专利名称：免疫系统的激活和抑制的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用NF-κB的诱导剂和抑制剂激活和抑制免疫系统，以及应用所述诱导剂和抑制剂治疗移植排斥、自身免疫病、变态反应、传染病和癌症。
背景技术：
抗原呈递是启动免疫应答的关键步骤，而人们认为树突细胞(DC)是原初T细胞最有效的抗原呈递细胞。这部分是由于它们高度表达MHC和共同刺激分子(Hart(1997)Blood 90，3245-3287)。然而，对于调节抗原呈递功能的生物化学途径所知甚少，这部分是由于难以转染DC。在本文中，本发明人使用IκB降解的抑制剂，即有效抑制NF-κB激活的PSI，显示消除DC诱导混合淋巴细胞反应的能力。抑制DC功能和消除抗原呈递的机制涉及下调节多个步骤，其中包括共同刺激分子(CD86和CD80)、II型HLA(DQ＞DR)以及细胞因子如IL-12。此外，暴露于所述DC的T细胞不能通过随后遇到正常DC而被刺激。这些结果指出NF-κB是阻断抗原呈递的有效靶。
树突细胞在初次免疫应答应答呈递抗原到原初T细胞的过程中是非常重要的。它们是骨髓衍生的细胞，在20世纪70年代早期由Steinman和Cohn(1973)J.Exp.Med 179，1109首次描述。起初因为难以分离足够数量的树突细胞，因此对它们的研究遇到困难，但通过用GM-CSF和IL-4培养CD34+细胞或人类单核细胞，在体外产生一种DC亚群，部分克服了这个问题。这些培养的DC具有未成熟DC的表型，可以通过与TNFα或LPS一起孵育成熟成为高度表达MHC、CD80/86的细胞(Bender等(1996)J.Immunol.Methods 196，121；Romani等(1996)J.Immunol.Methods(1996)196，137；Reddy等(1997)Blood 90，3640)。
从外周血中的集落形成后单位(post colony-forming unit)CD14+中间体也可以衍生DC。DC迁移到皮肤、粘膜、脾和胸腺中的外周位点。它们涉及多种临床上重要的过程，其中包括同种异体移植排斥、特应性疾病、自身免疫和抗肿瘤免疫。
可以使用细胞因子，主要是GM-CSF、IL-4和TNFα，从CD34+干细胞或CD14+外周血单核细胞离体培养DC(Scabolsc等(1995)J.Immunol.154，5651-5661)。来自这些来源的DC都有免疫活性，并且能够摄入外源呈递的抗原、加工所述抗原并将其呈递给细胞毒性T细胞(Grabbe等(1995)Immunology Today 16，117-121；Girolomoni和Ricciardi-Castagnoli(1997)Immunology Today 18，102-104)。DC可以传递体内产生的抗原特异性肿瘤免疫(Kwak等(1995)Lancet 345，1016-1020)，而用肿瘤抗原离体脉冲处理自体DC，可以诱导可测量的抗肿瘤效应(Hsu等(1996)Nature Medicine 2，52-58)。可以使用肿瘤膜粗裂解物、纯化肽或肽片段，有效脉冲处理DC。在例如WO/00/26249中描述了来自患者的自体树突细胞的离体扩充、加载肽抗原和作为继承性免疫治疗的再输注。
通过证明阻断抗原呈递下调节免疫应答并且可用于治疗疾病的动物模型，证实抗原呈递在产生免疫应答中的重要性。因此，已经使用鼠II类MHC的抗体治疗实验性变应性脑脊髓炎(Smith等(1994)Immunology 83，1)，而用抗体或CTLA4-Ig融合蛋白阻断CD80/86共同刺激分子在移植或关节炎的动物模型中是有益的(Lu等(1999)GeneTher.6，554-563)。这已经引起人们寻找可用于人类疾病或移植中的下调节抗原呈递的新途径。
人门已经推测NF-κB涉及免疫系统。这一点在例如Baeueurle P.A.和Henkel T.的论文中有概述(Annual Reviews in Immunology，1994，第12卷，第141-179页)。然而，由于以前无法研究激活或失活NF-κB对抗原呈递细胞的效应，因而没有人证明NF-κB在免疫系统的激活和抑制中确实是关键性的。本发明人第一次证明了NF-κB在免疫应答中的关键作用。
转录因子NF-κB象蛋白一样，其激活来自转录后修饰，以允许预先形成的转录因子从胞质转运到核。一种名为IκB的抑制剂蛋白的磷酸化和降解控制该转运，该抑制剂蛋白与NF-κB形成复合物，因此将其保留在胞质中。通过合适信号刺激细胞导致IκB的修饰，而IκB的修饰又导致它从NF-κB解离和/或降解。
IκB蛋白与NF-κB的结合屏蔽了NF-κB的核定位信号(NLS)。根据细胞类型和细胞发育阶段用特定因子刺激细胞时，IκB受到修饰，无法结合NF-κB，导致NF-κB与IκB解离。
NF-κB是一种异二聚体蛋白，由一个50kD亚基(p50)和一个65kD亚基(p65)组成。已经克隆了编码p50和p65的cDNA，并且显示所述cDNA在300个氨基酸的区上同源。
最近已经克隆了NF-κB家族的另一成员Rel B，该成员是来自血清刺激的成纤维细胞的立即早期反应基因。
p50和p65都能够形成同二聚体，但所述同二聚体的性质不同p50同二聚体具有强DNA结合物亲和性，但不能反式激活转录，p65同二聚体仅能微弱结合DNA，但能够反式激活。p50作为110kD前体(p110)的氨基末端部分合成，该前体没有DNA结合活性和二聚活性。所述羧基末端部分包含八个锚蛋白重复，这是一个在几种涉及细胞周期控制和分化的蛋白中发现的基序。
已经鉴定了五个IκB家族成员IκBα、IκBβ、p105/IκBγ、p110/IκBΔ和IκBε(Baeuerle和Baltimore，Cell 1996，第87卷，第13-20页)。所有IκB样家族成员都包含多个锚蛋白重复，所述重复对于抑制NF-κB激活是必不可少的。
本发明人已经发现在人巨噬细胞和类风湿性滑膜中炎症反应的许多关键特性依赖于转录因子NF-κB。本发明人已经研究了蛋白体抑制药物pSI，该药物最初描述为蛋白体胰凝乳蛋白酶样活性的抑制剂。已经发现许多促炎介质(如TNFα、IL-6、IL-2)的产生依赖于NF-κB(可受PCT/GB98/02753所公开的AdvIκBα的抑制)，而抗炎细胞因子和介质(即IL-10、IL-1受体拮抗物、IL-11)则不受影响。这提醒我们NF-κB准确区分这两类介质，这就提出问题考虑到炎症和免疫系统的密切关系，NF-κB在诱导免疫中到底起什么作用。
本发明人首先研究了蛋白体抑制药物PSI的效应，该药物不需要使用基因治疗。已知该药物抑制IκB降解，因此抑制树突细胞免疫刺激功能中的NF-κB激活，所述激活是产生初次免疫应答的关键早期步骤。
据报道使用PSI治疗单核细胞衍生的成熟DC，抑制它们在混合淋巴细胞反应中诱导T细胞增殖的能力。为阐明该效应的机制，进行细胞表面分析、细胞因子测定和共培养，这些研究提示阻断NF-κB使得免疫抑制机制可以在树突细胞和T细胞的相互作用中发挥作用。
此外，本发明人已经证明所述改变导致无反应性应答性应答。也就是说，它们导致无法产生免疫应答，甚至在除去原始的抑制化合物后也是如此。
本发明人也已经意识到NF-κB也可以用作诱导或调整免疫应答的靶。这是未曾预期到的，因为已经显示NF-κB已经在DC中被激活(Feuillard等(1996)Eui.J Immunol 262547-2551；Granelli-Piperno等(1995)Proc Natl.Acad.Sci.USA 92，10944-10948)，因此本来预期进一步的激活不是有利的。
发明内容
本发明的第一方面提供抑制哺乳动物(如人类)中抗原呈递或诱导无反应性应答的方法，所述方法包括给予药用有效剂量的APC(如DC)功能的胞内抑制剂。
“APC功能的胞内抑制剂”包括任何合适的抗原呈递细胞功能抑制剂。所谓“APC功能”包括呈递抗原的能力、表达II类MHC的能力、表达细胞表面分子如共同刺激分子(包括CD80和CD86)的能力、产生细胞因子的能力和诱导无反应性而不是激活的能力。APC功能的抑制剂通常是DC功能的抑制剂。所述抑制剂最好是APC内细胞内信号传递的抑制剂。“APC内细胞内信号传递”包括细胞膜和细胞核之间的通信，控制基因表达(包括表达CD80和CD86)和控制细胞骨架组构的信号传递。抑制细胞内信号传递包括，例如，在下文更详细描述的NF-κB抑制剂。
为避免疑问，包含CPG基序的细胞因子和分子不是APC功能的胞内抑制剂，因为它们在细胞外起作用。所述抑制剂当然是不杀伤所述细胞的抑制剂。
本发明的另一方面提供一种抑制哺乳动物体内抗原呈递或诱导无反应性应答的方法，所述方法包括给予药用有效剂量的NF-κB抑制剂。
药学有效剂量指在哺乳动物中足以诱导所需应答的量。可以通过本领域内已知的常规临床试验和实验性试验确定该量。
哺乳动物指任何哺乳动物，但尤其是指人类。
无反应性是免疫耐受性的一种形式，其中淋巴细胞(在这种情况下是T淋巴细胞)在不合适的环境下暴露于抗原后，变得对随后任选的免疫原性刺激不应，所述免疫原性刺激通常是由激活的抗原呈递细胞呈递的免疫原性剂量抗原(参见Roitt，I.，Broskoff，J.和Male，D.(1998，第5版)Immunology，Mosby，London)。因此，本发明提供了诱导哺乳动物中耐受性反应的方法。
抗原呈递指将抗原作为结合于细胞表面MHC分子的肽片段展示；只有以这种方式呈递抗原时，T细胞才识别所述抗原。
本发明的再一方面提供一种治疗变态反应或自身免疫病的方法，所述方法包括给予药用有效剂量的APC(如DC)功能的细胞内抑制剂以在哺乳动物中诱导无反应性应答。
本发明的又一方面提供一种治疗变态反应或自身免疫病的方法，所述方法包括给予药用有效剂量的NF-κB抑制剂以在哺乳动物中诱导无反应性应答。所述自身免疫病可以是任何自身免疫病，例如类风湿性关节炎、I型糖尿病、多发性硬化、局限性回肠炎、桥本甲状腺炎、腹腔疾病、重症肌无力、寻常性天疱疮、系统性红斑狼疮和Graves病。
可以使用本文描述的方法治疗的变态反应包括对下列变应原的变态反应Fel d 1(家猫Felis domesticus的猫皮和唾液腺变应原，其氨基酸序列在WO 91/06571中公开)、Der pI、Der pII、Der fI或Der fII(来自家尘螨嗜皮螨属(dermatophagoides)的主要蛋白变应原，其氨基酸序列在WO 94/24281中公开)。
本发明基本上可应用于任何变态反应，包括由下列选出的变应原引起的变态反应草、树和杂草(包括豚草)的花粉；真菌和霉菌；食物如鱼、贝类、龙虾(crab lobster)、花生、坚果、面筋、蛋和牛奶；有螫针昆虫(stinging insect)如蜜蜂、黄蜂和大黄蜂以及摇蚊科(chirnomidae)(非吸血蠓)；蜘蛛和螨，包括家尘螨；在哺乳动物如猫、狗、牛、猪、绵羊、马、兔、大鼠、豚鼠、小鼠和沙土鼠的皮屑、尿、唾液、血液或其它体液中发现的变应原；一般空气中的颗粒；胶乳；以及蛋白去污剂添加剂。
还可以治疗针对来自下列昆虫的蛋白的变态反应家蝇、果蝇、sheep blow fly、锥蝇、米象、蚕、蜜蜂、非吸血蠓幼虫、蜡螟幼虫、面粉虫、蟑螂和黄粉甲(Tenibrio molitor)的幼虫。
本发明的再一方面提供预防哺乳动物(如人类)中移植排斥的方法，所述方法包括给予药学有效量的APC(如DC)功能的细胞内抑制剂以在哺乳动物中诱导无反应性应答。
本发明的又一方面提供预防移植排斥的方法，所述方法包括给予药用有效剂量的NF-κB抑制剂以诱导无反应性应答。
本发明还涉及用作药物的APC功能抑制剂例如NF-κB抑制剂，所述药物用以诱导无反应性应答、抑制移植组织的排斥、或作为抗自身免疫病药物或用于治疗变态反应。
本发明还提供NF-κB抑制剂，用于生产治疗移植排斥、变态反应或自身免疫病的药物。
所述NF-κB抑制剂最好是蛋白水解的抑制剂，例如蛋白体抑制剂。所述抑制剂可以是可从Calbiochem获得的PSI。已知PSI是蛋白体的抑制剂(Traechner等，EMBO J.(1994)，第13卷，第5433-41页；Griscavage等，PNAS(1996)，第93卷，第3308-12页；Bondeson等，J.Immunol.(1999)，第162卷，第2939-45页)。也可以使用ALLN(Jobin等，Hepatology(1998)，第27卷，第1285-95页)；Lactacystin(Delic等(1998)，第77卷，第1103-07页)；MG-132(Jobin等，同上)；C-LFF和钙蛋白酶抑制剂(Neauparfant和Hiscott，Cytokine & Growth FactorReviews(1996)，第7卷，第175-190页)；或CVT-134(Lum等，Biochem.Pharmacol(1998)，第55卷，第1391-97页)作为抑制剂。
其它抑制剂包括咖啡酸苯乙酯(Natarajan等，PNAS(1992)，第93卷，第9090-95页)；吡咯烷二硫代碳酸酯(Schreck等，J.Exp.Med.(1992)，第175卷，第1181-94页)；洛伐他汀(Guijarro等，Nephrol DialTransplant(1996)，第11卷，第990-996页)；Aselastine HCL(Yoneda，Japan.J.Pharmacol.(1997)，第73卷，第145-153页)；Tepaxalin(Kazmi等，J Cell.Biochem.(1995)，第57卷，第299-310页)；(-)-没食子茶精-3-五倍子酸(Lin & Lin，Mol.Pharmacol.(1997)，第52卷，第465-472页)；deoxyspergualin(Tapper等，J Immunol.(1995)，第155卷，第2427-36页)；苯基-N-叔丁基硝酮(Kotake等，Biochem.Biophys Acta(1998)，第1446卷，第77-84页)；槲皮素(Sato等，J Rheumatol.(1997)，第24卷，第1680-84页)；Cucumin(Chan，Biochem，Pharmacol.(1998)，第55卷，第965-973页)；或E3330(Goto等，Mol.Pharmacol(1996)，第49卷，第860-873页)。
从本文指出的NF-κB抑制剂和激活剂的例子可以清楚地看出，优选所述抑制剂或激活剂进入所述细胞并在细胞内起作用，即作为细胞内NF-κB抑制剂或激活剂起作用，如作为导致NF-κB抑制或激活的细胞内信号传递事件的细胞内调节剂。
在本发明的另一实施方案中，NF-κB的抑制剂抑制NF-κB，即直接对NF-κB的水平(量)、细胞定位或活性起作用。例如，所述抑制剂可以是天然出现的与NF-κB直接相互作用的NF-κB调节剂，例如IκB。
所述抑制剂最好是IκB，尤其是IκBα，IκBα在例如Makarov的论文，Gene Therapy，1997，第4卷，第846-852页以及PCT/GB98/02753中有描述。其它NF-κB抑制剂包括反义cDNA或编码任何已知NF-κB亚基的寡核苷酸，所述NF-κB亚基如p50、p65、Rel B。Bondeson等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，5668描述了一种编码IκB的腺病毒。
所述抑制剂也可以是选择性破坏编码NF-κB的mRNA的核酶，或者是防止NF-κB转录的反义分子，或者是阻断NF-κB作用的抗体或抗体样分子。这些抑制剂将在下面更详细描述。人们将会认识到，APC(如DC)功能抑制剂也可以包括例如抑制APC内细胞内信号传递的核酶或反义分子或抗体或抗体样分子。
人们将会认识到，NF-κB抑制剂的抑制剂可以作为NF-κB诱导剂。因此，阻断IκBα功能或表达的抗体或反义分子或核酶可以作为NF-κB诱导剂。所述诱导剂的应用在下文描述。
以下文献中描述了本文公开的病毒或病毒样颗粒的基因组中编码的核酶Cech和Herschlag“单链DNA的位点特异性切割”US5,180,818；Altman等“用RNA酶P切割靶RNA”US 5,168,053、Cantin等“HIV-1 RNA的核酶切割”US 5,149,796；Cech等“RNA核酶限制性内切核糖核酸酶和方法”US 5,116,742；Been等“RNA核酶聚合酶、脱磷酸酶、限制性内切核酸酶和方法”，US 5,093,246；以及Been等“RNA核酶聚合酶、脱磷酸酶、限制性内切核糖核酸酶和方法；通过转酯作用在特定位点切割单链RNA”，US 4,987,071，所有文献都通过引用结合到本文中。
所述抑制剂最好由核酸序列编码，例如由在载体如腺病毒内的核酸序列编码。编码所述抑制剂的核酸序列最好有效连接表达所述序列所必需的调节元件。所述载体可用于基因治疗，以允许编码所述抑制剂的核酸序列能够插入哺乳动物的体内。本领域内已知基因治疗的方法，例如使用腺病毒。所述载体也可以包含编码抗原性分子的核酸序列。
所使用的载体构建物最好是AdvIκBα，该构建物在PCT/GB98/02753中公开。
“有效连接”指这样的并列设置在该设置下可以执行各成分的正常功能。因此，编码序列“有效连接”调节元件指这样的设置在该设置下编码NF-κB抑制剂(或诱导剂，如下文更详细的描述使用)的核酸序列能够在调节序列的控制下表达。
“调节序列”指在特定宿主生物中表达有效连接的编码序列所必需的核酸序列。例如，适合真核细胞的调节序列是启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
“载体”指包括单链、双链、环状或超螺旋DNA的DNA分子。合适的载体包括反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疸病毒和细菌质粒。反转录病毒载体是通过将它们的基因组随机整合进宿主基因组而复制的反转录病毒。WO 92/07573描述了合适的反转录病毒载体。
腺病毒是线性双链DNA病毒。合适的腺病毒载体描述于Rosenfeld等，Science，1991，第252卷，第432页。
腺伴随病毒(AAV)属于细小病毒科，包括约4-6KB的单链DNA。
痘病毒载体是大病毒，有几个可插入基因的位点。它们对热稳定，可以在室温储存。安全性研究指出痘病毒载体是复制缺陷型，不能从宿主传传播到宿主或从宿主传播到环境。
可以将包含编码NF-κB抑制剂(或诱导剂，如下文描述)的核酸的载体以脂质体的形式，采用本领域内已知的方法，引入哺乳动物体内。或者，可以使用气溶胶形式的脂质体，通过粘膜或肺到达机体。这样的技术是本领域内已知的。
免疫脂质体(抗体导向的脂质体)尤其可用于靶向过量表达细胞表面蛋白、并且可获得针对所述蛋白的抗体的细胞类型，这对于树突细胞或前体是有可能的，例如使用针对CD1、CD14或CD83的抗体(或其它树突细胞或前体细胞表面分子，如上文所述)。为制备免疫脂质体，依照Martin和Papahadjopoulos(1982)J.Biol.Chem.257，286-288的方法合成MPB-PE(N-[4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酰]磷脂酰乙醇胺)。将MPB-PE加入脂质体双分子层中，使抗体或其片段与脂质体表面形成共价偶联。将本发明的DNA或其它遗传构建物方便地加载到脂质体上以传递到靶细胞，例如通过以下步骤在包含所述DNA或其它遗传构建物的溶液中形成所述脂质体，然后在高达0.8MPa的氮气压力下，顺序挤出通过0.6μm和0.2μm孔径的聚碳酸酯滤膜。在挤出步骤后，在80000xg超速离心45分钟，分离已包载的DNA构建物和游离DNA构建物。将新鲜制备的脱氧缓冲液中的MPB-PE脂质体与新鲜制备的抗体(或其片段)混合，在4℃下氮气环境中恒定竖转式旋转(end over end rotation)过夜，进行所述偶联反应。在80000xg超速离心45分钟，分离免疫脂质体和未偶联的抗体。可以注射免疫脂质体，例如腹膜内注射，或将其直接注射入靶细胞存在的位点，例如通过皮下注射。DNA疫苗形式的编码NF-κB抑制剂的裸DNA，也可以用作NF-κB抑制剂。
如上文所提到的，另一种可用的抑制剂是应用NF-κB序列(如RelB)的反义核酸。这样的反义核酸包含能够结合NF-κB核酸序列、抑制所述NF-κB序列转录的核酸序列。产生反义核酸的方法本身是本领域内已知的。
反义寡核苷酸是能够特异性结合互补核酸序列的单链核酸。通过与合适的靶序列结合，形成RNA-RNA、DNA-DNA或RNA-DNA双链体。因为这些核酸与基因的有义链或编码链互补，所以常常将它们称为“反义的”。最近，已经证明形成三股螺旋是可能的，其中寡核苷酸结合到DNA双链体上。人们发现寡核苷酸能够识别DNA双螺旋大沟中的序列。因此形成三股螺旋。这提示有可能合成通过识别大沟氢键位点而特异性结合双链DNA的序列特异性分子。
上述寡核苷酸通过结合到靶核酸上，能够抑制所述靶核酸的功能。例如，这可能是阻断转录、加工、添加poly(A)、复制、翻译的结果，或者是促进细胞的抑制机制，例如促进RNA降解的结果。
在实验室中制备反义寡核苷酸，然后将其引入细胞，例如通过微注射或从细胞培养的培养基摄入细胞，或者在用携带反义基因的质粒或反转录病毒或其它载体转染细胞后，在细胞内表达所述反义基因。人们首先发现反义寡核苷酸在劳斯肉瘤病毒、疱疹性口腔炎病毒、1型单纯疱疹病毒、猿猴病毒和流感病毒的细胞培养物中抑制病毒复制或表达。从那以后，人们广泛研究了在包括兔网织红细胞裂解物和麦胚提取物的无细胞系统中反义寡核苷酸对mRNA翻译的抑制。已经使用与AIDS HIV反转录病毒RNA互补的寡核苷酸，在体外证明了反义寡苷酸抑制病毒功能(Goodchild，J.1998“反义寡脱氧核苷酸对人免疫缺陷病毒复制的抑制”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(15)，5507-11)。Goodchild的研究显示最有效的寡核苷酸与poly(A)信号互补；同样有效的是靶向RNA 5’末端的寡核苷酸，尤其是靶向帽和临近引物结合位点以及在引物结合位点上的5’非翻译区的寡核苷酸。所述帽、5’非翻译区和poly(A)信号位于反转录病毒RNA末端的重复序列(R区)内，与它们互补的寡核苷酸可以结合所述RNA两次。
反义寡核苷酸一般长15到35个碱基。例如，已经显示20聚体寡核苷酸抑制表皮生长因子受体mRNA的表达(Witters等，Breast CancerRes Treat 5341-50(1990))，而已经显示25聚体寡核苷酸降低促肾上腺皮质激素的表达90％以上(Frankel等，J Neurosurg 91261-7(1999))。然而，人们知道，可能理想的是使用超出该范围长度的寡核苷酸，例如10、11、12、13或14个碱基，或36、37、38、39或40个碱基。
所述反义核酸可以由合适载体编码，例如由下面讨论的类型编码。
所述抑制剂或者可以是抗NF-κB疫苗或是针对NF-κB的抗体或其片段如Fv。所述疫苗或抗体可以针对NF-κB的任何合适部分，只要其导致NF-κB的抑制。所述抗体最好是单克隆抗体。产生疫苗和抗体的方法是本领域内已知的。或者，所述抗体可以是仍然保持抗NF-κB活性的合适抗体片段，例如Fab或(Fab)2片段或Fv。所述抗体可以连接允许进入细胞的多肽序列，即所述抗体(尤其是抗体片段)可以连接到促进细胞(如DC)摄入所述抗体的部分。例如，所述抗体可以连接本领域内技术人员已知的能够促进细胞摄入所述分子或相互作用多肽的亲脂性分子或多肽结构域。因此，所述部分可以衍生自允许进入细胞的Antennapedia螺旋3(Derossi等(1998)Trends Cell Biol 8，84-87)或者HIV的序列(一般是tat)。这样的序列是已知的，包括允许进入细胞的穿透肽(penetraiion peptide)和HIV的序列(一般是工程化的tat)。或者，可以将编码所述抗体(最好是抗体片段)的cDNA作为如上文所述的载体传递。
本发明的再一方面提供刺激哺乳动物(如人类)抗原呈递或免疫应答的方法，所述方法包括给予药用有效剂量的APC(如DC)功能的细胞内诱导剂。
“APC功能的细胞内增强剂”包括任何合适的抗原呈递细胞功能增强剂。所述增强剂一般是DC功能的增强剂。所述增强剂最好是APC内细胞内信号传递的增强剂。
术语“APC功能”和“APC内的细胞内信号传递”如上文所定义。
为避免疑问，包含CPG基序的细胞因子和分子不是APC功能的细胞内诱导剂或增强剂，因为它们在细胞外起作用。
本发明的又一方面提供通过给予药用有效剂量的NF-κB诱导剂，刺激哺乳动物的抗原呈递或免疫应答的方法。所述方法最好用于通过刺激哺乳动物的免疫系统，治疗(包括预防性治疗)传染病或癌症。传染病包括朊病毒相关疾病，其中包括海绵状脑病。该方法可用于治疗(包括预防性治疗)特征在于机体内(有害)分子(例如多肽)的异常类型和/或异常高水平的疾病或病症，例如与慢性炎症有关的炎症介质(例如细胞因子)的水平；细胞或结缔组织基质的分解产物，例如纤连蛋白片段；β-淀粉样多肽(与早老性痴呆有关)。刺激针对这样的分子的免疫应答能够帮助从机体中除去所述分子，因此帮助解决或预防所述病症。
优选所述癌症抗原是下面任一种表位或包含至少一种下面任一种表位i)在肿瘤中以异常高水平表达的正常细胞蛋白；如多种肿瘤中的细胞周期蛋白D1；乳腺癌中的细胞周期蛋白E；多种肿瘤中的mdm2；在各种肿瘤中都表达的EGFR、erb-B2、erb-B3、FGF-R、胰岛素样生长因子受体、Met、myc、p53和BCL-2。
ii)在肿瘤中突变的正常细胞蛋白；如在多种肿瘤中的Ras突变；在多种肿瘤中的p53突变；CML和ALL中的BCR/ABL易位；AML和MDS中的CSF-1受体突变；结肠癌中的APC突变；MEN2A、2B和FMTC中的RET突变；神经胶质瘤中的EGFR突变；PML中的PML/PARA易位；前B细胞白血病和儿童急性白血病中的E2A-PBX1易位。
iii)肿瘤中与病毒感染有关的病毒编码蛋白；如宫颈癌中的人乳头瘤病毒蛋白；B细胞淋巴瘤和Hodgkin淋巴瘤中的EB病毒蛋白；成人T细胞白血病中的HTLV-1蛋白；肝细胞癌中的乙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒蛋白；卡波西肉瘤中的疱疹样病毒蛋白。
iv)感染IHV的患者体内的HIV编码蛋白。
因此，上述癌症相关抗原可以分为三个主要的类别(i)在肿瘤细胞中高水平表达的正常自身抗原；(ii)在肿瘤细胞中表达的突变型自身抗原；(iii)在肿瘤中表达的与病毒感染有关的病毒抗原。优选类(i)。
类(i)包括三个亚型a)过量表达的正常细胞蛋白；
b)在正常细胞中以组织特异性方式表达、但也在肿瘤中表达的蛋白；和c)属于胚胎抗原的蛋白，所述蛋白在大多数成人组织中沉默，而在肿瘤中异常表达。
b)和c)的例子有b)组织特异性分化抗原如肿瘤反应性CTL的靶，如GATA-1、IKAROS、SCL(在造血谱系和白血病中表达)；和免疫球蛋白恒定区(用于治疗多发性骨髓瘤)；和c)用于治疗白血病和维尔姆斯瘤的维尔姆斯瘤抗原1(WT1)，和于治疗肝部和肠肿瘤的癌胚抗原(CEA，一种胎蛋白)。在一个实施方案中，通过肿瘤样品的粗提物提供所述癌相关抗原。
在Stauss和Dahl(1995)Tumour Immunology，Dalgleish/Browning，第7章中描述了在人类肿瘤中过量表达癌基因编码的蛋白以及在人类肿瘤中表达的突变型癌基因，该文献特此通过引用结合到本文中。
优选治疗患有以下疾病的患者癌症；更优选以下任何一种乳腺癌；膀胱癌；肺癌；前列腺癌；甲状腺癌；白血病和淋巴瘤如CML、ALL、AML、PML；结肠癌；神经胶质瘤；精原细胞瘤；肝癌；胰腺癌；膀胱癌；肾癌；宫颈癌；睾丸癌；头颈癌；卵巢癌；成神经细胞瘤和黑素瘤。
CML是慢性髓细胞白血病；ALL是急性成淋巴细胞白血病；AML是急性髓细胞白血病；而PML是前髓细胞白血病。
或者，患者患有由病原体引起的任何疾病或有患此病的危险，尤其是由细菌、酵母、病毒、锥虫等引起的疾病。优选所述疾病由病原体的慢性感染引起。优选所述病原体不容易被宿主免疫系统清除。
优选所述疾病是病毒感染，更优选由以下任一种病毒引起的疾病HIV、乳头瘤病毒、EB病毒、HTLV-1、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒或任何引起慢性感染的病毒。尤其优选所述病毒是HIV。
在一些疾病如某些类型甲状腺病中，细胞产生异常大量的激素。因此，本发明的方法可用于帮助消除产生大量激素的细胞。所述抗原可以是细胞过度产生的激素、参与合成所述激素的生物合成酶。
也可以有效治疗患有细菌感染的患者，所述细菌感染尤其是引起慢性感染的感染。所述细菌感染可以是细胞内感染。因此，所述方法可用于治疗肺结核。
本发明人已经意识到NF-κB的关键功能使其受到刺激后导致哺乳动物(如人类)体内免疫应答增强。
本发明的又一方面提供用作药物、尤其是作为免疫应答刺激剂的NF-κB诱导剂。所述NF-κB诱导剂可以用作抗传染病剂，或作为抗癌药，或用于治疗如上文所述特征在于(有害)分子的异常类型和/或异常高水平的疾病或病症。
在患有传染病或癌症或特征在于机体内分子的异常类型和/或异常高水平的病症的患者体内增强免疫应答，将通过增加机体自身对抗所述传染病或癌症或病症的免疫应答而帮助治疗患者。
本发明的再一方面提供用于生产药物的NF-κB诱导剂，所述药物用于刺激免疫应答。所述诱导剂最好用于治疗传染病或癌症或如上文所限定的病症。
优选的NF-κB诱导剂包括MEKKI、NIK、IKK1、IKK2、TRAF2、TRAF5、TRAF6、TAK、TPL-2或Rel B或其它NF-κB亚基如p65或cRel。也可以使用能够诱导NF-κB的所述诱导剂的片段和突变蛋白。所述诱导剂可以由如上文关于NF-κB抑制剂所述的载体编码，然后将其引入需要治疗的患者的细胞中。
优选的NF-κB诱导剂是MyD88的显性失活突变体(即能够抑制野生型MyD88分子的信号传递，例如在其中存在野生型和抑制性MyD88分子的细胞中)。所述抑制可能由于阻断内源野生型MyD88与内源MyD88的结合配偶体如Toll样受体(TLR)之间的相互作用所致。所述显性失活突变体可以是MyD88lpr(Burns等(1988)J Biol Chem 273(20)，12203-12209)或缺乏死亡域的MyD88片段(参见Burns等(1988)和该文献评论的参考文献)。据认为MyD88(骨髓分化蛋白)具有一个模块组构，所述模块组构由N末端死亡域(DD)、C末端Toll域和将两个结构域分开的短接头组成(在Burns等(1998)中综述)。所述N末端DD涉及约90个氨基酸的基序，据认为该基序介导与其它DD序列的蛋白-蛋白相互作用，形成同二聚体或异二聚体(Boldin等(1995)J Biol Chem270，387-391)。
所述抑制性MyD88可以是活性不如MyD88的MyD88分子，最好基本不能结合DD(例如MyD88的DD或IRAK的DD)。例如，所述抑制性MyD88可以是活性不如MyD88，最好基本不能通过DD而二聚体化。所述抑制性MyD88分子可以是MyD88的截短形式，例如其中缺失全部或部分名为死亡域的结构域的MyD88分子。它可以是突变型MyD88分子，例如在DD中例如由于非保守性突变而发生突变的MyD88分子。例如，它可以在相当于全长小鼠MyD88的Phe56的位置发生突变，例如突变为Ash。它可以是如上文提到的名为MyD88lpr的突变型MyD88分子，其中还缺失MyD88的N末端53个氨基酸Burns等(1998)J.Biol.Chem.273，12203-12209。与野生型MyD88例如小鼠野生型MyD88相比，MyD88lpr具有一个点突变(F56N；小鼠序列编号)。该点突变位于DD内，防止DD的二聚体化(Burns等(1998))。该突变对应于lprcp突变，已知lprcp突变可能是通过破坏DD域的构象而消除Fas的细胞毒性信号传递(Nagata(1994)Semin Immunol 6，3-8；Huang等(1996)Nature 384，638-641)。
已经公开了野生型MyD88和显性失活MyD88(MyD88-lpr)的构建物(Burns K.等J.Biol Chem 1998)，但MyD88-lpr被错误地描述成在其死亡域上发生一单氨基酸突变，其中Phe56突变为Asn。该突变对应于Fas配体死亡域中存在的lprcp突变，lprcp突变通过破坏死亡域的构象而消除其下游信号传递。实际上，除所述点突变外，在N末端域还存在一个53个氨基酸的缺失(缺失所述genebank序列的1-159碱基)。该缺失导致缺失部分死亡域。
优选所述抑制性MyD88包含有功能的Toll域，即能够与Toll域例如野生型MyD88(如野生型人或小鼠MyD88)的Toll域或TLR相互作用的Toll域。优选所述抑制性MyD88包含全长MyD88 Toll域。全长Toll域对于Toll-Toll域相互作用是必不可少的。
测量蛋白-蛋白相互作用(以及它们的增强或破坏)的方法是本领域内技术人员众所周知的。在Burns等(1998)中也描述了测量DD和Toll-Toll相互作用的合适方法。合适的方法可以包括，例如，酵母双杂种相互作用、共纯化、ELISA、共免疫沉淀、荧光共振能量转移(FRET)技术和表面等离子体(plasmon)共振技术。因此，假如通过ELISA、共免疫沉淀或表面等离子体共振方法或酵母双杂种相互作用或共纯化方法可以检测到一种MyD88多肽与包含DD或Toll域的多肽之间的相互作用，那么就可以认为所述MyD88分子能够结合DD或Toll域或与其相互作用。优选的方法是表面等离子体共振。
初步研究表明MEKK1能够诱导NF-κB并增强APC(如DC)功能。优选所述诱导剂能够在DC或其前体中诱导NF-κB。因此，APC功能诱导剂或增强剂可以用于疫苗生产。相似的，APC功能抑制剂可以用于防止细胞识别特定抗原，因此诱导无反应性状态。
因此，本发明提供一种分子，所述分子包含(1)一个包含或编码细胞内调节剂的部分(调节部分)，所述细胞内调节剂例如抗原呈递细胞(APC)如DC的功能的胞内抑制剂或细胞内增强剂，和(2)一个包含或编码抗原性分子的部分(抗原性部分)。具体地说，本发明提供编码一种抗原和一种调节剂的多核苷酸，所述调节剂例如DC功能的抑制剂或增强剂。所述分子最好是或包含编码一种抗原以及一种APC(如DC)功能增强剂的DNA疫苗。所述调节剂例如APC(如DC)功能增强剂可以是保留或增强了其细胞内信号传递活性的细胞内信号分子或其衍生物。优选所述衍生物保留或增强DC功能。所述衍生物最好是NF-κB的激活剂/诱导剂。它可以是NF-κB或其成分。所述DNA疫苗可以包含包括以下部分的重组多核苷酸一个编码APC(如DC)功能的增强剂的部分以及一个编码抗原性分子的部分。或者，所述抗原性分子可以由独立的多核苷酸分子编码；而这是不太优选的。
人们将认识到，可以使用如所述的优选的抑制剂。
优选的增强剂是MEKK和MyD88的显性失活突变体，例如MyD88lpr。
人们将认识到在本发明的疫苗中可以使用如上文所述的优选增强剂/诱导剂。
所述抗原性分子可以包含一种或多种表位的一个以上拷贝。例如，它可以包含单一表位形成氨基酸序列的单一拷贝，所述氨基酸序列例如长约8到30个氨基酸的序列，优选长约10到18个氨基酸的序列，更优选长约15个氨基酸的序列。它可以包含所述表位形成序列的多个拷贝，或者包含至少两种不同表位形成序列的单一或多个拷贝。可以连接所述抗原性序列，形成结构域样结构，或将所述抗原序列放置在载体多肽的不同点。所述多核苷酸可以编码一种或几种不同的抗原性分子，其中每一种分子都包含一个或多个抗原性部分或表位。
本发明还包括编码在本发明中使用的NF-κB诱导剂的DNA疫苗。所述疫苗可以包括DNA序列，所述DNA序列中加入了来自一种病原体的目的抗原、或者如上文所述的一种癌特异性抗原或异常分子如β淀粉样蛋白、或者朊病毒，所述病原体如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等，HIV、HTLV、流感、结核、疟疾的病原体。此外，所述疫苗还可能包括一种NF-κB激活剂、可能包括两种或多种NF-κB激活剂以发挥最大作用。抗原和激活剂都处于调节抗原和激活剂表达的合适启动子序列的控制之下。刺激免疫应答的另一种方法可以是提供包含编码NF-κB诱导剂的核酸序列的载体，所述编码NF-κB诱导剂的核酸序列有效连接表达所述序列所必需的调节元件。所述载体可以包含诱导型启动子，以使得通过增强NF-κB的激活而增强免疫反应。
在Thomson等(1996)J.Immunol.157，822-826和WO 96/03144中描述了使用重组多表位疫苗传递多CD8CTL表位，这两份文献都通过引用结合到本文中。在本发明中，可能希望在单一疫苗中包括一种肽(或编码一种肽的核酸)，其中所述肽以任何顺序包括例如来自肿瘤相关抗原的一种或多种抗原性氨基酸序列(例如每种序列长约8到18个氨基酸)以及一种CD4T细胞刺激表位(例如来自破伤风类毒素)。所述“串珠(bead-on-a-string)”疫苗一般是DNA疫苗。
所述抗原性分子可以包含在转化细胞或癌细胞上存在的表位(即肿瘤相关抗原或表位，例如由高比率的人黑素瘤产生的MAGE-1抗原(vad der Bruggen等(1991)Science 254，1643))。或者，它可以包含在致病生物如病毒中存在的表位，或者在受到致病生物感染的细胞(最好是人类细胞)上存在的表位，所述细胞例如上文提到的病毒感染的细胞。
所述表位可以是T细胞表位，即能够诱导本领域内技术人员众所周知的T细胞应答(TH-1应答)的表位，所述T细胞应答最好是CD8+细胞毒性T细胞应答，或者是能够诱发CD4+辅助T细胞应答(TH-2反应)的表位。在某些情况下可能不希望有细胞毒性T细胞应答，例如当所述抗原是分枝杆菌抗原(例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)或麻风分枝杆菌(M.leprae)抗原)时。
所述抑制剂或诱导剂或抗原可以是肽模拟化合物，例如对应于上文所讨论的多肽抑制剂或诱导剂的肽模拟化合物。
术语“肽模拟物”指这样的化合物，该化合物模拟作为治疗剂的特定肽的构象和所需特点，但避免可能不希望有的特点。例如，吗啡是可以口服给予的化合物，它是内啡肽的肽模拟物。
涉及肽的治疗应用由于缺乏口服生物利用性以及由于蛋白水解降解而受到限制。例如，一般地说，肽在体内被外肽酶和内肽酶快速降解，导致一般非常短的生物半衰期。将肽作为可能的治疗剂的另一缺点是它们缺乏通过口服给予的生物利用性。胃肠道内蛋白水解酶对肽的降解可能是起重要作用的因素。然而，问题比这更复杂，因为人们已经认识到，甚至不受快速代谢物失活影响的小环状肽仍然显示口服生物利用性差。这可能是由于穿过肠膜的转运差、肝提取将其从血液中快速清除以及随后排泄入肠。这些观察提示多酰胺键可能干扰口服生物利用性。据认为肽链中连接氨基酸残基的肽键在口服给予所述肽药物时断裂。
有多种不同方法设计和合成肽模拟物。在如Sherman和Spatola，J.Am.Chem.Soc.，112433(1990)公开的一种方法中，用多种化学官能团以基本上等排(isoteric)的方式取代一个或多个酰胺键。该逐步方法已经取得一定的成功，获得活性类似物。在一些情况下，已经显示这些类似物比它们天然出现的对应物具有更长的生物半衰期。该方法仍然有限制。很少成功地取代一个以上的酰胺键。因此，所获得的类似物仍然对该分子中其它地方的酶促失活敏感。当取代肽键时，优选新的接头部分具有与肽键基本相同的电荷分布和基本相同的极性。
可以通过本领域内已知的方法，例如在Mézière等(1997)J.Immunol.159 3230-3237中描述的那些方法，合成其中肽键倒转的反-倒位(retro-inverso)肽模拟物。该方法涉及制造包含涉及骨架的改变、而不是改变侧链取向的假肽。包含NH-CO键而不是CO-NH肽键的反-倒位肽对蛋白水解更有抗性。
在另一方法中，使用多种非编码氨基酸或修饰过的氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸来修饰哺乳动物肽。或者，已经通过共价修饰稳定了假定有生物活性的构象，所述修饰如环化或加入γ内酰胺或其它类型的桥。参见，例如Veber等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，752636(1978)和Thursell等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，111166(1983)。
许多合成策略中的共同主题是在基于肽的框架中引入一些环状部分。所述环状部分限制所述肽结构的构象空间，这常常导致所述肽对特定生物活性受体的亲和性增加。该策略的另一好处是在肽中引入环状部分还导致肽对细胞肽酶的敏感性降低。
合成环状稳定肽模拟物的一种方法是环合复分解(RCM)。该方法涉及下列步骤合成肽前体，使其与RCM催化剂接触，产生构象受到限制的肽。合适的肽前体可以包含两个或多个不饱和C-C键。可以使用固相肽合成技术进行所述方法。在该实施方案中，锚定到固体支持物上的所述前体与RCM催化剂接触，然后从所述固体支持物上切割下产物，产生构象受到限制的肽。
可以使用在合成多肽之前或之后化学修饰一个或多个氨基酸残基的多肽作为抗原，只要所述多肽的功能即在体内产生特异性免疫应答基本保持未变。所述修饰包括与酸或碱(尤其是生理上可接受的无机或有机酸和碱)形成盐、形成末端羧基的酯或酰胺、以及连接氨基酸保护基如N-叔丁氧羰基。所述修饰可以保护多肽免受体内代谢。
本发明的另一方面提供嵌合分子的成套部分(a kit of parts)或组合物，其中包括(1)一种细胞内调节剂，例如APC(如DC)功能的胞内抑制剂或细胞内增强剂，和(2)包含或编码一种抗原性分子的抗原性部分。
本发明的又一方面包括一种成套部分或组合物或嵌合分子(如嵌合多肽)，其中包含如上文所述的一个NF-κB抑制或激活/诱导部分和一个抗原性部分。
本发明这些方面中的任一个部分或两个部分还可以包含一个转运部分和/或一个细胞结合部分。所述细胞结合部分最好能够结合树突细胞或其前体。所述转运部分有助于所述分子内化，或者至少有助于所述抗原性部分、最好所述信号传递抑制或增强部分内化。因此，外源应用的肽可以连接于HIV tat肽。该肽可以指导它们进入I型MHC途径，由CTL呈递(参见，例如，Kim等(1997)J.Immumol.159，1666-1668。WO 95/31483描述了可以按照本发明修饰的嵌合分子。
树突细胞可以根据CD80、CD86、CD40、CD1a、HLA-DR和/或CD83细胞表面分子的表达来鉴定。未成熟的树突细胞可能是CD34+或CD14+。因此，所述细胞结合部分可能能够结合一种或多种这些细胞表面分子(例如，能够结合这样一种分子的抗体)。
未成熟的DC显示增强的抗原捕获和加工。它们显示大量的细胞内I型MHC和II型MHC；增强的胞吞作用和吞噬作用；高CCR1、CCR5和CCR6；低CCR7；高CD68；低CD40、CD54、CD80、CD83和CD86；没有DC-LAMP。
成熟DC显示增强的抗原加工。它们显示出高表面I型MHC和II型MHC；低胞吞作用和吞噬作用；低CCR1、CCR5和CCR6；高CCR7；低CD68；高CD40、CD54、CD58、CD80、CD83和CD86；高DC-LAMP；和高p55 fascin。
所述细胞结合部分可用于将如本文所述的任何抑制剂或激活剂导向APC(如DC或未成熟DC)，所述抑制剂或激活剂例如核酸、DNA疫苗或抗体。
所述多核苷酸或DNA疫苗最好能够在患者体内表达所编码的反义分子或多肽，更优选在患者的APC(如DC或未成熟DC)中表达。如本文所述，如果合适，可以从任何合适的多核苷酸(遗传构建物)表达所述反义分子或多肽(例如NF-κB抑制剂或诱导剂/激活剂)或抗原，然后将其传递给所述患者。通常表达所述反义分子或多肽的遗传构建物包含有效连接启动子的所述多肽编码序列，所述启动子能够在患者细胞中表达转录的多核苷酸(如RNA)分子，然后翻译所述多核苷酸分子合成所述多肽。合适的启动子是本领域内已知的，包括用于遍在表达的例如看家基因的启动子或用于组织特异性基因表达的启动子(取决于需要表达所述多肽的位点，例如在树突细胞或其前体中)。尤其是假如所述多肽的传递或摄入被靶向选定的细胞(即树突细胞或其前体)，那么最好使用树突细胞或树突前体细胞选择性启动子，但这不是必不可少的。
在树突细胞中选择性表达的启动子可以是来自CD36或CD83基因的启动子。
可以如下将所述疫苗靶向特定的细胞群体例如抗原呈递细胞例如，通过注射所述部位、使用靶向载体和传递系统，或者从患者体内选择性纯化所述细胞群体并离体给予所述肽或核酸(例如可以如Zhou等(1995)Blood 86，3295-3301；Roth等(1996)Scand.J.Immunology43，646-651中所述分选树突细胞)。此外，靶向载体可以包含指导所述抗原在合适位点表达的组织特异性或肿瘤特异性启动子。
如上文所提到的，可能希望使用诱导型启动子。人们将认识到，可能理想的是能够在细胞内调节所述多肽(例如NF-κB抑制剂或激活剂/诱导剂)的时序表达。因此，可能希望所述多肽的表达直接或间接地(参见下文)处于启动子的控制之下，而所述启动子可以通过例如一种小分子浓度来调节，当需要激活或抑制(取决于所述小分子是导致所述启动子的激活还是抑制)所述多肽的表达时，可以将所述小分子给予所述患者。人们将会认识到假如所述表达构建物能够在所述细胞中稳定一段时间(至少一周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、八个月或更长时间)，即能够表达所述多肽(在任何必需的调节分子存在下)，这将是特别有利的。本发明优选的构建物包括可调型启动子。可调型启动子的例子包括在下面文献中提到的启动子Rivera等(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96(15)，8657-62(由雷帕霉素控制，雷帕霉素是一种口服可生物利用的药物，使用两种独立的腺病毒或腺伴随病毒(AAV)载体，一种载体编码编码诱导型人生长激素(hGH)靶基因，另一种编码二分雷帕霉素调节的转录因子)；Magari等(1997)J ClinInvest 100(11)，2865-72(由雷帕霉素控制)；Bueler(1999)Biol Chem380(6)，613-22(腺伴随病毒载体的综述)；Bohl等(1998)Blood 92(5)，1512-7(由腺伴随载体中的强力霉素控制)；Abruzzese等(1996)J MolMed 74(7)，379-92(综述诱导因子，如激素、生长因子、细胞因子、细胞抑制剂、辐射、热激和相关的效应元件)。也可以使用四环素诱导载体。这些是由相对无毒的抗生素激活的启动子，并且已经显示可用于调节哺乳动物细胞培养物中的表达。同时基于类固醇的诱导剂可能是特别有用的，因为类固醇受体复合物进入核，DNA载体在核中转录前必须分离。
可以通过在两个水平上调节表达而进一步改善该系统，例如通过使用如上文讨论并且是本领域内技术人员已知的组织特异性启动子和由外源诱导剂/抑制剂(如小分子诱导剂)控制的启动子。因此，调节的一个水平可能涉及连接合适的多肽编码基因到诱导型启动子上，而调节的另一水平包括使用组织特异性启动子驱动编码必需的诱导型转录因子(它控制所述多肽(例如NF-κB抑制剂或诱导剂/激活剂编码基因从所述诱导型启动子的表达)的基因。通过所述遗传构建物细胞类型特异性打靶，可以进一步改善控制。
如本领域内技术人员已知的，可以在完整的哺乳动物体内评估前，在体外产生的APC(例如DC)中评估本发明的方法和构建物。实施例1描述了合适的方法。
可以使用本领域内众所周知的方法制备本发明的构建物。
本发明的再一方面提供用于本发明的载体、疫苗和抗体。
可以使用合适的药学上可接受的载体、填充剂或其它添加剂配制本发明的疫苗和载体(本发明的治疗分子)。可以通过任何合适的方法给予它们，例如肌内途径、静脉内途径、口服途径、肛门途径、鼻内途径等。优选皮下给予或肌内给予。人们将认识到最好口服给予上文讨论的诱导剂，如小分子诱导剂。
可能最好是用包含所述治疗分子(如遗传构建物)的合适传递溶媒局部灌注包含靶细胞的区域一段时间；另外或者用另一种方法，可以将所述传递溶媒或治疗分子直接注射(如皮下注射)入包含靶细胞的可到达区域。传递遗传构建物(如腺病毒载体构建物)到患者细胞的方法是本领域内技术人员众所周知的。
尤其是可以使用继承性治疗(adoptive therapy)方法，或者可以使用基因枪传递所述构建物到例如皮肤中的树突细胞。
继承性疗法包括以下步骤(1)从患者获得抗原呈递细胞或其前体，最好是树突细胞或其前体；(2)使所述抗原呈递细胞与上文所述的NF-κB抑制剂或诱导剂/激活剂离体接触，任选地还与需要针对其的免疫应答的抗原或上文讨论的的嵌合分子或多核苷酸离体接触；然后(3)将经如此处理的抗原呈递细胞重新引入患者体内。
所述树突细胞宜是用多肽脉冲处理的自体树突细胞，所述多肽如NF-κB激活剂或一种抗原。在Murphy等(1996)The Prostate 29，371-380和Tjua等(1997)The Prostate 32，272-278中描述了使用自体树突细胞的T细胞疗法，其中使用来自肿瘤相关抗原的肽脉冲处理所述树突细胞。
在另一实施方案中，使所述抗原呈递细胞如树突细胞与编码所述NF-κB抑制剂或激活剂/诱导剂的多核苷酸接触。所述多核苷酸可以是任何合适的多核苷酸，优选它能够转导树突细胞，因此分别导致所述抗原呈递细胞所负责的抗原呈递的激活或抑制。
如上文提到的，所述多核苷酸方便的是包含在病毒多核苷酸或病毒中。例如，已经显示腺病毒转导的树突细胞诱导与MUC1有关的抗原特异性抗肿瘤免疫(参见Gong等(1997)Gene Ther.4，1023-1028)。相似的，可以使用基于腺病毒的系统(参见，例如，Wan等(1997)Hum.Gene Ther.8，1355-1363)；可以使用反转录病毒系统(Specht等(1997)J.Exp.Med.186，1213-1221和Szabolcs等(1997)Blood 90，2160-2167)；也可以使用粒子介导的到树突细胞的转移(Tuting等(1997)Eur.J.Immunol.27，2702-2707)；还可以使用RNA(Ashley等(1997)J.Exp.Med.186，1177-1182)。
可以从患者(即自体树突细胞)或一个或多个健康个体(MHC匹配或不匹配)获得APC如树突细胞，如上文在体外处理，然后进行继承性治疗，即将经如此操作的树突细胞引入体内，所述树突细胞随后激活CTL反应。所谓“健康个体”指总体健康状态良好的个体，优选所述个体的免疫系统有活性，并且更优选不曾患过可容易测试和检测的任何疾病。
因此，本发明的方法包括继承性免疫治疗的方法。
优选将103到1011DC给予患者；更优选106到107DC。
可以通过任何方便的途径给予所述APC如DC。优选静脉内给予所述DC。还优选局部给予所述DC到疾病位点(例如肿瘤或局部病毒感染或细菌感染部位)。对于癌症尤其优选局部给予。方便的是，将所述DC给予供应疾病位点或疾病所处的组织的动脉。
可以将所述细胞(或疫苗)给予正在用某种其它方法治疗所述疾病的患者。因此，虽然可以单独使用所述治疗方法，但理想的是将其作为一种辅助治疗。
可以在其它治疗之前、期间或之后给予所述APC(如DC)或疫苗。
当需要治疗的疾病是癌症时，优选已经或正在或即将用常规治疗或手术以及本发明的方法治疗所述癌症。方便的是，根据所述治疗，使用放射疗法或化学疗法治疗所述癌症。
当需要治疗的疾病是病原体感染时，优选已经、正在或即将用常规方法或手术治疗所述感染。
假如需要治疗的患者受到HIV感染，优选使用本发明的方法辅助其它疗法，所述其它疗法例如使用反转录酶抑制剂如AZT或3TC的疗法或者联合疗法如HART(高活性反转录病毒疗法)。
当使用本发明的方法治疗实体瘤时，优选将所述APC(如DC)或疫苗作为第一手术后治疗(first post-surgery treatment)给予。
当使用本发明的方法治疗白血病时，优选在放射治疗或化学治疗后给予所述APC(如DC)或疫苗。还优选组合使用所述DC与骨髓移植联合治疗白血病患者。
癌症治疗如继承性免疫治疗在控制或消除最小残余疾病时最有效，而不是在减少大体积疾病(bulk disease)时有效。可以想象免疫治疗由于注入细胞毒性T淋巴细胞而暂时增加大体积疾病的尺寸。在治疗后可以监测疾病的程度和体积，但不能使用该指标作为正式的终点。在长时间内以常规方法随访患者，保证没有显示长期的不利事件。
其它传递或靶向策略可以包括以下方法。可以使用弹道压缩空气驱动的DNA/蛋白包被纳米颗粒穿透(例如使用BioRad装置)培养物中或体内的细胞。用于传递的构建物最好具有细胞类型特异性启动子。
适于胃肠外给予的制剂包括水性或非水无菌注射溶液，所述溶液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂以及使所述制剂与目标受体血液等渗压的溶质；以及水性和非水悬浮液，所述悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以盛装在单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿或管形瓶)中，并且可以保存在冷冻干燥(冻干)环境下，仅需要在临用前加入无菌液体溶媒如注射用水。可以从本领域内技术人员众所周知的种类的无菌粉末、颗粒剂或片剂制备临时配制的注射液和悬浮液。鼻用喷雾剂也是有用的形式。
所述构建物的剂量例如取决于所述构建物的大小和给予其的目的。一般地说，根据需要治疗组织的表面积计算该范围。构建物的有效剂量取决于所述构建物的大小、所使用的传递溶媒/靶向方法以及所述寡核苷酸的化学组成，但技术人员可以例如利用来自动物的数据和上文提到的体外测试系统确定合适的剂量。
例如，对于治疗和预防目的，都可以系统地给予患者所述构建物。例如，可以通过如上文所述的任何有效方法给予所述构建物，所述方法如胃肠外途径(如静脉内途径、皮下途径、肌内途径)或口服途径、鼻途径，或允许所述构建物例如到达患者血流并在血流中循环的途径。除局部给予构建物外，最好系统给予构建物，但在不采用局部给予构建物时系统给予构建物也有实用性。
据认为树突细胞摄入所述核酸并表达所编码的多肽可能是引发免疫应答的机制；然而，树突细胞可能没有受到转染，但仍然是重要的，因为它们从所述组织的转染细胞中获取表达的肽。
优选将所述疫苗(如DNA疫苗)肌内给予。也优选将所述疫苗给予皮肤上或皮肤内。
如上文提到的，本发明提供一种成套部分或组合物或嵌合分子，其中包括(1)一个包含或编码NF-κB抑制剂或诱导剂的调节部分和(2)一个包含或编码抗原性分子的抗原性部分。
关于本发明的任一前述方面，尤其是如上文所述的疫苗或所述成套部分或嵌合分子或组合物，所述抗原性分子最好包含在转化细胞或癌细胞或致病生物上存在的表位，或者在受到致病生物感染的细胞上的表位。
因此，本发明提供有效对抗癌症、或癌细胞或肿瘤细胞、或对抗致病生物或感染致病生物的细胞的疫苗，所述疫苗包含有效量的如上文所述NF-κB诱导剂或其它APC功能诱导剂，或包含有效量的编码NF-κB诱导剂或其它APC功能诱导剂的多核苷酸。所述疫苗最好还包含一种抗原或编码抗原的多核苷酸，所述抗原具有在所述癌细胞或肿瘤细胞上存在的表位或者在致病生物或感染致病生物的细胞上存在的表位。所述疫苗最好是核酸疫苗。
本发明的再一方面提供一种药用组合物，所述药用组合物包含本发明任一前述方面的NF-κB诱导剂、NF-κB抑制剂、疫苗、分子、多核苷酸、成套部分或嵌合分子或组合物以及一种药学上可接受的载体。
本发明还提供用于医药的本发明前述任一方面的疫苗、分子、多核苷酸、成套部分、组合物或嵌合分子。本发明还提供应用本发明前述任一方面的疫苗、分子、多核苷酸、成套部分、组合物或嵌合分子生产用于治疗需要调节抗原呈递的患者的药物。
清楚的是本发明提供杀伤患者体内异常表达第一表位(firstepitope)的靶细胞的方法，所述方法包括以下步骤(1)从所述患者获得APC(如树突细胞)；(2)使所述APC(如树突细胞)与APC(如DC)功能增强剂离体接触；(3)任选地使所述细胞与所述表位接触或与编码所述表位的多核苷酸或表达载体接触，然后(4)将经如此处理的APC(如树突细胞)重新引入患者体内。
清楚的是本发明提供杀伤患者体内异常表达第一表位的靶细胞的方法，所述方法包括以下步骤(1)从所述患者获得树突细胞；(2)使所述树突细胞与NF-κB诱导剂离体接触；(3)任选地使所述细胞与所述表位接触或与编码所述表位的多核苷酸或表达载体接触，然后(4)将经如此处理的树突细胞重新引入患者体内。
所述靶细胞可以是癌细胞。
本发明还提供在体内或体外抑制或刺激树突细胞成熟和激活的方法，所述方法包括给予有效量的NF-κB抑制剂或诱导剂。
所述抑制剂或诱导剂如上文定义。
为避免疑问，在使用术语“树突细胞”的地方，除非上下文另外指明，该术语包括任何合适的抗原呈递细胞。优选所述抗原呈递细胞是树突细胞。
本发明的优选实施方案将在下文描述。
图1.用PSI处理的DC的细胞生存力。成熟DC或者未处理，或者用不同剂量PSI处理4小时。洗涤后，细胞在如所述没有补充单核细胞条件培养基的RPMI 1640中培养。处理后6天，细胞重悬浮于含10μg/ml碘化丙锭PI的PBS中并用FACSscan分析。
图2.用蛋白体抑制剂CbZ-Ile-Glu(O-tert-bytyl)-Ala-leucinal(PSI)处理的DC的免疫刺激能力。成熟DC用PSI(0.1μM▲)、(0.5μM■)、(1μM●)或不用PSI(○)处理4小时。洗涤后，将每类DC不同数目的细胞和105异种淋巴细胞接种到96孔板中。在第6天根据3H-TdR摄入测定确定增殖。(每一点代表五个单独实验的平均值+/-SEM)。
图3.使用单克隆抗体、HLA-DR、CD86(PE缀合的)；(Pharmingen，San Diego，CA)研究PSI对表面抗原表达的效应。PSI处理后第6天，用上文列出的MoAb研究未经处理(绿线)、PSI(0.1μM)处理(蓝点线)、PSI(1μM)处理(红点线)群体的表型，并用FACSscan(Becton Dickinson)分析所述群体。
图4.异种-MLR缺乏增殖反应的恢复。成熟DC用溶媒(A)或PSI(1μM)(B)处理4小时。洗涤后，将每种处理DC以逐级增加的数目与105异种淋巴细胞接种到包含溶媒(○，●)、2ng/ml IL-2(□，■)或10g/ml抗CD28抗体(△，▲)的96孔板中。第6天使用3H-TdR摄入测定确定增殖。(每一点代表三个单独实验的平均值+/-SEM)。
图5.PSI预处理的DC抑制异种-MLR中淋巴细胞的生长能力。成熟DC如上文所述用PSI处理。洗涤后，混合每种DC获得不同组合物仅用溶媒处理的DC(○)、1/4数目PSI处理的DC与3/4数目溶媒处理的DC混合(●)、1/8数目PSI处理的DC与7/8溶媒处理的DC混合(■)、或仅包含用PSI处理的DC(▲)。每种混合物以逐级增加的数目与105异种淋巴细胞接种到96孔板中。第6天使用3H-TdR摄入测定确定增殖。
图6.与用PSI处理或未经处理的DC预培养的异种淋巴细胞的反应削弱。淋巴细胞与1/10数目的PSI处理(●，▲)或未经处理DC(○，△)共培养。2天后，通过CD83、CD86包被的平板除去每种DC。使用溶媒处理的DC(○，●)或PSI(1μM)处理的DC(△，▲)再培养淋巴细胞4天。使用3H-TdR摄入测定确定增殖。(每一点代表三个单独实验的平均值+/-SEM)。
图7.PSI预处理的DC降低表面抗原在异种淋巴细胞上的表达。使用溶媒处理的DC(绿线)或PSI(1μM)处理的DC(红线)，在与异种MLR实验相同的条件下培养淋巴细胞6天。用MoAb、CD3、CD25(PE缀合的；Pharmingen)、CD54(PE缀合的；Serotec)、CD50(FITC缀合的；Serotec)测定每种淋巴细胞的表型，并通过FACScan分析每种淋巴细胞。
图8.与溶媒处理或PSI处理的DC共培养的异种淋巴细胞的细胞因子产生。成熟DC如上文所述用溶媒或PSI(1μM)处理。将异种淋巴细胞和每种DC以每孔2×105细胞接种到96孔板上，并用PMA(10nM)处理或不刺激达49小时。通过ELISA分析上清中的IL-2、IL-4和γ干扰素。
图9.用溶媒或PSI处理的DC的细胞因子产生。成熟DC如上所述用溶媒或PSI(1μM)处理。将每种DC和异种淋巴细胞以每孔2×105细胞接种到96孔板上，并用PMA(10nM)刺激或不刺激达48小时。通过ELISA分析上清中的IL-6、IL-8、IL-12和TNFα。
图10.MEKK-1的表达大大增强单核细胞衍生的树突细胞在异源MLR中的抗原呈递。简要地说，通过用50ng/ml GM-CSF和10mg/mlIL-4培养外周血单核细胞，产生树突细胞。第5天，所述细胞用不含插入片段的腺病毒或编码MEKK-1的腺病毒感染2小时(感染复数100∶1)，或保持不感染。2天后，用105纯化的异源T细胞在96孔平底板中与104树突细胞一起培养5天，用0.5μCi/孔脉冲处理过夜，第二天收获细胞。编码MEKK-1的树突细胞在诱导T细胞增殖方面比未感染的DC强4倍，而对于感染了未携带插入片段的腺病毒的树突细胞就不是这样。
图11.树突细胞中MyD88显性失活抑制剂(MyD88lpr)的表达诱导NF-κB激活用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养外周血单核细胞5天，产生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在无血清培养基中用不含插入片段的对照腺病毒(Ad0)和编码显性失活MyD88的腺病毒(AdMyD88-lpr)感染。使用感染复数100。表达6小时和24小时后，裂解细胞，通过EMSA检查核提取物中的NF-κB DNA结合活性。惊人的是，MyD88lpr的表达本身就能够诱导NF-κB激活，这与以前发现的完全相反。
图12.显性失活(抑制剂)而不是野生型MyD88的表达本身诱导TNFα产生，而不抑制树突细胞中LPS诱导的TNFα产生。
用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养外周血单核细胞5天，产生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒(Adβ-gal)、编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)和编码野生型MyD88的腺病毒(AdMyD88wt)感染。已经显示Adtoll没有功能，应该忽略。使用感染复数100。24小时后，用100ng/mlLPS刺激细胞。惊人的是，在缺少其它刺激的情况下，显性失活MyD88的表达本身可以诱导树突细胞产生TNFα。此外，它不能抑制LPS诱导的TNFα产生，该发现与以前的发现相反。
图13.野生型MyD88的表达消除MyD88-lpr(显性失活)诱导的树突细胞产生TNFα用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养外周血单核细胞5天，产生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒(Adβ-gal)、编码野生型MyD88的腺病毒(AdMyD88wt)和编码显性失活MyD88的腺病毒(AdMyD88lpr)感染。在某些情况下使用Adlpr与Adβ-gal或AdMyD88wt以1∶1和1∶5比例的双重感染。单感染使用感染复数100。24小时后，取出上清并分析。惊人的是，在缺少其它刺激的情况下，显性失活MyD88的表达本身可以诱导树突细胞产生TNFα。野生型Myd88能够抑制Myd88lpr诱导的TNF产生。
图14.显性失活MyD88在树突细胞中的表达增强抗原特异性T细胞增殖用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养外周血单核细胞5天，产生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在无血清培养基中用不含插入片段的对照腺病毒(Ad0)、编码作为原型抗原的绿荧光蛋白的腺病毒(AdGFP)和编码与显性失活MyD88连接的GFP的腺病毒(AdGFP-lpr)感染。48小时后，将剂量逐渐增加的树突细胞与2×104抗原特异性T细胞一起培养，第3天测定增殖。传递抗原特异性GFP到树突细胞诱导抗原特异性T细胞增殖，该作用受到显性失活MyD88的表达的增强。这与我们的抑制树突细胞中的MyD88活性诱导树突细胞激活的出乎意料的结果一致。
图15.在树突细胞中表达显性失活MyD88增强异源混合淋巴细胞反应(MLR)用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养外周血单核细胞5天，产生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在无血清培养基中用不含插入片段的对照腺病毒(Ad0)和编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。48小时后，将剂量逐渐增加的树突细胞与1×105异源T细胞一起培养，第6天测定增殖。显性失活MyD88的表达增强异源T细胞增殖，该发现指示DC抗原呈递增强。
图16.在树突细胞中表达显性失活MyD88增强共同刺激分子(CD80、CD86)的表达用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养外周血单核细胞5天，产生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在无血清培养基中用编码GFP的对照腺病毒感染，以及用编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。48小时后，收集树突细胞并染色检查CD80和CD86，这是有效抗原呈递功能所需的两种非常重要的共同刺激分子。显性失活形式的MyD88的表达，增强了CD80和CD86的细胞表面表达，这指示树突细胞抗原呈递功能增强。
图17.显性失活MyD88在巨噬细胞中的表达诱导p38MAPK磷酸化通过在5％FCS RPMI中加入100ng/ml M-CSF 2-3天，从外周血单核细胞分化出人巨噬细胞。然后所述细胞或者保持不感染，或者在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒或编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。使用如图显示的感染复数100(或者在一种情况下使用50)。在6小时、24小时和48小时后，裂解细胞，使用蛋白质印迹分析和磷酸(phospho)-p38 MAPK特异性抗体测定提取物的p38MAPK活性。未曾预料到的是，显性失活MyD88的表达在人巨噬细胞中诱导p38MAPK活性。
图18.显性失活MyD88在巨噬细胞中的表达诱导IRAK磷酸化通过在5％FCS RPMI中加入100ng/ml M-CSF 2-3天，从外周血单核细胞分化出人巨噬细胞。也使用在5％FCS DMEM中培养的HELA细胞。这两种细胞类型或者保持不感染，或者在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒、编码野生型MyD88的腺病毒和编码显性失活MyD88的腺病毒(AdMyD88lpr)感染。使用感染复数100。在5分钟或12小时后，裂解细胞，使用蛋白质印迹分析测定提取物中的IRAK和磷酸-IRAK。在HELA细胞中，发现显性失活MyD88(MyD88-lpr)的表达抑制IL-1诱导的IRAK激活。然而，未曾预料到的是，显性失活MyD88表达诱导人巨噬细胞中不因加入LPS而增加的IRAK活性。该发现提示MyD88活性也是巨噬细胞(而不是HELA细胞)中抑制IRAK磷酸化的抑制信号所需的，它的阻断导致IRAK激活。
图19.显性失活MyD88在巨噬细胞中的表达诱导IκBα磷酸化通过在5％FCS RPMI中加入100ng/ml M-CSF 2-3天，从外周血单核细胞分化出人巨噬细胞。所述细胞在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒或编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。使用感染复数100。24小时后，裂解细胞，使用蛋白质印迹测定磷酸-IκBα。未曾预料到的是，显性失活MyD88的表达在人巨噬细胞中诱导IκBα磷酸化。
图20.在缺乏任何刺激的情况下，显性失活MyD88而不是野生型MyD88在巨噬细胞中的表达诱导TNFα、IL-6和IL-8产生。
通过在5％FCS RPMI中加入100ng/ml M-CSF 2-3天，从外周血单核细胞分化出人巨噬细胞。然后所述细胞或者保持不感染，或者在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒、编码野生型MyD88的腺病毒和编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。使用感染复数100。(a)48小时后，收集上清，测定在缺乏任何其它刺激的情况下TNFα、IL-6和IL-8细胞因子的产生。在编码显性失活MyD88的细胞中可以检测到细胞因子产生，而在编码野生型MyD88的细胞或对照细胞中检测不到细胞因子产生。这提示在巨噬细胞中阻断MyD88活性导致细胞激活和释放炎性细胞因子，这与在树突细胞中一样，而与HSF或HUVEC不同。(b)在表达0小时、4小时、24小时和48小时，收集上清，通过ELISA测定TNF、IL-6和IL-8。仅显示了得自编码显性失活MyD88(MyD88-lpr)的细胞的结果，因为对照细胞或编码野生型MyD88的细胞有本底水平的细胞因子表达。
具体实施例方式
材料和方法1.试剂人重组GM-CSF和TNFα分别由Glenn Larsen博士(GI)和D Tracey博士(BASF)馈赠。人重组IL-4购自R&D System(Minneapolis，USA)。PMA、LPS和离子霉素得自Sigma Chemical Co.(St Louis，USA)。蛋白体抑制剂Cbz-Ile-Glu(O-叔丁基-Ala-ceremal(PSI)得自Calbiochem(Nottingham，UK)。M-CSF得自Genetics Institute(Boston，USA)。
2.制备外周血单核细胞对得自健康志愿者(North London Blood Trahsfusion Service，Colindale，UK)的白细胞提取(leukopheresis)残余物进行密度离心，获得外周血单核细胞(PBMC)。肝素化残余物用HBSS稀释2倍，取25ml小心地覆盖在50ml无菌管中的等体积Ficoll-Hypaque lymphoprep(Nycomed，Oslo，Norway)上，然后室温下于2000rpm离心30分钟。离心后，收集分界层，用HBSS洗两次(在2000rpm离心10分钟)。然后收集PBMC并将其重悬浮于30ml含5％FCS的RPMI。
3.分离外周血T细胞和单核细胞以及培养HeLa细胞将PBMC在Beckman JE6淘析器中进行细胞分离后，获得外周血T细胞和单核细胞。在含1％FCS的RPMI(淘析培养基)中进行淘析。使用抗CD45、CD3、CD14和CD19的荧光染料缀合抗人单克隆抗体(Becton Dickinson，Oxford，UK)通过流式细胞术，评价淋巴细胞和单核细胞的纯度。T淋巴细胞部分通常包含约80％表达CD3的细胞、约6％表达CD19的细胞和＜1％表达CD14的细胞。单核细胞部分通常包括＞85％表达CD14的细胞、＜0.5％表达CD19的细胞和＜3％表达CD3的细胞。HeLa细胞维持在5％FCS，1％青霉素/链霉素DMEM中。
4.用M-CSF使单核细胞分化以进行腺病毒感染为优化腺病毒感染，将新鲜淘析的单核细胞以1×106细胞/ml在含100ng/ml M-CSF(Genetics Institute，Boston，USA)的10cm培养皿(Falcon，UK)中培养。2-3天后，用PBS洗涤，除去未贴壁的细胞，余下的贴壁单核细胞用10ml细胞解离溶液(Sigma，UK)在37℃孵育1小时。所述细胞悬浮液在含5％FCS的RPMI中洗两次，通过锥虫蓝排除评价细胞生存力(90％)。根据FACS染色，该阶段的细胞99％是CD14阳性，所述细胞以1×106细胞/ml在24孔或48孔平底组织培养板(Falcon，UK)中培养以进行进一步的实验。
5.使单核细胞分化为树突细胞将新鲜淘析的单核细胞以1×106细胞/ml在10cm培养皿(Falcon，UK)中培养5-6天，培养基为补充了50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的5％FCS RPMI。在第3天，补充细胞因子。与直接从血或骨髓前体分化出树突细胞相比，本方法有几个好处。除容易和产生大量细胞外，该方法产生具有稳定“未成熟DC”表型的均一细胞群体。通过在所述DC中加入TNFα(10ng/ml)、LPS(100ng/ml)或单核细胞条件培养基(50％体积比)再培养2-3天，促进该表型至成熟。
6.单核细胞条件培养基临用前通过加入5ml人γ球蛋白(10mg/ml，Sigma Chemical Co.)10分钟，制备Ig包被的平板(100mm，Falcon)。平板使用前用RPMI 1640培养基(无血清)洗三次。经淘析的单核细胞(3×107)以7ml的体积覆盖所述Ig包被的平板1小时。洗去未贴壁的细胞，用新鲜完全RPMI培养基在37℃下培养γ球蛋白粘附的细胞24小时。
7.腺病毒载体和它们的繁殖A.Byres博士和M.Wood博士(Oxford University，UK)提供编码大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶(Adβ-gal)或没有插入片段(Ad0)的重组复制缺陷型腺病毒载体。通过AdTrack与B.Vogelstein教授(The HowardHuges Medical Institute，Baltimore，MD)提供的AdEasy-1腺病毒质粒双重重组，产生表达GFP的腺病毒(AdGFP)。从Xu博士(University ofTexas，Southwestern)和K.Burns博士(Lausanne，Switzerland)提供的质粒产生AdMyD88wt和AdMyD88lpr。具体地说，使用pAdTrackCMV产生AdMEKK-1wt，而使用名为AdTrack.CMVKS17的pAdTrack.CMV载体衍生物产生AdMyD88wt和AdMyD88lpr。如下构建pAdTrack.CMVKS17除去AdTrack.CMV的EcoRI位点及其多克隆位点(MCS)，并插入载体pBCSK(+)(Stratagene)的更大的多克隆位点。在通过热休克方法用1μg线性化pAdTrack.CMV-MEKK1wt、AdTrack.CMVKS17-MyD88wt或AdTrack.CMVKS17-My88lpr构建物和100ng复制缺陷型腺病毒载体pAdEasy-1转化的BJ5183细菌细胞中产生重组病毒。通过卡那霉素抗性选择阳性重组克隆。选择后，使用提取的DNA在293人胚肾细胞中进行病毒繁殖。通过两个氯化铯梯度起速离心纯化病毒；如He等(He T.C.等(1998).Science 2811509-12)所述。如下在HEK 293细胞中通过噬菌斑测定确定病毒贮液的滴度在无血清DMEM培养基(Gibco BRL)中暴露1小时，随后用(1.5％)琼脂/(含4％FCS的2xDMEM)混合物(体积比1∶1)覆盖，培养10-14天。(HeT.C.等(1998).Science 2811509-12)。
9.腺病毒感染细胞收集M-CSF分化的巨噬细胞和未成熟或成熟的树突细胞，计数并重新接种。然后所述细胞在无血清RPMI中用过量表达目的基因的复制缺陷型腺病毒感染。对于巨噬细胞和未成熟DC使用感染复数100，对于成熟DC使用感染复数300。2小时后，除去病毒，将细胞在完全培养基中继续培养1-2天以过量表达目的基因。然后所述细胞用于其它实验。
10.建立抗原特异性T细胞系绿荧光蛋白购自Clontech。为建立抗原特异性多克隆T细胞系，将1×106PBMC/ml与抗原(使用绿荧光蛋白时是1μg/ml，使用破伤风类毒素时是5μg/ml)培养7天，然后用20ng/ml IL-2再培养10-14天。每4天补充IL-2。这导致PBMC中抗原特异性T细胞的扩充和大多数其它细胞群体的细胞死亡。培养17-21天后，进行再刺激步骤将所述T细胞与照射处理的自体PBMC以1∶1的比例在存在新鲜抗原、缺乏IL-2的情况下培养。4天后，加入IL-2，再培养10-14天。该再刺激步骤重复至少4次，然后应用抗原特异性T细胞于其它实验。
11.抗原特异性T细胞的增殖测定为评价抗原特异性T细胞系的特异性，将1×105抗原特异性T细胞与1×105照射处理的自体PBMC和各种浓度的抗原在96孔平底微量滴定板中培养。3天后，细胞用[3H]胸苷脉冲处理过夜，第二天收获细胞。
为测量树突细胞诱导的抗原特异性T细胞增殖，将1×105抗原特异性T细胞与剂量逐级变化的照射处理过或丝裂霉素处理过的树突细胞一起培养，所述处理过的树突细胞未经脉冲处理过、用抗原脉冲处理、未感染或用腺病毒感染。2天后测量[3H]胸苷掺入。所有抗原特异性增殖测定都一式三份进行。
12.混合淋巴细胞反应(MLR)为测定未照射处理或照射处理过(137Cs源，3000rad)的DC的免疫刺激能力，将未感染、腺病毒感染、LPS处理或单核细胞条件培养基处理的DC以逐级增加的剂量与1×105异源淘析的T细胞在96孔平板微量滴定板(Falcon)中培养，一式四份。第5天用[3H]胸苷(0.5μCi/孔；Amersham Life Science，UK)脉冲处理16小时后，通过胸苷掺入测定增殖。
13.细胞因子分析细胞用溶媒或1μM PSI预处理4小时，或用腺病毒载体感染2小时。然后PSSI处理的DC直接用于下面实验，而感染的细胞再培养2天，使得过量表达所述相关蛋白。刺激所述细胞后24小时，收集培养物上清并冻存。用针对TNFα、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12和IFNγ的特异性单克隆抗体和多克隆抗体，通过标准2层或3层夹心ELISA技术测定细胞培养物上清中的细胞因子水平。这些测试所用的抗体对和标准购自Pharmingen，只有IL-12试剂由Genetics Institute(Boston，USA)馈赠。
14.免疫荧光染色和流式细胞术分析为进行FACS染色，首先收获细胞。对于需要保持表面受体完整的贴壁细胞，在37℃使用温热的2％EDTA的PBS溶液20分钟。细胞处于溶液中后，洗涤细胞一次，然后重悬浮于冰冷的FACS洗涤缓冲液。所有随后的孵育均在4℃下进行。为进行每项分析，5×105细胞与相关抗原特异性抗体或同种型对照一起孵育30分钟，然后用FACS洗涤缓冲液洗涤两次。然后通过流式细胞术检查细胞。使用CellQuest(Becton Dickinson)准备细胞以在FACScan流式细胞仪(Becton and Dickinson)上进行分析。直接缀合于HLA-DR、HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD80、CD86、CD3、CD14和CD25的单克隆抗体购自Pharmingen，San Diego，USA。
15.制备胞质蛋白提取物制备胞质提取物，通过蛋白质印迹研究涉及信号转导的生物化学事件。将贴壁细胞从组织培养板/瓶刮到新鲜PBS中，离心收获(在4℃ 13000g 10秒钟)。相似地通过离心沉淀未贴壁的细胞并用新鲜PBS洗一次。弃去上清后，根据需要裂解的细胞数，加入适量的冰冷的低渗裂解缓冲液(Whiteside S.T.等(1992).Nucleic Acids Res 201531-8)(每1×106细胞50-100μl)。裂解液在冰上孵育10分钟后，离心(13000g，5分钟，4℃)以除去核和细胞碎片。将澄清的裂解液转移到新鲜试管，冻存于-20℃，用于随后估计蛋白浓度以及在蛋白质印迹中使用。
16.制备核蛋白提取物制备核蛋白提取物以研究NF-κB激活和从胞质到核的转运以及其DNA结合活性。在低渗裂解缓冲液中裂解细胞(参见上节)后，离心(13000g，5分钟，4℃)沉淀核，所述核在低渗裂解缓冲液中洗一次，除去污染的胞质蛋白，然后4℃搅拌下重悬浮于高渗提取缓冲液1-2小时。低渗裂解缓冲液防止裂解时蛋白从核中滤出，而高渗提取缓冲液使核膜能渗透，使核蛋白能够进入溶液内。离心(13000g，10分钟，4℃)后，将包含核蛋白的上清转移到新鲜试管中，保存于-70℃。该制备核提取物的方法是基于Whiteside S.T.等(1992).Nucleic Acids Res 201531-8的方法。
17.免疫沉淀为免疫沉淀IRAK，将胞质提取物与3μg抗IRAK抗体在温和振摇下于4℃温育1小时。然后加入50μl 50％浆液蛋白G琼脂糖(Amersham)，再振摇2小时。随后收集结合蛋白G琼脂糖的IRAK，洗涤四次，重悬浮于蛋白质印迹加样缓冲液中，煮沸5分钟，然后立即用于蛋白质印迹。
18.蛋白浓度测定在使用胞质提取物或核提取物于任何其它实验性程序(如蛋白质印迹、电泳迁移率变动分析)前，有必要测定它们的蛋白浓度以保证每份样品中存在等量蛋白。通过Bradford测定评估蛋白浓度。简要地说，将20μl合适稀释的提取物加入96孔组织培养板中，一式三份，另外板上还加入20μl用作标准的一系列浓度范围为10-1000μg/ml的BSA(Sigma，UK)。然后在每个孔中加入200μl Bradford试剂，用分光光度计(Multiscan Bichromatic，Labsystems)在595nm测定吸光度。根据BSA浓度范围形成的线性标准曲线，测定胞质提取物和核提取物中的蛋白量。
19.蛋白质印迹分析和电泳迁移率变动分析通过SDS-PAGE在10％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上分离胞质蛋白，然后电转移到硝酸纤维素膜上。使用分别购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，USA)和Upstate Biotechnology(USA)的抗体测定IκBα和IRAK，使用从New England Biolabs获得的抗体检测磷酸化形式的IκBα、p38和p42/44 MAPK。
结果1.PSI抑制DC的免疫刺激功能PSI是一种蛋白体活性抑制剂，同样能够抑制诱导的IκB降解和随后的NF-κB激活。我们使用PSI来检查NF-κB在树突细胞(DC)活性中的功能，尤其是在与抗原呈递和T细胞激活有关的活性中的功能。我们以前已经表明PSI能够在浓度达到1μM时抑制NF-κB激活。为测试PSI对DC生存力的影响，用浓度范围从0.1μM到5μM的PSI孵育成熟DC。根据碘化丙锭(PI)染色方法判断，＞5μM的浓度显示出某些毒性(图1)，因此功能性研究仅在0.1到2μM的范围内进行，在大多数实验中使用1μM。为评价NFκB在DC功能中的作用，用0.3μM、0.5μM或1μM PSI孵育成熟DC 3小时，然后洗涤细胞。由于PSI是不可逆结合蛋白体的已激活肽，因此可以在MLR的6天时间内评价DC的功能，而不受短时间药物暴露的影响。
在异源MLR测定中T细胞暴露于PSI处理的DC(PSI-DC)对于淋巴细胞的应答有深刻影响，该影响可随PSI浓度逐渐增强(titrabale)。已经发现当用0.1μM PSI预处理DC时没有可检测的效应，而0.5μM和1μM导致T细胞不能应答激活而增殖(图2)。
2.PSI减少涉及抗原呈递的分子在表面表达在MLR中T细胞识别II类HLA抗原，其中HLA-DR是最丰富的，因此在PSI处理后6天评价其表达。在0.1μM PSI观察到对DR的最小效应(通过FACS)，而在1μM观察到大的降低(图3)。CD86是在DC上表达的主要共同刺激分子，其表达也减少，在1μM PSI时基本上降低到背景的水平(图3)。
3.IL-2抗体或抗CD28抗体不可拯救用PSI处理的树突细胞抑制的MLR。
关于T细胞对PSI-DC增殖性应答低的机制有两类大的可能性。第一类可能性是这些DC不是刺激性的，因此所述T细胞没有作出反应。第二类可能性是所述T细胞已经被耐受或主动免疫调节过程主动“关闭”。为区别这些可能性，我们尝试用IL-2或抗CD28以浓度(2ng/ml IL-2或10μg/ml抗CD28)刺激所述T细胞。
在接种T细胞和DC的同时加入IL-2或抗CD28。在第6天评价增殖，揭示IL-2对于恢复增殖的效应非常轻微，然而该结果不依赖于DC的数目并且与PSI处理无关(图4a)。
对于未经处理的DC观察到同样程度的免疫刺激(图4b)。抗CD28没有恢复性效应，而考虑到PSI对主要CD28配体CD86的下调节作用，这也是已经预料到的。这些结果与多种机制一致，因此进行其它实验。
4.用PSI预处理的DC抑制DC诱导的MLR一种检测PSI-DC是否产生抑制效应的方法是将PSI处理的DC和未经处理DC的混合物与T细胞一起培养。假如PSI-DC仅仅是没有刺激性的，那么PSI处理的DC对于增殖反应的效应应该最小。然而，根据增殖反应曲线的斜率判断，发现低至1/8或1/4 PSI-IDC的存在导致反应降低至1/3-1/5(图5)。随后我们研究暴露于PSI-DC是否会诱导T细胞长期无应答性。T细胞如以前所述暴露于正常DC或PSI-DC，然后收集T细胞，用DC处理所述T细胞第二次，并测量增殖性反应(图6)。暴露于正常DC的T细胞在两个事件中都反应，而如预期的，T细胞对两轮PSI-DC都不反应。然而，在用正常DC刺激前已经用PSI-DC刺激的T细胞也不能反应(图6)。这指出暴露于PSI-DC的效应是持续的，并且所述T细胞达到了无应答性或无反应性状态。如预期的，在暴露于正常DC后第二轮暴露于PSI-DC的T细胞无法增殖。
5.暴露于PSI处理的树突细胞的T淋巴细胞的细胞表面抗原分析为研究PSI处理的DC的效应机制，我们在培养6天后分析T淋巴细胞。如预期的，T细胞产量更低。CD3的细胞表面表达降低。然而，最具戏剧性的，是CD25表达显著减少，与对照相比事实上被消除(图7)。
分析涉及细胞表面粘附的分子的表达，例如CD11a(LFA-1)以及其一种受体ICAM-1CD54的表达。这两种分子的表达在PSI处理的淋巴细胞上都减少，CD54的表达降低到类似于CD3的程度，而CD11a的表达仅稍稍降低(图7)。
6.T细胞暴露于PSI-DC导致产生IL-4，而不产生IL-2或IFNγ产生细胞因子是T细胞对DC刺激的关键应答之一，其中表达IL-2、IFNγ和IL-4(图8)。因此我们研究暴露于PSI-DC所发生的应答类型。在对PSI-DC应答时并未产生IL-2和关键的Th1细胞因子IFNγ。然而，IL-4的产生不受影响。该数据提示PSI-DC能够传递一些信号到T细胞。这支持我们前面的观察，即PSI-DC诱导T细胞中一种类型的无应答性状态，据信该类型需要一种活性信号。
7.PSI抑制DC产生TNF而不抑制产生IL-8我们还研究了PSI对DC在随后的MIR中产生细胞因子的影响。在MIR期间，TNF和IL-6表达受到PSI-DC的抑制，而IL-6受到抑制的程度较低。与此不同，IL-8表达不受影响(图9)。类似于在T细胞上的结果，该结果显示PSI处理的鉴别性质，并指出NFκB在TNF和IL-6表达中有作用，而在IL-8表达中没有作用。
8.用MEKK1激活DC导致MLR反应增强。
由于对NFκB的抑制抑制了DC功能，因此研究使用刺激NFκB的MEKK可能激活DC的效应。用编码MEKK1的腺病毒(activatingencoding MEKK1)以感染复数150∶1感染DC。当在MLR中使用时，这样的MEKK1 DC的活性比正常DC强4倍(图10)。
9.Myd88lpr激活NF-κB我们已经发现一种NF-κB的有效诱导剂是名为Myd88lpr的Myd88的突变蛋白，所述突变蛋白包含头53个氨基酸的缺失和一个点突变Phe56Asn。Myd88lpr通常抑制Toll相关受体信号传递，例如IL-1受体(1)。然而，我们观察到通过腺病毒载体将Myd88lpr引入未成熟DC，诱导核NF-κB活性的有效激活，该激活在用Admyd88感染后6小时可检测到，在感染时24小后更强烈(图11)。
10.Myd88lpr诱导未成熟DC产生TNF至于MEKK1，我们希望研究Myd88lpr是否也激活DC功能。用AdMyd88lpr感染未成熟DC，导致感染后24小时所述细胞自发产生TNF。此外，Myd88lpr对于LPS诱导的TNF产生没有抑制效应。Myd88wt并不在DC中诱导TNF产生(图12)。
11.Myd88lpr增强DC的抗原呈递由于对NF-κB的抑制抑制了DC功能，因此研究使用刺激NF-κB的Myd88lpr有效激活DC的效应。用AdMyd88lpr(也表达GFP)、Ad0或AdGFP(绿荧光蛋白)感染未成熟DC。24小时后，用2×104GFP抗原特异性T细胞与各种浓度的受感染DC一起培养，在三天时测量作为T细胞增殖的反应。传递GFP到树突细胞诱导抗原特异性T细胞增殖，Myd88lpr增强该增殖(图14)。该结果与以前述图(图11和12)中所示的Myd88lpr激活NF-κB和TNT产生的结果一致。
12.Myd88lpr也增强DC诱导的异源混合淋巴细胞反应(MLR)NF-κB活性作用于DC的效应的另一项测试是研究MLR反应。用Ad0和Admyd88lpr感染未成熟DC，48小时后，将剂量逐级增加的感染DC与105异源T细胞一起培养，培养六天后测量表现为增殖的反应。用AdMyd88lpr感染比用Ad0感染或未感染细胞有更强的MLR反应。这一点在DC数目较低时最为显著，其中对照的反应仅相当于仅有T细胞的反应，其中表达Myd88lpr的DC反应更高(图15)。
13.Myd88lpr表达增强共同刺激分子CD80和CD86的表达细胞表面分子CD80和CD86的表达对于DC的抗原呈递功能是重要的。在图16中，我们显示与未感染的DC或感染对照病毒的细胞相比，Myd88lpr在DC中的表达(通过腺病毒感染)增强CD80和CD86两者的表达。
14.除NF-κB外，My88lpr也激活其它信号分子我们已经显示Myd88lpr是NF-κB的有效诱导剂。我们也观察到该分子能够激活其它信号途径，这次是在巨噬细胞中，例如p38MAPK，这是一种已知涉及细胞机制例如控制细胞因子表达的激酶(图17)。此外，Myd88lpr在巨噬细胞中还激活IRAKK1，IRAK1是TLR和IL-1R信号机制的关键成分(图18)。
参考文献1.Burns，K.，F.Martinon，C.Esslinger，H.Pahl，P.Schneider，J.LBodmer，F.Di Marco，L.French和J.Tschopp.1998.一种涉及白细胞介素-1信号的衔接蛋白MyD88.J Biol Chem 273，第20期12203.
讨论用蛋白体抑制剂PSI以能够阻断NFκB诱导的浓度处理DC，显示出降低MLR中的增殖性反应。这提示NFκB功能涉及在MLR中刺激未接触过抗原的T细胞。由于PSI的特异性是针对蛋白体的，因此它有可能影响其它转录因子的功能，虽然这一点未曾在描述该药物作用的原始出版物中报道(Traenckner等(1994)EMBO J.13，5433-5441；Traenckner和Baeuerle(1995)J.Cell Sci.增刊19，79-84；和Haas等(1988)J.Leukoc.Biol.63，395-404)。需要使用其它方法的其它独立实验来证实NFκB的作用，而我们已经启动了使用在CMV启动子控制下过量表达IκBα的腺病毒感染DC的研究。这种IκBα过量表达抑制NFκB，也抑制树突细胞的抗原呈递功能(Yoshimura等，未公开的数据)，这与本文提出的数据一致。
在不同水平上评价了PSI处理的DC降低免疫原性的机制，并且证明是DC中抗原呈递细胞功能的多个方面受到下调节。首先，研究了对于DC用以刺激T细胞的细胞表面分子表达的影响，并且发现HLA-DR和CD86的表达显著降低，这两种分子对于抗原识别和CD28激活都是重要的。还发现DC产生的细胞因子如IL-12和TNFα减少，这两种细胞因子已知在早期激活T细胞中是重要的。与此不同，在T细胞/DC共培养物中其它细胞因子如IL-6或IL-8的产生没有改变。这些结果指出PSI处理的DC降低了涉及抗原呈递的所有三大类分子的表达，这三大类分子是T细胞识别靶(HLA-DR)、共同刺激分子(CD86)以及免疫刺激性细胞因子(IL-12和TNFα)。
解决了关于缺乏T细胞增殖性反应的机制的其它问题。这可能仅仅是由于DC缺乏免疫原性，或者可能是由于诱导一种免疫耐受性形式或一种免疫调节形式。通过共培养实验进一步分析了该机制，将PSI处理的DC加入未经处理的DC中，分析该混合物在MLR中对未接触过抗原的T细胞的效应。发现假如将少至1/8(12.5％)的PSI处理的DC加入未经处理的DC中，那么在增殖剂量反应曲线上将有显著降低，相当于活性DC的1/3到1/5。该结果以及IL-2和抗CD28不能刺激这些T细胞的事实(数据未显示)，表明PSI处理的DC对于T细胞功能有抑制(免疫调制)效应。此外，T细胞暴露于PSI处理的DC，诱导T细胞表面标记表达的深刻变化，在共培养第6天分析CD3表达降低，事实上消除了CD25，ICAM-1和LFA-1有一些减少。在多个耐受性模型中已经报道了相似的效应Zanders等(1983)Nature 303，625-627；Zanders等(1985)J.Immunol.15，302-305；Park等(1997)Eur.J.Immunol.15，302-305；和Waldmann和Cubbold(1998)Ann.Rev.Immunol.16，619-644，因此我们怀疑PSI处理的DC是否诱导免疫耐受性。如下进行评价首先将异源T细胞暴露于PSI处理的DC2天，然后通过用抗CD83和抗CD86淘析，除去所述DC细胞。所述T细胞然后暴露于来自同一供体的正常DC/或PSI处理的DC4天，而它们缺乏反应证明至少已经诱导了“长时间持续的”(4-6天)免疫耐受性。耐受性的正式定义包括“抗原特异性”，这一点无法在该类实验中正式测试，但在后面使用对可溶性抗原破伤风类毒素应答的T细胞系的一系列独立实验中证实了这一点(Calder等，数据未公开)。然而，本文中的术语“免疫耐受性”是合适的，因为用来自同一供体的DC进行再次攻击。
在另一组实验中，进一步评价了暴露于PSI处理的DC的T细胞的功能。T细胞的细胞因子产生被显著改变。由此IL-2产生受到的抑制超过90％，IRNγ产生也是如此，这些发现也与诱导耐受性一致。IL-2和IFNγ是“Th1”细胞因子，令人感兴趣的是“Th2”细胞因子IL-4的表达没有改变。这暗示由PSI处理的DC诱导的免疫抑制效应/耐受性诱导局限于Th1亚组(subset)。需要用纯化的Th1和Th2T细胞的进一步研究来说明这一点。
本文报道的研究以及使用过量表达内源NFκB抑制剂IκBα的腺病毒的其它实验(Yoshimura等，数据未公开)指出NFκB在调节抗原呈递中有重要作用。这与以前的发现一致，即NFκB对于DC成熟是必不可少的(Rescizno等(1998)J.Exp.Med 188，2175-2180)。这也与下面概念一致NFκB是先天免疫翻译成适应性免疫的主要机制。因此，通过多种微生物因子或其它有害因子激活的、激活免疫系统的所谓“危险信号”(Matzinger(1994)Ann.Rev.Immunol 12，991-1045；Janeway等(1196)Curr.Biol.6，519-522)看起来涉及NFκB的激活。对于需要TLR4去诱导NFκB激活的LPS已经确认了这一点(Chow等(1999)J.Biol.Chem.274，10689-10692)。
在抗原呈递的调节中，值得注意的是NFκB协调调节所有3个方面，即T细胞靶(MHC)、共同刺激分子(CD86)以及诱导性细胞因子(IL-12、TNFα)的表达。这得出明显的预期，即阻断NFκB的药物(如PSI)，可能是有用的体内免疫抑制剂，显然这取决于它们的毒性分布型。PSI对于系统性应用可能毒性太强，因此不能用于灌注靶器官如肾，以在移植前阻断APC功能。这项研究一个有趣的推论是有意激活NFκB可能是为疫苗提供有用的辅助效应的好策略。测试该假说的实验正在进行中。
正在进行其它研究，以进一步分析PSI处理的DC影响T细胞功能的准确机制1.阻断抗原呈递细胞中的NF-κB抑制T细胞功能，其中使用PSI或其它蛋白体抑制剂如，或者其它NF-κB抑制剂如cDNA抑制剂如IκB、NF-κB组分的反义分子、药物抑制剂如2.在DC中阻断NF-κB诱导T细胞中的耐受性3.将NF-κB抑制剂应用于)自身免疫)移植)变态反应4.推论-假如NF-κB抑制阻断抗原呈递并促进耐受性，那么NF-κB刺激将上调节抗原呈递。这可以通过多种可能的途径完成，其中激活刺激NF-κB的途径以增强免疫。这些包括使用腺病毒或MEKK1、NIK、IKK2、MyD88的显性失活突变体、TRAF2、TRAF6的其它基因转移法。可以将这些序列加入与编码需要的免疫所针对的抗原的构建物相同的遗传构建物中。NF-κB刺激也可用于调节变态反应患者体内的免疫反应，以改变TH1:TH2反应平衡倾向于TH1反应。
我们认为，结果表明PSI在DC中产生无反应性状态。即所述药物诱导DC对抗原的长期无应答性状态。
上面观察的推论是通过激活DC内的细胞内信号途径如NF-κB，人们将能够激活所述细胞并增强抗原呈递功能。我们使用激活NF-κB的细胞内信号分子MEKK1和Myd88lpr，测试了这一点。先前已经描述了MEKK1是多种其它途径中NF-κB的激活剂，根据MLR测量，使用腺病毒载体将MEKK1引入DC诱导DC功能的激活。
我们还观察到，Myd88的一种突变蛋白Myd88lpr(通常是TLR和IL-1受体信号的抑制剂)也在DC中激活NF-κB。当Myd88lpr在DC中表达时，根据MLR测量、或使用抗原特异性T细胞测量以及诱导细胞因子产生测量，Myd88lpr增强DC抗原呈递功能。这些结果产生了这样的可能性当细胞内信号分子如NF-κB与抗原结合时，可以作为强有力的佐剂。这可以提供疫苗设计的一种新方法。Myd88lpr也激活p38MAPK的事实暗示激活DC的其它信号分子也可用于该目的。
权利要求
1.NF-κB抑制剂或包含编码NF-κB抑制剂的核酸的载体在生产药物方面的应用，所述核酸与表达所述核酸所必需的调节元件有效连接，所述药物通过给予哺乳动物从而在哺乳动物体内抑制抗原呈递或诱导无变应性反应，其中还给予所述哺乳动物一种抗原性分子或编码一种抗原性分子的多核苷酸。
2.依照权利要求1的应用，其中所述载体是一种腺病毒或慢病毒。
3.依照任一项前述权利要求的应用，其中所述抑制剂为IκBα或PSI、或IKK2显性失活突变体。
4.依照权利要求1或2的应用，其中所述抑制剂为有效抗至少一部分NF-κB的反义核酸。
5.依照权利要求1或2的应用，其中所述抑制剂为一种抗体或其能够结合NF-κB的Fab、(Fab)2或Fv片段，或者为一种编码所述抗体或其Fab、(Fab)2或Fv片段的cDNA。
6.依照权利要求1的应用，其中所述药物包含APC，该APC在体外暴露于所述抑制剂或诱导剂。
7.一种编码抗原性分子和NF-κB抑制剂的多核苷酸。
8.一种配套组件或组分，其包含(1)一个调节部分，其构成或编码一种NF-κB抑制剂，和(2)一个抗原性部分，其构成或编码一种抗原性分子。
9.依照权利要求1的应用，其中所述抗原性分子包含在转化细胞或癌细胞上或在致病生物上存在的表位，或包含在致病生物感染的细胞上存在的表位，或者包含在早老性痴呆或海绵状脑病中表达的多肽。
10.依照权利要求7和8任一项的多核苷酸、配套组件或组分，它们用于医药。
全文摘要
公开了使用NF－κB诱导剂激活免疫应答、使用NF－κB抑制剂诱导无反应性应答、以及通过给予NF－κB激活剂或抑制剂而抑制或激活免疫应答。NF－κB抑制剂的例子包括IκBα、PSI、编码IκBα的核苷酸序列、编码NF－κB序列(如Rel B)的反义核酸以及抗NF－κB抗体。NF－κB诱导剂的例子包括NIK、MEKK、IKK2、TRRF2和Rel B。还公开了编码NF－κB诱导剂和抑制剂的载体，例如腺病毒载体。
文档编号A61P37/04GK1817367SQ20061005152
公开日2006年8月16日 申请日期2000年12月22日 优先权日1999年12月24日
发明者B·福克斯维尔, M·菲尔德曼 申请人:辛诺维斯有限公司