专利名称：用于检测兽类疾病的免疫诊断测试方法
技术领域：
本发明涉及一种进行兽类疾病免疫诊断检测的装置和方法。本发明尤其涉及通过测定动物体液内的特定抗体检测动物体液内是否存在作为抗原的病毒或细菌蛋白。病毒或细菌蛋白通过高特异性抗原-抗体作用结合于压电晶体传感器表面的抗体上得到检测。
背景技术：
本文中用于阐明本发明的背景或提供有关实际应用方面的其它细节的出版物和其它材料，附于参考文献中并为简便起见集中列于参考文献的附录中。
在兽医诊断实验室，最常需要的诊断测试是诊断疾病，通常包括测试是否存在病毒或细菌抗原，或它们的抗体。传统的方法学在这个领域中的实际应用包括例如分离病毒、中和病毒、平板凝集、抑制血细胞凝集、免疫扩散、经典微生物学培养技术、高压液相色谱、和薄层色谱等，都是耗时和高成本的，需要数日或数周证实结果。为了加快和简化当前免疫分析技术，应用高特异性的抗原抗体反应愈加重要。诸如放射免疫分析(RIA)，免疫荧光分析(IFA)，酶联免疫吸附分析(ELISA)，和Western免疫印迹(WB)等技术已显示了可信的成功率并且现在已应用于兽医诊断实验室。
上述实验室中使用的大部分免疫分析法需要相对昂贵的设备和熟练的技术人员。大部分测试包括手工操作和多个程序。例如，用于传统病毒或细菌抗原/抗体检测的固相夹心免疫分析法包括下述步骤(a)在固相支持物上固定抗体/抗原肽，(b)步骤(a)中固定的抗体/抗原与可能含有抗原/抗体的样品反应形成免疫复合物，(c)用含去垢剂的清洗液清洗步骤(b)中的免疫复合物去除未结合的抗原/抗体，(d)免疫复合物和酶或放射性标记的二抗反应形成夹心复合物，(e)清洗除去未结合的标记二抗分离夹心复合物，(f)加入可用作酶或放射性标记物底物的复合物与夹心复合物反应并可通过比色检测催化反应。
在分析过程中使用的放射性同位素或酶标二抗存在的问题是使操作繁琐并提高了分析成本。初始样品处理到最终结果输送过程中的多个反应步骤和长时间孵育需要8-10小时。对试剂保鲜储存，昂贵的设备和稳定的电源供给的需要使得分析技术难以在没有良好装备的实验室或非本领域的情况下进行。
为克服这些需求导致的限制性进行的努力使多种快速免疫分析方法得到发展。例如，斑点酶免疫分析(DEI)，斑点免疫结合分析(DIA)，和各种颗粒沉积测试已发展成为诊断病毒/细菌血清抗体的常规实验室方法。在这些分析中，将抗原点到条状或片状硝酸纤维素膜上，而将血清加到吸附纸条上。用酶联抗球蛋白和产生的有颜色的不溶的底物产物检测抗原/抗体复合物。这个测试可以在相对短的时间(1-5小时)进行血清测试。尽管这些分析可以扩展到实验室环境以外进行应用，但它们的用途可能仍在某种程度上受限于酶类体系故有的温度敏感性，及特定抗免疫球蛋白试剂(Heberling和Kalter，1986)。
也进行过简化和修改传统免疫分析的其它尝试。美国专利5,695,928公开了一种能够在一个测试样品中进行多个测试物快速检测的免疫分析方法。该发明的特点是在初级抗原-测试物复合物形成的同时抽提和分离测试物。接着将初级抗原-测试物复合物捕获于可以促进快速有效检测的多缝隙固相支持物上。
美国专利5,630,924公布了通过毛细管电泳或其它电分离技术进行超快速结合分析的组合物，方法，和装置。
美国专利5,565,365公布了一种分析液态样品的系统，它通过检测在大量直径为特定大小的小珠上形成的配体/结合物的放射性进行分析。这种小珠是一种多孔物质位于与液体多孔筛相连的导管中，液体多孔筛的孔径小于小珠的直径。大量常磁颗粒悬浮于导管中，在足够大强度的磁场作用下排列成液体多孔筛。
美国专利5,554,340公布了一种液体样品分析系统，它使用了典型的荧光标签。该系统包括一种透镜，它能够聚集激发光和荧光，它还涉及一种液流管道，此管道横穿光轴并且通过透镜的聚焦区。管道中，邻近聚焦区有一个或多个机械筛，这些筛可以以珠的直径为函数捕获小珠的通过。这种小珠至少一部分用配基/结合物，如特异性结合配基，预先包被，基本上优选可通过激发光和荧光的透明材料。
美国专利5,212,065公布了一种快速免疫分析装置，包括作为试剂支持物和消耗试剂储存池的单孔膜。免疫分析装置指导其中样品和试剂的流动，消除试剂的侧向扩散和逆流，无需额外的外部装置。
美国专利5,236,824公布了一种原位激光磁力免疫分析(LMIA)方法，此方法排除了免疫分析方法中通常所需的B/F分离步骤。激光磁力免疫分析可以定量测定靶免疫物质，例如这种靶物质可以为抗原、抗体、淋巴细胞、病毒、肿瘤细胞和感染细胞，在分析物溶液中含有结合的和游离的物质。当分析物溶液中含有磁力标记的结合型靶物质，可以观察到激光束磁力电导散射瞬时增加，而在仅含有相关试剂的对照检测溶液中未见此增加。磁力电导LMIA装置包括磁力梯度生成仪，它构成原位LMIA的主体部分。
进行抗原或抗体分析的另一种方法是使用抗原/抗体生物传感器。生物传感器具有廉价仪器的优势，可以在实验室以外的地方使用并由非熟练人员加入样品；理想状况下可以快速获得结果。免疫传感器既可通过类似于免疫分析的直接竞争或置换反应或者通过直接改变传感器输出检测抗原/抗体浓度(Karube和Suzuki，1986)。对于前一种的系统类型，传感器传感范围涉及光学机制、电流计机制、和放射化学机制。与传统免疫分析类似的是，这些检测方法通常需要使用标记的受体并且在完全分析前需要几步预备步骤。另一个传感器系统是一种质量检测传感器，它可以通过直接改变传感器输出监测抗原-抗体反应，这种传感器系统能够直接通过检测质量的变化监测抗原抗体反应。分析的原理和程序很简单并且排除使用任何潜在的危险材料。这种系统类型的实例之一是压电(Pz)晶体装置。有了这种系统，既可以在气相也可以在液相中进行分析。
Pz晶体装置由夹在两层金属电极之间的夹心型石英晶体晶片组成。电极使得该装置与以共振频率驱动石英晶体的外部振荡电路连接。频率大小决定于晶体质量，以及与晶体电极区相连的任一层电极物质。电极表面质量的变化由此改变石英晶体微平衡(QCM)装置的频率。使用压电振荡器作为可能的生物医学传感器的根据是频率变化和晶体表面质量负载的关系，用下述方程式表示ΔF＝-2F02Δm/A(ρqμq)1/2其中ΔF是测量的频率变化值，F0是Pz晶体的基频，A是指包被的面积，Δm是指表面沉积造成的质量改变，ρq是石英晶体的密度(2.648g cm-3)而μq是剪切系数(对AT切割的(AT-cut)石英晶体为2.947×1011g cm s-1s-2)。质量敏感度表述为S＝2F02/(ρqμq)1/2对于10MHz压电晶体，质量敏感度S＝0.227Hzng-1cm2，推测4.4ng/cm2的吸附导致约1Hz的频率变化。
以Pz晶体为基础的免疫传感器技术联合使用Pz装置、蛋白固定、和抗原-抗体反应。构建Pz免疫传感器的关键是通过表面修饰而建立敏感的抗原或抗体受体层从而可选择性吸附样品中待分析的物质。
用于制备生物传感器的蛋白固定方法包括物理吸附于支持物上(金属或聚合物)，捕获于膜上，和共价结合于支持物上(Williams和Blanch，1994)。所有的方法都具有各自的优点，例如，物理方法试验简便并被视为温和的偶联方法，能够保护蛋白的活性。然而，在特定条件下，这种结合在某种程度上是可逆的并且表面蛋白结合作用没有共价偶联作用力强。共价固定法中，化学键发生于表面和附于其上的物质间。尽管通常共价结合比其他固定方法复杂，但它提供的是一种最不可逆的表面结合作用，这对传感器的敏感性有利。而且，共价结合蛋白在操作条件下相对稳定。通常，蛋白固定的先决条件是保持活性、充分地结合、及包被蛋白与包被支持物的强烈粘附作用。不同的固定方法传感器的敏感性不同并适合于不同类型的蛋白固定。
Shons等首先描述了使用抗原作为压电晶体包被物(1972)，其基于使抗原吸附于一低能量塑料涂层，于1-3二[三氟甲基]苯中的nyerbar C(30％)溶液，提供了能够与蛋白形成疏水键的薄层。用抗原包被后，晶体暴露于未知量的抗体溶液中。抗体和抗原包被晶体间的免疫反应导致抗体的免疫结合。质量负载造成的频率改变与溶液中特定抗体的浓度成比例。
美国专利4,242,096公开了直接检测液体样品中抗原的免疫分析法，这种方法中抗原共价包被于晶体上，该晶体具有诸如聚(2-羟基-3-二甲氨基-1，4-丁烷)的聚合物单层。美国专利4,236,893和4,314,821及其它专利公布了首先使用聚合物引发表面再吸附抗原的方法。美国专利4,735,906公布了使用表面改良形成硅氧烷聚合物单层的晶体固定蛋白，进而通过氨基键固定蛋白的方法。Bastiaans(美国专利4,735,906)公布了在液相中使用ST切割的压电SAW装置进行免疫分析的方法。晶体表面经硅烷衍生物，甘氨酰氧丙基三甲氧基硅烷(GOPS)改良。新加坡专利申请9801211-5(S.F.Y.Li)公开了自组装固定技术，通过该技术，传感器系统敏感性优于其他固定方法。
重组技术在蛋白质生物技术中占有重要地位，通过这项技术可以获得大量基因工程产生的重组蛋白。生产重组蛋白的目的可分为四大类(Fanks，1993)1)获取大量蛋白；2)研究点突变蛋白；3)生产蛋白用于生物技术；4)体内代谢操作。尤其是，例如，酶免疫分析的发展需要大量结构明确的蛋白作免疫原和酶标示踪剂。近年来，使用重组技术产生的特定病毒或细菌抗原作为血清学测试中的保护性免疫原已引起越来越多的兴趣。本文所要说明的是，重组蛋白或重组抗原是从克隆了蛋白或抗原基因的机体或细胞或机体或细胞的子代中制备的，其中重组蛋白可以是融合蛋白。
本发明综合了Pz传导器及重组蛋白为基础的免疫分析进行动物体内病毒或细菌疾病的诊断。这样配置的Pz晶体传感器能够直接感受晶体的质量变化而监测抗原-抗体反应。已证实这对克服传统免疫分析方法的局限性是有帮助的。这项新技术的显著优点如下1)本系统成本低并能够在没有装备的实验室进行操作；2)基本设计和操作相对简单；3)易于实现实时显示的结果及易于迅速进行原位测试；及4)极少使用危险材料而使用未标记的温度敏感性低的并可以在20-25℃稳定储存和装运的试剂，这不同于传统的免疫分析法。
肠炎沙门氏菌(SE)是家禽工业的主要难题。近十年来SE是许多国家食物中毒的人体内分离出的主要沙门氏菌血清型。这种现象与污染这些血清型的家禽和鸡蛋的数量增多相关。从临床和环境中收集的样品中分离沙门氏菌的细菌学技术既辛苦，费时，又昂贵。因为沙门氏菌抽提本身的不连续性和可操作样品的数量不可能鉴定整个肠炎沙门氏菌感染的群体。然而，感染诸如肠炎沙门氏菌的侵袭性血清型的小鸡会产生针对该感染微生物的永久性免疫球蛋白G的反应。这样感染肠炎沙门氏菌鸡群的大量血清学筛选提供了一种相对更廉价的更可行的方法，其结果至少与细菌的方法相同。Thorns等(1996)建立ELISA为基础的肠炎沙门氏菌血清学测试。这个方法的根据是传统固相免疫分析法，在其中首次描述了肠炎沙门氏菌菌株命名为SEF14的新型菌毛抗原并预先将其包被于固相支持物上。通过典型的ELISA程序定性检测小鸡血清和蛋黄中的SEF14特定抗体。美国专利4,689,295号公布了一种检测食物样品中是否含有肠沙门氏菌的方法。包括至少提供一种能够选择性杂交沙门氏菌DNA形成可检测复合物的DNA探针，将DNA探针与食物样品中的细菌在探针可以与存在于食物样品中的沙门氏菌DNA杂交的条件下进行反应形成杂交DNA复合物，及检测杂交DNA复合物指示食物样品中沙门氏菌的存在。
猪生殖和呼吸综合征(PRRS)在全世界对养猪业而言都是一种重要的影响经济的疾病。PRRS病毒(PRRSV)，属于动脉炎病毒属正链RNA病毒，导致了这种疾病。当前诊断这种疾病的根据是1)临床迹象，其是急性爆发的特征，但在诊断轻微疾病时并不很有效；2)分离病毒，由于费时和不够可信很少使用；3)聚合酶链式反应(PCR)测试PRRS抗原；及4)应用包括免疫过氧化物酶单层分析(IPMA)、间接酶联免疫吸附分析(ELISA)和间接免疫荧光分析(IIFA)的血清学分析简要分析猪群。
美国缅因州IDEXX实验室公司，拥有一系列用于检测病毒或是细菌感染动物疾病的诊断测试抗体。IDEXX的肠炎沙门氏菌抗体测试试剂盒和PRRS抗体测试试剂盒的根据分别是竞争性和夹心酶联免疫分析(ELISA)技术。这些特定抗体测试试剂盒中，提供有抗原包被的平皿和所有试剂(包括酶联抗体，底物，样品稀释剂，清洗缓冲液，阳性/阴性对照，等)。测试程序包括样品孵育、酶联抗体孵育底物孵育、及多步清洗等步骤。最终信号通过分光光度计检测。整个程序(从接触检测样品到包被平皿)需要3-5小时，每个测试花费US$3-5，而且需要良好装备的实验室和熟练技术人员进行分析。尽管证实这些分析具有高度准确度，敏感性及特异性，上文提及的限制性使得在野外条件下进行大量原位筛选测试较难。
发明目的因此本发明的目的是提供诊断兽类疾病的装置和方法，其涉及检测病毒或细菌抗原的特异性抗体。本发明的另一个目的是检测病毒或细菌特定抗原。
本发明的再一目的是提供利用重组蛋白作受体物质制备Pz晶体传感器和检测抗原特定抗体的方法。
本发明另一个目的是提供简化和耗时短的检测肠炎沙门氏菌和PRRSV感染疾病的方法。
发明概述本发明提供针对兽类疾病的免疫诊断测试方法，涉及检测存在的病毒或细菌抗原或其抗体。一方面本发明装置包括利用Pz晶体作反应载体的免疫传感器。另一方面，重组病毒或细菌抗原固定于晶体表面作为敏感受体。Pz晶体装置可以感应晶体表面抗原-抗体反应造成的质量变化。
肠炎沙门氏菌(SE)或PRRSV检测方法包括通过共价或物理法将SE或PRRSV蛋白固定于晶体表面制备Pz传感器。考虑使用最小量的蛋白可采用浸渍或滴落包被的技术。用特定试剂封闭包被表面然后将其在适当时间内(从几秒到几小时)暴露于怀疑含有SE或PRRSV抗体的待测样品中(例如，小鸡血清，蛋黄，猪血清)。检测制备的晶体与样品孵育前后的频率。频率改变或不存在频率改变说明存在或不存在靶抗体。除蛋白偶联程序外，还公开了包括清洗缓冲液、封闭试剂、和检测样品稀释比例等其它技术细节。
附图简述
图1是Pz晶体传感器系统的示意图。
图2是流程图，显示了使用特异敏感材料组装Pz传感器的过程和样品的运行过程。
图3是用于浸渍包被过程的微量容器示意图。
图4说明了Pz传感器检测靶抗体的原理。
图5显示了使用肠炎沙门氏菌抗体的阳性和阴性对照进行检测引起的频率变化情况。
图6显示了检测35份未知鸡血清样品中肠炎沙门氏菌抗体的频率变化情况。
图7显示了7份已鉴定的阴性蛋黄和12份已鉴定的阳性蛋黄样品的SE-Pz传感器检测结果。
图8显示了制备的Pz传感器蛋白结合数量和敏感性间的关系。
图9简述了41份猪血清的测量结果。A组是阴性样品，B组是阳性结果，C组是未知样品。
图10显示了制备的PRRSV Pz传感器的多次使用性。
图11A显示了再生PRRSV Pz传感器的敏感性。图11B显示了再生SE Pz传感器的敏感性。这两个图中○是阳性对照1，●是阳性对照2。
图12显示了硫醇化合物处理过的SE Pz传感器表面，使用后用重镉酸(●)和热Piranha(○)再生的能力。
图13显示了重镉酸溶液对硫醇化合物(●)和γ-APTES(○)处理晶体的再生能力。
发明详述参照附图可以理解Pz晶体装置作为传感器系统的详细过程。
图1显示了常规的Pz晶体装置，它有一个金属电极20，沉积于晶片22的两侧。这两个电极与分别产生和检测共振频率的振荡器电路24和频率计数器26相连。如Shons等人(1972)所述的标准方法，使用AT切割的石英晶体的薄磁片，其两侧有两个电极。由于石英的压电特征和晶体取向，运用电极间的电压使晶体产生剪切变形。这些电极诱导产生垂直于石英晶片表面的振荡电场。在石英晶片间，振荡电场机械振荡产生持续的波。通过在振荡电路里包括晶体，产生共振，其中电子的和机械的振荡与石英的振荡基频相近。振荡电路和频率计数器在本领域中是众所周知的，如美国惠普公司的HP5213A，详见Breckenstein和Shay(1985)所述。基频依赖于晶片的厚度、化学结构、形状和质量，可以用通用计数器判定晶片的基频。最常用的晶体是10-16mm圆片形式的5、9或10MHz石英，其厚度为0.15mm。经常使用的金属为金、银、铝或镍。本发明中，所用的晶体是AT切割的10MHz石英片，晶片的直径为14mm，厚度为0.2mm。金电极的直径为5.1mm，厚度为100nm。此晶体的质量敏感度约为0.902ng/Hz。
Pz晶体装置作为免疫传感器系统，包括构建传感器和检测样品。Pz晶体构建成传感器通常包括用特异性生物受体进行表面修饰形成界面。此分析基于把特异性相互作用转化成频率信号。当制备的传感器与样品接触，包被的界面与被检测的分析物相互作用，导致频率信号改变，直接用于定量或定性分析靶分析物。
图2显示了构建基于Pz晶体的生物传感器和测试样品的详细过程。
首先，晶体尤其是金属电极表面必须用适宜的酸、碱和有机溶剂清洗干净。针对不同的表面修饰程序，采用合适的清洗方法。例如，为建立基于硫醇化合物的自组装单层，首先考虑使用热piranha溶液。热piranha溶液可以去除任何氧化剂，这样得到亲水性的金表面。另一种清洗方法是用碱和酸交替浸泡晶体，然后它可用于聚合物修饰。碱和酸浸泡后，用蒸馏水和有机物清洗。在干燥条件和大气压力下，测量清洁晶体的基频作为F0。
本发明使用了几种常规的蛋白固定化方法，包括直接物理吸附于稀有金属电极、共价结合于硅烷化的晶体、共价结合于硫醇化合物修饰的表面和物理吸附于疏水聚合物(聚苯乙烯)修饰的晶体。
稀有金表面上蛋白的物理吸附基于强不可逆疏水性硫醇-金相互作用(Horisberger和Vauthey，1984)。经实验验证此方法简便并且无需化学步骤修饰金表面。热piranha溶液处理过的晶体(F0)直接与含有生物分子的溶液孵育，经过适宜的时间，分子吸附到晶体表面。与生物分子孵育后的共振频率为FB。F0-FB与生物分子结合的数量相关。
通常还使用共价固定。共价结合过程一般包括用适宜的第一种化合物修饰晶体，由此把目的官能团引到晶体表面，在晶体表面和粘附的样品间形成共价键。最常使用的活化官能团包括伯胺、硫醇基、羟基以及羧酸。例如，聚氮丙啶(PEI)或γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(γ-APTES)修饰为晶体表面提供氨基基团；任何硫醇化合物与末端-COOH基团可为晶体提供-COOH修饰的表面。为了活化功能性化学修饰的表面，有时使用第二种化合物作为交联或偶联试剂。通常，交联或偶联试剂可以在活化的生物材料与修饰的表面之间提供额外的化学键，或者进一步活化修饰的表面。
在传统的免疫分析技术中，最广泛使用的固相材料是96孔微滴板，其用疏水性聚合物制成，如聚苯乙烯(不能弯曲的“刚性”平板)或聚氯乙烯(PVC，可弯曲平板)。在非极性蛋白亚结构和聚合物之间，抗原或抗体通过疏水性相互作用很容易粘附到塑料表面(Crowther，1995)。在Pz传感器制造中，蛋白结合于疏水性聚合物修饰的晶体，就是基于这篇参考文献的思路。这个固定化构思与传统的免疫分析很相似，并且很容易为具有免疫学背景的人理解和接受。与共价固定化相比，此方法相当简单，因为在晶体接触待固定蛋白前，仅需要使用第一种化合物进行一步聚合物修饰。
虽然固定生物分子有很多方法，但许多方法有一种或几种不足之处。总的来讲，方法的选择依赖于生物分子的特性以及传感器的期望性质。
为了进行化学修饰或蛋白固定，可以采用几种包被技术包括浸渍法、滴落法和旋转法。浸渍包被法是利用在合适溶剂中的合适浓度的待包被材料通过物理或化学作用吸附到晶体上。此法易于操作，只需把晶体浸渍在含有待包被的化学/生物化学物质的溶液中一段时间，即可包被。此技术遇到的一个问题是需要大量的溶液，以使晶体全部浸没其中。滴落包被法是把包被材料几微升一滴，逐滴滴到晶体表面。浸渍法确保晶体表面与溶液间长时间相互作用，并使表面与溶液充分接触。然而，滴落法因为溶剂的扩散和蒸发使相互作用的时间受限，会出现晶体表面和溶液液滴间接触不均匀的问题。但这种方法适于用聚合物包被，因为聚合物包被的量易于根据溶液浓度和液滴体积计算。此方法中，聚合物溶解于适宜的溶剂，滴加到高速旋转的晶体上，溶液展开，通过晶体表面形成一层均匀的薄膜，溶剂蒸发把聚合物膜留在晶体表面。
在整个制备Pz免疫传感器的过程中，根据不同的包被材料和不同的反应条件单独或联合使用以上提到的包被技术。
图3是适于用最小量贵重蛋白浸渍法包被晶体的容器示意图。它是用环氧树脂粘合的显微镜载玻片制成，尺寸为54mm×12mm×1mm，适合于同时浸渍三个晶体。使用这种特制容器，每个晶体有200μL包被蛋白足够。在最佳的蛋白浓度下，抽提的微克级蛋白足够包被每个晶体。
在使用免疫分析和免疫传感器时，运行样品前一定要防止干扰蛋白非特异性吸附到包被的固相或制备的传感器的传导器上。检测样品时，非特异吸附可导致不希望的干扰蛋白的吸附。常用的阻止非特异吸附的方法包括用封闭试剂孵育包被的晶体，这样未占用的活性残基用非活化蛋白封闭。在常规的免疫分析实验中，通常使用牛血清白蛋白、人血清白蛋白、酪蛋白、明胶、去污剂和脱脂奶粉等(Crowther，1995)。本发明根据不同情况的需要采用适合的封闭试剂。封闭的方法采用浸泡包被晶体或滴加该封闭液于包被表面。在敏感蛋白固定后采用此程序，与受试样品孵育时，可以阻止非特异性免疫反应造成的物质吸附。
清洗的目的是为了分离结合的与未结合(游离)试剂。在传感器制备阶段，使用包被过程的溶剂进行清洗，然后再用蒸馏水洗涤。为了监测整个包被过程，在干态下检测F0、F1和F2的值。两个连续步骤间的ΔF值与附着物质的绝对数量相关，可以通过Saraubery方程计算。晶体间每个固定化过程的频率改变的一致性使晶体间蛋白结合数量一致，进而确保样品检测的可重复性。
生物分子固定化和封闭后，为了维持等渗性，使用的清洗液通常是具有缓冲能力的PBS(0.01-0.1M，pH7.4)，因为绝大多数抗原-抗体反应在这种条件下是最优的。除了保持传感器上固定蛋白的活性，另一个关键问题是保持其稳定性，因为它会影响传感器的长期稳定性和敏感性。本发明需要多次洗涤，这是为了保证固定蛋白的稳定性(FB′，FB″……)。多次洗涤步骤间频率改变与否暗示是否出现解吸附。
图4描述了制备Pz传感器的原理，该传感器具有固定的敏感蛋白层以检测动物体液中特异性抗体。28是Pz晶体；30是包被的敏感蛋白(抗原)；32是特异于包被抗原的靶抗体；34是非活性封闭蛋白；36表示其他抗体；38表示其他血清组分。根据本发明此检测程序包括以下步骤1)获得在干燥状态下包被和封闭晶体的共振频率FR；2)受试样品溶液与晶体的反应性表面孵育；3)洗去未结合物质并干燥晶体；4)检测晶体的共振频率FS。与样品孵育前后的频率变化(FR-FS)的存在与否说明了是否存在针对抗原的抗体，并为诊断性检测给出答案阴性/阳性或是/不是。
抗体与包被抗原间的反应依赖于孵育步骤的分布、时间、温度和pH值。孵育的温度通常是37℃或室温。孵育时间从几分钟到1小时。本发明的孵育步骤包括将包被晶体浸渍到样品中或把样品滴加到晶体表面并使溶剂挥发。所需的时间和温度依赖于每个不同的免疫反应系统。本发明的缓冲条件由PBS缓冲液控制，维持在pH7.2。
用过的晶体可以再生和重复使用几次。如果制备的晶体与阴性样品孵育，仅产生很小的信号改变，可以重复进行其它检测。另外，用过的晶体使用某些溶剂完全剥去包被物，重建新鲜的金表面，使之再生。凭借新的表面修饰，再生的晶体可以用于包被任何其它的物质。在这种意义上讲，晶体没有使用次数的限制。
已证明，基于Pz晶体的免疫传感器廉价、简便，并且能快速检测。一旦敏感层固定于Pz晶体的表面，所需的分析时间为几分钟到1小时。而且，此分析技术需求很低，方法简便并且无需复杂的实验设备。
本发明进一步详述于下面的实施例中，这些实施例用于阐明本发明，本发明并不限于此。所用的本领域熟知的标准技术或特殊技术描述如下。
实施例1制备用于检测小鸡肠炎沙门氏菌疾病的Pz传感器A)制备重组肠炎沙门氏菌(SE)抗原鉴定了编码小鸡肠炎沙门氏菌血清型的独特序列。对序列的已知使检测肠炎沙门氏菌成为可能。利用了鞭毛蛋白部分基因序列克隆(GenBank登录号Z15068)中核苷酸754-1023，编码90个氨基酸残基(SEQ ID NO2)的270bp序列(SEQ ID NO1)。该99个氨基酸多肽与感染肠炎沙门氏菌的小鸡血清特异性反应。通过聚合酶链式反应(PCR)技术用肠炎沙门氏菌菌株13076的基因组DNA扩增该序列。将PCR扩增产物插入细菌表达载体谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因下游，这样当基因表达时产生重组融合蛋白(连接99个氨基酸多肽的GST)。转化此载体到细菌宿主大肠杆菌JM105感受态细胞中。接种含适当重组质粒的大肠杆菌细胞单克隆于有70ug/mL氨苄青霉素(加入氨苄青霉素是为了筛选转化细胞)的1mLLuria-Bertani中。4小时后，1∶10稀释培养物并在37℃ 250rpm振荡培养10小时。在适当大小的摇瓶中再以1∶10稀释培养物并在上述条件下继续生长。当培养物O.D.600达到0.6时，加入终浓度为2.5mM的IPTG(异丙基硫代-β-半乳糖苷)并继续培养4小时。收集细菌细胞沉淀并用裂解缓冲液重悬细胞沉淀(50mM Tris pH8，0.3mM NaCl，0.5mM EDTA，0.5％Tween 20)。超声处理细菌细胞，10000xg离心20分钟。继而蛋白从沉淀进入上清中并完全溶解于含1M，6M，和8M尿素的裂解缓冲液中。蛋白的每一步纯化均用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和考马斯亮蓝染色分析。大部分重组蛋白存在于上清和1M尿素提取液中。接着使用从法玛西亚生物技术获得的试剂盒经GST亲和层析柱纯化这些组分中的重组蛋白。再用SDS-PAGE分析显示蛋白纯度达98-99％。根据序列估算蛋白分子量为9000且SDS凝胶电泳确定为35000。使用蛋黄(从鸡蛋中获取)和阴性对照及天然和实验感染的小鸡血清阳性对照进行Western印迹鉴定纯化的重组蛋白。B)制备SE-Pz传感器本发明中采用三种传统蛋白固定程序在晶体表面包被一层重组肠炎沙门氏菌蛋白以制备Pz传感器。已证实这些方法可以确保不损失蛋白活性又有同样量的蛋白结合。C)通过自组装单层技术进行固定用热Piranha溶液(30％H2O2∶H2SO4(1∶3))清洗带有金电极的制备好的10MHz AT切割的晶体(购自ICM公司，Oklahom美国)。Piranha溶液涂于金表面保持5分钟，然后用蒸馏水彻底清洗电极表面。接着用95％乙醇清洗后再用蒸馏水清洗。这个步骤重复两次。最后用氮气流吹干电极表面并记录共振频率(F0)。
本试验中，为了共价结合所说的SE抗原，首先用4-氨基苯硫酚(ATPh)修饰金电极表面，该分子在一侧提供硫醇基团而在另一侧提供氨基。同时硫醇基团自发吸附在金表面确保了氨基朝向界面并发挥功能基团的作用，从而可以通过交联试剂与蛋白的其它氨基作用而固定蛋白。立即将新清洗的晶体浸渍于20mM ATPh(第一种化合物)于二甲基亚砜(DMSO)中过夜以达到所说的这种固定。用蒸馏水洗后在空气中干燥，在2.5％戊二醛(GA)(第二种化合物)于PBS中浸渍修饰的晶体1小时进一步活化已获得的氨基。在用PBS缓冲液和蒸馏水清洗后，进行蛋白孵育。
在包被晶体上滴一小滴蛋白是最常采用的制备敏感层的技术，尤其是在抗体包被中。在本试验中，首先研究了这项技术。这包括在活化晶体每一面各加5uL浓缩SE蛋白溶液(500ug/mL)并在37℃孵育直到溶液完全蒸干。然而，不幸的是，此方法不能保证所有的包被晶体都能固定目的量的蛋白(根据某种频率的变化)。原因可能在于此方法提供的孵育时间有限及纯化重组蛋白使用的溶液有0.1％的SDS。为了克服这些问题，发展了另一项浸渍包被技术，即将修饰晶体浸渍于稀释的SE PBS溶液中(25ug/mL)并在37℃孵育希望的时间(1-2小时)。本技术的基础是设计并使用了一种大小是54mm×12mm×1mm，容量是648微升的自制微量容器。这项独特的设计可以同时浸渍三块晶体，而且典型地，每一块晶体只需5ug重组蛋白。
这一方法更适于重组蛋白的包被，因为不仅可以确保充足的孵育时间并且缩小了所需蛋白的量。而且更长的孵育时间可以使用更低浓度的包被蛋白。在本实施例中，使用的SE最大浓度是25ug/mL，结合的量与表面的饱和度相关，即，频率不再变化。而且，稀释的蛋白可以使阴离子去垢剂SDS含量达到最低并减弱了它对蛋白固定的妨碍作用。除此之外，由于浸渍法确保了晶体和蛋白溶液之间充分而一致的接触，对改变与不同包被晶体结合的蛋白量的不一致性是有利的。滴落和浸渍-包被技术SE结合量的比较示于表1.1。
表1.1对应频率变化的SE结合量*方法 滴落 浸渍ΔF(Hz) 165.3±33.2 256±23.3结合能力(nmol/面)0.0021 0.0032*至少8块晶体的平均值D)用硅烷化法进行固定另一种包被程序是基于硅烷化法。用1.2N NaOH清洗晶体20分钟后用1.2N HCl清洗5分钟。再用蒸馏水清洗晶体并在空气中干燥。接着在晶体表面加几微升浓盐酸放置1-2分钟。最后，用蒸馏水和乙醇清洗晶体。
首先在含5％氨基丙基三乙氧基硅烷(γ-ATPES)的丙酮中浸渍洗净的晶体1小时。用丙酮和蒸馏水洗后(F1)，后续程序与APTh法相同，包括进一步用GA活化(F2)及最后与25ug/mL重组SE蛋白浸渍孵育(FB)。接着的多步清洗可以确保包被的稳定性(FB′，FB″)。E)通过聚苯乙烯法固定如上所述，用酸碱交替法清洗晶体。室温下将清洗的晶体浸渍在溶有聚苯乙烯珠的甲苯中30分钟，通过物理吸附形成聚合物膜。用乙醇和蒸馏水清洗晶体后(F1)在适当的时间内将带有聚合物膜的晶体浸渍于重组SE蛋白包被缓冲液中(FB)。
聚苯乙烯膜的厚度决定于聚合物溶液的浓度。本例中采用3mg/mL，此聚合物包被量相应的频率变化是1196±325Hz。尽管9mg/mL聚合物提供更厚的聚合物包被，相应的频率变化是4919±325Hz，但包被蛋白的量不再增加。这说明3mg/mL聚合物提供了饱和的聚合物包被并且包被物覆盖了整个晶体。
根据疏水作用将蛋白吸附于塑料上。相互作用的几率决定于蛋白浓度，包被pH，温度，和孵育时间。在优化包被过程中晶体于37℃在SE溶液(25ug/mL于50mM碳酸盐包被缓冲液pH9.6中)中浸渍1小时。实验表明SE浓度达25ug/mL时结合量达到饱和，相应频率变化是240±19.9(表1.2)。
表1.2不同浓度下结合SE蛋白造成的频率变化浓度(ug/mL) 30.0 25.0 12.5 10.0 6.0ΔF(Hz) 232 240 171 140 55在整个包被程序中，为了检测反应过程记录了F0-FB。提供的三种固定方法可以确保几乎等量的SE结合(表1.3)而无活性损失。这些包被方法是稳定的，因为在清洗过程中没有频率变化。在优化包被条件下，5ug所述的蛋白足以制备一块Pz晶体。
表1.3不同方法中SE的结合程序方法ATPh γ-APTES 聚苯乙烯步骤 ΔF(Hz)第一化合物 1063±12.8545±58.6 1196±125第二化合物 171±19.1 273±221 NILSE蛋白 256±18.3 232±22.3 240±23.2本发明中，因聚苯乙烯包被法相对简单并缩短了固定时间而首先推荐。应用所说的固定程序制备大量含SE包被层的Pz晶体进行小鸡血清样品或蛋黄中SE特定抗体的测试。
为避免非特异吸附，将SE蛋白包被晶体与BSA 37℃孵育半小时，可以选择滴落法将5uL 5％BSA滴加到晶体的每一面或将晶体浸渍于1％BSA溶液中。清洗并烘干处理好的晶体保存于4℃或冷藏。
聚苯乙烯法是经选择检测SE的最佳方法，在本实施例的下述段落(F)和(G)中所用的Pz晶体使用聚苯乙烯包被法制备。SE蛋白通过物理吸附固定于聚苯乙烯修饰的晶体表面。聚苯乙烯修饰的电极表面结合干扰蛋白的活性降低从而非特异性结合大大减少。SE与聚苯乙烯膜结合的原因是长时间(过夜)孵育产生的静电作用。与血清样品短时间孵育(5-10分钟)即可使特定抗体结合于包被抗原上。F)检测小鸡血清中的SE抗体从冷柜中取出制备的晶体并使其恢复室温。测量共振频率FR。用于检测的样品是小鸡血清。稀释的血清样品降低了干扰蛋白的背景，但是也由于抗体浓度降低导致敏感度减弱。在本实施例中，发现血清样品用PBS缓冲液稀释五十倍(1∶50)是敏感度的需要和另一方面干扰性结合达到平衡的最佳选择。在此优选的稀释度下，10uL稀释血清样品涂于晶体的每一个表面并在室温下包被电极约20分钟。清洗并干燥上述晶体，共振频率值定为FS。FR-FS对应于待测血清样品中的质量吸附。
共涉及47只小鸡的血清。选用六个阴性和六个阳性血清对照鉴定制备的传感器的性能。结果见图5。阳性和阴性样品造成的频率改变有明显的差异并提供了是或非的诊断结果。截断值定为六个阴性对照的平均信号加三倍的标准差，由此截断值为176.7Hz。
用SE-Pz传感器(图6)分析另外35个未知血清并与传统免疫分析结果进行比较。对SE-Pz传感器而言，存在或不存在SE抗体是由与血清样品孵育前后的晶体信号变化确定的。如果ΔF(FR-FS)低于截断值，即本例中的176.6Hz，确定样品是SE抗体阴性，而如果ΔF大于或等于截断值，确定样品是SE抗体阳性。阳性对照血清(血清0)产生强阳性信号。35个样品中的六个强于或与阳性对照一样强。另11个样品显示是阳性，有18个是阴性。除血清33外，这些结果与Western印迹分析和商品化可购买的IDEXX SE抗体测试试剂盒一致。表1.4是2×2偶然性表，通过此表列出了SE-Pz传感器与两种传统免疫分析的比较结果。Pz传感器和传统免疫分析结果的一致性是96％，而相对敏感性和特异性分别是100％和95％。
表1.4SE-Pz传感器和传统免疫分析的总结与比较Western印迹/IDEXX ELISA证实阳性 阴性 总数SE-Pz感器阳性 16 1 17SE-Pz传感器阴性 0 18 18总数 16 19SE-Pz传感器阳性 a b a+bSE-Pz传感器阴性 c d c+d总数 a+cb+d敏感性＝a/(a+c)；特异性＝d/(b+d)；一致性＝(a+d)/(a+b+c+d)G)检测蛋黄中的SE抗体本实施例中，检测样品的类型是蛋黄。检测的稀释度从1∶1到1∶10。发现用PBS缓冲液以1∶5稀释是同时符合所需敏感性和降低干扰性结合的优选稀释度。将优选稀释度稀释的蛋黄样品10uL加至晶体的两个侧面上并覆盖整个电极表面于37℃孵育约30分钟。清洗并干燥上述晶体，确定共振频率是FS。FR-FS对应于检测样品中的质量吸收。用SE-Pz传感器检测共19个已知的实验感染的蛋黄或未感染的小鸡。结果示于图7。截断值定义为阴性样品平均值加三倍标准差。
实施例2制备Pz传感器检测猪的生殖和呼吸综合症病毒疾病A)制备重组猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)抗原已鉴定编码猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)的独特序列。PRRSV在其基因组中具有八个开放阅读框架(ORFs)1a，1b，2，3，4，5，6，和7。使用PRRSV毒株PCR扩增病毒ORFs5和7并克隆于细菌宿主大肠杆菌JM105感受态细胞中。ORF5 DNA序列示于SEQ IDNO3而ORF5蛋白序列为SEQ ID NO4。接下来的重组表达过程和纯化过程几乎与实施例1所述的SE抗原相同。通过从制备的SDS-PAGE胶切割目的条带纯化8M尿素组分。纯化的重组表达蛋白纯度是98-99％并以天然或实验感染的猪血清为阳性和阴性对照经Western印迹鉴定。从序列推算的分子量大小是9000而SDS胶电泳确定是41000kD。B)用PRRSV ORF5抗原层制备Pz传感器(PRRS-ORF 5-Pz传感器)本实施例中，重组PRRSV-ORF-5蛋白用作敏感抗原。用PRRSV-ORF-5蛋白层制备Pz传感器，采用实施例1中描述的固定方法。尽管每一个方法相应于特定频率改变确保了足量的蛋白结合，进一步的实验显示共价结合不适于区分阳性和阴性血清样品。产生了两个问题，阴性对照产生的相对强的背景和与阳性对照孵育时微弱的频率改变。前一个问题可能说明包被表面仍然存在干扰蛋白，即血清中的组分吸附上去，造成的非特异性吸附残余物。后一个问题可能由于PRRSV蛋白失活及检测的抗体与包被的PRRSV蛋白免疫反应受阻。为了克服这两个问题及获得有明显差别的阳性和阴性信号，做了如下尝试。首先，在血清样品与包被晶体接触前用适当的封闭剂，诸如PBS，奶粉，明胶和酪蛋白缓冲液，与PRRSV包被晶体孵育。第二，为了增强阳性对照血清频率改变的信号，优化血清孵育条件，包括时间、温度、和血清稀释度。所有尝试均无益于改善传感器的状况。
幸运的是，通过PRRSV蛋白直接非共价结合于晶体表面制备具有PRRSV层的Pz传感器是非常适当的。
由于蛋白分子和金表面之间的疏水作用和硫醇-金相互作用，蛋白在金电极上有强烈的不可逆的吸附作用。将彻底清洗的晶体(F0)浸渍于PRRSV溶液中室温过夜以将PRRSV蛋白固定于晶体表面。为了避免溶液蒸发，将浸渍晶体的自制微量容器放于湿度很高的箱子中。用蒸馏水洗后空气中干燥包被晶体(FB)。将晶体与酪蛋白缓冲液(含0.5％酪蛋白，0.2％Tween 20的PBS缓冲液)室温共同孵育1小时。接着清洗并干燥晶体(FR)。F0-FB对应于蛋白结合的量，而FB-FR对应于封闭蛋白的吸附。
包被于金表面的蛋白比率和含量决定于1)包被分子的扩散系数；2)包被表面积与包被溶液体积的比例；3)吸附底物的浓度；4)温度；和5)吸附时间的长短。所有这些因素均是相互联系的而最重要的是确定每一个包被体系的优选抗原浓度。为了确保制备的传感器的高敏感性，在一方面包被蛋白需要饱和晶体表面可吸附的任何位点，另一方面由于实际的结合密度会影响结果，必须仔细确定不同浓度结合蛋白的效果。抗原的高密度结合可能会因为空间抑制(抗原分子被过分挤压)而无法结合抗体。
本实施例中PRRSV蛋白的使用浓度是5-50ug/mL。此范围内蛋白结合量相应的频率变化是140-800Hz。包被晶体封闭后(FR)，用PRRSV确实阳性的猪血清与其孵育(FS)，并监测不同PRRSV蛋白结合能力的传感器的敏感性(图8)。观察到PRRSV结合量196.4-312.5ng/两面，相应频率变化220-350Hz，是最敏感的，阳性对照的ΔF(FR-FS)是250-320Hz。
使用25ug/mL的PRRSV溶液为优选浓度以获得220-350Hz的PRRSV结合。这种情况下，大量晶体得到包被。结合于十块晶体上的蛋白的量示于表2.1。每一块制备的晶体PRRSV蛋白的高度一致的结合量是传感器与传感器间高度可重复性的基础。此物理吸附法用于本实施例下文C-F部分的试验。
表2.1ORF 5 PRRSV蛋白结合量编号PRRSV结合导致的 结合能力 结合能力ΔF(Hz) (ng/面) (nmol/面)1 250 112.80.00282 330 148.80.00363 285 128.50.00314 325 146.60.00365 260 117.30.00296 310 139.80.00347 360 162.40.00408 265 119.50.00299 280 126.30.003110 300 135.30.0033平均值±标准差 296.5±35.0 133.7±15.8 0.0033+0.00038C)样品测试程序包被并封闭了的晶体保存于4℃。从冷层柜中取出包被封闭的晶体使其恢复室温。测试共振频率FR。用于检测的样品是猪血清样品。在本实施例中，用PBS缓冲液五倍稀释(1∶5)血清样品是达到所需敏感度和降低干扰性结合的最佳稀释度。在晶体每一面加10uL优选稀释度稀释的样品并在室温覆盖整个电极10分钟(发现与样品孵育10分钟是优选的)。清洗和干燥上述晶体后，确定共振频率值FS。FR-FS对应于检测血清样品中质量的吸附。
本实施例中共涉及41份猪血清。图9是显示测试结果的柱形图。其中的12份血清(A组)和14份猪血清(B组)分别是阴性和阳性对照，用于确定传感器的性能。12份确实为PRRSV-阴性参考血清(A组)有正常的FR-FS值分布，范围是1到60，平均值是30.0±20.9Hz(表2.2)。截断值定为12个阴性对照平均频率变化加三倍标准差。另15份未知的猪血清用于与传统Western印迹和商业提供的ELISA结果比较传感器的敏感性和特异性。通过与血清样品孵育前后晶体频率的变化(FR-FS)确定是否存在PRRSV的抗体。如果ΔF小于截断值，样品鉴定为PRRSV抗体阴性，而如果ΔF大于或等于截断值，样品鉴定为PRRSV抗体阳性。15份样品中的8份是阳性，其余的是阴性。这些结果与IDEXX PRRS抗体测试试剂盒或Western印迹分析吻合得很好。
表2.2确实阴性猪血清样品的ORF 5 PRRS Pz传感器频率变化值分布编号 ΔF(Hz)1 602 53 524 325 106 407 78 29 3610 5011 912 55平均值±SD 30.0±20.1截断值(平均值+3 SD) 90.2D)IDEXX ELISA交叉比较交叉比较ORF 5 PRRSV Pz传感器测试的的几份猪血清测试结果与购买的IDEXX PRRS ELISA测试试剂盒的测试结果(表2.3)。按照标准程序进行IDEXX PRRS ELISA操作，通过计算每个样品的S/P比率确定是否存在PRRSV抗体。如果S/P比率低于0.4，鉴定样品是PRRSV抗体阴性，而如果S/P比率大于或等于0.4，样品鉴定为PRRSV抗体阳性。
表2.3PRRS-ORF 5-Pz传感器与IDEXX ELISA的交叉比较PRRSV Pz传感IDEXX PRRS ELISAΔF(Hz) 标准化信号*S/P比率 标准化信号*截断值 90.2 0.401(-)0 0 0.10 0.252(-)10 0.11 0.17 0.41猪3(-)35 0.39 0.24 0.60血清 4弱(+) 1551.72 0.73 1.83样品 5弱(+) 1401.55 0.63 1.586(+)3103.44 2.0 5.007(+)2502.78 2.1 5.25每一个样品的标准化信号由样品频率变化ΔF样品或(S/P)样品与截断值频率的比率确定。表2.3中每一个测定标准化值大于1的血清可以鉴定为阳性样品。血清样品1-3用Pz传感器鉴定标准化信号0-0.39是阴性，而IDEXX ELISA标准化信号是0.25-0.60。血清样品6和7用Pz传感器鉴定标准化信号2.8-3.4是强阳性，而IDEXX ELISA给出的标准化信号是5.00-5.25。血清样品Nos.4和5鉴定是弱阳性。PRRSV Pz传感器和购买的IDEXXELISA标准化信号仅略高于1。E)ORF 5 PRRSV Pz传感器的可重复性用不同的制备的传感器分别检测几份血清样品，监测不同传感器频率变化的可重复性(表2.4)。标准差是5.0-15.0％，与IDEXX结果具可比性，可以接受。
表2.4用不同的Pz传感器平行检测血清样品样品ΔF(Hz) 1(-)2(-) 3(弱+) 4(+) 5(+) 6(+)次数1 90 10 140 310 225 2952 55 20 115 250 195 3103 60 5 -- 320 250 --4 -- -- -- 240 ----平均±SD 67.8±9.9 15.3±2.3 127.5±17.7 275.5±23.3 223.2±27.5 302.5±17.5RSD(％) 14.6 15.0 13.8 8.5 12.3 5.3F)传感器的重复使用重复使用本文是指在先用制备的晶体检测阴性血清的情况下，又用于进行其他分析。用四块制备的晶体(1-4)以不同的顺序检测两个阴性血清，和两个阳性血清。结果示于图10。晶体1先与阴性对照1孵育，得到的信号ΔF为36Hz，晶体1再与阴性对照2孵育产生50Hz的频率改变。进一步，将此使用两次的晶体与阳性对照孵育产生的信号为225Hz。晶体2用作对照，直接检测同一个阳性对照，产生250Hz的信号。用另两块晶体进行类似的试验。阳性对照2用用过一次的和新的晶体进行检测。两次测试产生的频率非常接近，而SD在建议的SD范围内，是15％。这说明制备的晶体可以至少使用3次而敏感性无明显减弱。
实施例3用过晶体的再生进行过阳性测试的制备的晶体可以通过调整pH进行再生。在pH11.0的硼酸/KCl-NaOH缓冲液(50mL硼砂+22.7mL0.1M NaOH)中浸渍使用过的晶体30分钟可以从免疫复合物中去除抗体。用蒸馏水和PBS清洗后晶体可以用于其它分析。图11A-B显示再生PRRSV-Pz传感器(图11A)和SE-Pz传感器(图11B)的敏感性。进行约3-4次分析才可能出现不可逆的活性损失。
发现重铬酸(10g重铬酸钠溶解于30mL热H2O中，冷却，加入70mL浓H2SO4)清洗液是除去制备的传感器表面所有包被物的最佳途径。几乎适合于任何条件的包被表面。例如，硫醇化合物修饰表面在金和硫原子间有强键。进行处理时滴加10uL重铬酸溶液于该表面上保持15分钟以上，接着用蒸馏水清洗可以使频率恢复原始基线F0，而且可以在新形成的金表面进行任何新的表面修饰。图12显示了用重铬酸溶液和热Piranha进行硫醇化合物表面处理得到的再生能力的比较结果。证实重组PRRSV蛋白直接固定于金表面是很稳定的。PRRSV吸附的金表面再生需用重铬酸孵育15分钟。
金表面与γ-APTES通过三个金氧键相互作用。γ-APTES处理的晶体再生需要长时间的清洗。图13显示重铬酸清洗溶液再生经APTh和γ-APTES处理的晶体的能力。
尽管本申请中参照本发明优选实施方案的详细说明公开了本发明，应理解的是本说明书意在举例示出本发明而非限制本发明，这是引物本领域的熟练技术人员易于在本发明的实质和所附范围内作出某些修改。
参考文献Breckenstein A和Shay M(1985)。电子化学学报301295。
Crowther JR(1995)。分子生物中的方法学421-218。
Franks F(1993)蛋白质生物技术p467(Humana Press，Totowa，New Jersy)。
Heberling RL和Vauthey M(1984)。组织化学8013-18。
Karube I和Suzuki M(1986)。生物传感器2343-362。
Shons A等(1972)。生物医学材料研究杂志6565-570。
Thorns CJ等(1996)临床微生物杂志34792-797。
Williams RA和Blanch HW(1994)。生物传感器和生物电子学2159-167。新加坡专利申请号No.9801211-5美国专利号No.4,236,893美国专利号No.4,242,096美国专利号No.4,314,821美国专利号No.4,689,295美国专利号No.4,735,906美国专利号No.5,212,065美国专利号No.5,236,824美国专利号No.5,554,340美国专利号No.5,565,365美国专利号No.5,630,924美国专利号No.5,695,928
序列表<110>萨姆·房有·李苏小笛吉米·况沙伦·刘刘伟分子农业生物学院<120>用于检测兽类疾病的免疫诊断测试方法<130>GM/MC/R33-77<140>PCT/SG 99/00098<141>1999-10-04<150>SG 9903147-8<151>1999-07-05<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>270<212>DNA<213>肠炎沙门氏菌<220><221>CDS<222>(1)..(270)<400>1tct act get ggt acc gct gaa gcc aaa gcg ata gct ggt gcc att aaa 48Ser Thr Ala Gly Thr Ala Glu Ala Lys Ala Ile Ala Gly Ala Ile Lys1 5 10 15ggt ggt aag gaa gga gat acc ttt gat tat aaa ggc gtg act ttt act 96Gly Gly Lys Glu Gly Asp Thr Phe Asp Tyr Lys Gly Val Thr Phe Thr20 25 30att gat aca aaa act ggt gat gac ggt aat ggt aag gtt tct act acc 144Ile Asp Thr Lys Thr Gly Asp Asp Gly Asn Gly Lys Val Ser Thr Thr35 40 45atc aat ggt gaa aaa gtt acg tta act gtc gct gat att gcc act ggc 192Ile Asn Gly Glu Lys Val Thr Leu Thr Val Ala Asp Ile Ala Thr Gly50 55 60gcg acg gat gtt aat gct gct acc tta caa tca agc aaa aat gtt tat 240Ala Thr Asp Val Asn Ala Ala Thr Leu Gln Ser Ser Lys Asn Val Tyr65 70 75 80aca tct gta gtg aac ggt cag ttt act ttt 270Thr Ser Val Val Asn Gly Gln Phe Thr Phe85 90<210>2<211>90<212>PRT<213>肠炎沙门氏菌<400>2Ser Thr Ala Gly Thr Ala Glu Ala Lys Ala Ile Ala Gly Ala Ile Lys1 5 10 15Gly Gly Lys Glu Gly Asp Thr Phe Asp Tyr Lys Gly Val Thr Phe Thr20 25 30Ile Asp Thr Lys Thr Gly Asp Asp Gly Ash Gly Lys Val Ser Thr Thr35 40 45Ile Asn Gly Glu Lys Val Thr Leu Thr Val Ala Asp Ile Ala Thr Gly50 55 60Ala Thr Asp Val Asn Ala Ala Thr Leu Gln Ser Ser Lys Asn Val Tyr65 70 75 80Thr Ser Val Val Asn Gly Gln Phe Thr Phe85 90<210>3<211>630<212>DNA<213>猪生殖和呼吸综合征病毒<220><221>CDS<222>(1)..(600)<400>3atg ttg ggg aaa tgc ttg acc gtg ggc tgt tgc tcg cga ttg ctt tct 48Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Val Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser1 5 10 15ttg tgg tgt atc gtg ccg ttc tgt ttt gct gtg ctc gcc gac gcc cac 96Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asp Ala His20 25 30agc agc agc agc tct cat ctg caa ttc att tac aac ttg acg cta tgt 144Ser Ser Ser Ser Ser His Leu Gln Phe Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys35 40 45gag ctg aat ggc aca gat tgg cta gct gat aga ttt gat tgg gca gtg 192Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asp Arg Phe Asp Trp Ala Val50 55 60gag agc ttt gtc atc ttt cct gtt ttg act cac att gtc tcc tat ggt 240Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80gcc ctc act acc agc cat ttc ctt gac aca att gct tta gtc act gtg 288Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Ile Ala Leu Val Thr Val85 90 95tct acc gcc ggg ttt gtt cac ggg cgg tat gtc ctg agt agc atc tac 336Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr100 105 110gcg gtc tgt gcc ctg gct gcg ttg act tgc ttc gtc att agg ttt gta 384Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile Arg Phe Val115 120 125aag aat tgc atg tcc tgg cgc tac tca tgt act aga tat acc aac ttt 432Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe130 135 140ctt ctg gac act aag ggc aga ctc tat cgt tgg cgg tcg cct gtc att 480Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160ata gag aag agg ggc aaa gtt gag gtc gaa ggt cat ctg atc gat ctc 528Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu165 170 175aaa aga gtt gtg ctt gat ggt tcc gtg gca acc cct ata acc aga gtt 576Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val180 185 190tca gcg gaa caa tgg ggt cgt cat tagatgactt ctgtcatgat agcacggctc 630Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg His195 200<210>4<211>200<212>PRT<213>猪生殖和呼吸综合征病毒<400>4Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Val Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asp Ala His20 25 30Ser Ser Ser Ser Ser His Leu Gln Phe Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys35 40 45Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asp Arg Phe Asp Trp Ala Val50 55 60Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Ile Ala Leu Val Thr Val85 90 95Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr100 105 110Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile Arg Phe Val115 120 125Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe130 135 140Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu165 170 175Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val180 185 190Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg His195 200
权利要求
1.一种检测生物体中感染因子的存在的免疫诊断测试方法，包括a)在压电(Pz)晶体上固定i)来自该感染因子的抗原或ii)特异于来自该感染因子的抗原的抗体；b)测定步骤(a)之后所述晶体的共振频率；c)将所述晶体与来自所述待测生物体的生物标本接触；d)测定步骤(c)之后所述晶体的共振频率；e)将步骤(b)测定的共振频率与步骤(d)测定的共振频率比较，如果两个频率的差值相等或高于截断值，则说明该生物样品呈阳性，即存在所述感染因子。
2.权利要求1的方法，其中所述的抗原是一种重组抗原。
3.权利要求1的方法，其中所述的感染因子是一种细菌或病毒。
4.权利要求1的方法，其中步骤(a)之后，所述晶体用封闭试剂封闭。
5.权利要求1的方法，其中所述的Pz晶体包括0.1-1000MHz AT切割的结晶石英晶体。
6.权利要求5的方法，其中所述的Pz晶体还包括银或金电极。
7.权利要求5的方法，其中所述的Pz晶体还包括一个振荡电路，它能够以自身固有的共振频率电刺激该Pz晶体振荡。
8.权利要求1的方法，其中所述的共振频率使用通用计数器测量。
9.权利要求1的方法，其中所述的抗原是跨膜包膜蛋白。
10.权利要求9的方法，其中所述的跨膜包膜蛋白是利用重组技术制备的融合蛋白，它包含谷胱甘肽-S-转移酶。
11.权利要求1的方法，其中所述的固定化是选自以下一组的方法1)物理吸附于金属或聚苯乙烯修饰的晶体表面；2)共价结合于聚合物、硅烷或硫醇化合物处理过的晶体。
12.权利要求11的方法，其中所述的固定化通过将Pz晶体浸渍于抗原溶液中而进行。
13.权利要求1的方法，其中所述的生物标本在接触前被稀释。
14.权利要求4的方法，还包括步骤(a)、封闭步骤、步骤(c)后的清洗，其中所述的清洗是用含有去污剂的生理缓冲液进行。
15.权利要求14的方法，其中所述生理缓冲液是磷酸盐缓冲液。
16.权利要求4的方法，其中所述的封闭试剂是非活性蛋白。
17.权利要求16的方法，其中所述封闭试剂是牛血清白蛋白或酪蛋白缓冲液。
18.权利要求4的方法，其中所述封闭试剂采用浸渍技术或滴落技术而施加。
19.权利要求1的方法，其中所述的与生物标本接触是在液相或蒸气相中进行。
20.权利要求1的方法，其中所述的截断值定义为阴性对照的平均值加三倍的标准差。
21.权利要求1的方法，其中所述的Pz晶体先前用于所述感染因子是阴性的测试中。
22.权利要求1的方法，其中所述的抗原包括SEQ ID NO2的肽。
23.权利要求1的方法，其中所述的抗原包括PRRSV的ORF5。
24.再生带有i)结合的抗原或ii)结合的抗体的用过的Pz晶体的方法，包括用含有硼酸/KCl-NaOH的缓冲液清洗，去除与所述抗原或抗体结合的任何蛋白，同时不除去所述抗原或抗体，从而使带有结合抗原或抗体的所述Pz晶体可以重复使用。
25.再生用过的Pz晶体的方法，包括用重铬酸清洗，由此去除任何结合的蛋白和任何结合的抗原，以产生清洁的晶体，从而可与新抗原结合。
26.用抗原或抗体包被Pz晶体的方法，包括在抗原或抗体溶液中浸渍此晶体。
27.一种诊断试剂盒，包括用重组抗原或抗体包被的Pz晶体。
28.权利要求27的诊断试剂盒，其中所述的重组抗原包括SEQ IDNO2的蛋白质。
29.权利要求27的诊断试剂盒，其中所述的重组抗原包括PRRSV的ORF5。
全文摘要
本发明公开了一种定性检测动物体液中病毒或细菌抗体的方法,和一种进行该方法的装置。一方面本发明装置包括压电晶体,它由振荡电路操纵,用通用计数器检测共振频率。另一方面,重组病毒或细菌蛋白固定于上述压电(Pz)晶体表面并用作抗原。在一个实施方案中,制成的Pz传感器可以监测频率变化的信号检测是否存在病毒或细菌特异性抗体。在另一个实施方案中,本发明方法被证实是低成本的,简便的和快速的。
文档编号G01N33/569GK1371477SQ9981679
公开日2002年9月25日 申请日期1999年10月4日 优先权日1999年7月5日
发明者萨姆·房有·李, 苏小笛, 吉米·况, 沙伦·刘, 刘伟 申请人:分子农业生物学院, 材料研究与工程学院