专利名称：用于抑制血管发生的四环咔啉衍生物的制作方法
相关申请的交叉参考本发明要求于2004年3月15日提交的第60/552,724号美国临时专利申请的优先权，该申请引入本文作为参考。
本发明领域本发明涉及用于抑制血管发生的方法和化合物。更具体而言，本发明涉及用于抑制血管发生的方法和化合物。
背景技术：
异常血管发生在许多疾病的发病机理中起到关键作用，所述疾病包括恶性的、缺血性的、炎性和免疫性病症(Carmeliet，Nat.Med.，P(6)653-60(2003)，Ferrara，Semin.Oncol，29(6 Suppl 16)10-4(2002))。这些疾病中最著名的是癌症、渗出性黄斑变性和糖尿病性视网膜病(DR)，其中最后两种在美国是失明的主要原因(Witmer等人，Prog.Retin Eye Res.，22(1)1-29(2003)，Clark等人，Nat.Rev.Drug Discovery，2448-459(2003))。在过去的十年期间，我们对血管发生的分子基础的理解已经相当成熟。刺激血管发生的许多细胞因子和生长因子，诸如VEGF、FGF-2、PDGF、IGF-1、TGF、TNF-α、G-CSF已经被确认(Ferrara等人，Nat.Med.，5(12)1359-64(1999)，Kerbel等人，Nat.Rev.Cancer，2(10)727-39(2002)，Rofstad等人，Cancer Res.，60(17)4932-8(2000))。在这些生长因子中，血管内皮生长因子(VEGF)在血管发生中起到重要作用(Ferrara，Semin.Oncol，29(6 Suppl 16)10-4(2002))。
VEGF，也称为VEGF-A，最初被识别是因为它诱发血管渗透性和促进血管内皮细胞增殖的能力(Leung等人，Science，2461306-1309(1989)，Plouet等人，EMBO J，53801-3806(1989)，Connolly等人，J.Biol.Chem.，2(5420017-20024(1989))。VEGF是由单独的基因编码，所述基因通过选择剪切引起四种同工型(Tischer等人，J.Biol.Chem.，2＜5511947-11954(1991))。所有四种同工型共有相同显著长的和GC富集的5’-UTR，以及包括多个RNA稳定性决定子的3’-UTR。受体VEGFR-2(还称为KDR或Flk-1)和VEGFR-1(以前称为Flt1)识别二聚形式的VEGF(Ortega等人，Front.Biosci.，4D141-52(1999)，Sato等人，Annals ofNew York Academy of Science，902201-207，(2000))。高度特异性的VEGFR-2受体在内皮细胞上被表达。结合VEGFR-2受体的VEGF激活受体的酪氨酸激酶活性，导致内皮细胞增殖、分化和原始血管形成(primitive vessel formation)(Shalaby等人，Nature，37662-66，(1995))。VEGFR-1通过充当诱饵或通过VEGFR-2抑制信号传导通路来抑制内细胞生长(Fong等人，Nature，37666-70(1995))。
三十多年前，有人建议抑制肿瘤血管生长可以是一种治疗癌症的有效方法(Folkman，N.Engl.J.Med.，255(21)1182-6(1971))。VEGF和它的受体已经被证明在肿瘤血管生长中具有重要作用，尤其是肿瘤生长的早期阶段(Hanahan等人.，Cell，#6353-364，1996))。确实，增加的VEGF表达水平已经与主要肿瘤组织中的微血管密度相关联(Gasparini等人，J.Natl.CancerInst.，89139-147(1997))。此外，增加的VEGF转录水平在实际上所有的常见实体肿瘤中被发现(Ferrara等人，Endocr.Rev.，184-25，1997))。通常，携带肿瘤的患者与那些没有肿瘤的个体相比具有更高水平的VEGF，而且血清/血浆中的高VEGF水平与差的预后相关联(Dirix等人，Br.J.Cancer，76238-243(1997))。与VEGF在肿瘤血管发生中的作用相一致，VEGF无效(NULL)的胚胎干细胞表明在裸鼠中形成肿瘤的能力显著降低(Carmeliet等人.，Nature，550435-439(1996))。使用在植入裸鼠中的人异种移植物中的抗VEGF的特异性抗体，由此证明在肿瘤发生中涉及VEGF的直接证据(Kim等人，Nature，562841-844(1993)，Hichlin等人，Drug Discovery Today，6517-528(2001))。在这些研究中，肿瘤生长的抑制与抗体处理的肿瘤中的血管形成减少正向相关。随后的使用可溶性受体的实验证实了VEGF活性在肿瘤生长中的重要性(Lin等人，Cell Growth Differ.，9(1)49-58(1998))，并证明了由特异性抗体处理的VEGF的失活直接导致肿瘤相关的新血管形成的近似完全的抑制(Borgstrom等人，Prostate，551-10(1998)，Yuan等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9514765-14770(1996))。
在渗出性黄斑变性和糖尿病性视网膜病中，临床前的实验和临床试验已经证明VEGF的过量产生对于异常的视网膜的或脉络膜的新血管形成是关键的(综述见Witmer等人，Prog.Retin Eye Res.，22(1)1-29(2003))。证据已经证明在罹患诸如糖尿病性视网膜病和湿型黄斑变性的疾病的患者中眼内VEGF水平与活性视网膜/脉络膜的新血管形成(CNV)强烈相关(Funatsu等人.，Am.J.Ophthalmol，755(4)537-43(2002)，Lip等人，Ophthalmology，108(4)705-10(2001))。此外，使用转基因鼠的研究表明在视网膜色素上皮细胞或感光受体细胞中的VEGF的过度表达导致脉络膜的或视网膜的新血管形成(Schwesinger等人，Am.J.Pathol，158(3)1161-72(2001)，Ohno-Matsui等人，Am.J.Pathol，160(2)711-9(2002))。在最近研究中已证实，抑制抗体、可溶性受体、受体拮抗剂、或siRNA在动物模型和临床中对于减少VEGF介导的血管形成是有效的(Eyetech Study Group，22(2)143-52(2002)，Krzystolik等人，Arch.Ophthalmol，720(3)338-46(2002)，Shen等人，Lab Invest.，S2(2)167-82(2002)，Honda等人，Gene Ther.，7(11)978-85(2000)，Saishin等人，J.Cell Physiol，795(2)241-8(2003))。
VEGF的表达是通过许多因子和试剂调节的，包括细胞因子、生长因子、类固醇激素和化学品，以及调节诸如ras或肿瘤抑制物基因VHL等的致癌基因活性的突变(Maxwell等人，Nature，399271-275(1999)，Rak等人，CancerRes.，60490-498(2000))。然而，低氧是对调节VEGF表达的最显著的生理信号。低氧通过增加VEGF转录的转录速率和稳定性而导致VEGF表达的增强(Ikeda等人，J.Biol Chem.27019761-19766(1995)，Stein等人，MoI Cell.Biol.753112-3119(1998)，Levy等人，J.Biol.Chem.2772746-2753(1996))。低氧诱导因子1α(HIF-1α)是转录因子，其通过结合位于VEGF启动子中的低氧效应元件(HRE)而增加经受低氧的细胞中的VEGF基因表达(Liu等人，Circ.Res.，77638-643(1995)，Semenza，Annu.Rev.Cell Dev.Biol，5551-578(1999))。作为因子结合到3’-UTR中元件的后果，VEGFmRNA的稳定性也被显著增加(Goldberg等人，J.Biol Cell J.Biol.Chem.，277(16)13635-40(2002))。此外，VEGF转录的翻译起始被特有地调节。在低氧条件下，由帽依赖性的翻译起始步骤介导的大多数细胞转录的翻译被大大削弱(Kraggerud等人，Anticancer Res.，75683-686(1995))。但是，VEGF mRNA翻译的起始在低氧的条件下是特有的，在所述条件下它通过VEGF 5’UTR内的内核糖体进入位点(IRES)而被介导(Stein等人，MoI CellBiol.753112-3119(1998)，Levy等人，J.Biol Chem.2772746-2753(1996)，Huez等人，MoI.Cell.Biol，756178-6190(1998)，Akiri等人，Oncogene，77227-236(1998))。
有大量的试验证据表明肿瘤生长可以通过阻止新血管形成而被抑制(Lin等人，Cell Growth Differ.，P(1)49-58(1998)，Zhu等人，Invest.New Drugs，77195-212(1999))。肿瘤血管通常是不成熟的并不断经历重新塑造(Carmeliet，Nat.Med，P(6)653-60(2003)，Carmeliet等人，Nature，407249-257(2000))。活跃的和异常的血管发生是前血管生成性(proangiogenic)和抗血管生成性(anti-angiogenic)因子的正常平衡中断的结果，所述因子包括各种细胞因子、生长因子和类固醇类激素。尽管调节肿瘤血管发生的复杂性，积累的证据证明靶向单个前血管生成性因子可以足以抑制肿瘤血管发生并抑制肿瘤生长(Kim等人，Nature，562841-844(1993)，Millauer等人，Nature，357576-579(1994)，Fong等人，Cancer Res.，5999-106(1999))。在许多血管发生靶中，VEGF及其受体是最引人注目的(Carmeliet，Nat.Med.，9(6)653-60(2003)，Ortega等人.，Front.Biosci.，4D141-52(1999))。如上所述，以特异性的靶向VEGF的单克隆抗体处理抑制植入裸鼠中的人异种移植物中的肿瘤生长。因此，设计为抑制VEGF信号传导的各种方法已经在肿瘤模型中被测试并已经被证明在宽范围的肿瘤细胞系中是高度有效的，所述细胞系包括癌、肉瘤和神经胶质瘤(Ferrara等人，Endocr.Rev.，184-25，1997)，Kim等人，Nature，362841-844(1993)，Millauer等人，Nature，367516-579(1994)，Fong等人，Cancer Res.，5999-106(1999)，Geng等人，Cancer Res.，672413-2419(2001))。此外，用VEGF抗体抑制VEGF在充分发育的啮齿类和灵长类中不导致显著的副作用(Ryan等人，Toxicol Pathol，2778-86(1999)，Ferrara等人，Nat.Med.，4336-340(1998))。总之，这些结果显示VEGF是用于研发肿瘤疗法的有效靶。确实，许多临床试验正在使用VEGF抑制剂进行(Matter，Drug Discovery Today，61005-1024(2001)，Hichlin等人，Drug Discovery Today，6517-528(2001))。
虽然在渗出性的与年龄相关的黄斑变性的病理学中涉及几种前血管生成性因子，但VEGF呈现为在发病机理和这种疾病的发展中是最关键的(Witmer等人，Prog.Retin Eye Res.，22(1)1-29(2003)，Holash等人，Science，2841994-1998(1999))。来自初期临床实验和临床试验的数据已经证明，单独阻断VEGF可以充分地减轻或稳定化疾病的进程(Eyetech Study Group，22(2)143-52(2002)，Krzystolik等人，Arch.Ophthalmol，720(3)338-46(2002)，Shen等人，Lab Invest，82(2)167-82(2002)，Honda等人，Gene Ther.，7(11)978-85(2000)，Saishin等人，J.Cell Physiol，795(2)241-8(2003))。例如，用特异性酪氨酸激酶抑制剂抑制VEGFR信号传导足以完全阻止鼠视网膜病早熟模型中的视网膜新血管形成(Ozaki H，Seo MS，Ozaki等人，Am.J.Pathol，756(2)697-707(2000))。此外，最近已经证明抗鼠VEGF的小干扰RNAs(siRNA)在鼠模型中的激光凝固法之后显著抑制眼新血管形成(Reich等人，MoI.Vis.30；9210-6(2003))。这些结果表明VEGF表达的选择性抑制是可完成的并提供了这种方法用于治疗诸如渗出性黄斑变性和糖尿病性视网膜病等眼新血管化疾病的证实。
三种方法已经被用于抑制VEGF活性，包括(1)使用特异性抗体、可溶性VEGF受体或抗VEGF/VEGFR交互作用的适体寡核苷酸(aptameroligos)抑制VEGF活性(Kim等人，Nature，552841-844(1993)，Lin等人，CellGrowth Differ.，P(1)49-58(1998)，Borgstrom等人，Prostate，551-10(1998)，Zhu等人，Invest.New Drugs，77195-212(1999)，Millauer等人，Nature，367576-579(1994)，Asano等人，Jpn.J.Cancer Res.，P0(1)93-100(1999)，Brekken等人，CancerRes.，60(18)5117-24(2000))；(2)用特异性小分子酪氨酸激酶抑制剂抑制VEGFR介导的信号传导(Fong等人，Cancer Res.，5P99-106(1999)，Wedge等人，Cancer Res.，60(4)970-5(2000)，Laird等人，Cancer Res.，60(15)4152-60(2000))；以及(3)使用反义链(antisense)、siRNA或核酶抑制VEGF/VEGFR的表达(Reich等人，MoI Vis.50；9210-6(2003)，Parry等人，Nucleic Acids Res.，272569-2577(1999)，Ellis等人，Surgery，720871-878(1996)，Filleur等人，Cancer Res.，65(14)3919-22(2003))。虽然所有这些方法显示体内血管发生的显著抑制，但它们都具有显著的局限性。例如，治疗蛋白质(抗体和可溶性受体)或寡核苷酸(反义链、siRNA或核酶)是渗透性差的大分子，它们通常需要非胃肠道注射给药并且生产昂贵。在治疗慢性眼新血管形成时，由于潜在的并发症如视网膜分离和程序相关的感染，多个注射剂可能是不切实际的。此外，酪氨酸激酶抑制剂具有有限的特异性的潜力。VEGF在正常的眼睛和其它组织中组成性地低水平表达，因此通过全身的抗体或酪氨酸激酶给药而完全抑制VEGF功能可能是有害的，尤其是对于AMD和RD的患者，他们中的许多人也是高血压患者(Giles等人，Cancer，97(8)1920-8(2003)，Sugimoto等人，J.Biol.Chem.，278(15)12605-8(2003)，Bergsland等人，AmericanSociety of Clinical Oncology 36th Annual Meeting，20-23May，2000，NewOrleans，LA，USA，Abstract 939)，DeVore等人，American Society of ClinicalOncology 36th Annual Meeting，20-23May，2000，New Orleans，LA，USA，Abstract 1896)。
因此，仍存在一种对于发展、表征以及优化用于新的抗血管发生药物的开发的主要大分子的需要。因此，本发明的一个目的是提供这样的化合物。
在此涉及的所有文件引入本申请作为参考，好像它们已在本文中充分描述。
本
发明内容
根据本发明已鉴别了转录后地抑制VEGF表达的化合物，并提供了它们的使用方法。
在本发明的一个方面，所提供的通式(I)化合物用于抑制VEGF的产生、抑制血管发生、和/或治疗癌症、糖尿病性视网膜病或渗出性黄斑变性。
在本发明的另一方面，提供使用本文所述化合物来抑制VEGF的产生、抑制血管生成、和/或治疗癌症、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、其它慢性炎症相关的疾病和病症、肥胖症、或渗出性黄斑变性的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及用于抑制VEGF产生的方法，其包括对有此需要的患者给药VEGF表达抑制量的至少一种本发明化合物。
在另一实施方案中，本发明提供用于抑制血管发生的方法，其包括对有此需要的患者给药抗血管生成量的至少一种本发明化合物。
在另一实施方案中，本发明提供用于治疗癌症、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、其它慢性炎症相关的疾病和病症、肥胖症、或渗出性黄斑变性的方法，其包括对有此需要的患者给药治疗有效量的至少一种本发明化合物。
本发明的这些和其它方面在参考以下优选实施方式和详细描述后将更加清楚地被理解。
图1图1说明了用本发明的某个化合物对VEGF表达的抑制。
图2图2说明了磷酸二酯酶5(PDE-5)活性不受本发明某些化合物的影响。
具体实施例方式
作为血管生成的关键因子的血管内皮生长因子(VEGF)的异常上调是疾病状态的发病机理的重要贡献者，所述疾病状态例如是癌症、糖尿病性视网膜病变、风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、其它慢性炎症相关的疾病和失调、肥胖症、或渗出性黄斑变性。根据本发明，后转录地抑制VEGF表达的化合物已经被证实，并提供它们的使用方法。本发明的化合物具有用于抑制VEGF表达的纳摩尔(nanomolar)到亚纳摩尔(sub-nanomolar)活性。
A、本发明的化合物在本发明的一个方面，所提供的化合物可以用于抑制VEGF的产生、抑制血管发生、和/或治疗癌症、糖尿病性视网膜病变或渗出性黄斑变性。在某些实施方案中，本发明的化合物特异性地抑制VEGF产生，然而在其它的实施方案中，本发明的化合物抑制VEGF表达以及诸如FGF-2等的其它血管发生因子的表达。在这点上，泛血管生成性(pan-angiogenic)的抑制剂在抑制肿瘤生长的方法中可以是优选，然而VEGF特异性抑制剂对于眼新血管形成疾病可以是优选的(Eyetech Study Group，22(2)143-52(2002))。
本发明的化合物通常是手性的并因此可以作为外消旋混合物或对映体纯的组合物。例如，本发明化合物可以在对映体纯组合物中以(R，R)，(R，S)，(S，R)or(S，S)异构体的形式存在。在优选实施方式中，本发明的化合物是10R，3aR；10R，3aS；10S，3aR；或10S，3aS异构体，以及更优选为10S，3aR异构体。
如本文所使用的，“对映体纯”指基本由单一异构体组成的组合物，优选由90％、92％、95％、98％、99％或100％单一的异构体组成。
用于抑制VEGF产生的本发明优选的化合物包括如以通式(I)的那些化合物， 其中，X是氢、羟基、卤素、C1到C6烷基、或C1到C5烷氧基，任选地被C6到C10芳基取代；W是氧或硫原子；R1是C1到C8烷基；杂芳基；或C6到C10芳基，任选地被一个或更多个独立选择的R0基团取代；R0是卤素、C1到C6烷基，其中所述烷基任选由一个或更多个独立选择的卤素基团取代；5到12元杂环，其中所述杂环任选地被C1到C6烷基取代；5到12元杂芳基；氰基、硝基；氨基，其中所述氨基任选地被一个或更多个C1到C6烷基取代；酰氨基；酯基；或-ORa基团；Ra是氢；或C1到C6烷基，其中所述烷基任选地被一个或更多个独立选择的卤素、C1到C4烷氧基、5到10元杂芳基、5到10元杂环、或氨基取代；其中所述杂环任选地被-C(O)-Re基团或任选地被羟基取代的C1到C6烷基取代；以及所述氨基任选地被一个或更多个任选地被C1到C4烷氧基取代的独立选择的C1到C6烷基取代；R2是5到12元杂芳基；C2到C8烯基；C1到C8烷基，其中所述烷基任选地被一个或更多个独立选择的卤素、C1到C4烷氧基、5到10元杂环、5到10元杂芳基、任选地被一个或更多个独立选择的Rb取代的C6到C8芳基或-C(O)-Rc基团取代；或C6到C10芳基，任选地被一个或更多个独立选择的Rb基取代；Rb是卤素；氰基；硝基；C1到C4烷氧基；C1到C6烷基，其中所述烷基任选地被一个或更多个卤素基团取代；-O-C(O)-Rc；或-C(O)-O-Rc基团；以及
Rc是羟基或C1到C6烷基。
如对于本领域技术人员将是明显的，通式(I)化合物包括至少两个立构中心(例如，在R1取代基)，并可以存在为外消旋混合物或为对映体纯的组合物。如以上所述，在优选实施方案中，以对映体纯组合物的通式(I)化合物。更具体的，在优选实施方案中，本发明化合物是5R，11aR；5R，11aS；5S，11aR；或5S，11aS异构体，更优选为5S，11aR异构体。在这一点上，本发明的化合物可以基本由5R，11aR；5R，11aS；5S，11aR；或5S，11aS异构体组成的对映体纯的组合物的形式存在，以及更优选为5S，11aR异构体。
如本文所使用的，术语“烷基”通常指直链、支链或环状饱和烃基，其包括甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、n-戊基、n-己基、环己基、n-庚基、辛基、n-辛基等。在一些实施方案中，烷基取代基可以包括C1到C8、C1到C6、C1到C4烷基。烷基可以任选地被一个或更多个卤素或烷氧基取代。例如，烷基可以是卤代烷基、二卤代烷基或三卤代烷基。
如本文所使用的，“烯基”通常指线性、支链或环状的烯烃基，其具有一个或更多碳-碳双键，诸如C2到C8和C2到C6烯基，包括3-丙烯基。
如本文使用的，“烯基”通常指线性、支链或环状的炔烃基，其具有一个或更多碳-碳叁键，诸如C2到C8和C2到C6炔基，包括己-3-炔。
如本文使用的，“芳基”指环状芳香环结构，包括在芳基范围内的是具有从五到二十个碳原子的芳香环。芳环结构包括具有一个或更多个环结构的化合物，诸如单、二、或三环化合物。芳基的例子包括苯基、甲苯基、蒽基(anthracenyl)、芴基(fluorenyl)、茚基、薁基(azulenyl)、菲基(即菲)、和萘基(napthyl)(萘)环结构。在某些实施方式中，芳基可以任选地被取代。
如本文所使用的，“杂芳基”指环中的一个或更多个的原子-杂原子是一个非碳原子的元素的环状芳香环结构。杂原子通常是O、S或N原子。包含在杂芳基范围内，并独立可选择的是O、N和S杂芳环结构。所述环结构可以包括具有一个或多个环结构的化合物，诸如单、二、或三环化合物。在一些实施方案中，杂芳基可以是选自含有一个或更多个杂原子、两个或更多个杂原子、三个或更多个杂原子、或四个或更多个杂原子的杂芳基。杂芳环结构可以选自含有五个或更多个原子、六个或更多个原子、或八个或更多个原子的那些环。杂芳环结构的例子包括吖啶、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并间二氧杂环戊烯、苯并呋喃、二氢-色烯-4-酮基、1，3-二嗪、1，2-二嗪、1，2-二唑、1，4-二氮杂萘、呋喃、呋咱(furazan)、咪唑、吲哚、异噁唑、异喹啉、异噻唑、异吲哚、噁唑、嘌呤、哒嗪、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吡咯、喹啉、喹喔啉、噻唑、噻吩、1，3，5-三嗪、1，2，4-三嗪、1，2，3-三嗪、四唑和喹唑啉。在某些实施方案中，杂芳基可以任选被取代。
如本文所使用的，“杂环”指环中的一个或更多个原子-杂环原子是一个非碳原子的元素环状结构的。杂原子通常是O、S或N原子。包含在杂环范围内，并独立可选择的是O、N和S杂环结构。所述环结构可以包括具有一个或多个环结构的化合物，诸如单、二、或三环化合物。在一些实施方案中，所述杂环基团可以选白含有一个或更多个杂原子、两个或更多个杂原子、三个或更多个杂原子、或四个或更多个杂原子的杂环基团。杂环基团的例子包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、环氧乙烷基(oxiranyl)、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基或四氢硫代吡喃基(tetrahydrothiopyranyl)等。在某些实施方式中，杂环可以选择性的被取代。
如本文所使用的，“烷酰基”通常指带有-C-(O)-R结构的基团。在某些实施方案中，R可以是氢、烷基、4-吗啉基、或噻唑氨基。
如用于本文的，“烷氧基”通常指带有-O-R结构的基团。在某些实施方式中，R可以是烷基，如C1到C5烷基。
用于本发明的目的，卤素取代基可以独立的选自诸如氟、氯、溴、碘和砹的卤素。
在某些实施方案中，X可以是氢、甲基、甲氧基或卤素，优选甲基和卤素，更优选甲基、溴或氯。
R1可以优选是C6到C8芳基，任选地被至少一个R0基团取代。R0则可以优选是羟基、C1到C6烷基、烷氧基、或卤素，更优选是甲氧基、丙基或卤素，更优选是甲氧基、氯、或氟。可替换的，R0可以优选是-ORa，其中Ra是C1到C6烷基，其任选地被杂环基团取代，更优选的Ra是甲基或甲基-哌啶。可替换的，R1可以是苯并间二氧杂环戊烯基。
R2可以优选是C3到C6环烷基。在另一实施方案中，R2优选是杂芳基，更优选的是吡啶基。可替换的，R2可以优选是C6到C8芳基，其任选地被至少一个Rb基团取代。优选的Rb基团是氟、甲基、异丁基和甲氧基。
优选的R1取代基包括以下基团，其中*处指示连接到骨架分子上的键。
其它优选的R1取代基包括以下基团，其中*处表示连接到骨架分子上的键。
优选的R2取代基包括以下基团，其中*处表示连接到骨架分子的键。
其它优选的R2取代基包括以下基团，其中*处表示连接到骨架分子的键。
通式(I)中的优选的化合物种类包括那些如以下通式(I-a)所示的化合物，
其中X、W、R2、R0如以上通式(I)所述，包括优选实施方案，以及m是0、1、2或3。
在本发明范围内另一优选化合物种类包括如以通式(I-b)所示的化合物， 其中，X是氢、羟基、卤素、C1到C6烷基、或C1到C5烷氧基，任选地被C6到C8芳基取代；W是氧或硫原子；R1是C1到C8烷基；杂芳基；或C6到C8的芳基，任选被至少一个R0基团取代；R0是卤素；C1到C6烷基，任选被一个或更多个卤素基团取代；或-ORa；氰基；硝基；氨基；氨烷基(aminoalkyl)；酰胺基；酯基；Ra是氢；或C1到C6烷基，任选地被杂环基取代；R2是C2到C4烯基；C1到C8烷基，任选地被C6到C8芳基或烷氧基取代；C6到C8杂芳基；或C6到C8芳基，任选地被一个或更多个Rb基团取代；Rb是卤素；C1到C6烷基，任选地被一个或更多个卤素基团取代；烷氧基；或-C(O)-O-Rc基团；以及Rc是C1到C6烷基。
还被包括在本发明范围内的是本文所描述化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、calthrates、多晶型物、外消旋化合物、和立体异构体。
用于本发明的目的，如果包括X、R1、R2、R0、Ra、Rb、Rc和W的一个或更多个官能团被引入到包括通式(I-a)和(I-b)的通式(I)的分子中，出现在所公开的任何位置上的各个官能团可以被独立地选择，以及可以适当地被独立取代。此外，如果更通用的取代基被列出用于本发明分子中的任何位置，应该理解的是，该更通用的取代基可以被更具体的取代基替代，并且所得到的分子是在本发明分子范围内的。
本发明的优选化合物包括以下
在某些实施方案中，优选的化合物包括那些在实施例2中描述的VEGFELISA试验中EC50少于大约2uM、更优选在大约2uM和大约0.04uM(200nM到40nM)之间、更优选从大约0.04uM到大约0.008uM到(4nM到8nM)、以及更优选少于大约0.008uM(＜8nM)的化合物。尤其优选的化合物是化合物1-27，特别是化合物1、2、8、14、16和17。在一个实施方案中，本发明的优选化合物形成外消旋混合物，而在另一个实施方案中，本发明的化合物是对映体纯组合物。更优选地，本发明的化合物是在对映体纯组合物中的5S，11aR异构体。
以上被列出的化合物仅用于提供可以用于本发明方法的例子。根据本申请的公开文本，本领域技术人员将认识到可包括在现在要求保护的本发明范围内并可以用于本文所述的方法中的其它化合物。
B、本发明化合物的制备本发明化合物可以用现有技术中已知的任何方法制造。通过实施例的方式，本发明化合物可以根据以下通用方案来制备。更加特别的，方案I可以用于制造通式(I)的化合物。
方案I 更具体而言，在某些实施方案中，用于制备通式(I-a)的优选化合物的方案I的示例性方法包括形成游离胺Pictet-Spengler反应产物/中间体，如以下步骤I所描述的。
步骤I 在一个优选实施方案中，步骤-I可以包括添加需要的醛(B)到5-取代的色氨酸HCl(A)在0.1N硫酸中的悬浮液内。所述溶液接着可以在封闭的反应容器中在大约110℃-120℃下搅拌直到反应充分完成，例如，持续大约15分钟到大约20小时。在反应完成后，反应混合物可以冷却到室温，并过滤沉淀的盐。经过滤的残留物可以用醚、EtOAc或DCM和DMF的混合物洗涤并干燥，以得到为相应的酸式盐形式的产物(III)。可替换的，所需的醛(B)可以被添加到5-取代的色氨酸(A)在醋酸中的悬浮液内并被回流直到反应充分完成，例如，持续大约15分钟到大约20小时。在反应完成后，反应混合物可以被冷却到室温，并且可过滤相应的酸式盐。经过滤的残留物接着可以用醋酸、随后用DCM洗涤并干燥，以得到为盐形式的产物(C)。用EtOAc萃取，然后用含水氢氧化铵或1M含水氢氧化钠洗涤，由此可以得到游离胺(C)。接着使用该游离胺反应产物/中间体、或其盐，以形成通式Ia的其它优选化合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的化合物可以使用本领域任何已知的方法被拆分为对映体纯的组合物或合成为对映体纯组合物。例如，通过对映体混合物的直接结晶，通过对映体的非对映体盐的形成，通过非对映体的形成和分离，或通过外消旋混合物的酶促拆分，本发明的化合物可以被拆分。
例如，本发明之对映体纯的化合物可以由以类似于那些在方案II或方案III中示出的方式得到的对映体纯起始材料来合成(例如参见Inte J ofPep and Pro Res，130(1)，13-21(1987))。
方案II 方案III 如本领域技术人员认识到的，这些和其它反应方法可以用于制备本发明的化合物。对以上方法和步骤的不同的修改对于本领域技术人员将是显而易见的，而且本发明不特别受到制备本发明化合物的方法的限制。
C、本发明的方法在本发明的另一个方面中，提供通过使用本文所述的化合物来抑制VEGF产生，抑制血管发生，和/或治疗癌症、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、其它慢性炎症相关的疾病和病症、肥胖、或渗出性黄斑变性的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及抑制VEGF产生的方法，其包括对有此需要的患者给药VEGF表达抑制量的至少一种本发明的化合物。
在另一实施方案中，提供用于抑制血管发生的方法，其包括对有此需要的患者给药抗血管生成量的至少一种本发明的化合物。
在另一实施方案中，提供用于治疗癌症、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、其它慢性炎症相关的疾病和失调、肥胖症、或渗出性黄斑变性的方法，其包括对有此需要的患者给药治疗有效量的至少一种本发明的化合物。
不囿于理论的限制，本发明的方法据信是通过调节VEGF活性的组合机制而发生作用。在优选实施方案中，本发明的方法包括给药治疗有效量的至少一种本发明的化合物，其中所述化合物是10S，3aR异构体。
根据本发明的方法，所述化合物可以通过任何现有技术中已知的药物输送途径对患者给药。具体的示范性给药途径包括口腔的、眼睛的、直肠的、含服的、局部的、鼻腔的、眼药的、皮下的、肌肉内的、静脉内的(大丸剂和输注)、脑内的、经皮的、和肺部的。
如本文使用的术语“VEGF-抑制量”、“抗血管生成量”和“治疗有效量”指药剂的量，其用于治疗、改善、或阻止所鉴别的疾病或病症，或用于展现可检测的治疗或抑制效果。所述效果可以例如通过以下实施例中公开的试验来检测。用于患者的精确的有效量将取决于患者的体重、大小、和健康；疾病的性质和程度；以及用于给药的被选择的疗法或疗法的组合。用于给定情况的治疗有效量可以通过常规实验被确定，所述实验在临床医生的判断和技术之内。
对于任何化合物，所述治疗有效量可以在细胞如赘生细胞培养试验中，或在动物模型中，通常在大鼠、小鼠、兔、狗或猪中，被最初地评估。动物模型还可以用于测定合适的给药浓度范围和途径。这样的信息可以接着被用于测定人有用的给药剂量和途径。治疗的/预防的效果和毒性可以通过细胞培养或实验动物的标准药学步骤进行测定，例如，ED50(50％人群中治疗有效剂量)和LD50(对50％人群的致死剂量)。在治疗和毒性效果之间的剂量比率是治疗指数，其可以被表示为ED50/LD50之比。呈现大的治疗指数的药物组合物是优选的。从细胞培养试验和动物研究所得到的数据可以被用于配制用于人使用的剂量范围。在这样的组合物中得到的剂量优选在循环浓度范围内，所述浓度包括带有很小或没有毒性的ED50。根据所使用的剂型、患者的敏感性、和给药途经，剂量可以在这个范围内变化。
更具体而言，关于本发明化合物观察到的浓度-生物学效果关系指示初始的靶血浆浓度范围从近似0.1μg/mL到近似100μg/mL，优选从近似5μg/mL到近似50μg/mL，更优选从近似5μg/mL到近似10μg/mL。为了达到这样的血浆浓度，本发明化合物的给药剂量可根据给药途经从0.1μg到1000,000mg变化。对特定剂量和给药方法的指导在文献中已有提供并通常对本领域的医生是可得到的。通常地，剂量所在的范围是大约1mg/天到大约10g/天，或大约0.1g到大约3g/天，或大约0.3g到大约3g/天，或大约0.5g到大约2g/天，单独的、分开的或连续的剂量用于体重在大约40到大约100kg之间的患者(该剂量可以被调整用于高于或低于这个体重范围的患者，尤其是40kg以下的儿童)。
根据关于需要治疗的受试者的因素，精确的剂量由医生测定。剂量和给药可进行调整以提供充足水平的活性剂或保持所期望的效果。可以被考虑的因素包括疾病状态的严重度、患者的通常健康、年龄、体重和患者的性别、饮食、给药的时间和频率、药物组合、反应敏感性、和对治疗的耐受/反应。根据特定制剂的半衰期和清除率，长效药物组合物可以每3到4天、一周、或每两周一次而给药。
D、本发明化合物的代谢产物本文描述化合物的体内代谢产物也落入本发明的范围内。这样的产物可以由例如所给药化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等是反应产生，主要由于酶促方法。因此，本发明包括由一种包括使本发明化合物与哺乳动物组织或哺乳动物接触一段足以产生其代谢产物的时间的方法产生的化合物。这样的产物通常通过以下方法来鉴别制备本发明的经放射标记(例如，C14或H3)的化合物，以可检测的剂量(例如，大于大约0.5mg/kg)对诸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴子等的哺乳动物、或对人给药，进行代谢足够的时间(通常大约30秒到30小时)，并从尿、血液或其它生物样本中分离它的转化产物。这些产物易于被分离，因为它们已被标记(使用能够结合残存在代谢产物中的表位的抗体，由此其它的被分离)。代谢产物的结构以常规方式测定，例如通过MS或NMR分析。通常，代谢产物的分析可以用与本领域技术人员广泛熟知的常规药物代谢研究相同的方式来完成。只要它们不以其它方式见于体内，所述转化产物在用于本发明化合物的治疗剂量的诊断试验中是有用的，即使它们不具有自身的生物活性。
E、本发明的药物组合物虽然本发明化合物被纯净地给药是可能的，但是优选将本发明的化合物配制为药物组合物。这样，在本发明的另一方面中，提供用于本发明方法的药物组合物。本发明的药物组合物可以用药学可接受的诸如载体、溶剂、稳定剂、辅剂、稀释剂等赋形剂而配制，这取决于特定的给药模式和剂型。所述药物组合物通常应配制成达到生理学相容的pH，并且范围可以从大约3的pH到大约11的pH，优选大约pH 3到大约pH 7，这取决于制剂和给药途经。在可替换实施方案中，pH优选被调整到从大约pH 5.0到大约pH 8.0的范围。
更具体而言，本发明的药物组合物包括治疗和预防有效量的至少一种本发明的化合物、以及一种或更多药学可接受的赋形剂。可选择的，本发明的药物组合物可以包括本发明化合物的组合，或可以包括用于治疗癌症、糖尿病性视网膜病、或渗出性黄斑变性的第二活性成分。
例如用于非胃肠道的或口服给药的本发明的制剂最通常是固体、液体溶液、乳剂或混悬剂，然而用于肺部给药的可吸入的制剂通常是液体或粉末，而粉末制剂通常是优选的。本发明的优选药物组合物还可以被配制为冻干固体，其在给药之前用生理上可相容的溶剂复原。本发明的可替换药物组合物可以被配制为糖浆剂、乳膏剂、软膏剂、片剂等。
术语“药学可接受的赋形剂”指用于给药诸如本发明化合物等的药剂的赋形剂。所述术语指可以被施用但没有不适当毒性的任何药物赋形剂。药学可接受的赋形剂部分取决于将被给药的特定组合物，以及取决于用于给药所述组合物的特定方法。因此，存在各种本发明药物组合物的适合制剂(见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences)。
适合的赋形剂可以是载体分子，其包括大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、和惰性病毒颗粒。其它的示范性赋形剂包括抗氧剂，如抗坏血酸；螯合剂，如EDTA；碳水化合物，如糊精、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸；液体，如油、水、盐水、甘油和乙醇；润湿或乳化剂；pH缓冲物质；等等。脂质体也被包括在药学可接受的赋形剂的定义内。
本发明的药物组合物可以适用于所期望的给药方法的任何形式而被配制。当用于口服使用的时候，可以制备例如片剂、含片、锭剂、含水混悬剂或油性混悬剂、非水溶液、可分散的粉末或颗粒(包括微粉化颗粒或纳米颗粒)、乳剂、硬或软胶囊、糖浆剂、或酏剂。用于口服使用的组合物可以根据现有技术已知的用于制造药物组合物的任何方法制备，并且为了提供适口的制剂，所述组合物可以含有一种或更多种包括甜味剂、调味剂、着色剂、和防腐剂的物质。
尤其适用于与片剂结合使用的药学可接受的赋形剂包括例如惰性稀释剂，如纤维素、碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；崩解剂，如交联羧甲纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、玉米淀粉、或海藻酸；粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的或者通过包括微胶囊化的已知技术被包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并从而提供在更长时间段中的持久作用。例如，诸如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯等的时间延迟材料单独或与蜡一起被使用。
用于口服使用的制剂还可以为硬明胶胶囊的形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，所述稀释剂例如是纤维素、乳糖、磷酸钙或高岭土，或为软明胶胶囊的形式，其中活性成分与非水或油性介质混合，所述介质例如是丙三醇、丙二醇、聚乙二醇、花生油、液体石蜡或橄榄油。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物可以被配制为混悬剂，其包括与适用于混悬剂制造的至少一种药学可接受赋形剂混合的本发明的化合物。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物可以被配制为适用于通过添加适合赋形剂而制备混悬剂的分散粉末和颗粒。
适于与混悬剂结合使用的赋形剂包括悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶、阿拉伯胶，诸如自然产生的磷脂(例如卵磷脂)等的分散或湿润剂，氧化烯与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物(例如十七亚乙基氧基乙醇，heptadecaethyleneoxycethanol)，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的不完全酯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯)；以及增稠剂，如卡波姆、蜂蜡、固体石蜡或十六醇。所述混悬剂还可以包括一种或更多种防腐剂，如醋酸、甲基和/或n-丙基p-羟基-苯甲酸酯；一种或更多种着色剂；一种或更多种调味剂；一种或更多种诸如蔗糖或糖精等的甜味剂。
本发明的药物组合物还可以包括水包油乳剂的形式。油相可以是诸如橄榄油或花生油等的植物油、诸如液体石蜡等的矿物油、或它们的混合物。适合的乳化剂包括自然产生的树胶，如阿拉伯胶和西黄蓍胶；自然产生的磷脂，如大豆卵磷脂、从脂肪酸衍生的酯或不完全酯；己糖醇酐，如去水山梨糖醇单油酸酯；以及这些不完全酯与环氧乙烷的缩合产物，如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。所述乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。糖浆剂和酏剂可以用诸如甘油、山梨醇或蔗糖等甜味剂配制。这样的制剂还可以包括湿润剂、防腐剂、调味剂或着色剂。
此外，本发明的药物组合物可以是无菌注射制剂的形式，如无菌注射的含水乳剂或含油混悬剂。这种乳剂或混悬剂可以根据已知技术使用那些适合的分散或湿润剂和以上所述的悬浮剂来配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的非经肠的可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，所述稀释剂或溶剂例如是在1，2-丙烷-二醇中的溶液。无菌注射制剂还可以被制备为冻干粉。在可被采用的可接受载体和溶液之中可以是水、林格氏溶液、和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油可以用作溶剂或悬浮介质。为此目的，任何温和(bland)固定油可以被使用，其包括合成的甘油单酸酯或甘油二酸酯。此外，诸如油酸等的脂肪酸也可以被用于注射制剂中。
通常，用于本发明方法中的本发明的化合物是基本可溶于水并在大多药学可接受的质子溶剂中和在植物油中是微溶的。但是，该化合物在中链脂肪酸(例如，辛酸和癸酸)或甘油三酯中通常是可溶的，并在中链脂肪酸的丙二醇酯中具有高溶解度。本发明还包括已经通过化学或生物化学基团的取代或添加而被修饰的化合物，例如通过酯化、糖基化、聚乙二醇化(PEGylation)等，使它们更适于输送(例如，增加溶解度、生物利用度、适口性、减少副作用等)。
在优选实施方案中，本发明的化合物物可以配制在适用于低溶解度化合物的脂基制剂中用于口服给药。脂基制剂通常可以增强这样化合物的口服生物利用度。这样，本发明的优选的药物组合物包括治疗或预防有效量的本发明化合物、以及至少一种选自以下组中的药学可接受的赋形剂中链脂肪酸或其丙二醇酯(例如，可食用脂肪酸的丙二醇酯，如辛和癸脂肪酸)和药学可接受的表面活性剂，如聚氧基40氢化蓖麻油。
在可替换的实施方案中，环糊精可以被加入作为水溶解性增强剂。优选的环糊精包括α-、β-和γ-环糊精的羟丙基、羟乙基、葡糖基、麦芽糖基和麦芽三糖基衍生物。特别优选的环糊精溶解性增强剂是羟丙基-β-环糊精(HPBC)，其可以被加入到任何上述组合物中以进一步改善本发明化合物的水溶解特性。在一个实施方案中，所述组合物包括0.1％到20％的羟丙基-β-环糊精，更优选1％到15％的羟丙基-β-环糊精，以及甚至更优选的从2.5％到10％的羟丙基-β-环糊精。溶解性增强剂的使用量将取决于组合物中的本发明化合物的量。
F、联合治疗还可能的是将任何本发明化合物与一种或更多种用于癌症治疗中的其它活性成分组合，包括用于同时或顺序对需要治疗的患者给药的整体剂型或分开剂型中的化合物。当顺序给药时，所述组合可以在两次或更多次给药中施用。在可替换的实施方案中，可通过不同途径给药一种或更多种本发明化合物以及一种或更多种额外的活性成分。
本领域技术人员将认识到，各种活性成分可以与本发明化合物组合的方式给药，这可以用于增进或协同增强本发明化合物的VEGF抑制活性和/或抗血管生成活性。
根据本发明的方法，活性成分的组合可以是(1)在组合制剂中联合配制并同时给药或输送；(2)以分开制剂的方式交替或平行输送；或(3)通过现有技术中已知的任何其它组合治疗方案。当以交替疗法输送时，本发明的方法可以包括顺序给药或传递活性成分，例如分离的溶液、乳剂、混悬剂、片剂、丸剂或胶囊，或通过在分离的注射器中的不同注射液。通常，在交替治疗期间，各种活性成分的有效剂量被相继施用，即连续的，然而在同时治疗中，两种或更多种活性成分的有效剂量被一起施用。还可以使用不同顺序的间断性联合治疗。
为了有助于理解本发明，以下实施例被包括。涉及本发明的试验当然不应当被认为是对本发明的特别限制，而本发明的这些变化，无论是现在已知的还是之后发展的，只要是可以在所述技术领域技术人员可预见的范围之内，都应认为是在如本文所描述的和此后要求的本发明范围内。
实施例本发明将参考以下非限制的实施例来更加详细地描述，这些实施例的提供是为了更加详细地说明本发明，而不是对其范围的限制。所述实施例说明本发明某些化合物的制备，以及这些化合物体内和/或体外的测试。本领域技术人员将理解的是，在这些实施例中所描述的技术代表由本发明人描述的用以很好地实施本发明的技术，并由此构成用于实施其的优选方式。但应理解的是，本领域技术人员将根据本公开认识到在所公开的特定方法中可以做许多变化，并仍旧得到类似或相似的结果，而不偏离本发明的主旨和范围。
实施例1本发明化合物的制备通式I的化合物可以根据方案I来制备。例如，化合物23、33、35和40可以如下制备。本发明的其它优选化合物，如以下表4中的，可以相似地制备。
实施例1A化合物2(外消旋)的合成 根据方案I，p-茴香醛(2.16g，15.9mmol，1.93mL)在室温下被加入到5-溴色氨酸(3g，10.6mmol)在100mL醋酸中的悬浮液内。反应混合物接着在大约125℃的硅油浴中被加热至回流，并保持在该温度大约3小时20分钟。得到的溶液在真空下被浓缩。残留物与二氯甲烷、乙醚和己烷一起被研磨以产生粉状的棕色固体。收集所得到的所需产物的酸式盐并以己烷洗涤三次，没有纯化而用于下一步骤。
将收集的棕色固体悬浮在60ml丙酮中。该悬浮液用三乙胺(14.37mmol，2mL)和环己基异硫氰酸酯(2.03g，14.37mmol，2.04mL)处理以形成均质溶液。反应混合物在大约70℃下回流大约2.5小时，并然后在真空下浓缩。残留物在硅胶上用10％到15％到20％EtOAc己烷溶液纯化，以产生4.13g所需产物(82％)。MS(MH+)m/z＝525.23，Rt4.23。
实施例1B化合物14的合成 根据方案I，将p-茴香醛(0.18ml，1.5mmol)加入到在AcOH(1.5ml)中的5-溴色氨酸(283mg，1.0mmol)内并在有帽试管(cappedtube)中加热到大约110℃。该固体一加热就溶解。大约2.5小时后，将反应混合物冷却到室温并在旋转蒸发器中浓缩。粘稠的油残留物在CH3CN(2ml)中搅拌，并沉淀出褐色的固体。该固体被过滤并以CH3CN(2x)洗涤，以得到5，其为亮棕色的粉末，0.20g，产率为50％。通过LC-MS，该产物是95％纯的，带有3％的4和2％的p-茴香醛污染物，然后其不进一步纯化即被使用。MS(ES+)m/z401/403.13，Rt2.45分钟。
向5(55.5mg，1.5mmol)在2-丁酮(1.5ml)和TEA(0.2ml)中的溶液中加入环己基异氰酸酯。混合物在加帽的试管中在100℃下加热。2小时后，反应混合物被冷却到室温，在旋转蒸发器中浓缩。残留物用2％EtOAc二氯甲烷溶液进行色谱纯制，以得到6，其为白色粉末，45mg，产率为55％。MS(ES+)m/z508/510.23，Rt4.2分钟。
实施例1C化合物16的合成 根据方案I，将p-茴香醛(0.25ml，2.0mmol)加入到1(218mg，1.0mmol)在0.1N H2SO4(5ml)中的悬浮液内。反应混合物被加热到大约100℃过夜。之后，反应混合物被冷却到室温，过滤，以水(2x)、己烷(3x)和醚(2x)洗涤固体，并在空气中干燥以得到2，其为棕褐色粉末，320mg，产率为95％。通过LC-MS测定，该产物含有4.7％p-茴香醛的污染物，然后不经进一步纯化即被使用。MS(ES+)m/z337.25，Rt2.36分钟。
接着将环己基异硫氰酸酯(28μl，0.2mmol)添加至在10ml螺旋试管中的2在丙酮(2.0ml)和DMSO(0.4ml)中的混合物内。试管被封帽并且该混合物被加热到大约70℃(加热阻断温度)大约36小时。反应混合物接着被浓缩至干并进行色谱纯制(在己烷中的10％EtOAc)以得到3(化合物16)，其为淡黄色固体，55mg，产率为60％。MS(ES+)m/z460.27，Rt4.64分钟。
实施例1D化合物17的合成 此外，根据方案I，化合物11由化合物7(0.72g，3.0mmol)和胡椒醛合成，得到8，其产量为0.87g，产率为79％。通过LC-MS测定，产物8是96％纯的，其不经进一步纯化即被使用。MS(ES+)m/z371.18。接着，在室温下将SOCl2(0.15ml，2.0mmol)加入到8(0.66g，1.78mmol)在MeOH中的悬浮液内。固体被溶解并且所得到的溶液被加热到大约65℃过夜。反应混合物被冷却到室温并在旋转蒸发器中浓缩至干。粗产物9不经进一纯化即被用于10的合成。
接着在大约0℃下将TEA(0.74ml，5.34mmol)加入到粗产物9在CH2Cl2中的的悬浮液内，得到澄清溶液。将氯乙酰氯(0.34ml，4.27mmol)加入到该溶液中。大约30分钟之后，反应混合物以水稀释并以EtOAc萃取。合并的有机层被浓缩并以二氯甲烷中的5％EtOAc进行色谱处理以得到为棕褐色油的10(0.63g，由8计算总产量为77％)。MS(ES+)m/z461.16，Rt3.56min。
然后将环己胺(34μ，0.3mmol)加入到10在乙醇(2ml)中的溶液内。所述混合物被过夜回流，冷却到室温并在旋转蒸发器中浓缩。残留物以二氯甲烷中的5％EtOAc进行色谱处理以得到为白色粉末的11(23mg，产率为47％)。MS(ES+)m/z492.31，Rt3.57分钟。
实施例1E手性原料的制备通过使用对映体纯的起始原料，优选由如下制备的原料，本发明的化合物可以任选地以对映体纯的组合物的形式被制备。
5-溴-色氨酸的酶法拆分 根据方案II，将外消旋醚(4.15g，13.34mmol)溶解在乙腈(60ml)中并以水(120ml)稀释。用1N HCl将混合物的pH调整到7.0。加入氯化钾(230mg)和α-糜蛋白酶。通过使用自动滴定器，在整个拆分过程中用0.5NNaOH将混合物的pH保持在7.0。反应通过LC-MS监控。大约3小时后，加入额外的α-糜蛋白酶(30mg)，并且不对称水解在大约下一个3小时内完成。所得到的白色絮状混合物在旋转蒸发器中浓缩以除去乙腈，以EtOAc(100ml)稀释并由5N NaOH碱化到pH＝12-13。混合物然后通过celite进行过滤。以EtOAc(3x)萃取含水部分。合并的有机液以0.5N NaOH洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩，以得到为棕褐色固体的未水解的D-异构体，1.97g，产率为48％。手性色谱仪，97％纯并＞99％ee。合并的水层被酸化到pH＝6.0。所得到的白色固体被过滤、以水(2x)洗涤并在炉(95℃)中干燥，得到S-异构体，1.54g，产率为42％。LC-MS100％纯。5-溴-色氨酸的手性合成可替换的，对映体纯起始原料可以根据如以下的方案III来合成(例如参见Taniguchi，M.；Hino，T.Tetrahedron 1981，37，1487；Irie，K.；Ishida，A.；Nakamura，T.；Oh-Ishi，T.Chem.Pharm，Bull.1984，32，2126)。
5-溴-(D)-色氨酸甲酯也可以通过相同的顺序被制备。
实施例2低氧诱导的内源性VEGF表达的评价效果试验本发明化合物调节缺血诱导的内源性VEGF表达的能力可以如以下进行分析。VEGF蛋白水平可由ELISA试验来监控(R&D系统)。简而言之，在本发明化合物存在或不存在的时候，海拉细胞(HeLa Cell)在低氧条件下(1％O2，5％CO2，以氮平衡)可以培养24-48小时。之后，条件培养基可以由ELISA测定，并且VEGF的浓度可由每个试验的标准ELISA曲线计算。
剂量-应答分析可以使用ELISA试验和以上所述条件进行。用于剂量-应答ELISA的条件类似于如上所述的那些条件。在平行组中，使用CellTiterGlo(Promega)在与ELISA相同的条件下可以进行剂量-应答细胞毒性试验，以确保VEGF表达的抑制不是由于细胞毒性。剂量-应答曲线可以使用抑制百分数对化合物的浓度来绘制，且对于每种化合物可以产生EC50和CC50数值，其中最大抑制设定为100％，而最小抑制设定为0％。本发明的优选化合物的EC50将小于50，优选小于10，更加优选小于2，甚至更加优选小于0.5，以及甚至更加优选小于0.01。
图1显示了本发明的典型化合物--化合物2在抑制低氧条件下肿瘤细胞中的内源性VEGF的产生方面的能力。ELISA EC50是0.0025，然而它的CC50(0.22μM细胞毒性)大于20nm。用于本发明一系列优选化合物的EC50在表4中被提供。
表4
其中1个星，＞1uM(1000nM)2个星，0.2-1uM(200nM-1000nM)3个星，0.04uM-0.2uM(40nM-200nM)4个星，0.008uM-0.04uM(8nM-40nM)5个星，＜0.008uM(＜8nM)
实施例3在体内肿瘤生长PD模型中本发明化合物抑制VEGF表达和肿瘤生长本发明还显示在以下评估瘤内VEGF水平的药效模型中的活性。简要地，将HT1080细胞(一种人纤维肉瘤细胞系)可皮下植入裸小鼠中。七天后，在期望的剂量范围例如200mg/kg/天，小鼠可以被口服给药化合物持续7天。之后肿瘤可从小鼠中切离，并在含有蛋白酶抑制剂的Tris-HCl缓冲液中匀浆化。Moulder等人，Cancer Res.61(24)8887-85(2001)。随后使用人VEGF ELISA试剂盒(R&D系统)测量瘤内VEGF水平。使用Bio-Rad蛋白试验试剂盒测定匀浆的蛋白浓度，并使瘤内VEGF水平相对于蛋白质浓度进行归一化。
当在100mm3的肿瘤上使用一周的时候，与载体处理的对照组比较(数据未示出)，本发明优选的化合物将通常抑制至少50％的肿瘤生长。
实施例4本发明化合物不影响PDE5的活性测试本发明化合物以评估对磷酸二酯酶5(PDE5)活性的作用。对PDE5活性的作用使用来自Molecular Device的高效荧光极化试验(HEEP)试剂盒来测定。HEEP试验是通过使用cGMP的荧光标记衍生物作为基质来测定PED-5的活性的。当由PDE-5水解时，荧光标记的cGMP衍生物能够与结合剂结合。cGMP基质结合剂复合物导致高极化荧光状态。
图2显示了本发明化合物在PDE-5活性上的结果。在结合重组PDE5(CalBioChem)和cGMP基质之后，在存在或不存在阳性对照(Tadalafil)的情况下，混合物在室温下被温育45分钟。一旦加入结合剂，反应就被停止。使用由制造商推荐的设置，在Viewlux上测定荧光极化。如图2中被证明的，与阳性对照相比，本发明化合物不抑制PDE-5的活性。
本文所引用的所有出版物和专利申请以相同的程度引入本文作为参考，好像每个单独的出版物或专利申请都已具体且单独地指明被引入参考。
虽然某些实施方案已经在以上被详细描述，但是本领域普通技术人员将清楚地理解到，在不偏离其教导的情况下，这些实施方案还可进行许多修改。所有这些修改也包括在本发明的权利要求书中。
权利要求
1.一种用于抑制患者中VEGF产生的方法，其包括对有此需要的患者施用VEGF抑制量的式I的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋体或立体异构体， 其中，X是氢、羟基、卤素、C1到C6烷基、或C1到C5烷氧基，任选地被C6到C10芳基取代；W是氧或硫原子；R1是C1到C8烷基；5到12元杂芳基；或C6到C10芳基，任选地被一个或更多个独立选择的R0基团取代；R0是卤素、C1到C6烷基，其中所述烷基任选由一个或更多个独立选择的卤素基团取代；5到12元杂环，其中所述杂环任选地被C1到C6烷基取代；5到12元杂芳基；氰基、硝基；氨基，其中所述氨基任选地被一个或更多个C1到C6烷基取代；酰氨基；酯基；或-ORa基团；Ra是氢；或C1到C6烷基，其中所述烷基任选地被一个或更多个独立选择的卤素、C1到C4烷氧基、5到10元杂芳基、5到10元杂环、或氨基取代；其中所述杂环任选地被-C(O)-Rc基团或任选地被羟基取代的C1到C6烷基取代；以及所述氨基任选地被一个或更多个独立选择的任选地被C1到C4烷氧基取代的C1到C6烷基取代；R2是5到12元杂芳基；C2到C8烯基；C1到C8烷基，其中所述烷基任选地被一个或更多个独立选择的卤素、C1到C4烷氧基、5到10元杂环、5到10元杂芳基、任选地被一个或更多个独立选择的Rb取代的C6到C8芳基或-C(O)-Rc基团取代；或C6到C10芳基，任选地被一个或更多个独立选择的Rb基取代；Rb是卤素；氰基；硝基；C1到C4烷氧基；C1到C6烷基，其中所述烷基被任选地被一个或更多卤素基团取代；-O-C(O)-Rc；或-C(O)-O-Rc基团；以及Rc是羟基或C1到C6烷基。
2.如权利要求1所述的方法，其中X是氢、甲基、甲氧基、或卤素。
3.如权利要求1所述的方法，其中R1是任选地被一个或更多个独立选的R0基团取代的C6到C8芳基。
4.如权利要求3所述的方法，其中R0是C1到C4烷氧基和卤素。
5.如权利要求1所述的方法，其中R2是C3到C6环烷基或5到12元杂芳基。
6.如权利要求1所述的方法，其中R2是任选地被一个或更多个独立选的Rb基团取代的C6到C8芳基。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物是通式(I-a)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋体或立体异构体， 其中m是0、1、2或3。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述化合物是通式(I-a)化合物的10S，3aR异构体。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物是通式(I-b)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋体或立体异构体， 其中，X是氢、羟基、卤素、C1到C6烷基、或C1到C5烷氧基，任选地被C6到C8芳基取代；W是氧或硫原子；R1是C1到C8烷基；杂芳基；或C6到C8的芳基，任选地由至少一个R0基团取代；R0是卤素；C1到C6烷基，选择地由一个或更多个卤素基团取代；或-ORa；氰基；硝基；氨基；氨烷基；酰胺基；酯基；Ra是氢；或C1到C6烷基，任选地被杂环基取代；R2是C2到C4烯基，C1到C8烷基，任选地被C6到C8芳基或烷氧基取代；C6到C8杂芳基；或C6到C8芳基，任选地被一个或更多个Rb基取代；Rb是卤素；C1到C6烷基，任选地被一个或更多个卤素基团取代；烷氧基；或-C(O)-O-Rc基团；以及Rc是C1到C6烷基。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述化合物是通式(I-b)化合物的10S，3aR异构体。
11.一种抑制患者中血管发生的方法，其包括对有此需要的患者给药抗血管生成量的通式(I)化合物或其药物上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋体或立体异构体 其中，X是氢、羟基、卤素、C1到C6烷基、或C1到C5烷氧基，任选地被C6到C10芳基取代；W是氧或硫原子；R1是C1到C8烷基；杂芳基；或C6到C10芳基，任选地被一个或更多个独立选择的R0基团取代；R0是卤素；C1到C6烷基，其中所述烷基被任选地被一个或更多个独立选择的卤素基团取代；5到12元杂环，其中所述杂环任选地被C1到C6烷基取代；5到12元杂芳基；氰基、硝基；氨基，其中所述氨基被任选地被一个或更多个C1到C6烷基取代；酰氨基；酯基；或-ORa基团；Ra是氢；或C1到C6烷基，其中所述烷基任选地被一个或更多个独立选择的卤素、C1到C4烷氧基、5到10元杂芳基、5到10元杂环、或氨基取代；其中所述杂环任选地被-C(O)-Rc基团或任选地被羟基取代的C1到C6烷基取代；以及所述氨基任选地被一个或更多个独立选择的任选地被C1到C4烷氧基取代的C1到C6烷基取代；R2是5到12元杂芳基；C2到C8烯基；C1到C8烷基，其中所述烷基任选地被一个或更多个独立选择的卤素、C1到C4烷氧基、5到10元杂环、5到10元杂芳基、任选地被一个或更多个独立选择的Rb取代的C6到C8芳基或-C(O)-Rc基团取代；或C6到C10芳基，任选地被一个或更多个独立选择的Rb基取代；Rb是卤素；氰基；硝基；C1到C4烷氧基；C1到C6烷基，其中所述烷基被任选地被一个或更多个卤素基团取代；-O-C(O)-Rc；或-C(O)-O-Rc基团；以及Rc是羟基或C1到C6烷基。
12.如权利要求11所述的方法，其中X是氢、甲基、甲氧基、或卤素。
13.如权利要求11所述的方法，其中R1是任选地被一个或更多个独立选择的R0基团取代的C6到C8芳基。
14.如权利要求13所述的方法，其中R0是C1到C4烷氧基和卤素。
15.如权利要求11所述的方法，其中R2是C3到C6环烷基或5到12元杂芳基。
16.如权利要求11所述的方法，其中R2是任选地被一个或更多个独立选择的Rb基团取代的C6到C8芳基。
17.如权利要求11所述的方法，其中所述化合物是通式(I-a)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋体或立体异构体， 其中m是0、1、2或3。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述化合物是通式(I-a)化合物的10S，3aR异构体。
19.如权利要求11所述的方法，其中所述化合物是通式(I-b)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋体或立体异构体， 其中，X是氢、羟基、卤素、C1到C6烷基、或C1到C5烷氧基，任选地被C6到C8芳基取代；W是氧或硫原子；R1是C1到C8烷基；杂芳基；或C6到C8芳基，任选地由至少一个R0基团取代；R0是卤素；C1到C6烷基，任选地由一个或更多个卤素基团取代；或-ORa；氰基；硝基；氨基；氨烷基；酰胺基；酯基；Ra是氢；或C1到C6烷基，任选地被杂环基取代；R2是C2到C4烯基，C1到C8烷基，任选地被C6到C8芳基或烷氧基取代；C6到C8杂芳基；或C6到C8芳基，任选地被一个或更多个Rb基取代；Rb是卤素；C1到C6烷基，任选地被一个或更多个卤素基团取代；烷氧基；或-C(O)-O-Rc基团；以及Rc是C1到C6烷基。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述化合物是通式(I-b)化合物的10S，3aR异构体。
21.一种治疗患者中疾病或病症的方法，所述疾病或病症选自以下组中癌症、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、肥胖症、慢性炎症、和渗出性黄斑变性，其中所述方法包括对有此需要的患者施用治疗有效量的通式(I)的化合物或其药物上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋体或立体异构体， 其中，X是氢、羟基、卤素、C1到C6烷基、或C1到C5烷氧基，任选地被C6到C10芳基取代；W是氧或硫原子；R1是C1到C8烷基；杂芳基；或C6到C10芳基，任选地被一个或更多个独立选择的R0基团取代；R0是卤素；C1到C6烷基，其中所述烷基任选地由一个或更多个独立选择的卤素基团取代；5到12元杂环，其中所述杂环任选地被C1到C6烷基取代；5到12元杂芳基；氰基、硝基；氨基，其中所述氨基被任选地被一个或更多个C1到C6烷基取代；酰氨基；酯基；或-ORa基团；Ra是氢；或C1到C6烷基，其中所述烷基被任选地被一个或更多个独立选择的卤素、C1到C4烷氧基、5到10元杂芳基、5到10元杂环、或氨基取代；其中所述杂环任选地被-C(O)-Rc基团或任选地被羟基取代的C1到C6烷基取代；以及所述氨基任选地被一个或更多个独立选择的任选地被C1到C4烷氧基取代的C1到C6烷基取代；R2是5到12元杂芳基；C2到C8烯基；C1到C8烷基，其中所述烷基任选地被一个或更多个独立选择的卤素、C1到C4烷氧基、5到10元杂环、5到10元杂芳基、任选地被一个或更多个独立选择的Rb取代的C6到C8芳基或-C(O)-Rc基团取代；或C6到C10芳基，任选地被一个或更多个独立选择的Rb基取代；Rb是卤素；氰基；硝基；C1到C4烷氧基；C1到C6烷基，其中所述烷基被任选地被一个或更多个卤素基团取代；-O-C(O)-Rc；或-C(O)-O-Rc基团；以及Rc是羟基或C1到C6烷基。
22.如权利要求21所述的方法，其中X是氢、甲基、甲氧基、或卤素。
23.如权利要求21所述的方法，其中R1是任选地被一个或更多个独立选择的R0基团取代的C6到C8芳基。
24.如权利要求23所述的方法，其中R0是C1到C4烷氧基和卤素。
25.如权利要求21所述的方法，其中R2是C3到C6环烷基或5到12元杂芳基。
26.如权利要求21所述的方法，其中R2是任选地被一个或更多独立选择的Rb基团取代的C6到C8芳基。
27.如权利要求21所述的方法，其中所述化合物是通式(I-a)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋体或立体异构体， 其中m是0、1、2或3。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述化合物是通式(I-a)化合物的10S，3aR异构体。
29.如权利要求21所述的方法，其中所述化合物是通式(I-b)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、多晶型物、外消旋体或立体异构体， 其中，X是氢、羟基、卤素、C1到C6烷基、或C1到C5烷氧基，任选地被C6到C8芳基取代；W是氧或硫原子；R1是C1到C8烷基；杂芳基；或C6到C8的芳基，任选地由至少一个R0基团取代；R0是卤素；C1到C6烷基，任选地由一个或更多个卤素基团取代；或-ORa；氰基；硝基；氨基；氨烷基；酰胺基；酯基；Ra是氢；或C1到C6烷基，任选地被杂环基取代；R2是C2到C4烯基，C1到C8烷基，任选地被C6到C8芳基或烷氧基取代；C6到C8杂芳基；或C6到C8芳基，任选地被一个或更多个Rb基取代；Rb是卤素；C1到C6烷基，任选地被一个或更多个卤素基团取代；烷氧基；或-C(O)-O-Rc基团；以及Rc是C1到C6烷基。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述化合物是通式(I-b)化合物的5S，11aR异构体。
31.一种药物组合物，其包括(i)基本上由通式(I)化合物的10S，3aR异构体或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、或包合物组成的药剂， 其中，X是氢、羟基、卤素、C1到C6烷基、或C1到C5烷氧基，任选地被C6到C10芳基取代；W是氧或硫原子；R1是C1到C8烷基；杂芳基；或C6到C10芳基，任选地被一个或更多个独立选择的R0基团取代；R0是卤素；C1到C6烷基，其中所述烷基任选地由一个或更多个独立选择的卤素基团取代；5到12元杂环，其中所述杂环任选地被C1到C6烷基取代；5到12元杂芳基；氰基、硝基；氨基，其中所述氨基被任选地被一个或更多个C1到C6烷基取代；酰氨基；酯基；或-ORa基团；Ra是氢；或C1到C6烷基，其中所述烷基任选地被一个或更多个独立选择的卤素、C1到C4烷氧基、5到10元杂芳基、5到10元杂环、或氨基取代；其中所述杂环任选地被-C(O)-Rc基团或任选地被羟基取代的C1到C6烷基取代；以及所述氨基任选地被一个或更多个独立选择的任选地被C1到C4烷氧基取代的C1到C6烷基取代；R2是5到12元杂芳基；C2到C8烯基；C1到C8烷基，其中所述烷基任选地被一个或更多个独立选择的卤素、C1到C4烷氧基、5到10元杂环、5到10元杂芳基、任选地被一个或更多独立选择的Rb取代的C6到C8芳基或-C(O)-Rc基团取代；或C6到C10芳基，任选地被一个或更多个独立选择的Rb基取代；Rb是卤素；氰基；硝基；C1到C4烷氧基；C1到C6烷基，其中所述烷基被任选地被一个或更多卤素基团取代；-O-C(O)-Rc；或-C(O)-O-Rc基团；以及Rc是羟基或C1到C6烷基。
32.一种化合物，其具有选自以下组中的结构
全文摘要
根据本发明鉴别出后转录地抑制VEGF表达的化合物，并提供它们的使用方法。在本发明的一个方面，这些化合物用于抑制VEGF的产生、抑制血管发生、和/或治疗癌症、糖尿病性视网膜病或渗出性黄斑变性。在本发明的另一个方面，提供使用本发明化合物抑制VEGF产生、抑制血管发生、和/或治疗癌症、糖尿病性视网膜病或渗出性黄斑变性的方法。
文档编号A61P17/00GK1960725SQ200580014951
公开日2007年5月9日 申请日期2005年3月15日 优先权日2004年3月15日
发明者文荣春, 曹良弦, 纳达拉贾恩·塔米拉拉苏, 齐红彦, 崔珣奎, 威廉·约瑟夫·伦诺克斯, 唐纳德·托马斯·科森 申请人:Ptc医疗公司