专利名称：使用荧光蛋白进行断层摄影成像的方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及光学断层摄影，并且更特别涉及使用荧光蛋白从活标本提取定量的三维分子和生物信息的方法和系统。
背景技术：
荧光蛋白(FPs)是用于不同生物医学应用的重要报道分子。在一些现有的应用中，利用落射荧光、共焦(显微术)或反射(整个动物)成像来探测工程FPs。
落射荧光、共焦显微术取决于向标本投射和从标本反射的相干(不扩散)光。因为显微术需要本质上相干的光，所以这种技术仅仅能够成像到标本中的小深度(例如小于1mm)。在更深的成像深度，众所周知光开始扩散，使得显微术在更深的成像深度无效。
已经证明反射荧光成像有助于探测和跟踪体内肿瘤，特别是那些附着在体表附近或者经手术暴露的器官中的肿瘤。然而，由于获得的图像是来自多个深度的荧光信号的叠加，这往往导致模糊的图像，因此反射荧光成像具有内在的局限性。此外，反射荧光成像不是断层摄影，并不检索深度信息或者允许荧光活性的绝对量化。这部分是由于光在生物组织中的非线性衰减和传播，其将反射荧光成像的应用限制在仅仅几毫米深度的半定量成像。
组织中更深的成像光学特征常常需要应用先进的光激发和光探测装置和技术并且使用断层摄影原理来组合在不同投射所采集的数据。使用衍射光源成像的进步已经导致了使用内在或外在施予的光学造影剂来研究组织的几项研究。特别地，扩散光学断层摄影(DOT)是可以在扩散介质中存在吸收和散射的情况下提供与扩散介质有关的断层摄影图像的技术。例如，DOT已应用于大脑血流动力成像和乳房组织的成像。例如，在2004年2月5日由Vasilis Ntziachristos和Jorge Ripoll提交的、标题为“Method and System for Free SpaceOptical Tomography of Diffuse Media”的国际专利申请PCT/US04/03229中，介绍了一种示意性的DOT方法和系统，该申请转让给本发明的受让人。
已经证明，由于在所谓的“近红外窗”中的低组织吸收，因此具有近红外范围内的波长的光可以传播通过组织的距离大约为几厘米。近红外(NIR)窗使NIR荧光技术得到发展以显示标本内的特殊生化反应。
也已经发展了用于处理NIR荧光信号的各种相关方法。特别地，合适的成像系统的发展已经允许应用荧光分子断层摄影(FMT)，其是一种使用NIR荧光探针或标记来解析深组织中的分子特征的技术。已经展示了应用于深层肿瘤中的酶活性的体内三维成像的FMT。
传统NIR光学断层摄影中的通常假设是扩散介质中的传播具有高散射以及如NIR窗提供的较低吸收。该假设允许通过“扩散近似”导出与“输运方程”有关的“扩散方程”，这为组织中的NIR光子传播建模提供了有效工具。例如在K.M.Case和P.F.Zweifel的“LinearTransport Therory”，Addison-Wesley，MA，(1967)以及K.Furutsu和Y.Yamada的“Diffusion Approximation for a Dissipative RandomMedium and the Applications”，Phys.Rev.E 50，3634(1994)中介绍了该输运方程。
众所周知，所有当前可用的荧光蛋白利用波长在可见光范围内的激发光。而且，传统的荧光蛋白当被激发时发射可见荧光。生物组织中传播的可见光的较高吸收将使用如由传统荧光蛋白提供的可见光的断层摄影成像变得复杂，这导致显著衰减。由于高吸收，(例如对于可见光)上述传统的扩散近似变得无效。
输运方程的其它更高级的解(除了上述扩散近似以外)已经产生并且已经应用于NIR光学断层摄影。所述高级解克服了上述扩散近似的不足。然而，输运方程的高级解通常计算量大并且不适用于具有大量激发光源的断层摄影系统，这导致产生大数据集。
为了提供断层摄影所需的多个图像，许多传统的光学断层摄影系统使用光学开关作为光源组件的一部分以便使用单个光元件在相对于标本的各种角度或者位置进行投射。众所周知，光学开关产生能量损耗。此外，许多光学断层摄影系统使用在室温下或在适度冷却下的CCD照相机来收集光。众所周知，室温或适度冷却的CCD照相机具有较高水平的暗(热)噪声，这往往限制了最终光学断层摄影图像的质量。
发明内容
根据本发明的一个方面，一种用于光学断层摄影的系统包括适于向其中具有荧光蛋白的标本投射激发光的表观光源(apparent lightsource)，其中激发光进入标本，成为标本内的内在光。内在光适于从荧光蛋白激发荧光。内在光和荧光是扩散的。在一些实施例中，激发光和荧光中的至少一个具有在可见光波长范围内的波长。
根据本发明的另一方面，一种光学断层摄影的方法包括使用适于向其中具有荧光蛋白的标本投射激发光的表观光源来产生激发光，其中激发光进入标本，成为标本内的内在光。内在光适于从荧光蛋白激发荧光。内在光和荧光是扩散的。在一些实施例中，激发光和荧光中的至少一个具有在可见光波长范围内的波长。
根据本发明的另一方面，一种用于光学断层摄影的系统包括至少一个可选择性移动的部件以选择性地移动表观光源，从而将多个光路指向标本。
从对附图的以下具体描述，可以更全面地理解本发明的上述特征以及本发明自身，其中图1是示出一种用于光学断层摄影的系统的框图，所述系统提供透射成像；图1A是示出一种用于光学断层摄影的系统的框图，所述系统提供反射成像；
图2是示出一种用于光学断层摄影的系统的框图，所述系统具有激光源、光纤、光学开关、冷却CCD照相机以及图像处理器；图3是一种光学扫描器的框图，该光学扫描器具有光纤耦合器、位置可控镜和远心透镜，它们一起用于在恒定工作距离(WD)处产生具有平光场的多个表观光源；图4是示出用于提供根据本发明的断层摄影图像的方法的流程图；图5示出了31个图像的系列，对应于如图3的光学扫描器提供的图1的31个表观光源，显示了内在光(即来自表观光源、进入并离开标本的激发光)；图5A示出了31个图像的另一系列，对应于如图3的光学扫描器提供的图1的31个表观光源，显示了响应于图5的内在光从标本内的荧光蛋白发射的荧光；图5B示出了31个图像的又一系列，对应于如图3的光学扫描器提供的图1的31个表观光源，显示了未穿过标本但是已经穿过均质板(即仿真模型)的透射光；图6示出了叠加死鼠的白光图像的荧光图像，其中具有表达细胞的绿色荧光蛋白(GFP)的玻璃瓶放置在死鼠的食管中；图6A示出了叠加死鼠的白光图像的另一荧光图像，其中具有表达细胞的绿色荧光蛋白(GFP)的另一玻璃瓶放置在死鼠的食管中，该玻璃瓶比图6的瓶具有更多的细胞；图7是一种用于光学断层摄影的系统的框图，该系统具有平面成像室；图7A是示出用于图7的系统中的成像室的框图；图8是另一种用于光学断层摄影的系统的框图，该系统具有旋转平面成像室；图8A是可以用于图8的系统中的旋转平面成像室的框图；图9是另一种用于光学断层摄影的系统的框图，该系统具有旋转的圆筒形成像室；图10是另一种用于光学断层摄影的系统的框图，该系统具有旋转的圆筒形成像室和可选择性移动的表观光源；图10A是示出旋转的圆筒形成像室和多个光源的框图；图11是另一种用于光学断层摄影的系统的框图，该系统具有带表观光源阵列的光学扫描头；以及图11A是如图11所示的光学扫描头的框图。
具体实施例方式
在介绍成像方法和系统之前，解释一些介绍性概念和术语。当在此使用时，“仿真模型(phantom)”指的是正在成像的测试对象。仿真模型典型地是具有类似于活组织的扩散光传播特性的人造物品，例如一片塑料。作为另一实例，仿真模型可以是其中具有表达荧光蛋白(即荧光标记)的细胞的玻璃瓶。
当在此使用时，术语“表观光源”用于说明单一光源投射到多个物理位置或角度，每个提供一个表观光源。
当在此使用时，术语“激发”光用于说明由激发光源产生的光，(例如表观光源)，在进入标本之前，所述光向待成像的标本传播。一旦到达标本中，所述光在此称为“内在”光。该内在光在标本中受到吸收和散射，并且也可以离开标本。
已经离开标本的内在光与激发光源产生的光具有相同的波长。激发光和内在光可以是单色的或者它们可以覆盖更宽的光谱，例如白光。
在一些实施例中，通常与光源设置在标本相同一侧的光探测设备来接收离开标本的内在光(例如，在下面介绍的图1A中的反射成像中)。在其它实施例中，通常与激发光源设置在标本相反一侧的光探测器来接收离开标本的内在光(例如，在下面介绍的图1的投射成像中)。在任一情况下，当激发光进入标本时，其成为内在光并且从标本的内部反射或者穿过标本。
当在此使用时，术语“发射”光用于说明由生物组织或在生物组织内产生的光。当在此使用时，术语“荧光”用于描述通过激发荧光蛋白以响应内在光而产生的发射光的形式。
当在此使用时，术语“图像”用于说明具有数字照相机或计算机系统产生的基础“图像数据”的直观表示。然而，应当理解当在此使用时，术语“图像”还用于指图像数据。
当在此使用时，术语“扩散”用于说明在标本内传播时已经遇到若干散射事件(例如十个以上的散射事件)的具有光子的光，与标本中光子的吸收无关。散射事件的数目可以大于或小于十。
下面所介绍的本发明的方法和系统适用于在扩散光传播占优势的生物组织中传播的可见光。然而，所述方法和系统也同样很好地适用于在扩散光传播占优势的任何介质中传播的任何形式的光，例如，在生物组织中传播到足够深度的NIR光，例如可见激发光和NIR荧光(发射光)。而且，所述方法和系统还可以适用于在相干传播占优势的介质中传播的光。
尽管此处所介绍的本发明的方法和系统同样地适用于发射可见荧光的荧光蛋白，在大约400nm到700nm的可见光波长范围内提供特别的益处，但是所述方法和系统也可以适用于具有其它波长的光，例如大约700nm到1000nm的近红外(NIR)范围内的荧光。而且，所述方法和系统同样很好地适用于其中激发光在一个波长范围内(例如在可见光范围内)而荧光蛋白发射的荧光在另一个波长范围内(例如在NIR范围内)的系统。所述方法和系统也适用于其中激发光和荧光蛋白发射的荧光在NIR范围内或者两者都在可见光范围内的场合。而且，可以使用超出400nm到1000nm的波长范围的光。
参照图1，用于使用荧光蛋白进行光学成像的系统10包括成像光源12和光引导设备14以提供多个表观光源(未示出)。表观光源在相对标本18的多个位置处提供激发光22a-22c。尽管显示了三个这样的位置，但是也可以有三个以上或三个以下的表观光源位置。激发光22a、22c照射在标本18上，在进入时成为内在光，并且作为内在光24a、24b离开标本18。内在光24a、24b穿过任选的可选择的滤光器28，穿过任选的图像增强器30，并且由光探测器32接收。激发光22b也进入标本18并且照射在标本18内的荧光蛋白20上。响应激发光22b，荧光蛋白20发射荧光26，该荧光26也穿过任选的可选择的滤光器28，穿过任选的图像增强器30，并且由光探测器32接收。
任选的白光源40可以为标本提供进一步的照明以提供其它光路(未示出)，该光路从标本的表面反射，并且同样穿过任选的可选择的滤光器28，穿过任选的图像增强器30，并且由光探测器32接收。
在一些实施例中，内在光24a、24b，荧光26以及来自白光源40的白光同时由光探测器接收。在该配置中，内在光24a、24b，荧光26以及来自白光源40的白光可以由可选择的滤光器28分离以同时或在不同的时间将不同的光提供给光探测器32。为此，可以将可选择的滤光器通带在不同时间集中在内在光、荧光和白光的波长上。
在其它实施例中，内在光24a、24b，荧光26以及来自白光源40的白光中的任何一个或多个的接收时间与内在光24a、24b，荧光26以及来自白光源40的白光中的其它光的接收时间不同。例如在一个特殊实施例中，首先接收内在光24a、24b，此时成像光源12熄灭。在内在光24a、24b不再存在后，接收荧光26。当停止发射荧光26后，打开白光源40，并且接收白光。
光探测器32用于将接收的光转换成数字数据32a(在此也称为图像数据)。图像处理器34接收数字数据32a并且生成图像46。在一些实施例中，图像46是断层摄影图像。
图像处理器34可以包括具有扩散方程处理器38的正向问题(forward problem)(FP)处理器36。下面例如将结合图4对正向问题处理器36和扩散方程处理器38的功能进行更具体的描述。在此只要说明的是正向问题处理器36将标本中的光传播的模型(预期光)与光探测器接收的光相比较。接收光和预期光(由光传播模型提供)之间的差异与标本内的荧光蛋白20有关。扩散方程处理器38提供用于“扩散方程”中的修正扩散系数，该“扩散方程”与可以用于提供上述光传播模型的“输运方程”有关。
在一些实施例中，修正扩散系数允许模型预测在可见光波长范围内的光(具有大约400nm到700nm的波长)的光传播。在其它实施例中，修正扩散系数允许模型预测在近红外波长范围内的光(具有大约700nm到1000nm的波长)的光传播。在又一实施例中，修正扩散系数允许模型预测波长在400nm到1000nm范围之外的光的光传播。
系统10也可以包括光方向控制器44以将表观光源引导到预定光路。系统10也可以包括任选的室位置控制器42以代替光方向控制器44或与之组合，其可以用于移动成像室16以提供更多的表观光源，即内在光沿更多的预定光路穿过标本18。
应当理解的是系统10提供一种透射成像系统，其中成像光源12产生的光穿过标本18并且基本上在标本18的另一侧被接收。
现在参照图1A，示出了系统70，其中将图1的类似元件表示成具有类似的附图标记，可选择的滤光器28、图像增强器30以及光探测器32通常与成像光源12和光引导设备14位于标本18的相同侧。利用该特殊配置，内在光72a、72b被光探测器32作为发射光接收。实质上，激发光22a-22c进入标本18并且反射，或者更具体而言，散射回到光接收器32。荧光74也由光探测器32接收。系统70生成图像76。
应当理解的是系统70提供一种反射成像系统，其中由成像光源12发射的光进入标本18并且基本上在标本18的相同侧被接收。在其它实施例中，光引导设备14和光探测器32之间的角度大约为90度。
现在参照图2，装置100包括激光器102、光纤104以及光学开关106，其组合在一起产生指向具有成像板108的成像室112的多个表观光源，标本110放置在该成像板108上。成像室可以充满匹配液114。可选择的滤光器115和CCD照相机116接收穿过标本110的内在光和由标本110发射的荧光。如上所述，可选择的滤光器具有选择性地集中在内在光或荧光的波长上的通带，这取决于正在生成的是内在图像还是荧光图像。光学开关106可以由计算机122控制。计算机122也可以经由CCD控制器118控制CCD照相机116。图像处理器120经由CCD控制器118接收数字数据116a。图形显示器124可以显示最终的图像信息。
应当认识到激光器102对应于图1和图1A的成像光源12，光学开关106对应于图1和图1A的光引导设备14，成像室112对应于图1和图1A的成像室16，CCD照相机116对应于图1和图1A的光探测器32，图像处理器120对应于图1和图1A的图像处理器34。
此处显示的标本110是放置在成像室112中的老鼠。激光器102提供激发光(未示出)，该激发光进入标本110并且激发标本110内的荧光蛋白(未示出)以产生荧光(未示出)。CCD照相机116经由可选择的滤光器115接收作为内在光的激光(已穿过标本110)并且也接收从标本110内发射的荧光。
在一个特殊实施例中，激光器102是氩(Ar+)激光器，其在大约200mW的连续波(CW)功率下发射具有大约488nm波长的激光。该激光可以用于激发标本110内的荧光蛋白，例如绿色或黄色荧光蛋白。
在一个特殊实施例中，光纤104是直径为100μm的多模光纤。激光器102通过光学开关106在相对于标本110的不同物理位置处提供多个表观光源。在一个特殊实施例中，光学开关提供31个表观光源。然而，在其它实施例中，可以提供31个以上或31个以下的表观光源。
虽然显示了光学开关106，但是在另一个实施例中可以使用光学扫描头(或光学扫描器)代替光学开关106，如图3中更具体地显示。
光学开关106在相对于标本110的多个角度或位置提供表观光源，由此允许图像处理器120形成相应的多种图像，其可以由图像处理器120结合到断层摄影方法中。
应当理解的是光学开关106包括多个可选择的光纤路径(未示出)，适于将光引导到相应的多个可选择的固定物理位置，从而提供在位置和数目上被选择性固定的表观光源。
在一个特殊实施例中，活组织(此处显示的是老鼠)放置在成像板108上并与光学匹配液114接触。下面将进一步介绍匹配液114。匹配液用于减小杂散光的影响。然而，在其它实施例中，不使用匹配液。
在操作中，内在光(源自每个表观光源)以及由标本110内的荧光蛋白发射的光由CCD照相机接收并且其后由图像处理器120进行断层摄影处理，如结合图4所述。
在一个特殊实施例中，CCD照相机116是具有减小暗噪声的冷却CCD照相机。例如，提供的CCD照相机116可以是Roper Scientific，Princeton Instruments的具有低温冷却单元的CCD照相机。
在操作期间，CCD控制器118控制并触发光学开关106，使得获得的每个图像对应于新表观光源的新位置(即光学开关106中的不同光路)，因此实现了激发和探测的正确同步。每次采集由N个图像组成，对每个表观光源位置进行一次采集。因此，假设512×512像素的CCD照相机，用于每组测量的最大数据量是N×512×512。然而，用于图像处理器120进行后续处理的探测器的数目(即像素)可以小于512×512像素的完全组，这取决于与表观光源中的每一个有关的视野。而且，可以减小使用的像素数目以减小图像处理所需的计算时间。
在一个特殊实施例中，CCD照相机116和可选择的滤光器115例如沿箭头140、140所表示的方向在标本110附近可选择性移动以便获得相对于标本110的其它角度的更多的图像。在另一个实施例中，稍微从CCD照相机116离线的光学扫描器117可以提供在相对于标本的其它角度的图像。
标本110可以水平地放置在成像板108上并且用盖玻片(未示出)压缩。然后，使用匹配液114充满成像室112，在一个特殊实施例中，该匹配液由脂类乳剂(intralipid)和墨汁(India ink)溶液组成。匹配液114提供光学特性的匹配，这往往减小室中的折射率与扩散-波失配。在一个特殊实施例中，匹配液114由1％的脂类乳剂和2.1％的墨汁组成，其分别对应于μa＝1.25cm-1和μs′＝16.7 cm-1，其中μa是吸收系数而μs′是减小的散射系数。下面将进一步介绍减小的散射系数。
现在参照图3，光学扫描器150可以用于代替图2的光学开关106并且也可以用作图2的光学扫描器117。在一个特殊实施例中，光学扫描器150可以包括围绕大致正交的轴在枢轴上转动的两个检流计控制镜(在此为了清楚起见，示出了一个检流计控制镜156)和一个扫描透镜158，扫描透镜158用于扫描和将激光束156聚焦在成像室162的输入窗上以提供多个表观光源，每个表观光源在不同的物理位置，在此由光束160a和160b代表。在一个特殊实施例中，扫描透镜158是远心透镜。在一个特殊实施例中，在场平面162(即图2的成像室112)的光束直径大约为300μm。可以使用单一光源(未示出)，其由光纤耦合器152接收。
与传统光学开关(例如图2的光学开关106)的光损耗相比，光学扫描器150提供更少的光损耗。因此，光学扫描器150提供低损耗的表观光源系统。此外，利用该光学扫描器150，扫描面积、光束形状以及表观光源的数量和表观光源的位置可以进行基本上无穷的变化，这不同于图2的光学开关106，其中固定数量的光路在固定的位置处。而且，可以获得更高的光功率和更宽的光波长范围(可见光到近红外(NIR)光)。
光学扫描器150具有多种胜过光学开关的优点，包括但不限于低能耗、在多个表观光源上的一致响应以及改善的可靠性和健壮性。而且，扫描面积以及表观光源的数量和空间配置可以由软件控制，所以其可以根据被扫描标本的特性进行变化。此外，可以获得更高功率的照明和更宽的波长范围(例如从400nm到1000nm)。
现在参照图4，光学断层摄影的方法200在步骤202开始，在此处产生激发光并且将其向标本发射。在一些实施例中，例如在导致产生断层摄影图像的实施例中，从对应于相对于标本的不同位置的多个表观光源提供激发光。
在一些实施例中，在多个表观光源处的多个光源通常同时提供激发光。在其它实施例中，多个表观光源顺序地提供激发光。
在方框204，接收内在光。如上所述，内在光对应于已进入并且离开标本的激发光。可以使用光探测器，例如图1的光探测器32来接收该内在光。在一些实施例中，接收的内在光对应于透射光，其中光探测器和表观光源基本上在标本相对的两侧。在其它实施例中，接收的内在光对应于反射光，其中光探测器和表观光源基本上在标本的相同侧。
在方框206，接收荧光。标本内的荧光蛋白响应内在光而发射荧光。可以使用光探测器，例如图1的光探测器32来接收该荧光。在一些实施例中，例如通过适于将荧光与内在光分离的滤光器(例如图1的28)，同时接收荧光和内在光。在其它实施例中，在激发光熄灭之后也通过滤光器接收荧光。
在方框208，将接收的内在光转换成第一图像信息，例如图1的数字数据32a。在方框210，将接收的内在光转换成第二图像信息，其也可以是数字数据32a。
在方框212，产生模型以预测标本中的光传播。所述模型可以基于扩散方程，该扩散方程具有如下将更具体描述(例如在下面的方程(4)中)的修正扩散系数以及具有如下面的方程(6)中的修正波数。
在方框212产生的光学模型可以与同质介质(即不具有光学异质性的介质)中的传播有关。在其它实施例中，也可以利用更先进的模型来解析且然后利用关于背景光学异质性的信息。
通过下面的论述，显而易见的是组织中的光传播可以通过使用具有修正扩散系数的修正扩散方程来建模，其中所述修正扩散系数适于预测扩散介质的光传播的特性，其中所述介质具有较高吸收，如在生物组织中的可见光传播的情况中。具有如下所述修正扩散系数，修正扩散方程例如可以预测可见光在生物组织中的传播，众所周知其将扩散并且对于可见光具有较高的吸收。然而，修正扩散方程也适合于精确地预测在扩散介质中传播的具有其它波长的光的传播，例如在生物组织中传播的近红外光。
一般扩散方程可以从辐射输运方程导出。在介质内传播的激光器激发光(内在光)产生的内在光场和由位置 处的荧光蛋白而在介质内产生的荧光场都被单独计算，然后用于计算归一化Born场(扩散近似)。如下面更具体所述，修正扩散方程可以用于正向问题中以提供介质内的荧光蛋白的图像。
由于在位置 处的表观光源，所以如在光探测器位置 所探测的介质中的光传播的Born场 具有修正扩散系数和修正传播波数，两者都说明高吸收，所述Born场由下式给出
Uc(r→s,r→d)=SoUfl(r→s,r→d)-ΘfUinc(r→s,r→d)Uinc(r→s,r→d)=---(1)]]>1Uo(r→s-r→,kλ1)∫d3r·Uo(r→s-r→,kλ1)n(r→)υDλ2G(r→d-r→,kλ2)]]>这里 和 分别是在激发(λ1)(激光器)和发射(λ2)(荧光)波长的测量值。Ubl(r→s,r→d)=ΘfUinc(r→s,r→d)]]>是渗滤信号(bleedthrough signal)，Θf是例如与图1的可选择的滤光器28有关的带通滤光衰减因数，So是说明在激发(λ1)和发射(λ2)波长的仪器增益差(例如光探测器增益差)的增益项， 是荧光蛋白吸收系数和荧光量子产额的乘积，kλ1、kλ2分别是在λ1和λ2的修正光子波传播波数，其说明高吸收，υ是光在介质中的速度，Dλ2是在λ2存在高吸收时的修正扩散系数，Uo(rs→-r→,kλ1)]]>是描述在λ1、在介质中的位置 建立的光子场的项，以及G(rd→-r,→kλ2)]]>是扩散近似的格林函数解，扩散近似描述发射光子波从在位置 的荧光蛋白传播到光探测器。函数G(rd→-r→,kλ2)]]>由下式给出G(r→d-r→,kλ2)=exp(ikλ2(r→d-r→))(r→d-r→)---(2)]]>上面的方程(1)基本由Uinc归一化。使用方程(1)中的归一化的优点在于消除了位置相关影响，而且，甚至在存在荧光蛋白的情况下，也可以计算该场。这意味着在施予荧光蛋白之前不需要进行背景测量，这对于体内研究是重要的。
表示与介质吸收无关的扩散光传播的吸收相关性的一种有用方式是通过将扩散系数写成Dα=13(μs'+αμa)---(3)]]>这里α是通常取决于介质的吸收、散射和各向异性的常数。系数μs′是减小的散射系数，而μa是吸收系数。减小的散射系数μs′可以写成μs'=(1-g)μs,]]>其中μs是散射系数。用于说明高吸收的修正扩散系数Dα的表达式可以通过从辐射输运方程的推导得到，获得
Dα=13(μs'+μa)(1-45μaμs'(1+g)+μa)-1---(4)]]>其中g是各向异性因数。这里，按照减小的散射系数μs′来表达Dα，散射系数μs′是各向异性介质的散射实验中的相关量。方程(4)和标准扩散系数D的最常用表达式之间的一个主要差别是在最常用的表达式中，α的值被先验地固定为α＝0或α＝1。然而α的更一般的表达式可以通过合适地选择各向异性因数g来说明各种程度的背景吸收，这取决于考虑的光谱范围。通过分析或者实验可以找到合适值。从方程(4)和方程(3)得到α的方程式为α=1-45μs'+μaμs'(1+g)+μa---(5)]]>α的典型值的范围为0.2到0.6。对于在生物组织中传播的可见光，假设各向异性因数g～0.8(这对于生物组织来说是典型的)，α大约为0.50到0.55。α和g的相关性小，并且g值在实际生物值内的变化(g在0.5至0.9之间)引起α值的变化小。
应当理解的是，如果使用传统的扩散系数(即α＝0或α＝1)，则对于具有高吸收的介质来说，扩散近似产生不精确的结果。这就是长期以来考虑的存在高吸收的情况下扩散近似失败的原因(例如对于可见光在生物组织中传播)。然而，当使用方程(4)的修正扩散系数时，扩散近似保持精确。为此，必须将修正波数定义为kλ=-μαλDαλ+iωvDαλ---(6)]]>其中ω是调制频率(ω＝0代表连续波激发光)。将方程4的修正扩散系数与方程6的波传播波数相组合，可以导出扩散近似的格林函数解，其适合于在存在高吸收的情况下成像，例如适合在生物组织中的可见光传播。
上述模型(方程1和随后的解释性方程)可以利用表观光源的属性，例如它们的位置和强度。
在方框214，将第一图像信息、第二图像信息以及光传播模型例如在所谓的“正向模型”中组合。在标本具有内部荧光蛋白并且由此在内部不同质的地方，方框214的组合产生以下形式的“图像问题”或“正向模型”测量值＝(理论预测值)×(未知分布)，这里通常根据方程(1)-(6)，测量值在方框204-210由光探测器32(图1)提供，而理论预测值在方框212由图像处理器34(图1)提供。未知分布对应于荧光蛋白发射的荧光。图像处理器34可以解析出未知分布以便确定标本18(图1)内的荧光蛋白20(图1)的物理位置和特性。
在方框216，产生标本中荧光蛋白浓度的图。在一些实施例中，该图是断层摄影图像。为了产生该图，上述正向模型被“反演”以解析出上述未知分布。
在产生荧光蛋白图中，受关注的体积可以分割为多个轴向(水平)层(例如21个层)，每层包含多个(例如651个)体素(voxel)。基于视野的大小和分段的数量来选择体素的大小。
受关注的体积可以在三维上分割成多个体素。这些可以看作是水平、垂直或横向层，类似于在三维空间中彼此紧靠着堆叠起来的方块。每个体素具有未知数量的荧光蛋白和未知的衰减。如果每个体素中的荧光和衰减是已知的，则可以预测测量的图像。然而每个体素中的荧光和衰减不是已知的。因此可以解析出(反演)上述正向问题以找到荧光蛋白图。
在一些实施例中，为了使图像的可理解性增强，理想的是将标本的白光图像叠加到荧光蛋白浓度图上。为此，可以在方框218利用白光源将标本照亮，而在方框220接收白光，并且在方框222可以生成白光图像。
可以将在方框222生成的白光图像与在方框216产生的荧光蛋白图进行叠加。为此，在一个特殊实施例中，将白光图像与荧光蛋白图配准或对准。
为了将白光图像与荧光蛋白图对准，例如可以通过仿真模型制造表观光源的图像以允许确定表观光源坐标。该程序提高了可以叠加在断层摄影图像上的白光图像的共同配准，减小了相对的位置误差。
现在参照图5，内在光的31个图像300对应于将光引导到标本的31个表观光源和作为透射光从那里接收的内在光。表观光源一次一个或同时或以任意组合将光引导到标本。
可以使用集中在来自光源(例如图1的12)的激发光的波长上的带通干涉滤光器(例如图l的28)来生成图像300。
现在参照图5A，荧光的31个图像310对应于将光引导到标本的31个表观光源和从那里接收的发射荧光。该表观光源一次一个或同时或以任意组合将光引导到标本。可以在表观光源正将光引导到标本时或在表观光源将光引导到标本之后接收荧光。例如在图4的方框214，将图5的内在光图像和图5A的荧光图像相结合。
可以使用集中在来自荧光蛋白(例如图1的20)的发射光的波长上的带通干涉滤光器(例如图1的28)来生成图像310。
测量值(或图像)300、310用于产生方程(1)描述的场 。曝光时间可以在单个图像之间变化以使得动态范围最大化。
现在参照图5B，表观光源的31个图像320对应于将光引导通过仿真模型的31个表观光源和从那里接收的光。表观光源一次一个或同时或以任意组合将光引导到仿真模型。表观光源的图像用于例如任选地将白光图像和荧光蛋白浓度图配准，如在图4的方框224所示。
可以使用集中在来自白光源(例如图1的40)的激发光的波长上的带通干涉滤光器(例如图1的28)来生成图像320。
现在参照图6和6A，显示了本发明的方法和系统提供的图像的实例。使用两个不同数量(105和lO6)的表达肿瘤细胞的绿色荧光蛋白(GFP)。将荧光蛋白放置在薄玻璃管内，并且在杀死动物之后，将其插入到动物的食管中。将动物放置在成像室(例如图1的16)内，然后成像室充满上述的匹配液。使用透射动物胸部周围区域的31个表观光源阵列来执行成像。
首先参照图6，图像350包括105个荧光蛋白的图352，老鼠的白光图像354叠加在其上。
接着参照图6A，图像370包括106个荧光蛋白的图372，老鼠的白光图像374叠加在其上。
现在参照图7，用于光学断层摄影400的系统400包括连接到光学扫描器412的激光源402，例如结合图3所述，该光学扫描器提供多个表观光源。系统400也包括激光强度控制器406(LIC)。该LIC406为激光源402提供强度控制。
系统400进一步包括图像增强器420和CCD照相机。可选择的滤光器418选择性地将频带集中在表观光源发射的激发光的波长上或者标本416内的荧光蛋白发射的光的波长上。计算机424可以控制LIC 406和光学扫描器412。计算机也可以行使图像处理器的功能，例如行使图1的图像处理器34的功能，从而在图形显示器426上提供图像。
在操作中，光学扫描器412在相对于标本416的多个位置处提供多个表观光源。CCD照相机收集作为透射光穿过标本416的内在光以及标本416内的荧光蛋白所发射的荧光。CCD照相机将接收的光转换成数字数据，如结合图4所述，计算机处理该数字数据以在图形显示器426上提供断层摄影图像。
在该特殊实施例中，断层摄影成像所需的多个图像与光学扫描器412提供的多个表观光源的位置有关，并且成像室保持基本不动，但是可以沿着轴417移动以影响图像质量。
现在参照图7A，图7的成像室414包括圆筒450，例如结合图2所述，其可以充满匹配液。成像板454和盖玻片456围绕标本416。
现在参照图8，其中将图7的类似元件表示成具有类似的附图标记，用于光学断层摄影的系统500包括固定标本510的成像室504。成像室504适于按照箭头506所表示那样旋转并适于沿轴508作平移运动。系统500可以包括旋转平台502以固定成像室504。
如结合图7所述，断层摄影成像所需的多个图像与光学扫描器412提供的多个表观光源的位置有关。另外，成像室504例如可以在计算机424的控制下作旋转和平移运动以提供更多的表观光源位置和/或角度，从而提供标本510的更多图像。
现在参照图8A，其中将图7和8的类似元件表示成具有类似的附图标记，图8的成像室504可以用成像室550(例如，如图7A所示)代替，但是适于按照箭头552所表示那样作旋转运动和按照箭头554所表示那样作平移运动。
成像室550也能够沿箭头556所表示的轴作平移运动，其考虑了对图8的CCD照相机442所得到图像的影响。
现在参照图9，另一种用于光学断层摄影的系统600包括其中放置标本604且大致为圆筒形的成像室602，在系统600中，将图7的类似元件表示成具有类似的附图标记。成像室602可以按照箭头606所表示那样旋转。该旋转可以由计算机控制，例如使用计算机608控制的旋转平台控制器612。虽然未显示图7的LIC 406，但是其可以包括在系统600中。
如结合图7所述，断层摄影成像所需的多个图像与光学扫描器412提供的多个表观光源的位置有关。另外，成像室602例如可以在计算机的控制下旋转，即提供更多的表观光源位置和/或角度，从而提供标本604的更多图像。
圆筒形成像室602的优点在于旋转和成像算法简单并且快速，而且不会引起图像质量产生缺陷。
现在参照图10，另一种用于光学断层摄影的系统700包括激光源710，其向光纤712提供光。光纤712例如可通过结构716选择性地沿着至少两个轴718、720移动。系统700也可以包括大体为圆筒形的成像室722，标本724放置在成像室722中。成像室722可以按照箭头723所表示那样旋转。该旋转可以由计算机控制，例如使用计算机740控制的旋转平台控制器744。此外，结构716(其提供光纤712在至少两个轴718、720上的运动)的运动可以由计算机控制，例如使用计算机740控制的XY平台控制器746。虽然未显示图7的LIC 406，但是其可以包括在系统700中。
与上述系统相同，穿过标本724的内在光和从标本724内发射的荧光穿过可选择的滤光器734并且由图像增强器736和CCD照相机738接收。CCD照相机向计算机740提供数字数据738a，该计算机740至少提供图4的方框208-216中所示的处理，并且在图形显示器742上提供标本724内的荧光蛋白图。
另一个光纤714可以在标本724的与光纤712相反的一侧提供第二光源726。第二光源726可以是用于提供图4的方框218到224的白光图像的单一白光源。在其它实施例中，以非常类似于例如图1A中所示的方式，第二光源726可以选择性地沿着至少两个轴730、732移动以提供用于标本724的反射成像的另外的多个表观光源。
使用图10的系统700可以获得图9的系统600所提供的同样高品质的3D图像。然而系统700的优点在于它可以在反射模式以及透射模式下工作并且可以实现任何几何形状，例如自由空间(即不接触并且没有匹配液)的圆筒形几何形状。
现在参照图10A，其中将图10的类似元件表示成具有类似的附图标记，可以提供第三光源760以获得甚至更多的表观光源。在一些实施例中，第三光源760可选择性地沿着至少两个轴762、764移动，例如既使用第二光源726提供侧向照明又使用第三光源760提供前向照明。
侧向照明和前向照明可以用于提高低水平光信号，尤其是在使用第一光源719的透射模式中被大吸收体隐藏的信号之外的信号收集效率。分别从第一、第二和第三光源719、726、760产生的测量值可以与断层摄影处理相结合并且用于解决类似于以上结合图4所述的正向问题。
现在参照图11，另一个成像系统800包括用于产生激发光的激光源802和单一光纤804。光纤804连接到分光器806，其将激发光既分到多个光纤808a-808N又分到光纤810，每个光纤携带激发光。光纤808a-808N连接到扫描头812，其可以沿着箭头814、816所表示的至少两个轴作平移运动。在一个特殊实施例中，光纤808a-808N提供表观光源，该表观光源同时向设置在成像室820(或成像室)内的标本822投射激发光。
与上述系统相同，离开标本822的内在光和由标本822内的荧光蛋白发射的荧光穿过可选择的滤光器828，穿过图像增强器830并且进入CCD照相机832。CCD照相机832将该光转换成数字数据832a，该数字数据832a由计算机834接收。计算机834例如通过图4所述的方法200对数字数据进行处理，并且可以在图形显示器836上显示断层摄影图像的图形显示。
白光源826可以产生白光，其从标本822反射，从而提供通过可选择的滤光器828、通过图像增强器830并且进入CCD照相机的白光。如结合图4所述，标本822的白光图像可以与标本822内的荧光蛋白图叠加，使得断层摄影图像更加易于理解。
计算机834还可以经由XY平台控制器838控制扫描头812的位置，按照箭头814、816所表示那样围绕轴移动扫描头以提供更多的表观光源，使得产生荧光蛋白的更好的断层摄影图。
在一个特殊实施例中，可以沿着箭头814、816所表示的至少两个轴对扫描头812进行扫描，并且可以同时对连接到扫描头812的所有光纤808a-808N进行照明。这种实施例的优点包括但不限于更快的断层摄影成像，特别是在存在低幅度光信号的情况下，其导致长的曝光时间。
可以通过合适地选择各个光纤808a-808N之间的距离使光纤808a-808N之间的串扰最小化，使得传播光子的路径不重叠。在其它实施例中，特别是对于曝光时间短的那些实施例，可以每次照明光纤808a-808N中的一个以消除来自光纤808a-808N之间的串扰的噪声。在该实施例中，分光器806可以由光学开关(例如图2的106)代替。在备选实施例中，可以沿着箭头814、816所表示的轴对单一光纤进行扫描。
现在参照图11A，其中将图11的类似元件表示成具有类似的附图标记，图11的扫描头812具有多个开孔850a-850N，其中每一个开孔对应于各自的表观光源，从而形成N个表观光源。当扫描头812沿轴(例如由箭头814、816所表示的轴)移动时，形成更多的表观光源，例如另外N个表观光源。
本发明的方法和系统可以使用任何荧光蛋白，包括但不限于DsRed和HcRed荧光蛋白。这些特殊的荧光蛋白提供在可见光谱的红光或近红外区的荧光。因为与可见光的其它波长相比，光的可见光谱的红光区在生物组织中具有更高效率的深穿透深度，并且可以提供比更长波长的NIR系统更高的分辨率，所以这些特殊的荧光蛋白可以导致产生具有更高质量的荧光蛋白图。
当本发明的方法和系统用于表达荧光蛋白(类似于GFP)的肿瘤细胞时，本发明的方法和系统可以用于研究肿瘤增长和监视肿瘤转移形成。
本发明的方法和系统可以用于GFP表达肿瘤细胞和YFP表达病毒细胞以研究特定患者靶向治疗的基因传递和基因治疗。
本发明的方法和系统也可以利用使用算法的成像模式以在不需要匹配液的情况下对任意几何形状成像。用于光传播的建模和解决正向问题的算法可以适用于所有上述系统的实施方式。
应当理解的是，当使用可见光时，与使用近红外(NIR)光的传统断层摄影方法相比，本发明的系统和方法提供更高的空间分辨率。
由本发明的上述实施例所提供的激发光和产生的发射荧光可以是连续波(CW)光、强度调制(IM)或时间分辨(TR)光或两者的组合。本发明的系统和方法可以给出关于作为时间函数的系统动态特性的信息，并且最终的图像可以与另一种诸如核磁共振成像(MRI)、计算机断层摄影成像(CT)、超声或生物发光成像等成像方法所获得的图像共同配准。
该上述系统和方法使用结合适当归一化的修正扩散近似，其允许在具有较高吸收系数(例如＞0.3cm-1)的介质中(即其是扩散的)且在至少400nm到700nm的可见光波长范围内对体内荧光蛋白进行三维断层摄影成像。修正扩散近似并不需要使用更复杂的输运方程。因此，该修正解取得计算效率。
在上述的一些实施例中，使用非接触组织照明和/或非接触光接收，其中上述表观光源和/或光探测器与正被扫描的标本隔开。在其它实施例中，将表观光源和/或光探测器放置成与标本大体接触。
通过使用各种不同的荧光蛋白，可以将上述方法和系统应用于多种生物和分子过程。例如，在各种实施例中，荧光蛋白可以用于监视肿瘤增长、肿瘤转移形成、基因表达以及治疗效果。另外，该方法和系统可以用于提供无创、全身分子成像以无创地产生与亚细胞水平的活动有关的信息。
本发明的方法和系统可以提供对特定分子和生物异常的了解，该异常形成了许多疾病的基础，例如癌症、肿瘤增长和肿瘤转移形成。由于血色素的高吸收使血管与肿瘤细胞的荧光背景形成对比，因此该方法和系统也可以用于对血管成像。此外，该方法和系统可以用于在分子水平评估新的靶向治疗的功效。反过来，这又可以对药物开发、药物测试、合适疗法的选择以及给定患者的疗法变化产生影响。此外，该方法和系统允许在活体系统的完整微环境中研究疾病的起源。并且进一步地，该方法和系统有助于测试新基因传递策略。与使用当前可能耗时和费力的传统基本科学技术相比，该成像方法和系统允许更快地采集三维信息。
本发明的方法和系统在用于促进各种疾病(包括癌症、神经变性症、炎症、传染病和其它疾病)的控制和根除的各种各样的生物、免疫和基因治疗中具有广泛应用。此外，该方法和系统在组合设置中广泛应用于无伤痕疾病检测和治疗。
此处引用的所有参考文献全文并入此处作为参考。
已经介绍了本发明的优选实施例，现在对于本领域的普通技术人员显而易见的是可以使用包含它们的概念的其它实施例。因此应当理解这些实施例不应当限于所公开的实施例，而是应当仅仅由所附的权利要求的精神和范围限制。
权利要求
1.一种用于光学断层摄影的系统，包括适于向其中具有荧光蛋白的标本投射激发光的表观光源，其中所述激发光进入标本，成为所述标本内的内在光，其中所述内在光适于从所述荧光蛋白激发荧光，并且其中所述内在光和所述荧光是扩散的。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述激发光和所述荧光中的至少一个具有在可见光波长范围内的波长。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述荧光具有在可见光波长范围内的波长。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述荧光具有在可见光波长范围的红光部分内的波长。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述荧光具有在近红外(NIR)区内的波长。
6.根据权利要求1所述的系统，还包括光探测器，适于接收离开所述标本的所述内在光并且适于接收离开所述标本的所述荧光，还适于将接收的所述内在光转换成第一图像信息，并且还适于将接收的所述荧光转换成第二图像信息；和图像处理器，连接到所述光探测器并且适于产生光传播模型，其中所述模型适于预测在扩散介质中的光传播，其中所述图像处理器还适于组合所述第一图像信息、所述第二图像信息以及所述光传播模型，并且还适于提供所述荧光蛋白的图像。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所述图像处理器包括使用具有修正扩散系数的扩散方程的扩散方程处理器，该修正扩散系数与所述内在光和所述荧光中的至少一个有关。
8.根据权利要求6所述的系统，其中所述光探测器有选择性地移动以在相对于标本的多个光路上接收所述内在光和荧光。
9.根据权利要求6所述的系统，还包括光学扫描器，以在相对于标本的多个光路上将所述内在光和荧光提供给所述光探测器。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述表观光源包括光引导设备，以有选择性地移动所述表观光源进而在多个光路上向所述标本引导所述激发光。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述光引导设备包括光学开关，以有选择性地移动所述表观光源进而向所述标本提供所述多个光路。
12.根据权利要求10所述的系统，其中所述光引导设备包括可移动的反射镜，以有选择性地移动所述表观光源进而向所述标本提供所述多个光路。
13.根据权利要求10所述的系统，其中所述光引导设备适于沿至少一个表观光源平移轴有选择性地以平移方式来移动所述表观光源。
14.根据权利要求1所述的系统，其中所述标本可有选择性地移动以在相对于所述标本的多个光路上提供所述激发光。
15.根据权利要求14所述的系统，其中标本可围绕标本旋转轴有选择性地作旋转运动。
16.根据权利要求14所述的系统，其中标本可沿至少一个标本平移轴有选择性地作平移运动。
17.根据权利要求14所述的系统，其中标本可围绕标本旋转轴有选择性地作旋转运动，并且所述标本还可沿至少一个标本平移轴选择性地作平移运动。
18.根据权利要求1所述的系统，其中所述表观光源包括光引导设备，以有选择性地移动所述表观光源进而在多个光路上向所述标本引导所述激发光，并且所述标本可有选择性地移动以在相对于所述标本的多个光路上提供所述激发光。
19.根据权利要求1所述的系统，其中所述内在光作为透射光穿过所述标本。
20.根据权利要求1所述的系统，其中所述内在光作为反射光从所述标本反射。
21.一种光学断层摄影的方法，包括使用适于向其中具有荧光蛋白的标本投射激发光的表观光源来产生激发光，其中所述激发光进入所述标本，成为所述标本内的内在光，其中所述内在光适于从所述荧光蛋白激发荧光，并且其中所述内在光和所述荧光是扩散的。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述激发光和所述荧光中的至少一个具有在可见光波长范围内的波长。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述荧光具有在可见光波长范围内的波长。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述荧光具有在可见光波长范围的红光部分内的波长。
25.根据权利要求21所述的系统，其中所述荧光具有在近红外(NIR)区内的波长。
26.根据权利要求21所述的方法，还包括接收离开所述标本的所述内在光；接收离开所述标本的所述荧光；将接收的所述内在光转换成第一图像信息；将接收的所述荧光转换成第二图像信息；产生适于预测扩散介质中的光传播的模型；和组合所述第一图像信息、所述第二图像信息和所述模型以提供所述荧光蛋白的图像。
27.根据权利要求26所述的方法，其中接收所述内在光和接收所述荧光包括使用可有选择性移动的光探测器接收所述内在光和接收所述荧光，该光探测器适于在相对于标本的多个光路上接收所述内在光和荧光。
28.根据权利要求26所述的方法，其中根据具有修正扩散系数的扩散方程的解来产生所述模型，该修正扩散系数与所述内在光和所述荧光中的至少一个有关。
29.根据权利要求21所述的方法，还包括有选择性地移动所述表观光源以在多个光路上向所述标本引导所述激发光。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述表观光源包括光学开关，以有选择性地移动所述表观光源。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述表观光源包括可选择性移动的反射镜以有选择性地移动所述表观光源。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述选择性地移动所述表观光源包括沿至少一个表观光源平移轴有选择性地以平移方式移动所述表观光源。
33.根据权利要求21所述的方法，还包括有选择性地移动所述标本以在相对于标本的多个光路上提供所述激发光。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述有选择性地移动所述标本包括围绕标本旋转轴有选择性地旋转移动所述标本。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述有选择性地移动所述标本包括沿至少一个标本平移轴有选择性地以平移方式移动所述标本。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述选择性地移动所述标本包括围绕标本旋转轴有选择性地旋转移动所述标本；和沿至少一个标本平移轴有选择性地以平移方式移动所述标本。
37.根据权利要求21所述的方法，还包括有选择性地移动所述表观光源以在多个光路上向所述标本引导所述激发光；和有选择性地移动所述标本以在相对于所述标本的另外多个光路上提供所述激发光。
38.根据权利要求21所述的方法，其中所述内在光作为透射光穿过所述标本。
39.根据权利要求21所述的方法，其中所述内在光作为反射光从所述标本反射。
40.一种用于光学断层摄影的系统，包括至少一个可有选择性移动的部件，以有选择性地移动表观光源进而将多个光路向标本引导。
41.根据权利要求40所述的系统，其中所述可有选择性移动的部件包括至少一个可选择性移动的反射镜。
42.根据权利要求40所述的系统，其中所述可有选择性移动的部件包括可有选择性移动的结构。
43.根据权利要求42所述的系统，还包括连接到所述可有选择性移动的结构的光纤。
全文摘要
一种用于光学断层摄影的系统包括适于向其中具有荧光蛋白的标本投射激发光的表观光源，其中激发光进入标本，成为标本内的内在光，其中内在光适于从荧光蛋白激发荧光，并且其中该内在光和荧光是扩散的。一种光学断层摄影的方法包括使用表观光源产生激发光，其中内在光和荧光是扩散的。
文档编号A61B5/00GK1953701SQ200580015062
公开日2007年4月25日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月11日
发明者瓦西利斯·恩齐亚克里斯托斯, 豪尔赫·里波利, 扬尼斯·扎哈拉基斯 申请人:通用医院有限公司