毒素-免疫系统的制作方法

专利名称：毒素-免疫系统的制作方法
毒素-免疫系统交叉申请本申请要求2009年12月16日提交的美国临时专利申请系列No. 61/286, 899的优先权，将其通过引用整体并入本文。
美国政府权益的声明此工作部分由NIH资金No. Al080609资助,及美国政府在本发明中具有特定权利。背景技术：
阴性选择标记物和它们在克隆载体及克隆技术中的应用在分子生物学领域具有大的价值,特别是可用于任何细胞类型的此类载体。文献中的表达毒性蛋白’或“死亡基因”的多数基因，仅在原核生物系统中发挥功能。该基因的例包括rpsL, tetAR, pheS, t'hyA, IacY, gat.a-1, ccdB和sacB。本文公升的本发明提供在细菌和真核生物细胞中有活性的优势，使得本文公开的全部实施方式可作为细胞系统领域的本领域普通技术人员会利用的程度利用。抗生素抗性基因是发酵过程中使用的最常见的可选择的标记物，以避免无质粒的细胞过度生长培养物。但是抗生素是昂贵的化合物，且它们，或它们的降解产物，可混杂生物质或产生产物。这些混杂是自工业,医疗和调控角度无法接受的。因而’当使用抗生素时，必需展示，最终产物是“无抗生素的”。残留的抗生素水平和如果必需它们的去除的评定也是昂贵的过程。由于这些情况,工业中的当前趋势是在生产过程中完全放弃抗生素。生物学剂经历的增加的调控需求会在工业蛋白表达和生产领域具有大冲击。在不远的将来，期望对基于抗生素的选择和生产系统可为"0耐受性〃。除了抗生素本身之外，抗生素抗性基因是重要考虑。抗生素-抗性基因的完全缺失是唯一方式确保环境中无繁殖或抗性转移到病原性株。发明概述在第I方面，本发明提供重组载体，其包含编码VI型分泌输出蛋白2(Tse2)的第I基因,其中第I基因可操作地连接于异源调控序列。在第2方面,本发明提供重组宿主细胞,其包含根据本发明的任何实施方式的重组载体。在第3方面，本发明提供用于可选择性克隆的方法，包括在适合于Tse2由重组载体的表达或破坏的表达的条件下(如果无插入子存在)培养本发明的任何实施方式的重组宿主细胞，并选择那些由于包含具有克隆进表达载体的插入子的重组载体而生长的细胞。在第4方面,本发明提供产生缺乏插入子的克隆载体的方法,其包括在适合于载体复制和Tse2表达的条件下培养本发明的任何实施方式的重组宿主细胞,其中宿主细胞还表达Tse2解毒剂,并从宿主细胞分离载体。在进一步实施方式中，解毒剂包含VI:型分泌免疫蛋白2(Tsi2)。在第5方面，本发明提供重组载体，其包含编码Tsi2的核酸，其中核酸可操作地连接于调控序列。
在第6方面,本发明提供重组宿主细胞,其包含本发明的第5方面的任何实施方式或实施方式的组合的重组载体。在第7方面，本发明提供宿主细胞,其在它们的基因组中包含可操作地连接于调控序列的编码VI型分泌输出蛋白2(TSe2)的第I重组基因。在一实施方式中，宿主细胞还包含编码Tse2的解毒剂的第2重组基因,其中第2基因可操作地连接于调控序列。在一实施方式中，编码解毒剂的第2重组基因可,诸如在质粒或病毒中为附加型。在进一步实施方式中，解毒剂包含VI型分泌免疫蛋白2(Tsi2)。在第8方面,本发明涉及试剂盒，其包含被区划以在其中接收及保持至少一个容器的载体或容具，其中第I容器含有线性或环状DNA分子,其包含具有至少一个Tse2基因序列的DNA片段的载体，如本文所述。在另一实施方式中，试剂盒中含有的载体具有至少一个Tsi2基因序列的DNA片段,如本文所述。在另一实施方式中，试剂盒含有一种或更多具有至少一个Tse2序列的DNA片段的载体和具有至少一个Tsi2序列的DNA片段的载体。


图I.鉴定H1-T6SS底物的基于MS的筛选的概观和结果。(A)铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) HS]-1的基因组织。此工作中操作的基因以彩色显示。T6SS的活性可通过PPPA和clpVl的缺失来调节。自特定的遗传背景的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株的细胞-关联的(细胞)及浓缩的上清(Sup)蛋白级分中Hcpl-V的蛋白印迹分析。亲本株的遗传背景在以下以印迹显示。将针对RNA聚合酶a (a-RNAP)的抗体在此和随后印迹中用作装载对照。(C)pppA的缺失导致增加的p-Fhal-V水平。通过蛋白印迹观察p-Fhal-V为一种或更多具有延缓的电泳运动性的物质。(D) A pppA和A clpVl的比较性半-定量分泌蛋白质组分析的Rl和R2中检测的Cl蛋白的光谱计数比。指示以两个重复的Hcpl的位置。虚线之内的蛋白具有< 2倍的SC比及构成89%的Cl蛋白。图2. 2种VgrG-家族蛋白由retS调控及以HI-T6SS-依赖性方式分泌。(A)编码Rl和R2中鉴定的C2蛋白的遗传座位的概观(绿色)。提供由Goodman等人测定的各ORF的RetS调节(Goodman et al. ,2004)。不被RetS显著调控的基因填充灰色。(B和C)展示VgrGl-V(B)和VgrG4-V(C)的分泌的蛋白印迹分析在ApppA背景中引发且是HI-T6SS (clpVl)-依赖性的。全部印迹针对VSV^G表位(a -VSV-G)。图3. Tse蛋白是紧密调控的H1-T6SS底物。(A) Tse分泌在被pppA的紧密负调节下且是H1-T6SS-依赖性的。用来自pPSV35的C-端VSV-G表位标记融合表达的Tse蛋白的蛋白印迹分析(Rietsch et al.，2005)。除非另外注明，此图中的全部印迹是a -VSV-G0(B)通过蛋白印迹分析测量的染色体-编码的Tsel-V的HI-T6SS-依赖性分泌。(C) Hcpl分泌独立于tse基因。对照株或缺少VgrGl和vgrG4,或3种tse基因的株中Hcpl定位的蛋白印迹分析。(D)形成关键H1-T6S设备复合物不需要tse基因。特定的遗传背景中染色体-编码的ClpVl-GFP定位通过荧光显微镜检测量。TMA-DPH是用来可视化细胞位置的亲脂性染料。(E) Tse蛋白的产生和分泌在A retS中显著增加。来自含有在野生型或A retS背景中制备的染色体-编码的Tse-VSV-G表位标记融合体的株的Tse水平的蛋白印迹分析。注在用来观察AretS中高水平的Tse分泌的条件F，分泌不可在ApppA中可视化，如在⑶中展示。
图4. Tse2和Tsi2蛋白是毒素-免疫模块。(A)在Tsi2缺失下,Tse2对铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)是毒性的。在非-诱导(-IPTG)或诱导(+IPTG)条件下，含有载体对照㈠或含有tse2的载体⑴的指示的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株的生长。(B)Tse2和Tsi2物理学关联。自含有表达tsi2 (对照)或tsi2-V的质粒的指示的株a -VSV-G免疫沉淀之前(前)及之后(后)样品的蛋白印迹分析。糖原合酶激酶(GSK)标签用于检测Tse2 (Garcia et al. ,2006)。图5.异源性地表达的Tse2对原核生物和真核生物细胞有毒性。(A)Tse2对酿酒酵母(S. cerevisiae)有毒性。在非-诱导(葡萄糖)或诱导(半乳糖)条件下，含有载体对照或表达指示的tse的载体的酿酒酵母(S. cerevisiae)细胞的生长。(B)Tsi2阻断酿酒酵母(S. cerevisiae)中Tse2的毒性。带有具有指示的基因的质粒,或空质粒的酿酒酵母(S. cerevisiae),在非-诱导或诱导条件下生长。(C，D和E)转染的Tse2对哺乳动物细胞具有显著的效应。流式细胞术(C)和荧光显微镜检(D)用表达tse基因或tsi2的质粒的GFP报告子共转染实验的分析。测定指示的转染后圆形细胞的百分率(E) (n > 500)。对照(ctrl)实验含有仅报告子质粒。条形图代表自至少3次独立实验的平均数(±SEM) 0 (F和G) tse2的表达抑制大肠埃希氏菌(E. coli) (F)和泰国伯克霍尔德氏菌(B. thailandensis) (G)的生长。将大肠埃希氏菌(E. coli) (F)和泰国伯克霍尔德氏菌(B. thailandensis) (G)用通过分别用IPTG(F)或鼠李糖(G)的诱导性表达调控的,不含有插入子，tse2或者tse2和tsi2座位的表达质粒转化。在温育I(F)或2 (G)天之后,对在固体培养基上的生长成像。图6.对Tse2的免疫提供针对由H1-T6SS分泌毒素的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株的生长优势。(A)由铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的HI-T6SS分泌的Tse2不在HeLa细胞中促进细胞毒性。用指示的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株或大肠埃希氏菌(E. coli)感染后由HeLa细胞的LDH释放。分别作为高度细胞毒性和非-细胞毒性对照包括铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株PA14和大肠埃希氏菌(E. coli)。条代表5次独立实验的平均值土 SEM。(B和C)在液体培养基(B)中或固体支持物(B和C)上指示的基因型的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株之间的体外生长竞争实验的结果。亲本株是AretS。A clpVl和A tsi2-依赖性效应互补,如分别通过+clpVl及+tsi2指示(见方法)。条代表自3次独立实验的平均供体受体CFU比(土 SEM)。发明详述本文引用的全部参考文献通过引用整体并入本文。在本申请中，除非另外陈述，利用的技术可见于任何几种熟知的参考文献，诸如Molecular Cloning A LaboratoryManual (Sambrook, et al. , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), GeneExpression Technology (Methods in Enzymology. Vol. 185, edited by D.Goeddel,1991. Academic Press, San Diego, CA),“Guide to Protein Purification，，in Methodsin Enzymology(M. P. Deutshcer, ed. , (1990)Academic Press, Inc.) ；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, SanDiego, CA)， Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique,2nd Ed. (R.I. Freshnev. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols,PP. 109-128, ed. E. .J. Murray, The Humana Press Inc.，Clifton, N. .J.)，和 Ambion 1998Catalog(Ambion, Austin, TX) 0
如本文所用，单数形式"a" , " an"和"the"包括复数个指示物,除非情景明显另外指示。本文所用的“和”与“或”互换使用，除非另外明确陈述。本发明的任何方面的全部实施方式可组合使用，除非情景明显另外指示。在第I方面,本发明提供重组载体，其包含编码VI型分泌输出蛋白2(Tse2)的第I基因，其中第I基因可操作地连接于异源调控序列。如下列例所述,细胞内Tse2对广范围的原核生物和真核生物细胞有毒性。由此，Tse2可,例如，在原核生物和真核生物中阴性选择克隆中使用。Tse2也可在使用抗生素的选择不适合于实验设计时使用。此系统的使用可避免痕量抗生素在系统中残留。如本文所用基因”是任何能表达叙述的蛋白的核酸，由此包括基因组DNA,mRNA,cDNA,等。 如本文所用，“载体”可为环状载体，诸如\载体，或线性化的载体，诸如线性化的质粒或病毒载体。本发明也涉及载体,其包含一种或更多本发明中使用的和/或在本发明的方法中使用的核酸分子。根据本发明，任何载体可用于构建本发明的载体。尤其是，本领域中知道的载体和可商购的那些(及其变体或衍生物)可根据本发明加工为包括编码一个或更多重组位点的一种或更多核酸分子(或其部分)，或其突变体,片段或衍生物,用于在本发明的方法中使用。该载体可从，例如，Vector Laboratories Inc. ；Promega ；Novagen ；New England Biolabs ；Clontech ；Roche ；Pharmacia ；EpiCenter ；OriGenes TechnologiesInc. ；Stratagene ；Perkin Elmer ;Pharmingen ;and Invitrogen Corp. , Carlsbad，Calif得到。该载体可然后例如用于克隆或亚克隆目的核酸分子。特定目的载体的一般类包括原核生物和/或真核生物克隆载体,表达载体,融合载体,2-杂交体或逆转2-杂交体载体,用于不同宿主的穿梭载体，诱变载体，转录载体等。其他目的载体包括病毒来源载体(Ml3载体,细菌噬菌体.\ 载体,噬菌体Pl载体,腺病毒载体,疱疹病毒载体,反转录病毒载体,噬菌体展示载体,组合库载体)，高、低和可调整的拷贝数载体，具有用于在单宿主中组合使用的相容的复制子的载体(PACYC184和PBR322)和真核生物附加型复制载体(pCDM8)。特定目的载体包括原核生物表达载体,诸如pcDNA II，pSL301, pSE280, pSE380，pSE420,pTrcHisA,B和 C,pRSET A,B和 C(Invitrogen Corp. , Carlsbad,Calif.),pGEMEX-1和 pGEMEX-2(Promega, Inc.), pET 载体(Novagen, Inc.) pTrc99A, pKK223_3, pGEX 载体，pEZZ18, pRIT2T 和 pMC1871(Pharmacia, Inc.), pKK233_2 和 pKK388_l(Clontech,Inc.)和 pProEx-HT(Invitrogen Corp. , Carlsbad, Calif.)和其变体和衍生物。目标载体也可由真核生物表达载体制得，诸如pFastBac, pFastBac HT, pFastBac双，pSFV 和 pTet-Splice (Invitrogen Corp., Carlsbad, Calif.) pEUK-Cl, pPUR, pMAM,pMAMneo, pBIlOl, pBI121, pDR2, pCMVEBNA 和 pYACneo(Clontech), pSVK3, pSVL, pMSG,pCHllO 和 pKK232-8(Pharmacia, Inc.)，p3 ' SS, pXTl, pSG5, pPbac，pMbac, pMClneo 和p()G44(Stratagene,Inc.)和 pYES2, pAC360,pBlueBacHis A,B 和 C, pVLl392,pBsueBac111,pCDM8, pcDNAI, pZeoSV, pcDNA3pREP4, pCEP4 和 pEBVHis(Invitrogen Corp. Carlsbad,Calif.)和其变体或衍生物。其他特定目的载体包括pUC18，pUC19, pBlueScript, pSPORT,粘粒，噬菌粒，YAC(酵母人工染色体),BAC(细菌人工染色体),MAC(哺乳动物人工染色体)，pQE70,pQE60, pQE9 (Quiagen), pBS 载体，PhageScript 载体，BlueScript 载体，pNH8A, pNH16A,pNHlSA, pNH46A(Stratagene)，pcDNA3(Invitrogen, Carlsbad, Calif.), pGEX, pTrsfus,pTrc99A, pET-5, pET-9，pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pR I: T 5 (Pharmacia), pSPORT I,PSP0RT2, pCMVSP0RT2. 0 和 pSV-SPORTl (Invitrogen Corp. , Carlsbad, Calif.)和其变体或衍生物。额外的目的载体包括pTrxFus, pThioHis, pLEX, pTrcIiis, pTrcHis2, pRSET,pB!ueBacHis2, pc!)NA3. I/His, pcDNAS. I (-)/Myc-Hi s, pSecTag, pEBVHi s, pPIC9K,pPIC3. 5K, pA0815, pPICZ, pGAPZ, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, pSinRepS,pSinHis, pIND, pIND(SPl)，pVgRXR, pcDNA2. I。pYES2, pZErOl. I, pZErO-2. 1，pCR-Blunt,pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8，pcDNAl. 1，pcDNAl. I/Amp, pcDNA3. 1，pcDNAS. 1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREPlO, pCEP4,pEBVHis, pCR3. I, pCR2. I, pCR3. I-Uni 和 pCRBac, 自 Invitrogen ；.入 gtll, pTrc99A,pKK223-3, pGEX-2T, pGEX_2TK, pGEX_4T_l， pGEX-4T_2, pGEX-4T_3, pGEX_3X, pGEX_5X_l， pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCHllO, pKK232-8,PSL1180, pNEO 和 pUC4K,自 Pharmacia ;pSCREEN-Ib(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2,pCITE-4-abc (+), pOCUS-2, pTAg, pET_32LIC, pET_30LIC, pBAC-2 cp LIC, pBACgus-2 cpLIC, pT7Blue_2 LIC, pT7Blue_2, pET_3abcd, pET_7abc, pET9abcd, pETllabcd, pET12abc,pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-pET-17xb， pET-19b， pET-20b(+), pET-21abcd(+),pET-22b (+), pET-23abcd(+), pET-24abcd (+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b (+),pET_28abc(+), pET_29abc(+), pET_30abc(+), pET_31b(+), pET_32abc(+), pET_33b(+)，pBAC-I, pBACgus-1, pBAC4x_l, pBACgus4x_l, pBAC_3cp, pBACgus_2cp, pBACsurf-1, pig,Signal pig, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg 和 Selecta Vecta-Gpt，自Novagen ；pLexA, pB42AD, pG13T9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGADIO,pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFP-N, pEGFP-C, pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis_GFP,pSEAP2-Basic, pSEAP2-Contral, pSEAP2_ 启动子，pSEAP2_ 增强子，p. P . gal-Basic,p. 0 . gal-对照，p. J3 . gal-启动子，p. fgal-增强子，pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg，pRetro-Off, pRetro-On, pi RESIneo, piRESIhyg, pLXSK, pLNCX, pLAPSN, pMAMneo,pMAMneo-CAT, pMAMneo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX 4T-1/2/3, pYEX-Sl, pBacPAK-His,pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, 入 gtlO, 入 gtll 和 pffE15,自 Clontech ；入 ZAP II, pBK-CMV，pBK-RSV，pBluescript II KS+/-，pBluescript II SK+/-, pAD-GAL4,pBD-GAL4Cam, pSurfscript,入 FIX II,入 DASH,入 EMBL3, A EMBL4, SuperCos, pCR-ScrigtAmp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS+/_，pBCKS+/-, pBC SK+/-> Phagescript,pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc,pET_3abcd, pET-1labcd, pSPUTK, pESP-1,pCMVLacI,pOPRSVI/MCS, pOPI3CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac，pMClneo, pMClneo 聚 A, pOG44, p0045,pFRT. ^ GAL, pNEO. P . GAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415 和pRS416,自 Stratagene。特定目的2-杂交体及逆转2-杂交体载体包括pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97,p2. 5, pGADl-3，pGADIO，pACt, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-1，pGAD424, pGBT8, pGBT9，PGAD-GAL4, pLexA, pBD_GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4_5,pNLexA, pYESTrp和其变体或衍生物。特定目的酵母表达载体包括pESP-1, pESP-2, pESC-His，pESC-Trp, pESC-URA,pESC-Leu(Stratagene), pRS401, pRS402, pRS411, pRS412, pRS421, pRS422 和其变体或衍生物。根据本发明的此方面的载体包括，但未限于pENTRlA, pENTR2B，pENTR3C, pENTR4,pENTR5, pENTR6, pENTR7, pENTR8, pENTR9, pENTRlO, pENTRll，pDESTl, pDEST2, pDEST’3,p:[)EST4, pDESTS, pDEST6, pDEST7, pDESTS, pDEST9, pDESTIO, pDESTll, pl)EST12. 2 (也称之为 pDEST12)，pDEST13, pDEST14, pDEST15, pDEST16, pDEST17, pDEST18, pDEST19, pDEST20,PDEST21, pDEST22, pDEST23, pDEST24, pDEST25, pDEST26, pDEST27, pEXP501(也称之为PCMVSP0RT6. 0)，pD0NR201，pD0NR202, pD0NR203，pD0NR204,pD0NR205,pD0NR206,pD0NR212,PD0NR212 (F)(图 28A 28C)，p!)0NR212 (R)(图 29A 29C), pMAB58, pMAB62, p!)EST28,PDEST29, pDEST30, pDEST31, pDEST32, pDEST33, pDEST34, pD0NR207, pMAB85, pMAB86,其中许多描述于PCT公开WO 00/52027(其整个公开通过引用并入本文)，及各这些载体的片段， 突变体，变体和衍生物。但是，本领域普通技术人员会明白，本发明也包括本文不特别指定的其他载体,其包含一种或更多本发明中使用的编码一个或更多重组位点的分离的核酸分子或其部分(或其突变体，片段，变体或衍生物),且其可还包含一种或更多额外的本文所述的物理或功能核苷酸序列，其可任选地可操作地连接于一种或更多编码一个或更多重组位点的核酸分子或其部分。该额外的载体可由本领域技术人员根据本说明书中提供的教导产生。如本文所用,术语“细胞”是指称原核生物或真核生物细胞,除非另外指定。在一优选的实施方式中，第I基因包含编码根据SEQ ID NO :2的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) Tse2氨基酸序列的核苷酸序列,或由其组成。在另一优选的实施方式中，第I基因包含根据SEQ ID NO 1的核苷酸序列,或由其组成。紧密相关的Tse2基因和Tse2蛋白存在于其他铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株，具有SEQ ID NO :3 4中标注的可变的位置。由此，在另一优选的实施方式中，第I基因包含能编码SEQ ID NO :4的氨基酸序列的核苷酸序列，或由其组成。在另一优选的实施方式中，第I基因包含根据SEQ ID NO 8的核苷酸序列,或由其组成。如本文所用，“Tse2”包括其功能相当体(截短,突变体,等),其中该相当体维持本文所述的细胞毒性活性。鉴定该功能相当体的方法在本文公开及公开了各种该功能相当体。例如，发明人发现，Tse2的残基1-6和156-158对于毒性不是需要的(见下表I)。由此,在另一实施方式中,第I基因包含能编码下列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO 5或SEQ ID NO: 6,或由其组成。发明人还鉴定了保留毒性的一系列Tse2突变多肽。特别是，发明人显示(见下),在保留毒性的前提下，在 SEQ ID NO 2 的第 9,10,60,119,129，130，139，140，149 和 150 位的突变是可容忍的(见下表2)。由此,在另一实施方式中，第I基因编码通过在氨基酸残基9,10,60,119,129,130,139,140,149和150的一个或更多的氨基酸取代,及残基1_6的一个或更多及残基156-158的一个或更多任选地删除而与SEQ ID NO 2的氨基酸序列不同的突变Tse2多肽。在另一实施方式中,第I基因编码包括一个或更多选自下列的氨基酸取代的突变 Tse2 多肽:S9A。L10A, R60A, Q119A, K129A, P129A, Q139A, L139A, R149A 和 R150Ao在进一步优选的实施方式中，第I基因包含能编码下列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IDNO :7或SEQ ID NO :8，或由其组成。调控序列是“异源”，是指其不是天然存在的Tse2调控区。如本文所用，“调控序列”是在可操作地连接的调控核酸,及含有^-个或更多用于调控下列活性(i) (iii)的"控制元件"的基因表达期间，调控或影响(i)转录，(ii)翻译和/或(iii)翻译后修饰的任何核酸序列。术语调控核酸的"控制元件"为本领域熟知(见，例如，Goeddel,Gene Expression Technology,Methods in E^nzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif. ,1990)且包括,例如,转录启动子,转录增强子元件,转录终止信号，多聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3’)，优化翻译起始的序列(位于编码序列的5’)，翻译终止序列，指导翻译后修饰的序列(例如，糖基化位点)，全部这些可用于调控可操作地连接于调控序列的基因的转录和/或翻译。本领域技术人员应同意，调控核酸的控制元件的选择会依赖于如下因素待转化的宿主细胞的选择，蛋白期望的表达水平,等。
术语〃启动子"包括足以在宿主细胞中直接转录的任何核酸序列,包括诱导型启动子，阻遏型启动子和组成型启动子。例示启动子包括细菌，病毒，藻类，哺乳动物和酵母启动子,如本领域熟知。许多该启动子，包括诱导型启动子,可从下列供应商商购,包括LifeTechnologies, System Biosciences 和 Promega Biosciences。在大肠埃希氏菌(E. coli)中表达的例示启动子包括，但未限于lac, tip, ptrc及17启动子。对于在真核生物细胞中表达蛋白有用的例示启动子包括但未限于杆状病毒多角体蛋白，SP6,金属硫蛋白I,苜蓿丫蚊夜蛾(Autographa californica)核多汗病毒,塞姆利基森林病毒，Tet., CMV, Gall, GallO和17启动子。在一实施方式中,Tse2基因可操作地连接于足以致使启动子_依赖性可控制的基因表达(例如,通过外部信号或剂(添加到/自重组体细胞的生长培养基移出化合物)，或通过改变培养条件(温度,pH,等)的诱导性或阻遏性)的启动子元件。例示可控制的启动子是醇-调控的，四环素-调控的，甾-调控的,金属-调控的,病原体-调控的,光-调控的或温度-调控的那些。对于用于细菌系统，知道许多可控制的启动子(Old and Primrose,1994)。常见的例包括Plae(IPTG) ,Ptae(IPTG), A Pe (Cl阻遏物的损失)，入Pl(Cl阻遏物的损失)，Ptrc(IPTG), Ptrp(IAA)0控制剂在各启动子之后显示于括弧中。可控制的植物启动子的例包括根-特异性ANRI启动子(Zhang and Forde (1998) Science 279 :407)和光合成器官-特异性RBCS启动子(Khoudi et al. (1997) Gene 197 :343)。其他例示可控制的启动子包括 Tet-系统(Gossen and Bujard, PNAS USA 89 :5547-5551，1992),蜕皮素系统(No 等人，PNAS USA 93 :3346-3351,1.996),孕酮-系统(Wang et al. , Nat. Biotech 15:239-243,1997),及雷帕霉素-系统(Ye et al. , Science 283 :88-91,1999),阿糖-诱导型启动子，及鼠李糖-诱导型启动子。表达载体和它们的加工及分离方法为本领域熟知(见，例如，Maniatis等人，见上)或它们可通过供应商获得，例如，Invitrogen.(Carlsbad, Calif.),Promega(Madison, ffis.)和 Statagene (La Jolla, Calif.)及根据需要修饰。可商购的表达载体的例包括 pcDNA3 (Invitrogen), Gateway 克隆技术(Life Technologies),及pCMV-Script (Stratagene)。载体组分,调控核酸，等是一般自商业来源可利用的,或可从天然的来源(例如，动物组织或微生物)分离或使用合成手段诸如PCR制备。组分的设置可为本领域普通技术人员实际上期望的任何设置。本发明中使用的载体可源于产生作为染色体外元件可或不可独立地复制的病毒粒子或病毒-样粒子的病毒基因组。病毒粒子可通过感染导入宿主细胞。病毒载体可整合进细胞基因组。用于转化哺乳动物细胞的病毒载体的例是SV40载体,及基于下列病毒的载体乳头瘤病毒,腺病毒,爱泼斯坦-巴尔病毒,痘苗病毒，及反转录病毒，诸如Rous肉瘤病毒,或小鼠白血病病毒,诸如莫洛尼鼠白血病病毒。对于哺乳动物细胞，可使用电穿孔或病毒-介导的导入。在一实施方式中，载体包含一个或更多独特 限制酶识别位点,其中核酸插入子克隆进一个或更多独特限制酶识别位点破坏Tse2的表达。此实施方式的载体可用作克隆媒质，由于插入子克隆进载体中的一个或更多限制性位点间断Tse2表达及提供容易可选择的标记物-具有不含有插入子的载体的细胞,它们的生长被Tse2表达抑制(只要它们不内源性地表达针对Tse2的解毒剂)，而具有插入子的那些则不。在一优选的实施方式中，使用本领域技术人员熟知的技术而将一个或更多独特限制性位点加工为Tse2的编码区，使得插入子克隆进限制性位点破坏Tse2的编码区。在此实施方式中，限制性位点可加工为编码区以导致沉默核苷酸变化，或可导致Tse2的氨基酸序列中一个或更多变化，只要编码的Tse2蛋白保留细胞毒性活性。或者，一个或更多独特限制性位点可位于调控区使得插入子的克隆会破坏Tse2自载体的表达。核酸序列的设计及合成和包含该序列的载体的制备在本领域技术人员的技能水平之内。本发明涉及新克隆和/或测序载体,其包括至少I个启动子核苷酸序列和编码作为毒有活性的融合蛋白(Tse2)的至少I个核苷酸序列，所述核苷酸序列由编码包括多个独特克隆位点(MCS)的核苷酸序列和编码Tse2的核苷酸序列的融合基因获得。利用原核生物死亡基因ccdB的类似系统已描述于美国专利No. 7，176，029，及通过引用整体并入本文。用于与Tse 2融合的例不融合蛋白偶体包含，但未限于，IacZ a , GFP, RFP, His和FLAG。在一非限制性实施方式中，克隆载体含有与LacZ a的C-端或N-端融合的Tse2基因。Tse2_LacZ融合蛋白的表达受诱导型启动子,诸如Iac启动子控制,使得Tse2_LacZ融合蛋白的表达会导致细胞死亡。在特定实施方式中，MCS含在LacZ基因之内，使得DNA片段的插入破坏IacZ a -Tse2基因融合体的表达，允许仅阳性重组体生长。含有非重组载体的细胞不生存。根据此实施方式的质粒允许待克隆的双消化的限制片段以相对Iac启动子的两个方向取向。限制片段插入独特克隆位点之一间断基因融合体的遗传信息，导致不具有功能的基因融合产物的合成。当导入终止密码子或当在阅读框内制造变化时，基因融合的插入灭活应总是发生。包含重组载体(破坏的Tse2)的细胞会是有活力的,而包含完整载体(完整Tse2)的细胞不会是有活力的。此阴性选择,通过在固体培养基上简单培养,使其可能消除包含非-重组载体的细胞(非-有活力的克隆)，及选择重组体克隆(有活力的克隆)。在另一实施方式中，重组载体包含一个或更多侧接Tse2基因的重组位点。在优选的实施方式中，重组载体包含至少第I和第2重组位点,它们侧接可操作地连接于调控序列的编码Tse2的第I基因,其中所述第I和第2重组位点不彼此重组。如本文所用，“重组位点”是在整合或重组的初始阶段期间被定点重组蛋白认识及结合的DNA的离散部分或段。例如,Cre重组酶的重组位点是IoxP,包含侧接8bp核心序列的2个13bp倒置的重复子(作为重组酶结合位点)的 34bp 序列。见 Sauer , B. , Curr. Opin. Biotech. 5 :521-527 (1994)。其他识别序列的例包括被重组蛋白\识别的at tB, attP，attL和attR序列。attB是含有2个9bp核心-型Int结合位点和7bp重叠区的约25bp序列，而attP是含有核心-型Int结合位点和臂-型Int结合位点以及用于辅助蛋白整合宿主因子(IHF) ,FIS和切除酶(Xis)的位点的约 240bp 序列。见 Landy , Curr. Opin. Biotech. 3 :699707 (1993)。识别序列的进一步例包括IoxP位点突变体，变体或衍生物诸如loxP511(见美国专利No. 5, 851, 808) ；dif位点；dif位点突变体,变体或衍生物；psi位点；psi位点突变体,变体或衍生物；cer位点；及cer位点突变体,变体或衍生物。也见，例如，US20100267128和W 01/11058,通过引用整体并入本文。提供用于在本发明中使用的重组位点和重组蛋白的其他系统包括自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的 FLP/FRT 系统，解离酶家族(例如，RuvC, yi, TndX,TnpX, Tn3解离酶，Hin, Hjc, Gin, SpCCEl, ParA和Cin),及IS231和其他苏云金芽孢杆菌(BaciIIus thuringiensis)可转座的元件。用于在本发明中使用的其他适合的重组系统包括在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中的XerC和XerD重组酶及psi, dif及cer重组位点。其他适合的重组位点可见于美国专利No. 5, 851，808，其特别通过引用并入本文。 此实施方式可用于重组克隆，例如使用Gateway CI oning系统，其描述于公开的美国专利申请NO.US20100267128,及1998年10月23日提交的美国申请序列号No. 09/177，387 ;2000年3月2日提交的美国申请序列号No. 09/517，466 ;及美国专利No. 5, 888, 732和6，143，557,将它们全部特别通过引用并入本文。简言之，Gateway Cloning系统利用含有至少I个重组位点的载体，以体内或体外克隆期望的核酸分子。在--实施方式中，系统利用含有自野生型(attO)位点突变而来的基于噬菌体A系统的至少2个不同定点重组位点(例如，attl和att2)的载体。各突变的位点对于相同的类型的其同源偶体att位点(即，其结合偶体重组位点)具有独特特异性(例如attBl与attP I,或attLl与att.Rl),且不会与其他突变体类型的重组位点或与野生型attO位点交叉-反应。不同位点特异性允许期望的分子的定向克隆或连接，由此提供克隆的分子的期望的取向。使用Gateway 系统通过取代侧接受体质粒分子(有时称的目标载体).....t的att位点的可选择的标记物(例如，Tse2)克隆及亚克隆侧接重组位点的核酸片段。然后通过Tse2敏感宿主株的转化和对受体分子上标记物的阳性选择来选择期望的克隆。Tse2对原核生物和真核生物细胞有毒性，由此Tse2敏感宿主株包括原核生物和真核生物细胞。在一实施方式中，载体含有侧接一个或更多限制酶位点或重组位点的Tse2基因。重组位点包括,但未限于，attB, attP，attL和attR。设计此载体,使得目的DNA片段(诸如,例如,PCR产物)会取代位于2个侧接位点之间的Tse2。如果目的DNA片段存在于载体中，含有载体的细胞生存，由于Tse2基因会不再存在于期望的重组载体上。如果目的基因不存在，Tse2基因会防止携带不期望的载体的细胞的存活。由此,仅含有具有目的DNA片段的阳性克隆的细胞会是活的，且容易选择。在一实施方式中,载体包含Tse2基因的至少I个无活性片段,其中当无活性片段穿过至少I个重组位点与包含Tse2基因的另一无活性片段的第2DNA段重组时,有功能的Tse2基因被拯救。在另一实施方式中,载体含有双选择盒,其中载体包含编码Tse2的第I基因,及编码第2可选择的标记物的第2基因,诸如抗生素抗性基因或编码第2毒性蛋白的第2 “死亡”基因。抗生素抗性基因可选自细菌或真核生物基因,及可促进针对氨苄西林，卡那霉素，四环素，氯霉素和本领域中知道的其他的抗性。第2死亡基因可为任何适合的死亡基因,包括但不限于，rpsL, tetAR, pheS, th.yA, IacY, gata-1, ccdB和sacBo第2死亡基因也可选自原核生物或真核生物毒性基因。此双选择盒侧翼有至少I个限制性位点或重组位点,使得目的DNA片段会在期望的重组或连接事件中取代位于2个位点之间的双选择盒。如果目的DNA片段存在，含有载体的细胞生存，由于Tse2基因会不再存在于期望的重组载体上。如果目的基因不存在,载体会仍含有Tse2基因且会防止携带不期望的载体的细胞的存活。此双选择盒可由此用于任何双阴性选择策略,如本领域普通技术人员所期望。在一实施方式中，当多抗生素的使用不与特定选择设计相容时，使用Tse2基因双阴性选择策略。作为非限制性例,载体含有包含在至少I个启动子控制下的Tse2基因以及氯霉素抗性基因的双选择盒。使用限制酶在双选择盒的上游和下游切割载体。任选地,线性化的载体可经凝胶纯化，以自反应移出切下的双选择盒DNA。含有目的DNA片段和适当的限制酶位点的DNA，诸如PCR产物,然后在连接反应中与线性化的载体组合。阳性克隆会是氯霉素敏感和有活力的(Tse2阴性)，由于双选择盒用目的DNA片段的取代。 在另一实施方式中,载体在Tse2基因或对应调控元件(例如启动子或增强子)之内含有至少I个重组位点，使得期望的重组事件会破坏Tse2基因自载体的表达。应选择重组位点的位置，使得如果期望的重组事件发生，得到的Tse2基因会是无活性和含有期望的载体的细胞会生存。如果期望的重组事件不发生，Tse2基因会保持完整和含有不期望的载体的细胞会不生存。在另--实施方式中,载体在Tse2基因或对应调控元件(例如启动子或增强子)之内含有至少I个重组位点，使得不期望的重组事件会产生完整和有功能的Tse2基因，其会导致含有不期望的载体的细胞死亡。在另一实施方式中，Tse2基因在多载体上片段化,共享的限制酶序列或重组位点序列连接基因片段。设计及排列载体,使得不期望的重组事件或连接事件会导致不期望的质粒上完整Tse2基因的创建，由此导致含有具有有功能的Tse2基因的不期望的载体的细胞死亡。在另一实施方式中，载体是适合于拓扑异构酶-介导的克隆的载体,如描述于美国专利No. 5，766，891和7，550，295，和/或TA克隆，如公开于美国专利No. 5, 827，657,均通过引用整体并入本文。在特定实施方式中，载体适合于拓扑异构酶或TA-介导的克隆线性化，使得载体经优化用于目的DNA片段的最有效整合。这些制备描述于参考的专利。简言之,拓扑异构酶—介导的克隆依赖于如下原理,Taq聚合酶具有将单脱氧腺苷(A)添加到PCR产物的V端的非-模板-依赖性末端转移酶活性。例如，自痘苗病毒的拓扑异构酶I在特定位点(CCCTT)结合于双联DNA及在一链中切割磷酸二酯主链。自断裂的磷酸二酯主链的能量通过切割的链的3'磷酸酯和拓扑异构酶I的酪氨酰残基(Tyr-274)之间形成共价键而保存。DNA和酶之间的磷酸-酪氨酰键可随后被原切割的链的5'羟基攻击，逆转反应及释放拓扑异构酶。在一实施方式中，本发明的载体包含含有单,悬伸3,脱氧胸苷(T)残基的线性载体，有拓扑异构酶I共价结合于载体(称之为“活化的载体”)。此允许PCR插入子与载体连接有效。
在另一实施方式中，载体经设计用于拓扑异构酶或TA克隆,使得拓扑异构酶或TA切割位点位于Tse2基因之内。在此实施方式中，载体可用于缺少期望的DNA插入子的克隆的阴性选择。进行拓扑异构酶或TA反应之后，含有期望的DNA插入子的载体会具有破坏的且无活性Tse2基因，由此允许含有该载体的细胞生存。但是,如果载体不合并插入子而在切割位点环化,Tse2基因会改性及有活性，由此产生毒性Tse2蛋白及杀细胞。在进一步实施方式中，拓扑异构酶或TA位点会与限制酶位点和/或测序引物位点侧接。在另一实施方式中，可组合TA或TOPO克隆策略,如公开于，例如，专利6,916, 632,其通过弓I用整体并入本文。在本发明中的另^-方面,可与本文中的任何其他实施方式组合,重组载体可包含可操作地连接于调控序列的编码Tse2解毒剂的基因。解毒剂可为能干扰Tse2的细胞毒性活性的任何表达产物，包括但不限于Tse2反义构建体，Tse2-结合适体和Tse2-结合多肽。该载体可,例如，作为其生存性可通过控制解毒剂多肽表达的条件而条件性地控制的细胞内的标记物使用。在优选的可与本文任何其他实施方式组合的实施方式中，第2基因编码VI型分泌免疫蛋白2(Tsi2),作为针对Tse2的解毒剂公开于随后例。在一优选的实施方式 中，第2基因包含可编码根据SEQ ID NO 10的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) Tsi2氨基酸序列的核苷酸序列,或由其组成。在另一优选的实施方式中,第2基因包含根据SEQ IDNO 9的核苷酸序列，或由其组成。紧密相关的Tsi2基因和Tsi2蛋白存在于其他铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株中，可变的位置标注于SEQ ID N0Uo由此,在另一优选的实施方式中，第2基因包含能编码SEQ ID NO :11的氨基酸序列的核苷酸序列，或由其组成。在另一优选的实施方式中，第2基因包含根据SEQ ID NO 12的核苷酸序列，或由其组成。如本文所用，“Tsi2”包括其功能相当体(截短，突变体，等)，其中该相当体维持它们的在细胞表达Tse2后赋予免疫的能力，如本文所述。鉴定该功能相当体的方法在本文公开及公开了各种该功能相当体。例如，发明人发现，Tsi2的残基60-77可被去除而仍保留其Tse2免疫活性。由此,在进一步实施方式中，第2基因包含能编码SEQ ID NO 13的氨基酸序列的核苷酸序列，或由其组成。发明人还鉴定了保留Tse2免疫功能的一系列Tsi2突变多肽。特别是,发明人显示，以下描述的具有单突变的Tsi2突变体保留Tse2免疫活性,显示,Tsi2是易于恢复活力的,且其与Tse2的相互作用是稳健的。由此,在另一实施方式中，第2基因包含能编码下列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO :10,11或13(具有I , 2，3,4，5或更多氨基酸取代)，或由其组成。可制造该取代的例示位置(根据SEQ ID NO :10 12编号)是氨基酸残基2,4,6,7,8,10,11,13,14,18,20,21,25,27,28,29,30,32,33,36,38,39,42,44,45,46,47,49,50,52,56,57,59 和 61。作为非限制性例，在本文实施方式中将Tsi2基因作为例示Tse2解毒剂描述。但是，此不应被理解为以任何方式限制本发明。任何Tse2解毒剂可取代公开的实施方式，包括但不限于Tse2反义构建体，Tse2-结合适体和Tse2-结合多肽。Tsi2基因可在任何期望的启动子调控控制下,包括但不限于以上对Tse2公开的那些，诸如以上公开的各种诱导型启动子，以及杆状病毒多角体蛋白，SP6,金属硫蛋白I,苜蓿丫蚊夜蛾(Autographa cal ifornica)核多汗病毒,塞姆利基森林病毒，Tet, CMV, Gall,GallO和T7启动子。在一实施方式中，Tsi2基因包括在载体上，其会,当表达时,给表达Tse2的细胞赋予免疫。在Tsi2缺失下表达Tse2的细胞系中，细胞会不生存。本文也提供在诱导型启动子控制下的Tsi2基因，如上所述。如果表达Tse2的细胞接收表达Tsi2基因的载体,原核生物或真核生物细胞会生存,而不表达Tsi2基因的该细胞会不生存。如本文例中所示,不束缚于任何特定机理，Tse2的Tsi2抑制的机理可能涉及蛋白物理关联。在另一实施方式中，Tsi2基因可用作期望的重组或连接事件的标记物。在非限制性例中，含有Tsi2基因的载体侧接一个或更多重组位点。目的DNA片段被插入载体上的位点，使得片段不破坏Tsi2基因但是含在重组位点之内。在另一实施方式中,拓扑异构酶或TA位点包括在侧接位点之内，但Tsi2基因之外，以辅助DNA片段插入。含有目的DNA片段的载体然后与含有匹配重组位点的第2载体组合，使得阳性重组事件会将目的DNA片段和Tsi2基因移到新载体,其可然后经选择用于表达Tse2的细胞的存活。在另一非限制性例中,载体含有侧接一个或更多限制性位点的Tsi2基因。目的DNA片段被插入载体上的位点， 使得片段不破坏Tsi2基因但是含在限制性位点之内。含有目的DNA片段的载体和第2克隆载体然后用一种或更多限制酶消化,之后是连接反应。阳性连接事件会将目的DNA片段和Tsi2基因移到第2克隆载体,其可然后经选择用于表达Tse2的细胞的存活。在另一实施方式中，不同抗生素抗性基因也可用在质粒上，使得本领域普通技术人员可采用双选择。在一实施方式中,载体包含无活性形式的Tsi2基因，诸如截短的形式。此载体可在，例如,拯救Tsi2基因的活性的方法中使用，使得含有有功能的Tsi2基因的载体也含有目的DNA片段(如本文所述)。有功能的Tsi 2可通过重组，整合或其他本文所述的事件或反应拯救。载体可由本领域普通技术人员的容易设计用于特定实验。在本发明中的另一方面,本发明在本文提供含有存在于载体上截短的或无活性形式的抗毒素(Tsi2)基因的重组载体。在非限制性例中,载体可为线性形式。为了恢复Tsi2基因的功能,将核苷酸的短序列加入待克隆的目的DNA片段的端部。此序列对应于Tsi2基因的截短的序列,使得附接于目的DNA片段的此序列会与截短的Tsi2基因结合，由此恢复有活性的抗毒素蛋白能抵抗Tse2蛋白的作用。短序列使用一种修饰的PCR引物合并到DNA片段。此系统允许仅重组质粒的阳性选择,及允许载体中克隆的片段的正确取向的选择，由于2种可能的取向中的仅一种会恢复有活性的Tsi2基因。在另一实施方式中，Tsi2基因的截短位于在本发明中定义的作为Tsi2解毒剂功能需要的区之内。例如，如本文所述，发明人发现，Tsi2的残基60-77可被去除而仍保留其Tse2免疫活性。像这样，Tsi2的截短必需在那些残基之外，以便产生无活性Tsi2蛋白。在另一实施方式中，含有截短的无活性Tsi2基因的载体是环状的。在另一实施方式中,本发明提供重组载体,其中编码Tsi2的基因会仅在适当的消除抗生素抗性基因或额外的细胞死亡基因之后是有功能的。任何抗生素抗性基因或额外的死亡基因可在此实施方式中使用。在一非限制性例中，Tsi2座位在含有共同序列的相同的质粒上分为2部分，及在侧接卡那霉素抗性基因的5’和3’区中克隆。在位于卡那霉素抗性基因之内的限制性位点的消化和Tse2表达细胞用线性DNA转化之后,完全有功能的Tsi2会通过同源重组组装。仅含有具有有功能的Tsi2的重组质粒的细菌或真核生物细胞可在转化后生长。此使用ccdB基因的策略的描述,见Peubez, et al. Microbial Cell Factories2010,9 :65,其通过引用并入本文。在另一实施方式中，Tsi2座位在2个或更多质粒上分裂为2个或更多部分。在另一实施方式中，Tsi2座位在2个或更多质粒上分裂为2个或更多部分或整合进细胞的染色体。在另一实施方式中，载体包含一个或更多独特限制酶识别位点,其中核酸插入子克隆进一个或更多独特限制酶识别位点破坏Tsi2解毒剂基因的表达。此实施方式的载体可用作克隆媒质，由于插入子克隆进载体中的一个或更多限制性位点间断Tsi2解毒剂基因表达及提供容易可选择的标记物。具有不含有插入子的载体的细胞生存,具有插入子的那些死。在另一实施方式中，本发明包含含有根据本文公开的任何实施方式的Tse2基因、的第I载体，及含有根据本文公开的任何实施方式的Tsi2基因的第2载体。在另一实施方式中，本发明包含含有根据本文公开的任何实施方式的Tse2基因，及含有根据本文公开的任何实施方式的Tsi2基因的载体。在一实施方式中，载体含有Tsi2基因，使得Tsi2基因的表达的损失致使细胞非-有活力。在一实施方式中，本发明提供用于本文所述的Gateway重组系统的一种或更多含有Tse2和Tsi2的载体。载体设计为使得如果期望的重组事件不发生,Tse2会是在载体上有活性的，而Tsi2会是无活性,且含有载体的细胞会死。如果期望的重组事件发生，载体会携带Tse2和Tsi2基因，将Tse2解毒剂赋予含有载体的细胞,且细胞会生存。在一实施方式中，I个载体可包含Tse2和Tsi2基因。在另一实施方式中，各基因可见于分离的载体。此策略可用于在Gateway系统中取代一个或更多抗生素抗性基因。在一实施方式中，载体含有Tsi2解毒剂基因。将载体转化进含有稳定地整合的Tse2基因,但受无活性启动子控制的细胞。例如，Tse2基因受T7启动子控制，但整合进缺少T7RNA聚合酶基因的细菌。核酸序列的设计及合成和包含该序列的载体的制备在本领域技术人员的技能水平之内。在另一实施方式中，I个载体含有Tsi2基因,及I个载体含有Tse2基因。这些载体可发现附加地在单细胞中。除了 Tse2的表达可需要的载体组分之外(及Tse2解毒剂，如果存在)，载体也可包括任何其他适合的控制元件,包括但不限于复制原点，例如,用于PCR的引物位点，转录和/或翻译起始和/或调节位点，重组信号，复制子，其他选择标记物，抗生素抗性基因，等。在一实施方式中，复制序列致使载体能附加型和染色体复制，使得载体能作为染色体外单元自身-复制,且能整合进染色体，由于可转位的序列,诸如插入序列或转座子的存在，由于与存在于染色体中的序列的实质性同源性或由于非-同源重组事件。复制序列或复制子会被转化的宿主识别及源于任何方便的来源，诸如自质粒，病毒，宿主细胞，例如，自主复制段，独自或与着丝粒一起，等。特定复制序列对于主题发明不是关键的,且可采用各种序列。便利地，可采用病毒的复制序列。在全部实施方式中,各个体核酸段可包含各种序列,其包括,但不限于适合于作为引物位点使用的序列(例如，引物诸如测序引物或扩增引物可杂交，以起始核酸合成，扩增或测序的序列)，转录或翻译信号或调控序列诸如启动子和/或增强子，核糖体结合位点，Kozak序列,起始密码子,终止信号诸如终止密码子,复制原点，重组位点(或其部分),可选择的标记物，及基因或基因的部分，以创建蛋白融合(例如，N-端或C-端)诸如GST，GUS,GFP, YFP, CFP,麦芽糖结合蛋白，6组氨酸(IIIS6)，表位,半抗原等和其组合。用于克隆该段的载体也可包含这些功能序列(例如,启动子,引物位点,等)。在包含该序列的段的组合和序列最佳克隆进一种或更多载体之后，分子可以各种方式操作,包括靶核酸分子的测序或扩增(即，通过使用通过整合序列导入的至少I个引物位点)，靶核酸分子的突变(即，通过在靶核酸分子中或上插入，缺失或取代)，通过同源重组插入另一分子,靶核酸分子的转录，及自靶核酸分子或其部分的蛋白表达(即，通过由段和/或载体含有的翻译和/或转录信号的表达)。克隆载体可存储于冷冻器，冰箱,液氮中，或以本领域普通技术人员知道的任何其他方法存储。在另一方面,本发明提供重组宿主细胞,其包含本发明的任何方面的任何实施方 式或实施方式的组合的重组载体。本文使用的术语〃宿主，"可为经遗传加工而表达异源Tse2 (及Tse2解毒剂,如果存在)的任何原核生物或真核生物,包括但不限于细菌(诸如大肠埃希氏菌(E. coli))，藻类，真菌(诸如酵母)，昆虫，无脊椎动物，植物和哺乳动物细胞类型。该宿主的例如，见 Maniatis et al. ,Molecular Cloning A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N. Y. (1982)。本发明的此方面的宿主细胞可，例如,在本文讨论的本发明的方法中使用。在一实施方式中，细菌或真核生物细胞含有稳定地整合进染色体的在选择的启动子控制下的Tse2基因或基因片段。在另一实施方式中，细菌或真核生物细胞含有载体中携带的在选择的启动子控制下的Tse2基因或基因片段。在一实施方式中，细菌或真核生物细胞含有稳定地整合进染色体的在选择的启动子控制下的Tsi2基因或基因片段。在另一实施方式中，细菌或真核生物细胞含有载体中携带的在选择的启动子控制下的Tsi2基因或基因片段。在另一方面，本发明提供用于可选择性克隆的方法，包括如果无插入子存在,在适合于Tse2由重组载体表达的条件下培养本发明的另一方面的任何实施方式的重组宿主细胞，并选择那些由于包含具有克隆进表达载体的插入子的重组载体而生长的细胞。在一实施方式中，载体包含一个或更多独特限制酶识别位点，且其中核酸插入子克隆进^-个或更多独特限制酶识别位点破坏第I基因的表达，及插入子克隆进载体中的一个或更多限制性位点间断Tse2表达及提供容易可选择的标记物一用不含有插入子的载体转染的细胞,它们的生长被Tse2表达抑制(只要它们不内源性地表达针对Tse2的解毒剂)，而具有插入子的那些不。在另--实施方式中，重组载体包含一个或更多侧接Tse2基因的重组位点。在一实施方式中，重组载体包含至少第I和第2重组位点,它们侧接可操作地连接于调控序列的编码Tse2的第I基因,其中所述第I和第2重组位点不彼此重组。在此实施方式中，待克隆的核酸片段侧翼有重组位点，通过取代侧接在重组载体上的重组位点的Tse2可选择的标记物克隆/亚克隆。期望的克隆然后通过Tse2敏感宿主株的转化,和受体分子上标记物的任何阳性选择来选择。Tse2对原核生物和真核生物细胞有毒性，由此Tse2敏感宿主株包括原核生物和真核生物细胞。由于Tse2在原核生物和真核生物细胞中有毒性，该可选择性克隆可在任何原核生物或真核生物宿主细胞中进行,包括但不限于细菌(诸如大肠埃希氏菌(E. coli))，藻类，真菌(诸如酵母)，昆虫，无脊椎动物，植物和哺乳动物细胞类型。适合于Tse2表达的细胞培养条件可通过本领域技术人员基于各种因素，包括特定宿主细胞，调控序列和载体设计参照本文教导来确定。在另一方面,本发明提供产生缺乏插入子的克隆载体的方法,其包括在适合于载体复制和Tse2表达的条件下培养本发明的第2方面的任何实施方式的重组宿主细胞，其中重组宿主细胞还表达Tse2解毒剂,并从宿主细胞分离载体。这些方法允许本发明的任何实施方式的载体的大规模产生。解毒剂可为能干扰Tse2的细胞毒性活性的任何表达产物,包括但不限于Tse2反义构建体,Tse2-结合适体和Tse2-结合多肽。在优选的可与本文任何其他实施方式组合的实施方式中，Tse2解毒剂包含本文公开的任何实施方式的Tsi2。适合于载体复制的细胞培养条件可由本领域技术人员基于各种因素，包括特定宿主细胞,调控序列和载体设计参照本文教导来确定。在另一方面,本发明提供宿主细胞,其在它们的基因组中包含可操作地连接于调控序列的编码Tse2的第I重组基因。在一非限制性实施方式中，重组体细胞在质粒或移动 遗传元件上包含编码解毒剂(诸如Tsi2)的第2基因，并且其解毒剂性质的选择(即Tse2免疫)维持该元件。在另一实施方式中，重组宿主细胞在质粒上包含编码有功能的Tse2的第I基因,其中重组宿主细胞包含表达Tsi2的第2基因，以允许Tse2质粒在宿主细胞中繁殖。在此实施方式中，第2基因可存在于相同的或不同质粒,另一额外-染色体元件，或整合进染色体。第I基因和第2基因是“重组体”，其中宿主细胞不内源性地表达Tse2或Tse解毒剂，由此Tse2表达需要Tse2的重组表达,及解毒剂表达需要解毒剂的重组表达。如本文所用在其基因组中”包括染色体插入和额外-染色体元件,诸如质粒或病毒载体。由此,在一优选的实施方式中，第I重组基因和/或第2重组基因以额外-染色体存在。在进一步优选的实施方式中，第I重组基因和/或第2重组基因作为染色体插入子存在。在存在编码Tse2的解毒剂的第2基因的实施方式中，第2基因可在相同的，或替代性地，在不同额外-染色体元件上，相比第I基因，或,替代性地,在基因组中连接的或未连接于第I基因。在其他实施方式中，第I和第2基因之一可为染色体插入，而第I和第2基因中的另一个可为额外-染色体元件。在第I和第2基因在相同的质粒上的实施方式中，基因可紧密连接。在另一实施方式中,第I和第2基因在相同的质粒且不是紧密连接的。在宿主细胞不包含编码Tse2的解毒剂的第2重组基因的实施方式中,Tse2调控序列是优选可控制的，以控制Tse2表达。在宿主细胞包含编码Tse2的解毒剂的第2重组基因的例示实施方式中，Tse2调控序列可为诱导性的和/或解毒剂调控序列可为组成性的，以控制Tse2表达。在另一非限制性实施方式中，重组体细胞(诸如哺乳动物细胞)在I个质粒上包含编码Tse2的第I基因,及在第2质粒上包含编码Tsi2的第2基因。在此实施方式中，Ts 12可用作导入表达Tse2的宿主细胞的表达载体上可选择的标记物,导入细胞，及仅表达Tsi2的细胞会能生长。在一实施方式中，Tse2的调控区是诱导性的，且导入后细胞的生长在诱导条件下发生。在此实施方式中，第2载体可还包含用于表达或其他目的的目的重组核酸。在Tse2调控元件是可控制的实施方式中，Tse2表达的控制可用于维持Tsi2质粒和/或就其整合选择，提供不使用抗生素制造稳定的细胞的方式。
在另--方面,载体可提供到试剂盒中。本发明也涉及用于进行本发明的方法,及特别用于创建本发明的产物核酸分子或本发明的其他连接的分子和/或化合物(例如，蛋白-蛋白，核酸-蛋白，等)或包含该产物核酸分子或连接的分子和/或化合物的支持物的试剂盒。本发明也涉及用于添加和/或移出和/或取代核酸,蛋白和/或其他分子和/或化合物，用于创建及使用本发明的组合库，及用于根据本发明的方法进行同源重组(特别基因革ElI向)的试剂盒。本发明的试剂盒也可包含用于进一步操作含有重组位点的分子和/或通过本发明的方法产生的化合物的其他组分。本发明的试剂盒可包含一种或更多本发明的核酸分子(特别是包含一个或更多重组位点和任选地包含一个或更多反应性功能部分的开始分子)，一种或更多本发明的分子和/或化合物，一种或更多本发明的支持物和/或一种或更多本发明的载体。该试剂盒可任选地包含一种或更多额外的组分，其选自一种或更多宿主细胞(例如,2,3,4,5等)，一种或更多引导(例如,通过转染或转化)分子或化合物进入一种或更多宿主细胞的试剂，一种或更多核苷酸，一种或更多聚合酶和/或反转录酶(例如，2，3,4，5,等)，一种或更多适合的缓冲剂(例如,2，3,4，5,等)，一种或更多引物(例如,2，3,4，5,7，10，12,15,20，30，50,等)，一种或更多终结剂(例如，2，3,4，5, 7，10，等)，一 个或更多用于创建组合库的分子群(例如，2, 3,4, 5, 7,10,12,15, 20，30, 50,等)及一个或更多组合库(例如,2, 3,4, 5,1,10,12,15, 20, 30, 50,等)。本发明的试剂盒也可含有进行本发明的方法的向导或流程。在另一方面本发明中提供用于接合,删除或取代核酸段的试剂盒，这些试剂盒包含至少一种选自下列的组分(I) 一种或更多重组蛋白或包含一种或更多重组蛋白的组合物,及⑵至少一种包含^-个或更多重组位点的核酸分子(优选具有至少2个不同重组特异性的载体)。本发明的试剂盒也可包含一种或更多选自下列的组分(a)包含额外的重组位点的额外的核酸分子；(b) —种或更多具有连接酶活性的酶；(c) 一种或更多具有聚合酶活性的酶；(d) —种或更多具有反转录酶活性的酶；(e) —种或更多具有限制性内切酶活性的酶；⑴一种或更多引物；(g) —种或更多核酸库；(h) ^-种或更多支持物；⑴一种或更多缓冲剂；(j) 一种或更多去污剂或含有去污剂的溶液；(k) 一种或更多核苷酸；(I) 一种或更多终结剂；(m) —种或更多转染试剂；(n) —种或更多宿主细胞；及(O)使用试剂盒组分的使用说明。在一实施方式中,本发明的试剂盒含有包含含有Tse2或Tsi2基因的至少一种线性化的或环状载体的组合物。在一些实施方式中，试剂盒中含有的线性化的载体经处理而使得载体的端对于结合于载体的另一端是抗性的。在其他实施方式中，本发明涉及试剂盒包含被区划为接收及在其中保持至少一个容器的载体或容具，其中第I容器含有线性或环状DNA分子,其包含具有至少一个Tse2基因序列的DNA片段的载体,如本文所述。在另一实施方式中，试剂盒中含有的载体具有至少一个Tsi2基因序列的DNA片段，如本文所述。在另一实施方式中，试剂盒含有具有至少一个Tse2序列的DNA片段的载体和具有至少一个Tsi2序列的DNA片段的载体。以上公开的Tse2和Tsi2的全部实施方式和实施方式的组合可在本发明的此方面使用。实施例总述分泌系统的功能谱被其底物限定。在此我们分析了 Hcp分泌岛-I-编码的VI型分泌系统(HI-T6SS)的调节改变的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)突变体的分泌蛋白质组。我们鉴定了此系统的3种底物,蛋白Tsel 3(6型,输出为I 3),其与分泌设备共调节，及分泌的在紧密翻译后控制F。Tse2蛋白发现是毒素-免疫系统的毒素组分，且当在细胞内表达时阻拦原核生物和真核生物细胞的生长。相反，分泌的Tse2对真核生物细胞无效应；但是，其对铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株以依赖于细胞接触和HI-T6SS的方式提供主要生长优势,相对于缺少免疫的那些。此展示,T6SS靶向针对细菌的毒素,辅助调和T6SS和噬菌体尾和刺之间的结构和进化关系。引言分泌的蛋白允许细菌密切地接触它们的周围及其他细菌。分泌的蛋白的重要 性和多样性被细菌已进化以致使它们的输出的多通路所反映(Abdallah et al. ,2007 ；Filloux, 2009)。大多-组分分泌系统,包括III和IV型分泌，已聚焦于大量的研究,因为在许多生物中，它们是特化的,用于效应子输出及它们具有经针-样设备将蛋白直接从细菌转位到宿主细胞细胞质的显著的能力(Cainkronne and Roy, 2006)。最近描述的VI型分泌系统(T6SS)是另--特化的系统,但是其生理学作用和一般机理尚不明确(Bingle et al.,
2008)。T6SS的研究指示，功能设备需要约15保守的及紧密连接的基因的产物，及强烈关联于属于溶血素共调节的蛋白(Hcp)家族的六聚体环形蛋白的输出(Fil :[oux, 2009;Mougous et al. ,2006)。需要Hcp蛋白用于分泌设备的组装,且它们与也通过T6SS输出的缬氨酸-甘氨酸重复子(Vgr)家族蛋白相互作用。Hcp/Vgr复合物的功能尚不清楚,但是相信，蛋白是分泌设备的细胞外结构组分。对Hcp和Vgr-家族蛋白的新近X-射线结晶学观察显示,它们分别类似于噬菌体管和尾刺蛋白(Leiman et al. , 2009 ;Pel :丨_ et al. , 2009) 这些发现提示思索,T6SS是进化上,结构上和机械上与噬菌体相关的。根据此模型,T6SS作为倒置的噬菌体尾在细菌表面组装，Hcp/Vgr复合物形成细胞-穿刺装置的远端。另一可注意的保守的T6S基因产物是ClpV, AAA+-家族ATP酶，其已假定为提供驱动分泌设备必需的能量(Mougous et al. ,2006)。余下保守的T6S蛋白的作用知之甚少。编码预测的附属元件的非保守的基因也连接于多数T6SS(Bingle et al. , 2008)。在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的 HSI-I-编码的 T6SS (H1-T6SS)(图 1A)中，这些基因编码通过叉头-关联的结构域蛋白，Fhal的磷酸化状态的变化严格调节分泌系统的活性的翻译后调控通路的元件(Mougous et al. ,2007)。Fhal被跨膜丝氨酸-苏氨酸Hanks-型激酶，PpkA的磷酸化,引发Hcpl分泌。PppA,PP2C_型磷酸酶,拮抗Fhal磷酸化。T6SS已连接到无数的过程，包括生物膜形成(Aschtgen et al. ,2008 ；Enos-Berlage et al. , 2005),缀合(Das et al.，2002),群体感应调节(Weber et al.,2009),及促进及限制毒力(FiIIoux, 2009)。铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) H1-T6SS已牵涉慢性感染中细菌的适合度；在此分泌系统中保守的基因中的突变体对于在大鼠肺慢性感染模型中有效复制失效，且系统显示在囊性纤维化(CF)患者感染中有活性(Mougous et al.，2006 ；Potvin et al. ,2003)。II1-T6SS也与其他慢性感染毒力因子诸如涉及生物膜形成的psl 及 pel 座位共调节(Goodman et al. , 2004 ；Ryder et al. , 2007)。明显保守的T6SS体系结构如何可参与该广范围的活性是不清楚的。分泌系统可对宿主细胞发挥其效应至少I个机理已收获自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的研究。此生物的T6S-关联的VgrG-家族蛋白含有在需要胞吞和细胞间接触的过程中转位进宿主细胞细胞质的具有肌动蛋白-交联活性的结构域(Ma et al. ,2009 ；Pukatzki et al. ,2007 ；Satchell，2009)。含有具有发病机制中的想得到的作用的非_结构域的VgrG-家族蛋白的子集已称“进化的"VgrG蛋白(Pukatzki et al. ,2007)。此构型，其中效应子结构域大概依靠其与T6S细胞穿刺设备的融合转位进宿主细胞 细胞质，引起兴趣,但其可能不是通用的；多种含有T6SS的生物不编码“进化的”VgrG蛋白(Boyer et al. , 2009 ；Pukatzki et al.,
2009)。明白T6SS的功能的关键-如用任何分泌系统-是鉴定及表征输出的蛋白底物。自迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的EvpP和自豌豆根瘤菌(RhizobiumIeguminosarum)的RbsB是系统的建议的底物;但是，与T6S底物的预期的性质不一致,RbsB含有N-端Sec分泌信号，及EvpP与分泌设备的组分稳定地关联(Bladergroen etal. , 2003 ；Pukatzki et al. , 2009 ；Zheng and Leung,2007)。在此研究中，我们鉴定了 3种蛋白，称之为Tsel 3 (VI型分泌输出的I 3)，其为铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的H1-T6SS的底物。我们显示,这些之-一,Tse2,是毒素-免疫系统的毒素组分，且其能阻拦各种原核生物和真核生物的生长。尽管细胞内表达的毒素的混乱，我们发现,II1-T6SS-输出的Tse2特异性靶向细菌。在生长竞争实验中，对Tse2的免疫以依赖于密切细胞间接触和有功能的H1-T6SS的方式提供的明显的生长优势。分泌系统将Tse2有效靶向细菌,而不靶向真核生物细胞的能力,提示T6S可在细菌之间递送毒素和效应分子中起到作用。结果HI-T6SS通态及断态株的设计及表征在实验室培养条件下,H1-T6SS的活化在翻译后水平被磷酸酶PppA强烈阻遏(图1A)。我们显示，pppA的灭活导致Hcpl输出，及显示此可反映分泌设备中“通态”的引发(Hsu et al. ,2009 ;Mougous et al. ,2007)。这些观察导致预测，设备的额外的组分，及甚至分泌系统的底物,也在此状态输出。为了鉴定这些蛋白，我们寻求比较ApppA和AclpVl的分泌蛋白质组。后者缺乏H1-T6SS ATP酶，ClpVl由此保持在“断态”(图1A) (Mougouset al. ，2006)。为了探查是否通态和断态突变可调节H1-T6SS的活性，我们检定了它们的对铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) PAOl hep I-V中Hcpl分泌的效应(当存在时，-V表示指示的基因与编码水疱性口炎病毒G表位的序列的融合)。如所预期,相对于亲本株,pppA的缺失促进了 Hcpl分泌和Fhal磷酸化(图IB和C)。由于野生型株不分泌Hcpl至司检测的水平，使用ApppA背景计量AclpVl的效应。clpVl缺失向ApppA的导入消除了 Hcpl分泌，且此效应完全被c:[pVl的异位表达弥补(图1B)。这些数据指示，pppA和clpVl缺失分别足以活化及灭活H1-T6SS分泌系统。通态及断态分泌蛋白质组的质量光谱测量分析接下来，我们使用了 MS和光谱计数来比较存在于通态和断态铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株的分泌蛋白质组的蛋白(Liu et al. ,2004)。平均光谱计数(SC)值用于鉴定是否各蛋白在状态之间区别分泌。我们的MS分析的结果总结于表SI。重要的是,光谱计数的总数，以两个重复，在通态和断态之间是可比较的。在重复实验之间鉴定符合我们的过滤标准的总共371种蛋白(表S2h我们将蛋白分为3组类别I (Cl ;表83和S4)-以通态和断态存在,类别2 (C2 ’表S5)-仅以通态存在,及类别3(C3 ;表S6)-仅以断态存在。重复之间的重叠在Cl蛋白之中最大。鉴定总共314种Cl蛋白，其中249种在重复之间共享。Cl差异的显著级分可归因于,在重复I(Rl)相比在重复2(R2)中，在此类别中鉴定13%更多蛋白。为了评定我们的数据组的定量组分的精确度,我们测量了 Cl蛋白内的SC比(通态/断态)的分布(图1D)。由于我们未预期H1-T6SS应呈现对分泌蛋白质组的全局效应，我们被在通态和断态之间上调对比下调的那些蛋白之间的近似的分裂(50% ±2，以两个重复)所鼓舞。此外,状态之间的平均SC的变化低,且此值在重复中类似([Rl],I. 13±1.04 ；[R2], I. 15±0. 90)。仅30种Rl和33种R2蛋白产生> 2的SC比。如所预期，Hcpl在通态样品中过度呈现。的确，Hcpl是在两个数据组中最区别分 泌的蛋白(SC比[R1], 13 ； [R2] ,171)(0 1D)。断态细胞的分泌蛋白质组中Hcpl的存在提示制备物之内细胞蛋白混杂的特定程度。此混杂也被许多检测的蛋白的预测的或知道的功能所证明(表S2 S4)。Hcpl的高丰度(119SC平均)相对于平均蛋白丰度(10. 9SC)可能是贡献于断态样品中其检测的另一因素。接下来,我们分析了 C2蛋白-仅在通态观察的那些。在Rl (19)和R2 (20)中鉴定类似数的这些蛋白，且这些中的5种见于两个重复(表I)。C2对比Cl蛋白的重复性是可归因于它们的平均SC的差异；C2蛋白的平均SC是2. 6,对比Cl中的12。在Rl和R2中鉴定的C2蛋白占C2-R1中6种最丰富的中的5种，及C2-R2中10种最丰富的中的5种。各这些蛋白缺少知道的输出通路的分泌信号。这些蛋白的鉴定和它们的分泌的生物化学验证是随后部分的主题。Rl和R2中的C3蛋白的数和丰度稍微少于对应C2值。虽然如此,我们鉴定了在Rl和R2之间共同的3种C3蛋白(表I)。处于断态的这些蛋白的存在可能反映通过在分泌蛋白质组中显现的H1-T6SS的活性调节导致的基因调节的变化。序列分析指示,各这些蛋白含有预测的信号肽(Emanuelsson et al.,2007)。[由H1-T6SS分泌2种VgrG蛋白2种VgrG-家族蛋白，开放阅读框PA0091和PA2685的产物，是在Rl和R2中最丰富的C2蛋白(表I)。有趣的是，早先微阵列工作显示,PA0091和PA2685用HSI-1通过RetS杂交体2-组分传感器/应答调节物蛋白协同地调控，但是未研究在H1-T6SS中这些蛋白的参与(图 2A) (Goodman et al. 2004 ；Laskowski and Kazmierczak, 2006 ；Zolfaghar etal.，2005)。PA0091座位位于HSI-I之内，而PA2685座位见于缺乏其他明显的T6S元件的未连接的位点(图IA和2A)。为了与之前命名法保持一致,这些基因会此后称为VgrGl和vgrG4 (Mougous et al. ,2006)0为了确认MS结果，我们比较了野生型细菌中的VgrGl和VgrG4向含有通态(ApppA)和断态(AclpVl)突变的株的定位。与我们的MS发现一致,vgrGl-V和vgrG4-V背景中细胞和上清液级分的蛋白印迹分析指示，蛋白的分泌被PPPA强烈阻遏，及需要clpVl (图2B和2C)。这些数据显示,H1-T6SS输出至少2种VgrG-家族蛋白。因为尚未明白的原因，VgrG4-V迁移为细胞级分中的2个主要条带和上清液中的大量的高分子量条带。3种HI-T6SS底物的鉴定在Rl和R2中鉴定的余下C2蛋白是由ORF PA 1844, PA2702和PA3484编码的蛋白。有趣的是,早先研究鉴定了作为由铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)临床分离物表达的免疫原性蛋白的PA1844的产物(Wehmhoner et al.，2003)。3种蛋白的生物信息学分析指示，它们不彼此或与铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)之外的蛋白共享可检测的序列同源性。各蛋白由在于预测的具有第2假想ORF的2-基因操纵子的ORF编码。有趣地,我们注意到，3种未连接的操纵子，如HSI-I (其包括vgrGl)和vgrG4,被RetS负调控(图2A)。基于我们的分泌蛋白质组分析,我们假定，分别由PA1844, PA2702和PA3484编码的蛋白，今后称之为Tsel-3，是H1-T6SS的底物。为了测试此,我们在在铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株的诊断小组中异位地表达时分析了蛋白的定位。各蛋白的分泌特征在这 些株中类似；相对于野生型，ApppA显示了显著增加的分泌水平,且分泌水平在含有额外的hep I或c IpVl缺失的ApppA株中在野生型水平或野生型水平以F (图3A)。作为混淆因子排除蛋白的过表达，由于相关的背景中染色体-编码的Tsel-V的分泌特征类似于异位地-表达的蛋白的分泌特征(图3B)。最终,我们用表达clpVl的质粒互补了 ApppAAclpVltsel-V 中 Tsel-V 分泌。为了作为H1-T6SS底物而非结构组分进一步区别Tse蛋白，我们测定了它们对T6分泌设备的核心功能的影响。对各研究的T6SS根本性的是分泌Hcp-相关的蛋白的能力。在系统性分析中，Hcp分泌显示需要全部预测的核心T6SS组分,包括VgrG-家族蛋白(Pukatzki et al. , 2007 ；Zheng and Leung, 2007)。我们在 ApppA hcpl-V背景中产生 T含有全部tse基因缺失的株,及比较了在相同的背景中，此株与缺少vgrGl和vgrG4或clpVl的株中的Hcpl分泌。蛋白印迹分析揭不，Hcpl分泌在A cIpVI和A vgrGl A vgrG4株中消除，但是其未受tse缺失影响(图3C)。含有ClpVl的多蛋白复合物对于有功能的T6S设备是必要的(Hsu et al.，2009)。作为H1-T6SS功能的第2指示物，我们使用了荧光显微镜检，以检查含有clpVl与编码绿荧光蛋白的序列的染色体融合的株(clpVl-GFP)中此复合物的形成(Mougous et al.，2006)。与Hcpl分泌结果一致，CIpVI-GFP定位的斑点外观,其为适当的设备组装的指示，不依赖于tse基因(图3D)。另一方面,H1-T6S设备的组装需要的基因,ppkA的缺失,破坏了 ClpVl-GFP定位。总之,这些发现提供证据，Tse蛋白是H1-T6SS的底物。通过Gac/Rsm通路的去阻遏引发Tse分泌早先微阵列实验推荐,tse基因被RetS (Gac/Rsm信号传导通路的组分)紧密阻遏(Lapouge et al. , 2008)。在此通路中，RetS和2种其他传感器激酶，LadS和GacS的活性会聚而通过小RNA-结合蛋白RsmA交互调控铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)中的急性和慢性毒力通路的重叠组(Brencic and Lory, 2009 ；Goodman et al. , 2004 ;Ventre et al.,2006)。为了直接研究Gac/Rsm通路对tse表达的效应,我们监控了含有retS缺失的株的细胞-关联的及分泌的级分中Tse蛋白的丰度。我们的数据显示,Gac/Rsm通路的活化显著提升细胞Tse水平及引发它们经H1-T6SS的输出(图3E)。值得注意的是，AretS中Tse蛋白的分泌远远过量于ApppA中观察的(图3E,比较ApppA和AretS)。
Tsi2是保护铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)免于Tse2的必要的蛋白在铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)PAOl的公开的转座子插入库中tse2/tsi2座位之内的转座子插入的缺乏提示，这些ORF对于生物的活力可为必要的(Jacobs et al.，2008)。为测试此可能性,我们尝试产生tse2和tsi.2的缺失。虽然A tse2株容易构建，tsi2对于几种缺失方法是难办的。基于遗传情景和共调节(图2A),我们假定,Tse2和Tsi2可功能性地相互作用，且对于tsi2的需求可因此依赖于tse2。两种基因的同时缺失的成功确认了此假说(图4A)。我们的发现暗示，Tsi2保护细胞免于Tse2。为了进一步探查此可能性，我们将tse2导入A tse2 A t.si2背景。tse2表达的诱导完全消除了 A t.se2 A tsi2的生长，但是其仅对野生型细胞具有弱效应。这些数据展示，tse2编码能抑制铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)生长的毒性蛋白，且展示，tsi2编码同源免疫蛋白。我们基于此性质命名了 Tsi2 (VI:型分泌免疫蛋白2)。
Tsi2可通过涉及蛋白的直接相互作用的机理,或通过蛋白拮抗地对共同通路发挥功能的间接机理阻断Tse2的活性。为了测定是否Tse2和Tsi2物理学相互作用，我们在铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)中进行了共免疫沉淀研究。在Tsi2-V的沉淀物中特别鉴定Tse2,指示稳定的Tse2-Tsi2复合物(图4B)。这些数据提供对Tse2和Tsi2之间的功能相互作用的额外的支持，且它们提示，Tse2的Tsi2抑制的机理可能涉及蛋白物理关联。细胞内Tse2对广谱原核生物和真核生物细胞有毒性铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)广泛分散在陆生和水生环境中，且其也是具有多样的宿主范围的机会性病原体。像这样，自铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)输出的Tse2具有与一系列生物相互作用的潜力，包括原核生物和真核生物。为了研究Tse2可靶向的生物，我们在自各域的代表性的物种的细胞质中表达tse2。选择2种真核生物细胞用于我们的调查，源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和HeLa人上皮的细胞系。包括酵母主要为了多样性,但是这些生物也与铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)在相配的环境中相互作用，并可因此代表毒素的祀(Wargo and Hogan, 2006)。将酿酒酵母(S. cerevisiae)细胞用对各tse基因的半乳糖-诱导性表达质粒,或用空对照质粒转化(Mumberg et al. , 1995)。相对于其他tse基因和对照，tse2表达导致在诱导条件下生长48小时后可观察的集落形成单位的显著减小(图5A)。为了致Tse2效应对酿酒酵母(S. cerevisiae)的特异性,我们接下来测试了是否Tsi2可阻断Tse2_介导的毒性。tsi2与tse2的共表达恢复了活力至类似于对照株的水平(图5B)。此结果暗示，Tse2对酿酒酵母(S. cerevisiae)的效应是特异性的，且毒素可经类似机理在细菌和酵母中作用。我们的发现与对酵母有毒性的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)蛋白的早先筛选一致。Arnoldo等人发现的Tse2在9种铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)蛋白之中，在包括知道的毒力因子的505的库之内，对酿酒酵母(S. cerevisiae)最有毒性(Arnoldo et al. ,2008)。使用报告子共转染测定在HeLa细胞中探查Tse2对哺乳动物细胞的效应。产生含有tse基因的表达质粒及与GFP报告子质粒混合。相对于对照,报告子质粒用tsel和tse:3的共转染对GFP表达无冲击；但是,tse2质粒的包括减少了 GFP表达至背景水平(图5C和5D)。我们也注意到用tse2转染和对照转染的细胞之间的形态学差异，其在圆形细胞级分中明显(图5E)。这些是Tse2的特定效应，如相比对照,tsi2表达质粒包括进tse2/GFP报告子质粒转染恢复了 GFP表达及降低了圆形细胞级分。从这些研究,我们总结，Tse2在相配的真核生物细胞类型中对必要的细胞过程具有有害的效应。接下来我们质问了是否Tse2在除了铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)之外的原核生物中具有活性。我们测试的2种生物，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)。将两种生物用加工用于tse2,或作为对照，Tse2和Tsi2的诱导性表达的质粒转化。在各情况中，tse2表达强烈抑制生长，且用tsi2的共表达逆转了此效应(图5F和5G)。结合我们在酿酒酵母(S. cerevisiae)和HeLa细胞中观察到的效应,我们总结,Tse2是当细胞内施用时在广谱生物中抑制必要的细胞过程的毒素。铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)可革C向细菌但不革G向具有Tse2的真核生物细胞由于tse2表达实验指示，毒素可作用于真核生物(图5A E)，我们质问是否铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)可用HI-T6SS祀向这些细胞。我们对一组铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株测量了向HeLa和J774细胞的细胞毒性,包括Tse2分泌过多(AretS)和非-分泌背景(AretS AclpVl)。在分析的全部条件下,我们不能观察Tse2_促进的细胞毒 性或对细胞的形态学冲击，如在转染实验中观察(图6A和数据未显示)。此外,对检测Tse2或哺乳动物细胞细胞质中的其他Tse蛋白的尝试产生无转位证据(数据未显示)。我们也研究了对与铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)共培养的酵母的Tse2-依赖性效应；再次，无效应可归因对Tse2(图SI)。基于我们的数据,我们总结,铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)不可能利用Tse2作为针对真核生物细胞的毒素。此与早先报道的结果一致,其显示,缺少retS的株是在急性毒力-相关的表型中高度衰减的，包括巨噬细胞和上皮细胞细胞毒性(Goodmanet al. ,2004 ；Zolfaghar et al. , 2005),及小鼠中的急性肺炎和角膜感染(Zolfaghar etal.,2006) (Laskows ki et al. ,2004)。细胞内tse2表达对细菌生长的影响提示我们接下来研究是否其靶可为另一原核生物细胞。为了测试此，我们在关于它们产生,分泌或抵抗Tse2的能力加工的A retS背景中，用铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株进行了一系列体外生长竞争实验。这些株之间的竞争在液体培养基中进行或在多孔固体支持物上过滤后进行。既不产生,也不分泌Tse2,也不针对毒素免疫，冲击了液体培养基中竞争株的生长速率(图6B)。相反，当细胞在固体支持物上生长时观察到依赖于tse2和tsi2的惊人的增殖优势。在AretS和AretSA tse2 A tsi.2之间的生长竞争实验中，今后分别称之为供体和受体株,5小时后供体细胞是约14倍更丰富(图6B)。此完全是Tse2介导的,如自供体株的tse2的缺失,或tsi2添加到受体株，消除了生长优势。供体株之内的clpVl灭活确认，Tse2_介导的生长优势需要有功能的HI-T6SS (图6B)。重要的是,供体的总增殖在各实验中保持恒定,指示，Tse2抑制受体株的生长。为了检查Tse2可辅助生长优势的程度,我们进行了用及不用Tse2免疫的株之间的长期竞争。实验起始于约10 I的供体-受体细胞比，提高各受体细胞会接触供体细胞的概率。在48小时之后，Tse2供体株相对于缺少免疫的受体株显示了显著的104倍生长优势(图6C)。这些数据最终展示,铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) H1-T6SS可将Tse2靶向另一细菌细胞。在液体培养基中对比在固体支持物上进行的竞争之间观察到的差异提示，需要密切供体-受体细胞接触。我们未直接展示，Tse2转位进受体细胞细胞质，但是其是可能解释我们的数据，假定需要细胞接触及Tsi2是与毒素物理学相互作用的细胞质免疫蛋白(图4B)。讨论T6SS具有牵涉多种，明显差异的过程。很少例外，未知这些过程中分泌系统的作用模式。由于T6SS体系结构呈现高度保守的,我们将我们的研究基于假定,T6SS的多样的活性，包括单个生物之内的T6SS,必需可归因于由各系统以特定方式输出的多种底物蛋白。我们的发现支持此模型；我们鉴定了铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)之外缺乏直系同原物，及特别需要HI-T6SS用于它们的输出的3种T6S底物(图I和3)。细菌基因组编码大和多样的阵列的毒素-免疫蛋白(TI)系统(Gerdes et al.,2005)。这些可为对于质粒维持,应激应答,程序性细胞死亡,细胞-命运承诺和针对其他细、菌防御重要。Tse2不同于其他TI毒素，其通过大，特化的分泌设备输出，而许多TI系统毒素是不活跃地分泌的，或它们利用sec通路(Riley and Wertz, 2002)。此区别暗示,通过T6S设备分泌对于Tse2靶向关联环境,细胞或亚细胞隔室是需要的。的确，我们显示,通过T6S设备的Tse2靶向对于其活性是必要的(图6)。我们发现，当细胞内表达时，Tse2针对相配的细菌和真核生物细胞是有活性的(图4和5)。尽管如此，我们发现无铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)可将Tse2革巴向真核生物细胞，包括上皮和巨噬细胞来源的哺乳动物细胞的证据(图6A和数据未显示)。意外地,铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)有效将毒素革E向另一细菌细胞(图6)。这些发现,结合随后的新近观察，提供对如F假说的支持，T6SS可作为细菌间相互作用通路。第I，分泌系统存在，且在许多非-病原性，独居细菌中保守(Bingle et al.，2008 ；Boyer et al.，2009)。第2，有实验证据支持噬菌体T4及的分泌设备和尾蛋白细胞外组分之间的进化关系(Ballisteret al. , 2008 ；Leiman et al. 2009 ；Pell et al. 2009 ；Pukatzki et al. ,2007)。最终,2个新近报道牵涉了细菌间相互作用中保守的T6S组分,VgrG。沙门氏菌属(Salmonella)基因组的生物信息学分析鉴定了带有与细菌-靶向S-型脓菌素高度相关的C-端效应子结构域的一组“进化的” VgrG蛋白，及自奇好变形杆菌(Proteus mirabi I is)的VgrG蛋白显示参与物种内自我/非-自我识别通路(Blondel et al. ,2009 ；Gibbs et al. ,2008)。也明白，在特定实例中，T6SS已进化为作用于真核生物细胞。在至少2个报道中，T6S设备已展示将蛋白递送至真核生物细胞(Ma et al. ,2009 ；Suarez et al. ,2009)。而且，几种病原性细菌的T6SS是主要毒力因子(Bingle et al. ,2008)。结合我们的发现，我们断定,有2个宽组T6SS,靶向细菌的那些和靶向真核生物的那些。目前不可能排除给定T6SS可具有双特异性。但是，我们的不能检测真核生物细胞感染中Tse2的效应，且Tse2分泌过多株在急性感染动物模型中衰减(Laskowski et al.，2004 ;Zolfaghar et al. ,2006)，提示,T6S设备可为高度辨别的。在这点上，启发性地认为自细菌间相互作用通路进化了其他分泌系统。假定从细菌缀合系统进化了 IVA型和IVB型分泌系统(Burns, 2003 ；Christieet al. ,2005 ；Lawley et al. , 2003) 0这些系统在真核生物细胞中毒中有效,但是测量指示，底物转位进细菌以仅 1X10 7供体细胞的频度发生(Luo and Isberg, 2004) 相反，Tse2通过H1-T6SS靶向细菌呈现许多数量级更有效,如我们的测定中的供体株能有效抑制等同量的受体细胞的净生长。宿主适应了 IV型分泌系统,H1-T6SS代表在革兰氏阴性特化的分泌系统的细胞靶向特异性中的2个明显的极端。此外，它们显示，高程度的区别可在靶向真核生物和原核生物的通路之间存在。
Tse2和H1-T6SS的生理学关联靶向细菌仍是待研究的问题。我们起始了确定物种间相互作用中这些因素的作用的研究，但是我们尚未鉴定效应。此可为因为由铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)释放的可扩散的抗-细菌分子支配在图6中使用的条件下进行的生长竞争的结果(Hoffmanet al. ,2006 ；Kessler et al. , 1993 ；Voggu et al. , 2006) 0 在设计为允许这些因子的自由扩散,及由此更紧密模拟天然的设置的未来研究中，可缓和它们的作用。有趣的是，全部测序的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株呈现出编码t.se2和t.si2的直系同原物。此外，我们发现基因普遍地存在于44个随机选择的CF患者临床分离物的库之内(图S2)。尽管这些发现,仍可能Tse2-介导的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)间的相互作用可在天然的情景中关联。例如,其可不是毒素或其免疫蛋白的简单存在或缺失,而是决定相互作用的结果的表达这些特性的程度和方式。在临床分离物的当前调查中，我们注意到H1-T6SS活化的高程度的异质性，如通过IIcpl分泌水平判断(Mougous et al. ,2006 ；Mougous et a!. ,2007).当前研究中使用的野生型株不分泌Hcpl,且在此背景中，HI-T6SS不提供针对免疫-缺陷型株的生长优势(数据未显示)。但是,许多临床分离物的H1-T6SS活化状态模拟AretS背景，由此这些株有可能能在与其他细菌的竞争中使用Tse2。在此情景中，引起兴趣的是，tse及IISI-I表达通过Gac/Rsm通路经历严格的调节(图3E)。由于此通路应答细菌信号，包括敏感株和其他假单胞菌属(Pseudomonas)的那些(Lapouge et al. ,2008),想得到,细胞间识别可为Tse2产生和抗性的重要方面。Tse2的H1-T6SS-依赖性递送的细胞间接触需求提示，系统可在涉及相对固定细胞，诸如生物膜中包裹的细胞的情景中起到重要作用。患者用CF的多克隆和多种微生物性肺感染,其中细菌被认为在生物膜-样结构之内，是Tse2可提供针对铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的适合度优势的-一种设置(Sibley et al. , 2006 ；Singh et al. , 2000)。有趣地，铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)是特别擅长适应此环境及在此环境中竞争,且研究显不，其可甚至替换既有细菌(D, Argenio et al. , 2007 ；Deretic et al.，1995 ;Hoffman etal. , 2006 ；Nguyen and Singh, 2006) (Foundation, 2007)。如果 Tse2 在 CF 感染中，在铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的适合度中起到关键作用，此可解释自CF患者的分离物中观察到的提升的表达和H1-T6SS 的活化(Mougous et al. , 2006 ；Mougous et al. , 2007 ；Starkeyet al. ,2009 ;Yahr,2006)。实验过程细菌株,质粒和生长条件在此研究中使用的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)株源于测序的株PAOl (Stoveret al. ,2000) o使铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)于37 °C生长在根据需要补充了 30 u gm],1庆大霉素,300 U g ml,1羧苄西林，25u g ml,1依加珊，5 % w/v蔗糖，0. 5mM IPTG和40 u g mr1 X-gal (5-溴-4-氯-3-卩引哚基 -D-卩比喃半乳糖苷)的 Luria-Bertani (LB)培养基中。使泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)E264和大肠埃希氏菌(Escherichia coli) BL21生长在根据需要含有200 Ii g mr1甲氧节唆，50 Ii g ml-1卡那霉素,0. 2 % w/v葡萄糖，0. 2 % w/v鼠李糖和0. 5mM IPTG的LB培养基中。使用于与铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)缀合的大肠埃希氏菌(E. coli) SMlO生长在含有15 y g mr1庆大霉素的LB培养基中。用于诱导性表达的质粒包括用于铜绿假单胞菌(P. gaeruginosa)的 pPSV35，pPSV35CV 和 pSW196(Baynham et al. ,2006 ；Hsu et al. ,2009 ；Rietsch etal. , 2005),用于大肠埃希氏菌(E. coli)的pET29b (Novagen),用于泰国伯克霍尔德氏菌(B. thailandensis)的 pSCrhaB2 (Cardona and Valvano, 2005),及用于酿酒酵母(S. cerevisiae)的 p426-GAL-L 和 p423-GAL-L (Mumberg et al. , 1995)。如之前描述产生染色体融合和基因缺失(Mougous et a!. , 2006 ；Rietsch et al.，2005)。见用于特定克隆过程的补充性实验过程。分泌蛋白质组制备使细胞在含有如在合成CF痰培养基中定义的19mM氨基酸的Vogel-Bonner最小培养基中生长至光学密度600nm (OD6cw) I. (KPalmer et al.,2007)。HI-T6SS活性需要氨基酸存在(数据未显示)。蛋白如之前描述制备(Wehmhoner et' al. ,2003)。质量光谱法
使沉淀的蛋白悬浮于100 U I的50mM NH4HCO3中的6M脲,分别用二硫苏糖醇和碘乙酰胺还原及烷基化及，用胰蛋白酶(50 I蛋白胰蛋白酶比)消化。将得到的肽用VydacC18柱(Nest组)根据生产商的流程脱盐。将样品干燥至5 UL,重悬浮于0. 1%甲酸/5%乙腈及在LTQ-Orbitrap质谱仪(Thermo Fisher) .....t以一式三份分析。使用Sequest搜索数据(Eng et al. ’ 1994)及用肽/蛋白Prophet确认(Keller et al. ,2002)。使用光谱计数计算鉴定的蛋白的相对丰度(Liu et al. ,2004)。见补充性实验过程额外的MS过程。蛋白的制备和蛋白印迹如之前描述制备细胞-相关的和上清液样品(Hsu et al. ,2009)。如之前描述进行蛋白印迹(Mougous et al. ,2006),例外是Tse蛋白的检测需要在含有0. 05% v/v Tween20的Tris-缓冲的盐水(TBST)中、在5% BSA中的第一抗体温育。使用a -GSK检测GSK标签(Cell Signaling Technologies)。免疫沉淀在中-对数期通过于4°C离心(6, 000Xg,3min)收获在适当的添加剂中生长的细胞，及重悬浮于IOral的含有蛋白酶抑制物(Sigma)和溶菌酶(0. 2mg m],1)的缓冲剂I (200mM NaCl, 20mM Tris pH7. 5, 5%甘油，2mM 二硫苏糖醇,0. I % triton)中。通过超声处理破坏细胞，并通过于4°C离心(25，000Xg,30min)澄清得到的裂解产物。移出(Pre) ____匕清液物质的样品，并将残留物与100 U I的a -VSV-G琼脂糖珠(Sigma)于4°C温育2小时。将珠用15m:[的缓冲剂I洗涤3次，并通过离心沉淀。将蛋白用SDS-PAGE装载缓冲剂洗脱。荧光显微镜检通过离心(6，000Xg,3min)收获中-对数期培养，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,及用含有0.5mM TM-DPII(Molecular Probes)的PBS重悬浮至0D6QQ5。如之前描述进行显微镜检(Hsu et al. ,2009)。显示的全部像相同地操作。酵母毒性测定将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) BY4742 (MAT a his3 A I leu2 A 0lys2 A 0 ura3 A 0)用含有tsel, tse2，tse’3的p426-GAL-L,或空载体转化，并生长在SC-Ura+2%葡萄糖中(Mumberg et al. , 1.995)。培养物用水重悬浮至0D_1. 0,并连续稀释5倍到SC-Ura+2%葡萄糖琼脂或SC_Ura+2 %半乳糖+2%棉子糖琼脂。在摄影之前将板于30°C温育2天。将tsi2基因克隆进p423-GAL-L，并转化进带有p426_GAL_L质粒的酿酒酵母(S. cerevisiae)BY4742。使培养物生长在SC-Ura-IIis+2%葡萄糖中。
生长竞争测定将过夜培养物以适当的供体-受体比混合至在5ml LB培养基中约1.0X108CFU/ml的总密度。在各实验中，供体或受体株含有在中性噬菌体附接位点插入的lacZ(Vanceet a!. ,2005).此基因对竞争结果无效应。将共培养物过滤到47mm 0. 2 Ii m硝酸纤维素膜(Nalgene)及放置到LB琼脂上或以I 100接种到2ml LB(含有0.4% w/v L-阿糖,如果需要)及于37°C伴随振摇温育。将过滤-生长的细胞重悬浮于LB培养基及平铺在含有X-gal的LB琼脂上。细胞培养和感染测定将HeLa细胞培养及维持在根据需要补充了 10 %胚胎牛血清(FBS)和100 U g mF1青霉素或链霉素的Dulbecco氏修饰的eagle培养基(DMEM, Invitrogen)中。于37°C在5% CO2存在下进行温育。使用在96-孔板中以2. 0 X IO4细胞/孔的密度接种的细胞进行感染测定。在o/n温育后,将孔在IXHank氏平衡的盐溶液中洗涤和添加缺少丙酮酸钠和抗生素的DMEM0将细菌接种物以来自OD6mL 0培养物的50的多重感染加入孔。温育5小时后，使用CytoTox-One测定(Promega)测量百分率细胞毒性。瞬时转染，细胞变圆测定，及流式细胞分析将HeLa细胞以2. 0 X IO5细胞/孔的密度接种于24-孔平底部板，及在o/n补充了10% FBS的DMEM温育。使用阳离子脂质体根据生产商的流程进行报告子共转染实验。将转染的DNA的总量使用等同量的GFP报告子质粒(空pEGFP-Nl (Clonetech)) (tse表达质粒(源于pEGFP-Nl)之一)标准化,并指示非特异性质粒或tsi2表达质粒。使用自以40X放大率获取的3个随机场的相差像手动定量细胞变圆。在流式细胞术之前，将HeLa细胞洗涤2次,并重悬浮于补充了 0. 75% FBS的I XTOS。在BD FACscan2细胞分析仪上进行分析，并使用FlowJo 7. 5软件(Tree Star, Inc.)计算平均GFP强度。实施例2产生Tse2和Tsi2突变体并分别测试细胞毒性活性和针对Tse2细胞毒性的免疫的保存。测试表I中列的截短突变体的(a)如通过铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)PAOl Atse2Atsi2.中等位基因的异位表达判断的毒性，(b)如通过a-VSV-G蛋白印迹测定的表达，及(C)通过自PAOl A retS A tse2对比PAOl A retS A tse2 A clpVl制备的浓缩的上清液中指示的蛋白的存在测定的分泌。表I中列的突变体基于铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)PAOl序列(SEQ ID NO :2)。全部截短在它们的C-端与VSV-G表位融合。表I.经Tse2截短突变体的T6S的毒性和分泌。
存在的Tse2残留物1 毒性2表达3 分泌47-158+++
10 158:+~:
13-158-~-
权利要求
1.重组载体,其包含编码VI型分泌输出蛋白2(Tse2)的第I基因,其中第I基因可操作地连接于异源调控序列。
2.权利要求I的重组载体，其中载体包含一个或更多独特限制酶识别位点，且其中核酸插入子克隆进一个或更多独特限制酶识别位点破坏第I基因的表达。
3.权利要求I或2的重组载体，其中重组载体包含至少第I和第2重组位点，它们侧接可操作地连接于调控序列的编码Tse2的第I基因,其中所述第I和第2重组位点不彼此重组。
4.权利要求I 3之任一项的重组载体,其中第I基因包含能编码下列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7 或 SEQID NO :8。
5.权利要求I 4之任一项的重组载体,其中第I基因的调控序列被条件性地控制。
6.权利要求I 5之任一项的重组载体，其还包含可操作地连接于调控序列的编码Tse2解毒剂的第2基因。
7.权利要求6的重组载体,其中第2基因编码VI型分泌免疫蛋白2(Tsi2)。
8.权利要求4 8之任一项的重组载体，其中第2基因包含能编码F列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO :13。
9.权利要求4 6之任一项的重组载体,其中第2基因的调控序列被条件性地控制。
10.权利要求I 9之任一项的重组载体,其中载体包含质粒。
11.权利要求I 9之任一项的重组载体，其中载体包含病毒核酸。
12.重组宿主细胞,其包含权利要求I 11之任一项的重组载体。
13.权利要求12的重组宿主细胞,其中宿主细胞是原核生物细胞。
14.权利要求12的重组宿主细胞,其中宿主细胞是真核生物细胞。
15.用于可选择性克隆的方法，包括 如果无插入子存在，在适合于Tse2由重组载体表达的条件下培养权利要求12 14之任一项的重组宿主细胞,并 选择那些由于包含具有克隆进表达载体的插入子的重组载体而生长的细胞。
16.产生缺乏插入子的克隆载体的方法,包括 在适合于载体复制和Tse2表达的条件下培养权利要求12 14之任一项的重组宿主细胞，其中重组宿主细胞还表达Tse2解毒剂,并 从宿主细胞分离载体。
17.权利要求16的方法,其中Tse2解毒剂包含Tsi2。
18.权利要求17的方法，其中Tsi2包含下列氨基酸序列SEQID NO :10, SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO: 13。
19.重组载体,其包含编码Tsi2的核酸,其中核酸可操作地连接于调控序列。
20.权利要求19的重组载体，其中核酸包含能编码下列氨基酸序列的核苷酸序列=SEQID NO 10, SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO :13。
21.宿主细胞,其在其基因组中包含可操作地连接于调控序列的编码Tse2的第I重组基因。
22.权利要求23的宿主细胞,其还包含编码Tse2的解毒剂的第2重组基因，其中第2基因可操作地连接于调控序列。
23.权利要求21或22的宿主细胞，其中第I重组基因和/或第2重组基因作为染色体插入存在。
24.权利要求22 24之任一项的宿主细胞，其中第2基因编码Tsi2类型。
25.权利要求21 24之任一项的宿主细胞,其中第I基因的调控序列被条件性地控制。
26.权利要求21 25之任一项的宿主细胞,其中第2基因的调控序列被条件性地控制。
27.权利要求21 26之任一项的宿主细胞,其中宿主细胞是细菌细胞。
28.权利要求21 27之任一项的宿主细胞，其中第I基因包含能编码下列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO 7 或SEQ ID NO:8。
29.权利要求22 29之任--项的宿主细胞,其中第2基因包含能编码下列氨基酸序列的核苷酸序列=SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO :13。
30.权利要求I 11之任一项的载体,其中载体是线性的。
31.权利要求I 11之任一项的载体，其中载体经处理而减少缺乏目的DNA片段的载体的形成。
32.权利要求I 11之任一项的载体,其中载体适合于TA或拓扑异构酶克隆反应。
全文摘要
本发明提供其生存性可条件性地控制的宿主细胞，及可用于制备该宿主细胞及用于可选择性克隆的载体。
文档编号C12N15/86GK102741273SQ201080062504
公开日2012年10月17日 申请日期2010年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者J·莫格斯 申请人:华盛顿大学