的自由基疾病预防治疗用组合物对肾疾病的效果。
5)对内脏器官衰竭症的效果试验 利用大白鼠冠动脉闭塞模型进行5分钟全身缺血，其后再开通血流。从实验前开始用昭和电工制化学发光器测定末梢血中的自由基依存性化学发光，结果表明血流再开通后就立即有显著的自由基上升。预先在大白鼠冠动脉阻断15分钟前静脉内给药5mg/kg的实施例3的注射药作为试验区，作为对照区和试验区同样只注入林格氏液。血流再开通后，5天、每天1次注入同量的本发明的自由基相关的疾病药物，10天后解剖，用45Ca放射自显影法(autoradiography)/影像分析仪(image analyzer)求出心脏、肝脏、肾脏、胰脏、胆囊的细胞坏死指数。对照区的大白鼠在缺血后各内脏器官中确认多个细胞坏死的迟发性细胞死亡，但在注入了本发明的注射药的大白鼠(rat)(1组10只)中确认可显著防止各细胞的坏死。
6)对内脏器官衰竭的比较效果试验 通过大白鼠冠动脉闭塞模型，施加5分钟全身缺血，之后再开通血流。从实验前开始用昭和电工制化学发光器测定末梢血中的自由基依存性化学发光，结果表明血流再开通后就立即有显著的自由基上升。预先在大白鼠冠动脉阻断15分钟前对大白鼠静脉内给药5mg/kg的实施例2的注射液作为试验区，作为对照区和试验区同样只注入配混了人Cu-Zn型SOD的林格氏液。血流再开通后，5天、每天1次注入同量的本发明的上述的药物用组合物，10天后解剖，用45Ca放射自显影法/影像分析仪求出心脏、肝脏、肾脏、胰脏、胆囊的细胞坏死指数。对照区的大白鼠用45Ca放射自显影法/影像分析仪观察，在缺血后各内脏器官中出现很多细胞坏死的迟发性细胞死亡，但在注入了本发明的注射药的大白鼠(1组8只)中确认可显著防止各细胞的坏死。
7)对皮肤疾病的比较效果试验 因为据称和自由基相关的皮肤的疾病、即因日光产生的色素沉积、皮肤的皱纹、口腔内的齿根骨膜炎、皮肤组织的皮脂溢、粉刺、烫伤、脱发等而烦恼的男女513人中，对于224人作为对照(control)区在口腔内只使甘露醇滞留3分钟，剩余的289名患者作为试验区，早晚一日2次每次5cc(每天10cc)涂布实施例5的水溶性外用剂3个月或者仅仅在齿根骨膜炎的情况下和漱口液一起在口腔内滞留3分钟进行漱口每隔一周时间记录症状，结果发现试验区的289人中的193人中出现了某种改善倾向，21人中出现恶化倾向。与此相对，213人的对照区的患者中25人中出现了某种改善倾向，19人中出现恶化倾向。剩余的患者的病状没有变化。即使对于各个病状分别研究其统计学上的有效性，同样确认了在试验区的治疗效果，但在对照区没有变化。这些结果证明了本发明的自由基疾病预防治疗药物对上述的皮肤疾病有效果。
B自由基疾病预防治疗用组合物对癌的效果 B-1组合物的制造 实施例7片剂 使用表1所示组成的富勒烯类的配混物，制造表2所示的本发明的自由基疾病预防治疗用组合物。
表1 予以说明的是，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)修饰复合化富勒烯PVP-富勒烯通过例如以下的方法调制。
即，首先在室温下将溶解于甲苯(1.0ml)中的混合富勒烯(C60∶C70＝3.5∶1mol/mol)(0.8mg)的搅拌溶液添加到PVP分子量60000(100mg)的氯仿溶液中。充分混合后，在减压下使溶剂蒸发，将残渣溶解于2.0ml的Milli-Q(注册商标)水中，共沸蒸馏悬浮溶液，馏去甲苯。
由此得到富勒烯.PVP复合体水溶液。另外，蒸发除去水得到粉末。
另外，表中所示的多羟基化富勒烯，是24个羟基结合到富勒烯分子上而形成的，其Na盐化合物，是在所结合的羟基的四个上进行Na取代而形成的。
另外，对于富勒烯聚酯，是通过乙酸对羟基化富勒烯的2个羟基进行酯化而形成的。对于Na、Na-K盐，是通过乙酸对2个羟基酯化、其它的2个羟基通过Na或者Na和K进行取代而形成的。
表2 利用通常的打片机，根据常法对以上述表2的处方(重量％)充分混合后的原料进行打片，制造了本发明的片剂。
实施例8粉剂 以表3的处方(重量％)混合粉碎，制造了本发明的粉剂。
表3 实施例9注射液 将灭菌处理后的上述表1记载的化合物(处方编号1-10)各1g溶解于无菌注射用5％葡萄糖液中，使其为100ml，用0.2μm膜过滤器过滤，装入10ml的注射用安瓿中，得到注射液。
实施例10注射液 采用下面的表4的处方(重量％)将以下的本申请发明的有效成分5重量％溶解于注射用5％葡萄糖液后，用0.2μm膜过滤器过滤，采用常法除去热源(pyrogen)后，制造本发明的自由基疾病预防治疗用组合物的注射液。
表4 实施例11点滴注射溶液 将灭菌处理了的上述表1记载的化合物(处方编号1-10)各5g溶解于点滴用5％葡萄糖液500ml后，用0.2μm的膜过滤器过滤，得到点滴注射溶液。
实施例12胶囊剂 混合上述表1记载的化合物(处方编号1-10)各20mg、玉米淀粉70mg、硬脂酸单酯镁5mg，装入明胶胶囊中得到胶囊剂。
实施例13散剂 混合上述表1记载的化合物(处方编号1-10)各1g和结晶性乳糖10g，得到散剂。
实施例14膜片 将上述表1记载的化合物(处方编号1-10)各20mg、马铃薯淀粉20mg、结晶纤维素30mg、乳糖20mg、无水单酯氢化钙15mg、蔗糖脂肪酸酯5mg、偏硅酸铝酸镁3mg打片后，用羟丙基甲基纤维素10mg得到膜片。
实施例15经口糖浆 在经口用糖浆液中悬浮上述表1记载的化合物(处方编号1-10)，得到经口糖浆。
实施例16软膏 根据下表5的处方，通过常法制造了本发明的自由基疾病预防治疗用组合物的外用剂(软膏)。
表5 实施例17液剂 根据下表6的处方，通过常法制造了本申请发明的自由基疾病预防治疗用组合物的液剂。
表6 B-2评价 试验例1稳定性试验 PVP·富勒烯(PVP分子量60000)、富勒烯单酯和富勒烯单酯的盐类在水溶液中的稳定性的差异(10天的室温保存试验)示于表7中。可知，富勒烯类与种类无关，都是稳定的，但是抗坏血酸即使在精制水中，随着时间也容易水解。
表7 予以说明的是，稳定性是通过将上述物质的0.1％水溶液(精制水)在室温下放置10天、采用HPLC法测定残存率进行评价。
试验例2细胞内吸收性(细胞内输送)试验 以8万个/cm2播种牛大动脉血管内皮细胞BAE2，18小时后，以分别相当于正常人血中浓度范围内的50μM的浓度给药富勒烯、抗坏血酸、上述表1的处方编号1～13的本申请发明的富勒烯类，22小时后，采用电量分析/ECD(电化学检测)-HPLC(高效液相)对细胞内的富勒烯类以及抗坏血酸类的存在量进行定量。采用〔14C〕聚乙二醇/气相色谱测定细胞内含水量，结果为0.598pL/细胞。结果表明，例如给药了PVP·富勒烯(PVP分子量为60000)和抗坏血酸情况下的各个细胞内富勒烯浓度为565μM、60μM，以细胞外浓度的11.3倍、1.2倍的浓度在细胞内进行浓缩、蓄积。在其它的富勒烯类的情况下也得到几乎同样的结果。这样显示出富勒烯类与抗坏血酸比较，其细胞内输送格外优异。
试验例3细胞移动性(细胞趋触性(thigmotaxis))试验 在体双室(body double chamber)的上室中播种20万个人纤维肉瘤细胞HT1080，所述体双室含有在上面涂布作为再构成基底膜的基质胶(matrigel)、在下面涂布作为细胞外基质(matrix)的纤维结合素(fibronectin)的小孔8μm的多孔膜。3.5小时后，对浸润到下室内的浸润癌细胞的数量进行Diff-Quick染色，用CCD照相机/マルチバィォスキャナ一测定，确认了本申请发明的富勒烯类癌转移抑制作用。在癌细胞中，预先18小时给药抗坏血酸、以及上述表1的处方编号1-13的本申请发明的富勒烯类。其结果为，在没有给药时的浸润癌细胞的数量为12400个，但在给药的任何情况下浸润癌细胞都显著减少，例如，在PVP·富勒烯(PVP分子量60000)的情况下给药300μM以及400μM，浸润癌细胞的数量变为8960个和356个。另外，采用电量分析/ECD-HPLC法测定细胞内的抗坏血酸浓度，其结果为，在给药了抗坏血酸、以及表1的处方编号1-13的本申请发明的富勒烯300μM时，分别为103、2700～2800μM。由这些结果确认了本申请发明的富勒烯类的给药区可最大地抑制癌细胞转移。另外，教导出该效果是因为本申请发明的富勒烯类可最大限度地提高细胞内富勒烯浓度产生的。
试验例4效果试验I 在自然发病高血压大白鼠(SHR大白鼠)(每组各5只)的背部皮下移植大白鼠的自然发生乳癌细胞(SST-2)1×100000个，35天后屠宰大白鼠测定肺重量以及菌落(colony)形成数，观察SST-2的肺转移的程度。上述表1的处方编号1的本申请发明的化合物给药组是从移植7天前到移植后34天经口给药以及皮下注射50以及100mg/大白鼠，将皮下肿瘤重量、肺重量以及转移的菌落形成数和无处理对照组进行比较。结果示于表8中。
表8 由该结果确认了在本发明的化合物给药区有抑制向肺转移的作用。
试验例5效果试验II 在自然发病高血压大白鼠(SHR大白鼠)(每一组各5只)的背部皮下移植大白鼠的自然发生乳癌细胞(SST-2)1×100000个，35天后屠宰大白鼠测定肺的重量以及菌落形成数，观察SST-2的肺转移的程度。上述表1的处方编号1的本申请发明的化合物给药组试验了载体给药以及和表9所示的已知的抗癌药的并用给药。从移植7天前到移植后34天经口给药50mg/1天/大白鼠的本申请发明的化合物、对于已知的抗癌药，文献记载(医薬品要覧第4版、p1474-1509、薬業時報社、1989)的单独使用浓度的最小量，将皮下肿瘤重量、肺重量以及转移的菌落形成数和给药了本申请发明的化合物的组进行比较。与本申请发明的化合物载体给药区比较，将癌转移抑制效果得到确认的记为○标记，不是的情况记为×标记，结果示于表9中。
表9 由该结果确认了在本申请发明的化合物和已知的抗癌药的并用区中与本申请发明的单独给药比较，具有更高的抑制向肺转移作用。
试验例6小鼠的皮肤癌转移的抑制效果的评价 使用上述表1的处方编号1的化合物，在以下的条件下给药小鼠，评价小鼠的皮肤癌转移的抑制的效果。
(小鼠)C57BL/6、8周龄雌性 (细胞)B16BL6(10万cells/0.2ml) (给药法)尾静脉注射，5连续给药 (饲养时间)14天 其结果示于图1中。确认了PVP·富勒烯复合体抑制皮肤癌的转移。
试验例7癌浸润试验 使用上述表1的处方编号1、即PVP·富勒烯(PVP分子量60000)，和试验例3同样，使用浸润细胞B16BL6(15scells/0.2ml)进行癌浸润试验。在试验中，进行“同时处理”和“前处理hr”，所述的“同时处理”指的是在就要使癌细胞浸润到再构成基底膜之前给药PVP·富勒烯，所述的“前处理hr”指的是在使癌细胞浸润到再构成基底膜1小时前给药PVP·富勒烯，缓慢搅拌培养1小时，防止细胞粘结、其后使其浸润。
另外，使用基质胶(0.12mg/ml)40μl。与非给药的情况以及只给药PVP(分子量60000)的情况进行了比较。其结果示于图2中。
如图2所示，证明了PVP·富勒烯显著抑制癌细胞转移。
如上所述，本发明的疾病预防治疗组合物，和容易被氧化、在制剂化过程或者制剂化后难以保持品质的、使用现有的抗氧化剂作为主剂的自由基疾病药物比较，即使在制剂中以及生物体中也不失去活性、达到稳定化、而且安全性高、几乎没有副作用，具有优异的自由基消除活性，因此可提供广范围的自由基疾病预防治疗药物、即对成人病、癌及其转移抑制、感染症等、而且特别是对各种缺血性疾病具有有效活性的药物。作为对于正在社会化的自由基疾病的预防或者治疗药物，在很广泛的范围内有用。
权利要求
1.自由基疾病预防治疗用组合物，其特征在于，含有富勒烯、富勒烯衍生物或者通过有机化合物修饰或者包合的富勒烯或者富勒烯衍生物的复合体中的1种以上作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯衍生物是结合含氧基、含氮基、烃基中的1种以上的富勒烯，所述烃基可以具有取代基。
3.根据权利要求1所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯类是选自富勒烯的多聚体、碳纳米管、以及它们的衍生物和它们的盐类的1种以上。
4.根据权利要求1所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯类是选自富勒烯的开裂体、富勒烯的分裂体、以及它们的衍生物和它们的盐类的1种以上。
5.根据权利要求3或4所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯类的盐类是钠、钾、镁、钙、以及铝盐中的1种以上。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯类是富勒烯以及富勒烯衍生物中的1种以上、和有机低聚物、有机聚合物、环糊精以及冠醚和它们的类似化合物中的1种以上的复合体。
7.根据权利要求6所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，是富勒烯以及富勒烯衍生物中的1种以上和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的复合体。
8.根据权利要求1-5任意一项所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯类由下式表示，
R1m-F-R2m
式中，F是Cn(C是碳原子，n是32以上的整数)表示的富勒烯、碳纳米管、以及它们的多聚体、开裂体、分裂体或者它们的混合物，R1m是结合到Cn上的m个的取代基，分别独立，相同或者不同，表示羟基、其羟基和无机酸或者有机酸的酯基、其羟基和糖的配糖体基、其羟基和酮的酮缩醇基、或者其羟基和醛的缩醛基，R2m是结合到Cn上的m个原子，分别独立，相同或者不同，或者1个原子结合到2个位置以上的不同的碳，m表示0或者1以上的整数。
9.根据权利要求4或者8所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，富勒烯开裂体、分裂体是下式的任何一个表示的富勒烯类或者内部具有其结构的分子的单体或者复合体，
式中，C是以碳原子表示的富勒烯的部分结构体，可以是2个以上的碳原子通过共价键结合(在没有共价键合的碳存在的情况下，即使式中没有表示Rn，也表示和Rn结合)，Rn是结合到C上的n个的取代基，分别独立，可相同也可不同，表示氢原子、碳原子、氧原子、氮原子、磷原子、羟基、其羟基和无机酸或者有机酸的酯基、其羟基和糖的配糖体基、其羟基和酮的酮缩醇基、或者其羟基和醛的缩醛基，n是0或者1以上的整数。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，进一步含有抗肿瘤药的1种以上。
11.根据权利要求10所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，抗肿瘤药为以下物质中的一种以上，氧氮芥(R)、环磷酰胺、美法仑、噻替哌、卡波醌、protecton(R)、白消安、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、异环磷酰胺、巯嘌呤、巯嘌呤苷、阿糖胞苷、达卡巴嗪、氟尿嘧啶、替加氟、盐酸安西他滨、氨甲嘌呤、卡莫氟、UFT(R)、衣诺他滨、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、放线菌素(D)、丝裂菌素C、色霉素A3、盐酸博莱霉素、硫酸博莱霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、新制癌霉素、硫酸培洛霉素、盐酸阿克拉霉素、美雄烷、环硫雄醇、柠檬酸他莫昔芬、二磷酸己烯雌酚四钠、溶血性链球菌制剂(R)、云芝多糖、香菇多糖、L-天冬酰胺酶、醋葡醛内酯、盐酸丙卡巴肼、氟尿苷、MDSKOWA3000(R)、顺铂、艾去适(R)、西佐喃、鱼精蛋白、肝素共存下的angiostaticsteroid、抗癌多糖、层粘连蛋白肽、含有Arg-Gly-Asp-(RGD)序列的抗癌多肽、以及抗癌血小板因子。
12.根据权利要求1-11任意一项所述的自由基疾病预防治疗用组合物，其中，自由基疾病为心肌梗塞、缺血性心疾病、心衰竭、心绞痛、心率不齐、动脉硬化症、肝脏脂质代谢紊乱、高血脂症、原发性高血压、高血压症、动脉硬化症、冠动脉硬化症、血栓症、闭塞性动脉硬化症、血管疾病、血管疾病、胆汁郁滞症、高胆固醇血症、胰损伤、内脏器官衰竭、急慢性肝炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、溃疡性大肠炎、消化器官损伤、胆囊症、糖尿病、关节炎治疗剂、风湿症、肝衰竭、肝损伤、缺血性肝损伤、肝脏脂质代谢紊乱、胆囊损伤、内脏器官移植损伤、糖尿病、中毒症、内脏器官移植损伤、癌、缺血性再灌注损伤、组织的老化、皮肤组织的色素沉积、皮肤组织的皱纹、齿根骨膜炎、皮肤组织的皮脂溢、皮肤组织的晒黑、皮肤组织的粉刺、烧烫伤、肥胖、脱发、精神病、痴呆症、帕金森病、或者感染症。
13.根据权利要求12所述的自由基疾病治疗预防用组合物，其中癌是肿瘤、良性肿瘤、或者恶性肿瘤。
14.根据权利要求12所述的自由基疾病治疗预防用组合物，其中，癌是恶性黑素瘤、恶性淋巴瘤、消化道癌、肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、尿道肿瘤、胆囊癌、胆管癌、胆道癌、乳腺癌、肝癌、胰脏癌、睾丸肿瘤、上颚癌、舌癌、唇癌、口腔癌、咽头癌、喉头癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑肿瘤、卡伯希肉瘤、血管瘤、白血病、真性红细胞增多、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、骨髓瘤、膀胱瘤、肉瘤、骨肉瘤、或者肌肉瘤。
15.根据权利要求12所述的自由基疾病治疗预防用组合物，其中，癌是皮肤癌、基底细胞癌、皮肤附件癌、皮肤转移癌、或者皮肤黑素瘤。
16.根据权利要求12所述的自由基疾病治疗预防用组合物，其中，缺血性再灌注损伤是缺血性心疾病、缺血性再灌注心肌损伤、缺血性肝损伤、缺血性再灌注肝脏损伤、缺血性再灌注肾脏损伤、缺血性再灌注胰脏损伤、缺血性再灌注胆囊损伤、缺血性再灌注循环器官损伤、缺血性再灌注消化器官损伤、缺血性再灌注肌肉损伤、缺血性再灌注血管损伤、缺血性再灌注眼损伤、缺血性再灌注皮肤损伤。
17.根据权利要求12所述的自由基疾病治疗预防用组合物，其中，感染病是细菌性感染病、病毒性感染病、真菌性感染病、或者寄生虫性感染病。
18.根据权利要求17所述的自由基疾病治疗预防用组合物，其中，病毒性感染病是肝炎、后天性免疫缺陷综合症(AIDS)、感冒、或者流感。
全文摘要
本发明提供富勒烯疾病预防治疗用组合物，其特征为，含有富勒烯、富勒烯衍生物、或者通过有机化合物修饰或者包合了的富勒烯或者富勒烯衍生物的复合体中的一种以上作为有效成分，副作用少，在体内具有高的自由基消除活性，而且制剂稳定性液优异。
文档编号A61K31/02GK101098684SQ20058004208
公开日2008年1月2日 申请日期2005年8月5日 优先权日2004年12月7日
发明者三羽信比古, 伊东忍, 松林贤司 申请人:维生素C60生化学研究公司