一种注射用脉络宁及其制备方法和质量控制方法

专利名称：一种注射用脉络宁及其制备方法和质量控制方法
技术领域：
本发明涉及中药制药领域，特别涉及一种注射用脉络宁及其制备方法和质量控制方法。
背景技术：
脉络宁注射液是由国家中医药管理局确定的全国中医院急诊科首批必备中成药之一，系在清代医家鲍相璈《验方新编》“四妙勇安汤”基础上经研制而成的注射剂。该药由石斛、玄参、牛膝、金银花等活血化淤、养阴通络的中药制成，为中药复方注射剂，具有增加纤维酶原、降低纤维蛋白酶原含量、抑制红细胞和血小板聚集、改善血液粘滞性和高凝状态、促进侧枝循环的建立、增加局部血流量、扩张血管、促进血液循环的作用；并具有胆碱能效应，可解除平滑肌痉挛、调整机体免疫功能及应激能力。其疗效确切，副作用小，临床上主要用于血管闭塞性脉管炎、静脉血栓形成、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及后遗症等病，随着临床经验的积累，其应用范围日渐扩大，在临床上得到广泛应用。近年来研究发现其中抗心血管病活性成分主要是绿原酸(秦文娟等.苦丁茶化学成分的研究(II)[J].中草药，1988，19(11)6～8)，且具有保肝利胆的作用(娄红祥等.金银花中水溶性化合物的分离与结构鉴定[J].中草药，1996，27(4)195～199。)。绿原酸还对在体内平衡血糖调控中发挥重要作用地葡萄糖-6-磷酸酶有抑制作用，有利于降低非胰岛素依赖性糖尿病的肝糖排泄过快(Schindler P W，Below P，Hemmerle H et al.Identification of two newinhibitors of hepatic glucoe-6-phosphatetranslocase[J].Diabetologia，1994，37(Suppl.1)A134)，脉络宁治疗心血管疾病、糖尿病和肝炎、肝硬化的机理即与此有关。此外绿原酸还具有自由基的清除及抗脂质过氧化作用和抗诱变作用。另一活性成分肉桂酸是玄参的主要成分，临床中发现有升高白细胞作用，近年动物实验证实有升白作用，动物实验还发现能提高外周白细胞及血小板数等。
目前市售脉络宁注射液的生产工艺还存在不同程度的问题与缺陷，其主要包括脉络宁制成水溶液，质量不够稳定，不易保存，常会出现色泽变深，晶体析出，成分变化等情况，且运输、贮存不方便；有效部位提取不全；制剂质量标准低，影响对产品的质检与控制；以吐温-80作为增溶剂，而吐温-80会引起高血压、心动过速，组胺水平升高和溶血的副反应，增加临床用药的不安全性。
中国专利CN1435250A公开了注射用脉络宁及口服固体制剂的制备方法，它采用甲醇，氯仿结合超声提取，由于甲醇、氯仿沸点低、毒性大，用于注射剂的制备不妥，也不适于工业生产。
中国专利CN1555854A、CN1654062A、CN1660314A公开的注射用脉络宁及其制备方法，其中抗心血管病活性主要成分绿原酸的含量较低，有效部位提取不完全，质量标准低。

发明内容
本发明克服现有技术的不足，提供了一种质量稳定、质量标准高的注射用脉络宁及其制备方法。同时还提供了质量控制方法。
本发明提供的注射用脉络宁，每1000支由金银花、牛膝、玄参、石斛各25Kg提取的有效成份和医学上所能接受的赋形剂组成。
本发明的的赋形剂可以是甘露醇、肌醇、乳糖、葡聚糖、氯化钠中的的一种或几种，用量为0.2-0.4g/支。
本发明注射用脉络宁中的肉桂酸含量不少于3.6mg/支、绿原酸含量不少于150mg/支。
本发明中的肉桂酸含量可达3.6-5mg/支、绿原酸含量可达150-180mg/支。
本发明提供的注射用脉络宁的制备方法，是通过以下步骤制得
(1)由中药金银花25kg、玄参25kg、牛膝25kg、石斛25kg制成1000支；
(2)取以上四味药材，加50％～70％乙醇在70～80℃下回流提取1～3次，每次6～10倍量，每次1～2小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，续以夹层蒸汽挥至无醇味；
(3)加1-2倍量注射用水，充分搅拌，夹层蒸汽加热至90～95℃后保温30-60分钟，冷藏12～24小时，以5000rpm的速度离心15-30分钟，取上清液备用；
(4)上清液用盐酸调pH至2.0～4.0，用1～2倍量的醋酸乙酯萃取4～8次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯后，以夹层蒸汽挥至无醋酸乙酯味；
(5)加注射用水10-15L，充分搅拌后滤过，滤液浓缩至适量体积，干燥，得中间体；
(6)取上述中间体，加入赋形剂，加水使之溶解后，用15-20％NaOH溶液调pH至6.0～8.0，加1-2％活性炭，搅拌15-30分钟，滤过，滤液适当补充注射用水至总量为5000ml～8000ml，通过0.22μm的微孔滤膜滤液备用；
(7)滤液以5～8ml/支分装，半压胶塞，装盘进箱，按冻干曲线进行冻干，冻干后压塞，放真空，出箱，轧铝盖，检验，贴标签，包装，即得。
本发明的干燥方法可以是喷雾干燥、真空干燥的一种。
本发明制备方法的优选方案是
(1)由中药金银花25kg、玄参25kg、牛膝25kg、石斛25kg制成1000支；
(2)取以上四味药材，加60％乙醇在70℃下回流提取2次，每次8倍量，每次1小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，续以夹层蒸汽挥至无醇味；
(3)加1倍量注射用水，充分搅拌，夹层蒸汽加热至95℃后保温30分钟，冷藏24小时，以5000rpm的速度离心15分钟，取上清液备用；
(4)上清液用盐酸调pH至3.0，用2倍量的醋酸乙酯萃取8次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯后，以夹层蒸汽挥至无醋酸乙酯味；
(5)加注射用水10L，充分搅拌后滤过，滤液浓缩至适量体积，干燥，得中间体；
(6)取上述中间体，加入赋形剂，加水使之溶解后，用20％NaOH溶液调pH20至7.0，加1‰活性炭，搅拌15分钟，滤过，滤液适当补充注射用水至总量为7000ml，通过0.22μm的微孔滤膜滤液备用；
(7)滤液以7ml/支分装，半压胶塞，装盘进箱，按冻干曲线进行冻干，冻干后压塞，放真空，出箱，轧铝盖，检验，贴标签，包装，即得。
本发明所使用的赋形剂最好是甘露醇，加入量最好是0.3g/支。
本发明提供的注射用脉络宁的质量控制方法如下
一、鉴别
a.金银花的薄层层析鉴别；
取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。取金银花药材粉末5g，加甲醇50ml，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至2ml，作为对照药材溶液。取本品1瓶，加甲醇50ml，超声提取30min，离心，上清液蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10ml，作为供试品溶液。另取牛膝、石斛、玄参药材，按照生产工艺要求制备成品，后按照上述供试品溶液的制备方法制得阴性制剂供试品溶液。照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液5μl、药材对照溶液3μl、供试品溶液3μl、阴性制剂供试品溶液3μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积用量比为20∶5∶5的醋酸丁酯-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下波长365nm处检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b.玄参的薄层层析鉴别；
取玄参药材粉末5g，加水饱和的正丁醇50ml，超声提取30min，取出，以7000r/min的速度离心10min，上清液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至2ml，作为对照药材溶液。取本品一瓶，加水溶解并定容至10ml，以水饱和的正丁醇萃取三次，用量分别为20ml、20ml、15ml，萃取液合并，水浴挥干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，作为供试品溶液。阴性制剂供试品溶液取牛膝、石斛、金银花药材，按照生产工艺要求制备成品，后按照供试品溶液的制备方法制得阴性制剂供试品溶液。照薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液5ul、供试品溶液5μl、阴性制剂供试品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积用量比为2-7∶1的氯仿∶甲醇溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸试液，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
c.牛膝的薄层层析鉴别；
取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
取牛膝药材粉末10g，加乙醇或甲醇50ml，加热回流90min，滤过，滤液加盐酸4ml，加热回流2小时，浓缩至约10ml，加水20ml，用石油醚60～90℃下萃取三次，用量分别为40ml、40ml、20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至2ml，作为对照药材溶液。取本品1瓶，加乙醇或甲醇50ml，加热回流90min，滤过，滤液加盐酸4ml，加热回流2小时，浓缩至约10ml，加水20ml，用石油醚60～90℃下萃取三次，用量分别为40ml、40ml、20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至2ml，作为供试品溶液。另取玄参、石斛、金银花药材，按照生产工艺要求制备成品，后按照供试品溶液的制备方法制得阴性制剂供试品溶液。照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液3μl、对照药材溶液6μl、供试品溶液3μl、阴性制剂供试品溶液3μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积用量比为10-20∶1的氯仿∶甲醇溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯下波长365nm处检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的荧光斑点；
d.石斛的薄层层析鉴别；
取滨蒿内酯对照品适量，加氯仿制成每1ml含0.3mg的溶液，作为对照品溶液。取石斛药材粉末5g，用氨水湿润，浸湿密塞放置30min，加入氯仿100ml，加热回流2小时，取出，滤过，滤液蒸干，加氯仿溶解并定容至2ml，作为对照药材溶液。取本品1瓶，粉末用氨水湿润，浸湿密塞放置30min，加入氯仿100ml，加热回流2小时，取出，滤过，滤液蒸干，加氯仿溶解并定容至10ml，作为供试品溶液。另取牛膝、金银花、玄参药材，按照生产工艺要求制备成品，后按照上述供试品溶液的制备方法制得阴性制剂供试品溶液。照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液2μl、对照药材溶液3μl、供试品溶液3μl、阴性制剂供试品溶液3μl，分别点于同一以羧甲基纤维素纳为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为0.5-4∶1的石油醚∶醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下波长365nm处检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
二、含量测定
a.肉桂酸 照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为54∶46的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为278nm。理论塔板数按肉桂酸峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备 精密称取肉桂酸对照品适量，加体积比为54∶46的甲醇-水溶剂制成每1ml含260μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取装量差异项下本品内容物，混匀，取0.2g，精密称定，置50ml容量瓶中，加体积比为54∶46的甲醇-水溶解并稀释至刻度，摇匀，再从中精密吸取5ml至10ml容量瓶中，以上述溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每支含肉桂酸C9H8O2不得少于3.60mg；
b.绿原酸 照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为5-35∶95-65的乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相，检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计不低于1500；
对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加体积比为5-35∶95-65的乙腈—水溶剂制成每1ml中含80μg的溶液；
供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，混匀，取0.2g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加体积比为5-35∶95-65的乙腈-水溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，再从中精密吸取1ml至25ml棕色量瓶中，以上述溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每支含绿原酸以C16H18O9计，不得少于150.0mg；
最终确定本品以肉桂酸和绿原酸为本品质量的定量指标；
三、指纹图谱
照高效液相色谱法，并结合中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南要求；
色谱条件及系统适用性试验；
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相，按下表进行梯度洗脱，检测波长为254nm，柱温35℃。理论板数按绿原酸峰计不低于3000；
梯度洗脱程序为
参照物的制备 取绿原酸对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成每1ml含20μg的溶液作为参照物溶液；取肉桂酸对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成每1ml含15μg的溶液作为参照物溶液；
供试品的制备 取本品一支，加入重蒸水溶解，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取上液0.2ml至25ml量瓶中，加重蒸水稀释至刻度，用0.45μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得；
测定法 精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录时间为70min，梯度平衡时间10min；
供试品图谱应与注射用脉络宁对照图谱相一致，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版计算，相似度应大于0.9；
注射用脉络宁的对照图谱见图2。
指纹图谱方法中流动相可以是甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05～0.5％磷酸溶液、乙腈-0.05～0.5％磷酸溶液和乙腈-0.01～0.2％甲酸溶液等多种色谱系统和梯度洗脱程序。
本发明注射用脉络宁的pH值、不溶性颗粒、澄明度、重金属、砷盐、蛋白质、鞣质、草酸盐、钾离子、树脂、水分、溶血试验、无菌、炽灼残渣检查均符合《中药新药研究的技术要求》及《中国药典2000年一部》注射剂项下的有关规定。
本发明通过大量的试验研究，确定本发明的注射用脉络宁的技术指标如下
采用本发明的工艺提取，可以得到高含量的绿原酸和肉桂酸，有效成分含量明显提高，同时产品的质量标准也大大提高。因为脉络宁治疗心血管疾病、糖尿病和肝炎、肝硬化的活性成分主要是绿原酸。另一活性成分肉桂酸临床中发现有升高白细胞作用，还发现能提高外周白细胞及血小板数等。所以本发明的注射用脉络宁因大大提高了绿原酸和肉桂酸的含量而具有更好的疗效。
本发明同时解决了水针剂质量不稳定等问题，具有成型性好、速溶、澄明、稳定、储运、携带和使用方便等特点。
本发明工艺步骤简单，适于工业生产。


图1注射用脉络宁典型的指纹图谱；
图2对照品(绿原酸)的梯度洗脱图谱；
图3对照品(肉桂酸)的梯度洗脱图谱；
图4空白溶剂的梯度洗脱图谱；
图5注射用脉络宁2小时图谱。
具体实施例方式
以下实验将进一步说明本发明。
实施例1
取处方量四味药材各25kg，加8倍量60％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，续以夹层蒸汽挥至无醇味，加1倍量水，充分搅拌，夹层蒸汽加热至95℃后保温30分钟，冷藏24小时，离心(5000rpm，15分钟)，取上清液用盐酸调pH至2.0，用2倍量的醋酸乙酯萃取6次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯后，以夹层蒸汽挥至无醋酸乙酯味，加注射用水10L，充分搅拌后滤过，滤液浓缩至适量体积，60℃真空干燥，得中间体，检测中间体含量。取上述中间体，加入甘露醇300g，加水适量使之溶解后，用20％NaOH溶液调pH至7.0，加1‰活性炭，搅拌15分钟，滤过，滤液适当补充注射用水至总量为7000ml，通过0.22μm的微孔滤膜，滤液以7ml/支分装，半压胶塞，装盘进箱，按冻干曲线进行冻干，冻干后压塞，放真空，出箱，轧铝盖，检验，贴标签，包装，即得。
实施例2
取处方量四味药材各25kg，加6倍量60％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，续以夹层蒸汽挥至无醇味，加1倍量水，充分搅拌，夹层蒸汽加热至95℃后保温30分钟，冷藏24小时，离心(5000rpm，15分钟)，取上清液用盐酸调pH至3.0，用2倍量的醋酸乙酯萃取6次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯后，以夹层蒸汽挥至无醋酸乙酯味，加注射用水10L，充分搅拌后滤过，滤液浓缩至适量体积，80℃真空干燥，得中间体，检测中间体含量。取上述中间体，加入甘露醇300g，加水适量使之溶解后，用20％NaOH溶液调pH至7.0，加1‰活性炭，搅拌15分钟，滤过，滤液适当补充注射用水至总量为5000ml，通过0.22μm的微孔滤膜，滤液以5ml/支分装，半压胶塞，装盘进箱，按冻干曲线进行冻干，冻干后压塞，放真空，出箱，轧铝盖，检验，贴标签，包装，即得。
实施例3
(1)由中药金银花25kg、玄参25kg、牛膝25kg、石斛25kg制成1000支；
(2)取以上四味药材，加50％乙醇在70℃下回流提取1次，每次6倍量，每次1小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，续以夹层蒸汽挥至无醇味；
(3)加1倍量注射用水，充分搅拌，夹层蒸汽加热至90℃后保温30分钟，冷藏12小时，以5000rpm的速度离心15分钟，取上清液备用；
(4)上清液用盐酸调pH至2.0，用1倍量的醋酸乙酯萃取4次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯后，以夹层蒸汽挥至无醋酸乙酯味；
(5)加注射用水10L，充分搅拌后滤过，滤液浓缩至适量体积，喷雾干燥，得中间体；
(6)取上述中间体，加入赋形剂肌醇200g，加水使之溶解后，用15％NaOH溶液调pH至6.0，加1‰活性炭，搅拌15分钟，滤过，滤液适当补充注射用水至总量为5000ml，通过0.22μm的微孔滤膜滤液备用；
(7)滤液以5ml/支分装，半压胶塞，装盘进箱，按冻干曲线进行冻干，冻干后压塞，放真空，出箱，轧铝盖，检验，贴标签，包装，即得。
实施例4
(1)由中药金银花25kg、玄参25kg、牛膝25kg、石斛25kg制成1000支；
(2)取以上四味药材，加50％～70％乙醇在70～80℃下回流提取3次，每次10倍量，每次2小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，续以夹层蒸汽挥至无醇味；
(3)加1-2倍量注射用水，充分搅拌，夹层蒸汽加热至95℃后保温60分钟，冷藏24小时，以5000rpm的速度离心30分钟，取上清液备用；
(4)上清液用盐酸调pH至4.0，用2倍量的醋酸乙酯萃取8次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯后，以夹层蒸汽挥至无醋酸乙酯味；
(5)加注射用水15L，充分搅拌后滤过，滤液浓缩至适量体积，真空干燥，得中间体；
(6)取上述中间体，加入赋形剂氯化钠300g，加水使之溶解后，用20％NaOH溶液调pH至8.0，加2‰活性炭，搅拌30分钟，滤过，滤液适当补充注射用水至总量为8000ml，通过0.22μm的微孔滤膜滤液备用；
(7)滤液以8ml/支分装，半压胶塞，装盘进箱，按冻干曲线进行冻干，冻干后压塞，放真空，出箱，轧铝盖，检验，贴标签，包装，即得。
实施例5
(1)由中药金银花25kg、玄参25kg、牛膝25kg、石斛25kg制成1000支；
(2)取以上四味药材，加60％乙醇在70℃下回流提取2次，每次8倍量，每次1小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，续以夹层蒸汽挥至无醇味；
(3)加1倍量注射用水，充分搅拌，夹层蒸汽加热至95℃后保温30分钟，冷藏24小时，以5000rpm的速度离心15分钟，取上清液备用；
(4)上清液用盐酸调pH至3.0，用2倍量的醋酸乙酯萃取8次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯后，以夹层蒸汽挥至无醋酸乙酯味；
(5)加注射用水10L，充分搅拌后滤过，滤液浓缩至适量体积，真空干燥，得中间体；
(6)取上述中间体，加入赋形剂乳糖100g、葡聚糖200g，加水使之溶解后，用20％NaOH溶液调pH至7.0，加1‰活性炭，搅拌15分钟，滤过，滤液适当补充注射用水至总量为7000ml，通过0.22μm的微孔滤膜滤液备用；
(7)滤液以5ml/支分装，半压胶塞，装盘进箱，按冻干曲线进行冻干，冻干后压塞，放真空，出箱，轧铝盖，检验，贴标签，包装，即得。
比较例1
本例为醇提和传统水提工艺比较。
对醇提和传统水提工艺进行比较，提取方法拟选为加水煎煮提取，70％乙醇、60％乙醇及50％的乙醇回流提取四种方法，以金银花中主要活性成份绿原酸和玄参中主要活性成份肉桂酸提取得率为主要评价指标，对这四种方法进行比较，筛选适宜的提取溶剂和提取方法。
1、不同提取方法样品液的制备
(1)水煎煮称取金银花、玄参、牛膝、石斛药材饮片各10g，加10倍量的水，煎煮2次，每次1.5h滤过，合并滤液，浓缩定容到100ml容量瓶中。
(2)50％乙醇回流称取金银花、玄参、牛膝、石斛药材饮片各10g，加8倍量50％的乙醇，回流3次，每次1.5小时，合并乙醇回流提取液，滤过，浓缩定容到100ml容量瓶中。
(3)60％乙醇回流称取金银花、玄参、牛膝、石斛药材饮片各10g，加8倍量60％的乙醇，回流3次，每次1.5小时，合并乙醇回流提取液，滤过，浓缩定容到100ml容量瓶中。
(4)70％乙醇回流称取金银花、玄参、牛膝、石斛药材饮片各10g，加8倍量70％的乙醇，回流3次，每次1.5小时，合并乙醇回流提取液，滤过，浓缩定容到100ml容量瓶中。
2、不同提取方法样品液中绿原酸、肉桂酸的含量测定
绿原酸的HPLC测定
(1)色谱条件与系统适应性试验
C18柱为色谱柱，甲醇-0.1％甲酸溶液梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长327nm，理论塔板数不低于1500。梯度洗脱不同时间比例见表1-1。
表1-1梯度洗脱表
(2)供试品溶液的制备
精密吸取水提样品液2ml，加蒸馏水稀释至25ml，离心，取上清液，供测定用。其余50％、60％、70％乙醇回流提取液，分别精密吸取2ml，加30％甲醇稀释至25ml，离心，取上清液，供测定用。测定结果见表2。
肉桂酸含量测定
色谱条件与系统适应性试验C18柱为色谱柱，甲醇-0.1％磷酸溶液(60∶40)为流动相；278nm检测波长，理论塔板数不低于1500
供试品溶液的制备精密吸取水提样品液2ml，加蒸馏水稀释至25ml，离心，取上清液，供测定用。其余50％、60％、70％乙醇回流提取液，分别精密吸取10ml，加50％甲醇稀释至25ml，离心，取上清液，供测定用。测定结果见表12。
测定方法精密量取上述对照品和各供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，以外标一点法计算，测定结果见表1-2。
表1-2不同提取方式绿原酸、肉桂酸提取量比较(n＝5)
3、不同提取方法样品液中绿原酸、肉桂酸提取得率的结果比较(Q检验)
由实验结果可知对醇提和传统水提工艺所得提取液中，绿原酸的提取得率未见显著性差异，但肉桂酸的提取得率兼有显著性差异，60％乙醇回流、70％乙醇回流、50％乙醇和水提取比较，见有显著性差异，确定选择50％～70％乙醇为提取溶剂，采用回流提取法提取。检验结果见表1-3、1-4。
表1-3不同溶剂对绿原酸的提取得率
Multiple Comparisons
Dependent VariableDATA
表1-4不同溶剂对肉桂酸的提取得率
Multiple Comparisons
Dependent VariableDATA
LSD
*The mean difference is significant at the .05 level.
比较例2
本例为水沉、热处理冷藏工艺与传统醇沉工艺的比较研究。
本发明应用一些极性偏小的杂质成分在水溶液中难以溶解，而与药效密切相关成分肉桂酸、绿原酸等成分在乙醇溶液中有较好的溶解性的原理，通过水沉来达到粗分离的目的。而传统工艺及专利公开号CN1660314A通过醇沉来实现初分离的。故对这两种工艺初分离前后的差异进行比较。
1、试验方法
取金银花、玄参、牛膝、石斛各20g，合并，加8倍量60％乙醇提取3次，每次1.5小时，合并乙醇提取液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，定容至250ml。精密吸取10ml，作为分离前的样品溶液，备测定用，其余部分等分两份。一份加等体积的注射用水稀释，水浴加热至95℃以上，保温30分钟，冷却后冷藏12小时，取出，离心(5500rpm，15min)，上清液定容至250ml。另一份加95％乙醇，使含醇量达80％，静置12小时，离心(5500rpm，15min)，取上清液，回收乙醇，加无水乙醇定容至250ml。平行试验5份。
2、供试液的制备
初分离前的样品自留样的10ml样品液中精密吸取2ml至25ml量瓶中，以蒸馏水稀释定容至刻度，摇匀，备用。
水沉之后的样品自250ml样品液中精密吸取4ml至25ml量瓶中，以蒸馏水稀释定容至刻度，摇匀，备用。
醇沉之后的样品自250ml样品液中精密吸取4ml至25ml量瓶中，以无水乙醇稀释定容至刻度，摇匀，备用。
3、检测方法及结果
绿原酸含量测定方法同“提取溶剂及提取方法的比较”。
肉桂酸含量测定方法同“提取溶剂及提取方法的比较”，结果见表1-5。
表1-5初分离前后绿原酸、肉桂酸含量的比较(n＝5)
4、水沉合并热处理冷藏前后，绿原酸及肉桂酸平均转移率为92.2％、85.8％。而醇沉处理后，绿原酸及肉桂酸平均转移率为80.3％、57.8％。水沉合并热处理冷藏前后平均转移率显著大于因此醇沉处理前后。
比较例3
本例为萃取前调节pH值至酸性的考察比较。
本发明考虑到药液的指标性成分肉桂酸、绿原酸等有机酸类物质在酸性条件下呈游离态，水溶性下降，采用醋酸乙酯萃取时，容易转移到有机相中，因此，试验考察了溶液pH值对指标性成份萃取率的影响。
(1)试验方法
取金银花、玄参、牛膝、石斛各100g，加60％乙醇回流提取3次，每次8倍量，每次1.5小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇后，水沉、热处理冷藏，离心，得上清液4000ml，备用。分别精密吸取上清液50ml，用2倍量的醋酸乙酯萃取6次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯后，以夹层蒸汽挥至无醋酸乙酯味。所得萃取液减压回收醋酸乙酯后，加水溶解定容至25ml，备用。平行5份。
(2)指标性成分的含量测定
绿原酸、肉桂酸含量测定方法同前。所得结果折算成25ml萃取液中绿原酸、肉桂酸的含量。列入表1-7。
表1-7不同pH值对绿原酸、肉桂酸含量影响的结果(n＝5)
结论本发明中采用醋酸乙酯萃取时，对指标性成份萃取率的影响显著。调节pH值至酸性能显著提高有效成分含量。
比较例4
本例为注射用脉络宁冻干中含量测定
肉桂酸 照高效液相色谱法(附录VID)测定。
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为塡充剂；甲醇-0.1％磷酸溶液(54∶46)为流动相；检测波长为278nm。理论塔板数按肉桂酸峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备 精密称取肉桂酸对照品适量，加溶剂甲醇-水(54∶46)制成每1ml含260μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取装量差异项下本品内容物，混匀，取0.2g，精密称定，置50ml容量瓶中，加溶剂甲醇-水(54∶46)溶解并稀释至刻度，摇匀，再从中精密吸取5ml至10ml容量瓶中，以上述溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
绿原酸 照高效液相色谱法(附录VID)测定。
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为塡充剂，以乙腈-0.1％磷酸溶液(11∶89)为流动相，检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计不低于1500。
对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加溶剂乙腈—水(11∶89)制成每1ml中含80μg的溶液。
供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，混匀，取0.2g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加溶剂乙腈-水(11∶89)溶解并稀释至刻度，摇匀，再从中精密吸取1ml至25ml棕色量瓶中，以上述溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
三批按本发明制备的脉络宁冻干成品(制备实例1)与市售脉络宁含量测定结果见1-6表。
表1-6脉络宁冻干粉针及市售脉络宁注射液中肉桂酸、绿原酸含量比较(n＝3)
结论本发明与市售脉络宁相比，所生产的脉络宁冻干有效成分含量明显提高。
实验例1
本例为注射用脉络宁冻干粉针剂指纹图谱质量控制方法。
照高效液相色谱法(2000版中国药典一部附录VID)，并结合《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》要求。
色谱条件及系统适用性试验
仪器Agilent 1100LC系列，Agilent chemstation色谱工作站
色谱柱kromasil-5C18柱(250mm×4.6mm，5μm)
流动相为A0.1％甲酸水溶液，B乙腈，流速1.0ml/min，按下表进行梯度洗脱，检测波长254nm，柱温35℃。梯度洗脱程序为
参照物的制备 取绿原酸对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成每1ml含16.16μg的溶液作为参照物溶液；取肉桂酸对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成每1ml含14.44μg的溶液作为参照物溶液。
供试品的制备 取本品一支，加入重蒸水溶解，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取上液0.2ml至25ml量瓶中，加重蒸水稀释至刻度，用0.45μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。
测定法 精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录时间为70min，梯度平衡时间10min。
方法学验证
为了验证方法的可靠性，根据国家药品监督管理局颁发的《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》的规定，对样品的稳定性、仪器的精密度、实验方法的重复性等均进行了考察。结果均符合规定。
稳定性试验取同一供试品溶液，分别在不同时间检测，考察各色谱峰相似度的一致性，利用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004年A版进行相似度评价，各相似度数值见表1。
表1注射用脉络宁稳定性试验相似度数据
精密度试验取同一供试品溶液，连续进样5次，考察各色谱峰相似度的一致性，利用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004年A版进行相似度评价，各相似度数值见表。
表2注射用脉络宁精密度试验相似度数据
重复性试验取同一批成品5支，按供试品的制备制得供试品，同法检测，考察各色谱峰相似度的一致性，利用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004年A版进行相似度评价，各相似度数值见表。
表3注射用脉络宁重复性相似度数据
空白试验
按制备工艺及供试品溶液的制备方法制得空白溶液，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，照正文色谱条件项下条件进行测定，结果见图4。结果表明空白不干扰测定。
记录时间的确定
按正文色谱条件，记录70分钟后，保持流动相比例不变记录50分钟色谱图(即记录120分钟指纹图谱)，见图5。结果表明，保留时间70-120分钟内未检出色谱峰，故确定分析时间为70分钟。
指纹图谱及各项技术参数
图谱积分参数斜率1；峰宽0.04；最小峰面积20；最小峰高1.5；谷谷积分。
计算软件采用国家药典会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”。
指纹图谱图1为注射用脉络宁典型的指纹图谱，图2为对照品(绿原酸)的梯度洗脱图谱，图3为对照品(肉桂酸)的梯度洗脱图谱，图4为空白溶剂的梯度洗脱图谱，图5为记录2小时的注射用脉络宁的指纹图谱。
参数设置
(1)参照谱图本品采用对照指纹图谱(共有模式)为参照谱图。
(2)时间窗宽度0.10
(3)数据剪切空白试验无干扰，故不需剪切。
(4)校正方式采用梯度洗脱的方式，供试品指纹图谱中色谱峰保留时间可能与对照指纹图谱中相应色谱峰保留时间不一致，故相似度计算时不宜采用自动校正方式，而应进行多点校正。
校正色谱峰的确定以3个强度较高的色谱峰(保留时间约20.2min，23.9min，59.8min)为校正色谱峰。故相似度计算时以这3个色谱峰进行校正。
(5)指纹图谱相似度计算结果
10批注射用脉络宁的相似度计算结果见表4。
表4 10批注射用脉络宁的相似度
相似度平均值0.987
表1-4结果表明，10批注射用脉络宁的相似度平均值大于0.90，根据以上试验结果，并按照《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》的规定，暂定本品的指纹图谱应与注射用脉络宁对照指纹图谱一致，相似度值应不低于0.90。
实验例2药效学研究
(一)注射用MLN对大鼠血液流变学的影响
1.方法
雄性SD大鼠60只，体重320g～350g，按体重随机均分为6组，每组10只。(1)MLN小剂量组16.5g/kg；(2)MLN中剂量组33g/kg；(3)MLN大剂量组66g/kg；(4)MLN注射液组3.3ml/kg；(5)丹参注射液组2g/kg；(6)生理盐水组5ml/kg。各组均按5ml/kg每日腹腔注射给药1次，连续给药10日。末次给药后0.5h，每鼠皮下注射0.1％肾上腺素0.1mg/kg，共2次，2次间隔4h，并在2次注射中间，将动物置于4℃冰水中浸泡5min，次日1％戊巴比妥钠30mg/kg ip麻醉，颈总动脉采血4ml，1％肝素生理盐水溶液抗凝(180U)，测定全血血液粘度及红细胞压积。
2.结果
结果显示注射用MLN 16.5g/kg、33g/kg、66g/kg三个剂量组ip 10d可降低大鼠200/s、30/s、5/s、1/s切变率下的全血粘度，与生理盐水组比较有显著性差异(P＜0.05、0.01)。其作用与MLN注射液和丹参注射液的作用强度相近。表明MLN具有改善血液流变学的作用，见表3-1。
表3-1注射用MLN对大鼠血流变学的影响(X±S)(n＝10)
*P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较
(二)注射用脉络宁(以下简写为MLN)对大鼠血小板聚集率的影响
1.方法
雄性SD大鼠48只，体重250g～280g，按体重随机均分为6组，每组8只。(1)MLN小剂量组16.5g/kg；(2)MLN中剂量组33g/kg；(3)MLN大剂量组66g/kg；(4)MLN注射液组3.3ml/kg；(5)丹参注射液组2g/kg；(6)生理盐水组5ml/kg。各组均按5ml/kg每日腹腔注射给药1次，连续给药10日。末次给药后0.5h，用1％戊巴比妥钠30mg/kg ip麻醉，经颈总动脉采血3ml，3.8％枸橼酸钠溶液抗凝。将血与抗凝剂(9∶1)混匀，1000rpm离心10min，吸取上层乳白色的富含血小板血浆(PRP)；剩下部分再次3000rpm离心10min，上清液即为少含血小板血浆(PPP)，用PPP调PRP，使其血小板计数为2.0×105个/mm3。按照比浊法测定ADP诱导的最大血小板聚集率。ADP在比浊管内的终浓度为0.146mg/ml。
2.结果
结果显示注射用MLN 16.5g/kg、33g/kg、66g/kg三个剂量组均能抑制大鼠最大血小板聚集率，与生理盐水组比较具有显著性差异(P＜0.01)。其作用与MLN注射液和丹参注射液的作用强度相近。抑制率分别为39.3％、51.7％、64.9％、45.2％及56.2％。表明注射用MLN具有抑制血小板聚集的作用，见表3-2。
表3-2注射用MLN对大鼠血小板聚集的影响(X±S)
.**P＜0.01与生理盐水组比较
(三)注射用MLN对大鼠颈总动脉—颈外静脉血栓形成的影响
1.方法
雄性SD大鼠60只，体重210g～220g，按体重随机均分为6组，每组10只。(1)MLN小剂量组16.5g(生药)/kg；(2)MLN中剂量组33g(生药)/kg；(3)MLN大剂量组66g(生药)/kg；(4)MLN注射液组3.3ml/kg；(5)丹参注射液组2g/kg；(6)生理盐水组5ml/kg。各组均按5ml/kg每日腹腔注射给药1次，连续给药10日。末次给药后0.5h，用1％戊巴比妥钠30mg/kg ip麻醉，分离右颈总动脉及左颈外静脉。在三段聚乙烯管中放入一根长约5cm的4号手术丝线。将肝素生理盐水(50U/ml)充满聚乙烯管腔。当管的一端插入左颈外静脉后，从聚乙烯管注入肝素50U/kg，夹住管壁。将管的另一端插入右颈总动脉。手术完成后开放血流，则血液从右颈总动脉流经聚乙烯管，返回颈外静脉。开放血流15分钟后中断血流。迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重即为血栓湿重。将丝线70℃烘干，取出称重，总重量减去丝线重即为血栓干重。按下列公式计算抑制率
2.结果
结果显示注射用MLN 16.5g/kg、33g/kg、66g/kg三个剂量组均能减少大鼠颈总动脉—颈外静脉血流旁路形成的血栓湿重和干重的重量，抑制率分别为12.7％、26.0％、38.6％(血栓湿重)，20.8％、39.6％，47.9％(血栓干重)，与生理盐水组比较具有显著性差异(P＜0.05、0.01)。MLN中剂量组与MLN注射液和丹参注射液的作用强度相近。表明注射用MLN具有抗血栓形成的作用，见表3-3。
表3-3注射用MLN对大鼠颈总动脉—颈外静脉旁路血栓形成的影响(X±S)
*P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较
(四)注射用MLN对家兔颈总动脉血栓形成的影响
1.方法
健康大耳白家兔36只，雌雄各半，体重1.9～2.2kg，按体重随机均分为6组，每组6只。(1)MLN小剂量组10g/kg；(2)MLN中剂量组20g/kg；(3)MLN大剂量组40g/kg；(4)MLN注射液组2ml/kg；(5)丹参注射液组1.2g/kg；(6)生理盐水组2ml/kg。各组均按2ml/kg每日耳缘静脉给药1次，连续给药3日。末次给药后0.5h，3％戊巴比妥钠30mg/kg iv麻醉，分离双侧颈总动脉，间隔3cm用两个动脉夹夹闭右侧颈总动脉，以4号针头抽出其中的血液，0.9％氯化钠注射液冲洗数次，向该段动脉内注入10％的双氧水约1ml，15min后抽出，0.9％氯化钠注射液冲洗数次后，拔出针头，干棉球压迫止血，放开动脉夹，使血流再通。2h后等长剪下双侧颈总动脉，称重，测量其长度，按下列公式计算血栓湿重(mg)、重量/重量指数(mg/mg)。
血栓湿重(mg)＝右颈总动脉重(mg)-左颈总动脉重(mg)
2.结果
结果显示注射用MLN 10g/kg、20g/kg、40g/kg三个剂量组均能减少血栓湿重和重量/重量指数，抑制率分别为27.7％、30.7％、70.5％(血栓湿重)，4.2％、33.3％，62.5％(重量/重量指数)，与生理盐水组比较具有显著性差异(P＜0.05、0.01)。表明注射用MLN具有抗血栓形成的作用，作用强度与MLN注射液组作用相当。见表3-4。
表3-4注射用MLN对家兔颈总动脉血栓形成的影响(X±S)
*P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较
(五)注射用MLN对花生四烯酸致小鼠死亡率的影响
1.方法
雄性KM小鼠180只，体重18g～22g，按体重随机均分为6组，每组30只。(1)MLN小剂量组33g/kg；(2)MLN中剂量组66g/kg；(3)MLN大剂量组132g/kg；(4)MLN注射液组6.6ml/kg；(5)丹参注射液组4g/kg；(6)生理盐水组10ml/kg。各组均按10ml/kg每日腹腔注射给药1次，连续给药7日。末次给药后0.5h，采用Kohler等报道的方法，给小鼠尾静脉注射(iv)花生四烯酸(AA)80mg/kg(5mg/ml的AA溶液0.16ml/10g)，立即观察小鼠的呼吸情况、活动状态，并记录5min内小鼠死亡数。结果以iv AA引起肺微血管形成血栓、导致小鼠呼吸衰竭而死亡的死亡率表示，统计方法用x2检验。
2.结果
结果显示注射用MLN 66g/kg、132g/kg二个剂量组均能降低花生四烯酸所致小鼠死亡数，减少死亡率，与生理盐水组比较具有显著性差异(P＜0.05，0.01)。表明注射用MLN具有抗血栓形成的作用，与MLN注射液组作用相当。见表3-5。
表3-5注射用MLN对静脉注射花生四烯酸致小鼠死亡率的影响
*P＜0.05 **P＜0.01与生理盐水组比较
(六)注射用MLN对大鼠急性不完全性脑缺血的影响
1.方法
雄性SD大鼠56只，体重210g～220g，按体重随机均分为7组，每组8只。(1)MLN小剂量组16.5g/kg；(2)MLN中剂量组33g/kg；(3)MLN大剂量组66g/kg；(4)MLN注射液组3.3ml/kg；(5)丹参注射液组2g/kg；(6)模型组NS 5ml/kg；(7)伪手术组NS 5ml/kg。各组均按5ml/kg每日腹腔注射给药1次，连续给药10日。末次给药后0.5h，用1％戊巴比妥钠30mg/kg ip麻醉，按文献方法行颈总动脉分离术，结扎双侧颈总动脉(伪手术组只行手术，而不结扎动脉)，3h后断头取脑，称全脑重、左、右半脑重后，左半脑置37℃恒温箱中干燥至恒重，按下列公式计算脑指数、脑含水量。
右半脑-30℃冷冻2h，手术刀平行冠状面切成1～2mm厚切片5～6片，2％红四氮唑缓冲液(pH7.4)中于37℃恒温水浴中染色15min后，分别称取红染(未梗塞区)部分重量及未染(梗塞区)部分重量，按下式计算梗塞面积百分率。
2.结果
结果显示注射用MLN 16.5g/kg、33g/kg、66g/kg三个剂量组均能降低大鼠急性不完全性脑缺血的梗塞面积、脑指数、脑含水量，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05，0.01)。其作用与MLN注射液3.3ml/kg、丹参注射液2g/kg相近。表明注射用MLN具有抗急性脑缺血作用，见表3-6。
表3-6注射用MLN对大鼠急性不完全性脑缺血的影响(X±S)
△P＜0.05、△△P＜0.01与伪手术组比较
*P＜0.05、**P＜0.01与模型组比较
(七)注射用MLN对小鼠急性脑缺血死亡率的影响
1.方法
雄性KM小鼠70只，体重19g～22g，按体重随机均分为7组，每组10只。(1)MLN小剂量组33g/kg；(2)MLN中剂量组66g/kg；(3)MLN大剂量组132g/kg；(4)MLN注射液组6.6ml/kg；(5)丹参注射液组4g/kg；(6)模型组10ml/kg；(7)假手术组。各组均按10ml/kg每日腹腔注射给药1次，连续给药7日。末次给药后0.5h，乙醚浅麻，4-0丝线结扎双侧颈总动脉，记录小鼠5min内存活时间(超过5min，计300s)(每分钟呼吸少于或等于5次为死亡)。假手术组手术操作相同，但不结扎颈总动脉。
2.结果
结果显示注射用MLN 33g/kg、66g/kg、132g/kg，MLN注射液6.6ml/kg，丹参注射液4g/kg能对抗因结扎双侧颈总动脉所致的小鼠急性脑缺血，明显延长小鼠存活时间(P＜0.05，0.01)。表明注射用MLN具有抗脑缺血作用，见表3-7。
表3-7注射用MLN对小鼠急性脑缺血存活时间的影响(X±S)
△△P＜0.01与伪手术组比较
*P＜0.05、**P＜0.01与模型组比较
(八)注射用MLN对大鼠离体血管平滑肌的作用
1.方法
1.1标本处理
选用清洁级SD大鼠，体重250～300g，雌雄不拘。采用鼠断头器将大鼠断头处死，迅速打开胸腔，取其胸主动脉，置于通以(95％O2+5％CO2，流量2L/min)混合气体饱和的冷Krebs-Henseleit生理液(K-H生理液成分[g/L]NaCl6.92，KCl 0.35，CaCl2 0.28，KH2PO4 0.16，MgSO4·7H2O 0.46，NaHCO3 2.1，Glucose 2.0)中，轻轻剪除动脉外膜脂肪及结缔组织，并剪成3mm宽血管环标本数段。将血管环用两根不锈钢微型挂钩贯穿血管管腔，标本悬挂于盛15ml KH液的浴管中，两端分别连在张力换能器和浴管底部的固定钩上，持续通入混合气体(95％O2+5％CO2，流量2L/min)，保持温度(37±0.5)℃。经Medlab-U/8c生物信号采集处理系统(模数转换器)与计算机相连，记录血管张力的变化。每个血管环悬挂在浴管内后，不加张力温浴30min，然后给予2.0g的前负荷，温浴1h。温浴期间不断调整张力，使之维持稳定，每15min更换一次K-H液。1.2注射用MLN对KCl所致动脉环收缩反应的影响
用累计浓度法加入KCl液(20，40，60mmol/L)刺激，每次观察约15min(以每次达到最大收缩为准)。得KCl收缩主动脉环的量效曲线。当各段血管收缩达到稳定的最大收缩平台后，用K-H液反复冲洗动脉环(每15min换37℃K-H液，15ml/次)，待其张力恢复正常后60min，再累计加入KCl液刺激。当各血管对KCl刺激稳定时，即连续2次同样的刺激所引起的收缩幅度差别＜10％时，观察药物干预的作用。
各动脉血管用K-H液冲洗稳定60min后，分为脉络宁注射液I、脉络宁注射液II、MLNI、MLNII、MLNIII、MLNIV组，分别加入已配制为不同浓度的药物(采用K-H液配制)溶液各1ml，使浴管内为以下终浓度①脉络宁注射液I组0.0125ml原液/ml；②脉络宁注射液II组0.025ml原液/ml；③MLNI组0.03125g(生药)/ml；④MLNII组0.0625g(生药)/ml；⑤MLNIII组0.125g(生药)/ml；⑥MLNIV组0.25g(生药)/ml。给药后20min后，累计加入KCl液(20，40，60mmol/L)刺激，观察不同浓度MLN对KCl收缩血管的影响。
观察完药物的干预作用后，用K-H液反复冲洗动脉环，待其张力恢复正常后60min，再用累计浓度法加入KCl液(20，40，60mmol/L)刺激，观察此时动脉对KCl的反应性。
1.3注射用MLN对去甲肾上腺素所致动脉环收缩反应的影响
用累计浓度法加入去甲肾上腺素NA(10-7～10-5mmol/L)刺激，每次观察约15min(以每次达到最大收缩为准)。得NA收缩主动脉环的量效曲线。当血管收缩达到稳定的最大收缩平台后，用K-H液反复冲洗动脉环(每15min换37℃K-H液，15ml/次)，待其张力恢复正常后60min，再累计加入去甲肾上腺素NA(10-7～10-5mmol/L)刺激。当血管对NA刺激稳定时，即连续2次同样的刺激所引起的收缩幅度差别＜10％时，观察药物干预的作用。
动脉用K-H液冲洗稳定60min后，分为脉络宁注射液I、脉络宁注射液II、MLNI、MLNII、MLNIII、MLNIV组，分别加入已配制为不同浓度的药物(采用K-H液配制)溶液各1ml，使浴管内为以下终浓度①脉络宁注射液I组0.0125ml原液/ml；②脉络宁注射液II组0.025ml原液/ml；③MLN I组0.03125g(生药)/ml；④MLN II组0.0625g(生药)/ml；⑤MLNIII组0.125g(生药)/ml；⑥MLNIV组0.25g(生药)/ml。给药后20min后，累计加入去甲肾上腺素NA(10-7～10-5mmol/L)刺激，观察不同浓度MLN对NA收缩血管的影响。
观察完药物的干预作用后，用K-H液反复冲洗动脉环，待其张力恢复正常后60min，再用累计浓度法加入去甲肾上腺素NA(10-7～10-5mmol/L)刺激，观察此时动脉对NA的反应性。
2.结果
2.1注射用MLN对KCl所致动脉环收缩反应的影响
结果显示，脉络宁注射液0.0125ml原液/ml～0.025ml原液/ml和注射用MLN0.03125g(生药)/ml～0.25g(生药)/ml浓度依赖性地抑制KCl(20～60mmol/L)对动脉环的收缩作用(p＜0.05，0.01)。脉络宁注射液使60mmol/LKCl所引起的动脉环收缩作用幅度分别下降11.11％、16.67％。注射用MLN使60mmol/LKCl所引起的动脉环收缩作用幅度分别下降12.59％、13.60％、50.00％、74.38％。结果见表3-8。
表3-8注射用MLN对KCl所致动脉环收缩反应的影响(X±S)
与给药前比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与MLN I比较，△△p＜0.01；与MLNII比较，_p＜0.05，__p＜0.01；与MLNIII比较，◇◇p＜0.01；
2.2注射用MLN对去甲肾上腺素所致动脉环收缩反应的影响
结果显示，脉络宁注射液0.0125ml原液/ml～0.025ml原液/ml和注射用MLN0.03125g(生药)/ml～0.25g(生药)/ml浓度依赖性地抑制NA(10-7～10-5mmol/L)对动脉环的收缩作用(p＜0.05，0.01)。脉络宁注射液使10-5mmol/L NA所引起的动脉环收缩作用幅度分别下降15.48％、28.57％。注射用MLN使10-5mmol/L NA所引起的动脉环收缩作用幅度分别下降10.18％、23.35％、56.41％、78.65％。结果见表3-9。
表3-9注射用MLN对去甲肾上腺素所致动脉环收缩反应的影响(X±S)
与给药前比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与MLN I比较，△△p＜0.01；与MLNII比较，_p＜0.05，__p＜0.01；与MLNIII比较，◇◇p＜0.01；
实验结论
注射用MLN具有降低血液粘度、改善血液流变学、抑制血小板聚集、抗血栓形成及扩血管作用，对脑缺血有一定的保护作用。注射用MLN药理作用显著，在部分实验中明显优于市售MLN组。
实验例3一般药理试验
1.静脉注射注射用MLN 33、132、264g/kg(生药量)均未引起小鼠流涎、肌颤现象；对小鼠一般行为如姿势、步态及自主活动无明显影响，与空白对照组比较无显著性差异(P＞0.05)；
2.静脉注射注射用MLN 33、132、264g/kg(生药量)并立即腹腔注射戊巴比妥钠后，其入睡率、入睡潜伏期和睡眠时间与空白对照组比较无显著性差异(P＞0.05)；
3.静脉注射注射用MLN 33、132、264g/kg(生药量)后，各组小鼠的悬尾停动时间与空白对照组比较无明显差异(p＞0.05)；
4.静脉注射注射用MLN 33、132、264g/kg(生药量)后，各组小鼠在平衡杆上的滑落次数与空白对照组比较无明显差异(p＞0.05)；
5.静脉注射注射用MLN 33、132、264g/kg(生药量)后，各组小鼠从倾斜板上滑落只数与空白对照组比较无明显差异(p＞0.05)。
6.静脉滴注注射用MLN 3.3、13.2、26.4g/kg(生药量)后，对家犬血压、心电图、呼吸频率和呼吸幅度与空白对照组比较无明显差异(p＞0.05)。
综上所述，注射用MLN在上述受试剂量范围内对小鼠中枢神经系统、家犬心血管系统及呼吸系统基本无明显影响。
实验例4急性毒性试验
实验对小鼠和大鼠进行了静脉给药和腹腔给药的最大给药量试验。结果在给药后均未见小鼠和大鼠的异常情况发生。若注射用MLN临床成人一日用量200g/60kg(按生药量计算)，则
①一日内两次静脉给药的小鼠最大给药量为2000g/kg，是临床成人一日用量的606倍；
②一日内两次腹腔注射给药的小鼠最大给药量为2000g/kg，是临床成人一日用量的606倍；
③一次静脉给药的大鼠最大给药量为320g/kg，是临床成人一日用量的97倍；
④一日内两次腹腔注射给药的大鼠最大给药量为960g/kg，是临床成人一日用量的290倍。
表明注射用MLN静脉给药安全度较大。
实验例5长期毒性试验
(一)大鼠长毒
用注射用MLN 33g/kg、100g/kg、200g/kg(按生药量计算)三个剂量组连续给大鼠腹腔注射12周和恢复2周。结果
1.大鼠一般体征良好，体重、摄食量正常，血液学、血液生化指标和脏器系数与对照组比较基本无显著性差异；
2.组织学检查结果显示注射用MLN高剂量组对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、十二指肠、回肠、结肠、胰腺、甲状腺、胸腺、肾上腺、脑、脊髓、视神经、脑垂体、淋巴结、膀胱、前列腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫、胸骨及骨髓等♂性23个脏器、♀性22个脏器的病理学表现与对照组相似，停药后也未查见新出现的迟发性病变。
综上所述，注射用MLN对大鼠基本无长期蓄积性的毒性作用。
(二)犬长毒
用注射用MLN 13.2g(生药量)/kg、66g(生药量)/kg和132g(生药量)/kg三个剂量组连续给Beagle犬前肢皮下头静脉给药12周和恢复2周，结果犬一般体征、体重、进食量、血液学指标、尿常规、血液生化指标及脏器系数基本无明显影响；组织学检查也显示高剂量组对犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、胰腺、唾液腺、胆囊、气管、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、肾上腺、大脑、小脑、脑干、颈段脊髓、胸段脊髓、腰段脊髓、视神经、脑垂体、坐骨神经、淋巴结、膀胱、前列腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫、胸骨及骨髓、乳腺、给药局部(静脉)等♂性、♀性各35个脏器或组织未见明显的组织学病理改变。表明注射用MLN经静脉给药对犬毒性较小。
实验例6安全性试验
1.溶血性试验结果表明，注射用MLN(批号040608)未见溶血及凝集反应；
2.豚鼠全身过敏性试验结果表明，注射用MLN(批号040608)过敏反应试验合格；
3.家兔血管刺激性试验结果表明，注射用MLN(批号040608)，于静脉给药后，注射部位未查见任何血管刺激性变化，提示注射用MLN(批号040608)对血管基本无刺激性反应；
4.家兔肌肉刺激性试验结果表明，注射用MLN(批号040608)，于股四头肌注射给药后，注射部位未查见任何刺激性变化，提示注射用MLN(批号040608)对家兔股四头肌基本无刺激性作用；
5.大鼠同种被动皮肤过敏试验(PCA)结果表明，注射用MLN(批号040608)应属于不会诱发皮肤被动过敏反应的药物，建议临床继续观察。
综上所述，注射用MLN符合注射剂的安全性要求，可供静脉注射使用。注MLN即脉络宁的缩写，本实验脉络宁冻干使用量均以生药量计，所用冻干为制备实例1中试产品。
权利要求
1、一种注射用脉络宁，其特征在于每1000支由金银花、牛膝、玄参、石斛各25Kg提取的有效成份和医学上所能接受的赋形剂组成。
2、根据权利要求1所述的注射用脉络宁，其特征在于所述的赋形剂是甘露醇、肌醇、乳糖、葡聚糖、氯化钠中的的一种或几种，用量为0.2-0.4g/支。
3、根据权利要求2所述的注射用脉络宁，其特征在于所述的赋形剂是甘露醇，用量为0.3g/支。
4、根据权利要求2所述的注射用脉络宁，其特征在于所述肉桂酸含量不少于3.6mg/支、绿原酸含量不少于150mg/支。
5、根据权利要求3所述的注射用脉络宁，其特征在于所述肉桂酸含量是3.6-5mg/支、绿原酸含量是150-180mg/支。
6、根据上述任一权利要求所述的注射用脉络宁的制备方法，其特征在于是通过以下步骤制得
(1)由中药金银花25kg、玄参25kg、牛膝25kg、石斛25kg制成1000支；
(2)取以上四味药材，加50％～70％乙醇在70～80℃下回流提取1～3次，每次6～10倍量，每次1～2小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，续以夹层蒸汽挥至无醇味；
(3)加1-2倍量注射用水，充分搅拌，夹层蒸汽加热至90～95℃后保温30-60分钟，冷藏12～24小时，以5000rpm的速度离心15-30分钟，取上清液备用；
(4)上清液用盐酸调pH至2.0～4.0，用1～2倍量的醋酸乙酯萃取4～8次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯后，以夹层蒸汽挥至无醋酸乙酯味；
(5)加注射用水10-15L，充分搅拌后滤过，滤液浓缩至适量体积，干燥，得中间体；
(6)取上述中间体，加入赋形剂，加水使之溶解后，用15-20％NaOH溶液调pH至6.0～8.0，加1-2‰活性炭，搅拌15-30分钟，滤过，滤液适当补充注射用水至总量为5000ml～8000ml，通过0.22μm的微孔滤膜滤液备用；
(7)滤液以5～8ml/支分装，半压胶塞，装盘进箱，按冻干曲线进行冻干，冻干后压塞，放真空，出箱，轧铝盖，检验，贴标签，包装，即得。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤(5)中的干燥方法为喷雾干燥或真空干燥的一种。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于是通过以下步骤制得，
(1)由中药金银花25kg、玄参25kg、牛膝25kg、石斛25kg制成1000支；
(2)取以上四味药材，加60％乙醇在70℃下回流提取2次，每次8倍量，每次1小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，续以夹层蒸汽挥至无醇味；
(3)加1倍量注射用水，充分搅拌，夹层蒸汽加热至95℃后保温30分钟，冷藏24小时，以5000rpm的速度离心15分钟，取上清液备用；
(4)上清液用盐酸调pH至3.0，用2倍量的醋酸乙酯萃取8次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯后，以夹层蒸汽挥至无醋酸乙酯味；
(5)加注射用水10L，充分搅拌后滤过，滤液浓缩至适量体积，干燥，得中间体；
(6)取上述中间体，加入赋形剂，加水使之溶解后，用20％NaOH溶液调pH至7.0，加1‰活性炭，搅拌15分钟，滤过，滤液适当补充注射用水至总量为7000ml，通过0.22μm的微孔滤膜滤液备用；
(7)滤液以7ml/支分装，半压胶塞，装盘进箱，按冻干曲线进行冻干，冻干后压塞，放真空，出箱，轧铝盖，检验，贴标签，包装，即得。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于加入赋形剂为甘露醇，用量为0.3g/支。
10、一种注射用脉络宁的质量控制方法，其特征在于方法如下，
一、鉴别
a.金银花的薄层层析鉴别；
取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。取金银花药材粉末5g，加甲醇50ml，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至2ml，作为对照药材溶液。取本品1瓶，加甲醇50ml，超声提取30min，离心，上清液蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10ml，作为供试品溶液。另取牛膝、石斛、玄参药材，按照生产工艺要求制备成品，后按照上述供试品溶液的制备方法制得阴性制剂供试品溶液。照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液5μl、药材对照溶液3μl、供试品溶液3μl、阴性制剂供试品溶液3μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积用量比为20∶5∶5的醋酸丁酯-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下波长365nm处检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b.玄参的薄层层析鉴别；
取玄参药材粉末5g，加水饱和的正丁醇50ml，超声提取30min，取出，以7000r/min的速度离心10min，上清液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至2ml，作为对照药材溶液。取本品一瓶，加水溶解并定容至10ml，以水饱和的正丁醇萃取三次，用量分别为20ml、20ml、15ml，萃取液合并，水浴挥干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，作为供试品溶液。阴性制剂供试品溶液取牛膝、石斛、金银花药材，按照生产工艺要求制备成品，后按照供试品溶液的制备方法制得阴性制剂供试品溶液。照薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液5ul、供试品溶液5μl、阴性制剂供试品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积用量比为2-7∶1的氯仿∶甲醇溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸试液，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
c.牛膝的薄层层析鉴别；
取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
取牛膝药材粉末10g，加乙醇或甲醇50ml，加热回流90min，滤过，滤液加盐酸4ml，加热回流2小时，浓缩至约10ml，加水20ml，用石油醚60～90℃下萃取三次，用量分别为40ml、40ml、20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至2ml，作为对照药材溶液。取本品1瓶，加乙醇或甲醇50ml，加热回流90min，滤过，滤液加盐酸4ml，加热回流2小时，浓缩至约10ml，加水20ml，用石油醚60～90℃下萃取三次，用量分别为40ml、40ml、20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至2ml，作为供试品溶液。另取玄参、石斛、金银花药材，按照生产工艺要求制备成品，后按照供试品溶液的制备方法制得阴性制剂供试品溶液。照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液3μl、对照药材溶液6μl、供试品溶液3μl、阴性制剂供试品溶液3μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积用量比为10-20∶1的氯仿∶甲醇溶液为展开剂，展开， 取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯下波长365nm处检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的荧光斑点；
d.石斛的薄层层析鉴别；
取滨蒿内酯对照品适量，加氯仿制成每1ml含0.3mg的溶液，作为对照品溶液。取石斛药材粉末5g，用氨水湿润，浸湿密塞放置30min，加入氯仿100ml，加热回流2小时，取出，滤过，滤液蒸干，加氯仿溶解并定容至2ml，作为对照药材溶液。取本品1瓶，粉末用氨水湿润，浸湿密塞放置30min，加入氯仿100ml，加热回流2小时，取出，滤过，滤液蒸干，加氯仿溶解并定容至10ml，作为供试品溶液。另取牛膝、金银花、玄参药材，按照生产工艺要求制备成品，后按照上述供试品溶液的制备方法制得阴性制剂供试品溶液。照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液2μl、对照药材溶液3μl、供试品溶液3μl、阴性制剂供试品溶液3μl，分别点于同一以羧甲基纤维素纳为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为0.5-4∶1的石油醚∶醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下波长365nm处检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
二、含量测定
a.肉桂酸 照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为54∶46的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为278nm。理论塔板数按肉桂酸峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备 精密称取肉桂酸对照品适量，加体积比为54∶46的甲醇-水溶剂制成每1ml含260μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取装量差异项下本品内容物，混匀，取0.2g，精密称定，置50ml容量瓶中，加体积比为54∶46的甲醇-水溶解并稀释至刻度，摇匀，再从中精密吸取5ml至10ml容量瓶中，以上述溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每支含肉桂酸C9H8O2不得少于3.60mg；
b.绿原酸 照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为5-35∶95-65的乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相，检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计不低于1500；
对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加体积比为5-35∶95-65的乙腈-水溶剂制成每1ml中含80μg的溶液；
供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，混匀，取0.2g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加体积比为5-35∶95-65的乙腈-水溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，再从中精密吸取1ml至25ml棕色量瓶中，以上述溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每支含绿原酸以C16H18O9计，不得少于150.0mg；
最终确定本品以肉桂酸和绿原酸为本品质量的定量指标；
三、指纹图谱
照高效液相色谱法，并结合中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南要求；
色谱条件及系统适用性试验；
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相，按下表进行梯度洗脱，检测波长为254nm，柱温35℃。理论板数按绿原酸峰计不低于3000；
梯度洗脱程序为
参照物的制备 取绿原酸对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成每1ml含20μg的溶液作为参照物溶液；取肉桂酸对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成每1ml含15μg的溶液作为参照物溶液；
供试品的制备 取本品一支，加入重蒸水溶解，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取上液0.2ml至25ml量瓶中，加重蒸水稀释至刻度，用0.45μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得；
测定法 精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录时间为70min，梯度平衡时间10min；
供试品图谱应与注射用脉络宁对照图谱相一致，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版计算，相似度应大于0.9；
指纹图谱方法中流动相可以是甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05～0.5％磷酸溶液、乙腈-0.05～0.5％磷酸溶液和乙腈-0.01～0.2％甲酸溶液等多种色谱系统和梯度洗脱程序。
全文摘要
本发明提供了一种注射用脉络宁及其制备方法和质量控制方法。本发明制备方法所得脉络宁，有效成分含量高，同时产品质量标准也大大提高。本发明的脉络宁因提高了绿原酸和肉桂酸的含量而具有更好的疗效。本发明同时解决了水针剂质量不稳定等问题，具有成型性好、速溶、澄明、稳定、储运、携带和使用方便等特点。本发明工艺步骤简单，适于工业生产。
文档编号A61K9/19GK1817365SQ20051011748
公开日2006年8月16日 申请日期2005年10月31日 优先权日2005年10月31日
发明者郭卫芹, 张 育, 齐新英 申请人:石家庄制药集团欧意药业有限公司