用于免疫相关疾病的治疗的新组合物和方法

专利名称：用于免疫相关疾病的治疗的新组合物和方法
用于免疫相关疾病的治疗的新组合物和方法发明领域本发明涉及对于免疫相关疾病的诊断和治疗有用的组合物和方法。
背景技术：
免疫相关和炎性疾病是相当复杂的、通常是多重互联的生物学途径的现象或结 果，在正常生理学中所述生物学途径对于应答创伤(insult)或损伤、自创伤或损伤启动修 复、及发动针对外来生物体的先天性和获得性防御是至关重要的。在这些正常生理学途径 引起别的创伤或损伤(或是与应答的强度直接相关、或是作为异常调节或过度刺激的结 果、或是作为对自身的反应、或是作为这些的组合)时发生疾病或病理状况。虽然这些疾病的发生通常牵涉多步途径且通常牵涉多种不同生物学系统/途径， 但是这些途径的一种或多种中的关键点干涉可具有改善或治疗的效应。治疗性干涉可以通 过拮抗有害过程/途径或刺激有益过程/途径而发生。许多免疫相关疾病是已知的，而且已经被广泛地研究。此类疾病包括免疫介导的 炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、感染性疾病、免疫缺陷病、瘤形成等等。T淋巴细胞(T细胞)是哺乳动物免疫应答的重要成分。T细胞识别与主要组织相 容性复合体(MHC)内的基因编码的自身分子(self-molecule)结合(associated)的抗原。 该抗原可以与MHC分子一起展示在抗原呈递细胞、受病毒感染的细胞、癌细胞、移植物等的 表面上。T细胞系统清除那些对宿主哺乳动物造成健康威胁的改变的细胞。T细胞包括辅助 性T细胞和细胞毒性T细胞。辅助性T细胞在识别抗原呈递细胞上的抗原-MHC复合物后大 量增殖。辅助性T细胞还分泌多种细胞因子，即淋巴因子，其在B细胞、细胞毒性T细胞及 多种参与免疫应答的其它细胞的活化中发挥中心作用。另一个子范畴的辅助性T细胞是滤 泡辅助性 T 细胞(TFh)(综述参见 Vineusa et al.，Nat. Rev. Immunol. 5 :853-865 (2005)) 通过它们的CXC-趋化因子受体5特征性表达可检测(Schaerli et al.，J. Exp. Med. 192 1553-62 (2000))，发现这些细胞生成IL-10和可能的IL-21。TFh细胞给生发中心B细胞提 供辅助，特别是在与B细胞共培养期间帮助B细胞存活和繁殖及有力地诱导抗体生成。已 经将它们与耐受性形成联系起来。调节性T细胞(TMg)是在抑制自身反应性免疫应答中发挥至关重要作用的辅助 性T细胞子集，而且常常见于慢性炎症部位，诸如在肿瘤组织中(Wang，H. Y. &ffang, R. F.， Curr Opin Immunol 19，217-23 (2007))。TMg 在表型上通过 CD25、CLTA4、GITR、和神经粗 蛋白-1 的高细胞表面表达来定义(Read，S.，Malmstrom, V. &Powrie, F.，J Exp Med 192， 295-302(2000) ；Sakaguchi，S.，ct al.，J Immunol 155,1151-64(1995) ；Takahashi，T.et al.，J Exp Med 192，303—10(2000) ；McHugh, R. S. et al.，Immunity 16,311-23(2002)； Bruder, D. et al.，Eur J Immunol 34，623-3(^2004))，而且在转录因子 F0XP3 的控制下 (Hori, S.，Nomura, Τ. &Sakaguchi, S.，Science 299，1057-61 (2003))。TMg 经由接触依赖 性机制和细胞因子生成对活化的T细胞实施它们的遏制功能Pehervari，Z. &Sakaguchi, Curr Opin Immunol 16，203-8 (2004))。Treg还通过与树突细胞(DC)上配体的直接相互作用 调控免疫应答，诸如CTLA4与DC上的B7分子相互作用引发对吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)的诱导(Fallarino，F. et al.，Nat Immunol 4，1206-12 (2003))，及CD40L连接(Serra，P. et al. ,Immunity 19，877-89 (2003))。DC是能够针对自身或非自身抗原诱导免疫或耐受的专 职抗原呈递细胞。DC扩增的Treg在体外遏制同种异体反应性应答(Yamazaki，S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103,2758-63(2006) ；Ahn, J. S. ， Krishnadas, D. K. Mgrawal, Int Immunol 19,227-37(2007)),而且当过继性转移时，适宜的TMg抑制NOD. scid小鼠 中的糖尿病(Tarbel 1, K. V. et al.，J ExpMed 199，1467-77 (2004))或实验诱发的哮喘 (Lewkowich, I. P. et al. J Exp Med202，1549-61 (2005))。DC 上配体与 TMg 的特异性相互 作用还能消除它们的遏制性功能，诸如GITR在小鼠中的参与(Shimizu, J.，et al.，Nat Immunol 3，135-42 (2002))，提示DC在调控TMg功能中可能具有兼职作用。分子CTLA4和GITR分别是共刺激/抑制分子的和TNF超家族内定义的 配体的代表(Greenwald, R. J.，et al.，Annu Rev Immunol 23, 515-48 (2005)) 这些分子 在Treg上是高的，但是在活化的T细胞上通常也上调。为了寻找新的在Treg细胞中表达的共 刺激分子，实施了搜索来鉴定具有Ig结构域和免疫受体基于酪氨酸的活化或抑制(ITAM/ ITIM)基序二者的在T细胞中特异性表达的基因(Abkis，A. R. et al.，Genes Immun 6， 319-31 000 )。经由这两种基因组范围生物信息学搜索策略的交集，鉴定到一种新的细胞 表面结合的蛋白质，编码IgV结构域、跨膜结构域、和两个假定的免疫受体酪氨酸抑制性基 序的蛋白质(参见美国专利公开号US20040121370，通过述及收入本文)。称作TIGIT(因 为T细胞-Ig和ITIM结构域)的蛋白质显示出在T细胞(特别是Treg和记忆细胞子集) 以及NK细胞上表达。需要新的治疗剂和治疗方法来解决免疫性病症，特别是自身免疫性病 症。在此，申请人鉴定TIGIT结合配偶体并提供新的组合物、检测方法、及用那些结合配偶 体和阐明的TIGIT对T细胞成熟和活性的影响来治疗受TIGIT相互作用调控的免疫性病症 的方法。发明概述本发明关注对于哺乳动物(包括人)中免疫相关疾病的诊断和治疗有用的组合物 和方法。本发明基于涉及对某些类型免疫细胞增殖和功能的负调节的蛋白质的鉴定。免疫 相关疾病可以通过遏制或增强免疫应答来治疗。增强免疫应答的分子刺激或加强对抗原的 免疫应答。刺激免疫应答的分子可以在治疗上用于增强免疫应答会是有益的情况。或者， 遏制免疫应答，削弱或减轻对抗原的免疫应答的分子(例如中和性抗体)可以在治疗上用 于削弱免疫应答会是有益的情况(例如炎症)。在此，申请人证明TIGIT (因为“T细胞-Ig 和ITIM结构域”)蛋白质特异性结合脊髓灰质炎病毒受体(PVR，也称作CD155)和新阐明的 蛋白质家族的数个其它成员，而且这种TIGIT-PVR相互作用负调节T细胞活化和增殖。因 而，TIGIT多肽、其激动剂、和其拮抗剂，以及PVR多肽、其激动剂和其拮抗剂对于制备用于 免疫相关和炎性疾病治疗的药物和药剂是有用的。本发明还提供治疗免疫相关和炎性疾病 的方法及检测和评估免疫相关和炎性疾病状态的方法和组合物。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，包含如下的氨基酸序列，该氨基 酸序列包含一个或多个下述氨基酸与人TIGIT氨基酸位置67对应的氨基酸位置处的丙氨 酸，与人TIGIT氨基酸位置74对应的氨基酸位置处的甘氨酸，与人TIGIT氨基酸位置114对 应的氨基酸位置处的脯氨酸，和与人TIGIT氨基酸位置116对应的氨基酸位置处的甘氨酸。 在一个方面，所述多肽不是 PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、TIGIT、CD96、或 CD226。在另一个方面，所述多肽进一步包含下述一项或多项与人TIGIT氨基酸位置M对应的氨基酸 位置处的选自缬氨酸、异亮氨酸、和亮氨酸的氨基酸，与人TIGIT氨基酸位置55对应的氨基 酸位置处的选自丝氨酸和苏氨酸的氨基酸，与人TIGIT氨基酸位置56对应的氨基酸位置处 的谷氨酰胺，与人TIGIT氨基酸位置112对应的氨基酸位置处的苏氨酸，和与人TIGIT氨基 酸位置113对应的氨基酸位置处的选自苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸。在另一个方面，所述 多肽进一步包含一个或多个选自下组的结构亚基序a.氨基酸位置M处的选自缬氨酸和异亮氨酸的氨基酸-氨基酸位置55处的选自 丝氨酸和苏氨酸的氨基酸-氨基酸位置56处的谷氨酰胺；b.位置67处的丙氨酸-氨基酸位置68-73每一个处的任意氨基酸-氨基酸位置 74处甘氨酸；和c.氨基酸位置112处的苏氨酸-氨基酸位置113处的选自苯丙氨酸和酪氨酸的氨 基酸-氨基酸位置114处的脯氨酸-氨基酸位置115处的任意氨基酸-氨基酸位置116处 的甘氨酸，其中所述氨基酸位置的编号方式与人TIGIT的氨基酸位置对应，尽管所述多肽中 氨基酸的绝对编号方式可以有所不同。在另一个实施方案中，本发明提供一种确定测试多肽是否是TLP多肽家族成员的 方法，包括将所述测试多肽的氨基酸序列与TLP多肽家族的一个或多个成员的氨基酸序列 比对并评估下述一项或多项在所述测试多肽氨基酸序列中的存在或缺失与人TIGIT氨基 酸位置67对应的氨基酸位置处的丙氨酸，与人TIGIT氨基酸位置74对应的氨基酸位置处 的甘氨酸，与人TIGIT氨基酸位置114对应的氨基酸位置处的脯氨酸，和与人TIGIT氨基酸 位置116对应的氨基酸位置处的甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于鉴定 TLP蛋白质家族的一个或多个成员的方法，其通过鉴定一个或多个序列数据库中其氨基酸 序列包含选自下组的至少一个氨基酸的蛋白质来进行与人TIGIT氨基酸位置67对应的氨 基酸位置处的丙氨酸，与人TIGIT氨基酸位置74对应的氨基酸位置处的甘氨酸，与人TIGIT 氨基酸位置114对应的氨基酸位置处的脯氨酸，和与人TIGIT氨基酸位置116对应的氨基 酸位置处的甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的药剂，其与TLP家族成员的一个或 多个保守的或基本上保守的区域特异性相互作用。在一个方面，所述药剂是TLP家族成员 的表达和/或活性的拮抗剂。在另一个方面，所述拮抗剂选自小分子抑制剂，抑制性抗体或 其抗原结合片段，适体，抑制性核酸，和抑制性多肽。在另一个方面，所述药剂是TLP家族成 员的表达和/或活性的激动剂。在另一个方面，所述激动剂选自激动性抗体或其抗原结合 片段，激动性肽，和活化TIGIT结合至PVR和/或由PVR介导的TIGIT细胞内信号传导的小 分子或蛋白质。在另一个实施方案中，本发明提供一种鉴定或检测一个或多个TLP家族成 员的方法，其通过使假定的TLP家族成员多肽与至少一种上述药剂接触并测定所述至少一 种药剂对所述假定的TLP家族成员的结合来进行。在另一个实施方案中，本发明提供一种确定测试免疫细胞是否是活化的或正常的 Treg、记忆T细胞、NK细胞、或TFh细胞的方法，包括评估所述测试免疫细胞中TIGIT的表达水 平并将其与已知活化的或正常的T,eg、记忆T细胞、NK细胞、或TFh细胞中TIGIT的表达水平 比较，或通过将所述测试免疫细胞中TIGIT的表达水平与已知标准TIGIT表达值比较。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于调控免疫系统功能和/或活性的方法，包括调控 TIGIT对PVR、PVRL3、和PVRL2中一项或多项的结合。在另一个实施方案中，本发明提供一种抗TIGIT抗体或其片段，包含至少一个 HVR，该HVR包含选自SEQ ID NO :23- 所列氨基酸序列的氨基酸序列。在另一个实施方 案中，本发明提供一种抗TIGIT抗体或其片段，包含至少一个HVR，该HVR包含选自SEQ ID NO :31-36所列氨基酸序列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供一种抗TIGIT 抗体或其片段，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO :21所列氨基酸序列。在另一个实施方 案中，本发明提供一种抗TIGIT抗体或其片段，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO : 所 列氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供一种抗TIGIT抗体或其片段，其中所述抗 体的重链包含SEQ ID NO :22所列氨基酸序列或其部分。在另一个实施方案中，本发明提供 一种抗TIGIT抗体或其片段，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO :30所列氨基酸序列或其 部分。在另一个实施方案中，本发明提供一种抗TIGIT抗体或其片段，其中所述抗体的轻链 包含SEQ ID NO :21所列氨基酸序列或其部分且所述抗体的重链包含SEQ IDNO :22所列氨 基酸序列或其部分。在另一个实施方案中，本发明提供一种抗TIGIT抗体或其片段，其中所 述抗体的轻链包含SEQ ID NO : 所列氨基酸序列或其部分且所述抗体的重链包含SEQ ID NO :30所列氨基酸序列或其部分。在另一个实施方案中，本发明提供一种抗TIGIT抗体或 其片段，其中所述抗体的轻链由核苷酸序列SEQ ID NO :50或其部分编码。在另一个实施方 案中，本发明提供一种抗TIGIT抗体或其片段，其中所述抗体的重链由核苷酸序列SEQ ID NO 51或其部分编码。在一个方面，本发明的抗体或其抗原结合片段选自人源化抗体、嵌合 抗体、双特异性抗体、异源偶联抗体、和免疫毒素。在另一个方面，本发明的至少一个HVR与SEQ ID NO :23- 任一所列HVR至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%相同。在另一个方面，本发明的 至少一个 HVR 与 SEQ ID NO :31-36 任一所列 HVR 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96^^97^^98%,或99%相同。在另一个方面，本发明抗体或抗原结合片段的轻链包含与 SEQ ID NO :21 所列氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%相同的氨基酸序列。在另一个方面，本发明抗体或抗原结合片段的轻链包含与SEQ ID NO 29 所列氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 相同的氨基酸序列。在另一个方面，本发明抗体或抗原结合片段的重链包含与SEQ ID NO 22 所列氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%相同 的氨基酸序列。在另一个方面，本发明抗体或抗原结合片段的重链包含与SEQID N0:30所 列氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的氨 基酸序列。在另一个方面，本发明的抗体或抗原结合片段包含轻链和重链，所述轻链包含与 SEQ ID NO :21 所列氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%相同的氨基酸序列且所述重链包含与SEQ ID NO :22所列氨基酸序列至少90^^91%, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的氨基酸序列。在另一个方面，本发 明的抗体或抗原结合片段包含轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO : 所列氨基酸序列 至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的氨基酸序列且所 述重链包含与SEQ IDNO 30所列氨基酸序列至少90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、或99%相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供一种调控⑶226-PVR相互作用和/或⑶96-PVR 相互作用的方法，包括在体内或在体外施用TIGIT、TIGIT表达和/或活性的激动剂、或 TIGIT表达和/或活性的拮抗剂中至少一项。在一个方面，施用TIGIT或TIGIT表达和/或 活性的激动剂且⑶226-PVR相互作用和/或⑶96-PVR相互作用受到抑制或阻断。在另一 个方面，施用TIGIT表达和/或活性的拮抗剂且⑶226-PVR相互作用和/或⑶96-PVR相互 作用受到刺激。在另一个实施方案中，本发明提供一种调控免疫细胞功能和/或活性的方法，其 通过调控TIGIT和/或PVR表达和/或活性，或通过调控由TIGIT结合PVR介导的细胞内 信号传导来进行。在一个方面，所述调控是降低或抑制一种或多种免疫细胞增殖或一种或 多种免疫细胞释放促炎性细胞因子，其通过在体外或在体内用TIGIT、TIGIT表达和/或活 性的激动剂、PVR表达和/或活性的激动剂处理所述细胞来进行，或通过刺激由TIGIT结合 PVR介导的细胞内信号传导来进行。在另一个方面，所述调控是提高或刺激一种或多种免疫 细胞增殖或一种或多种免疫细胞分泌促炎性细胞因子，其通过在体外或在体内用TIGIT表 达和/或活性的拮抗剂、PVR表达和/或活性的拮抗剂处理所述细胞来进行，或通过抑制由 TIGIT结合PVR介导的细胞内信号传导来进行。在另一个实施方案中，本发明提供一种抑制免疫应答的方法，其通过在体外或在 体内施用TIGIT、TIGIT表达和/或活性的激动剂、PVR表达和/或活性的激动剂来进行，或 通过刺激由TIGIT结合PVR介导的细胞内信号传导来进行。在另一个实施方案中，本发明 提供一种提高或刺激免疫应答的方法，其通过在体外或在体内施用TIGIT表达和/或活性 的拮抗剂、PVR表达和/或活性的拮抗剂来进行，或通过抑制由TIGIT结合PVR介导的细胞 内信号传导来进行。在另一个实施方案中，本发明提供一种调控来自免疫细胞的细胞因子生成的类型 和/或量的方法，其通过在体外或在体内调控TIGIT或PVR表达和/或活性来进行。在一 个方面，通过施用TIGIT表达和/或活性的拮抗剂、PVR表达和/或活性的拮抗剂，或通过 抑制由TIGIT结合PVR介导的细胞内信号传导来刺激和/或提高促炎性细胞因子生成。在 另一个方面，通过施用TIGIT表达和/或活性的激动剂、PVR表达和/或活性的激动剂，或 通过刺激由TIGIT结合PVR介导的细胞内信号传导来抑制促炎性细胞因子生成。在另一个实施方案中，本发明提供一种刺激一种或多种免疫细胞中ERK磷酸化和 /或经由ERK途径的细胞内信号传导的方法，包括用TIGIT、TIGIT表达和/或活性的激动 剂、或PVR表达和/或活性的激动剂处理所述一种或多种免疫细胞。在另一个实施方案中，本发明提供一种诊断受试者中涉及异常免疫细胞应答的免 疫相关疾病的方法，包括评估来自所述受试者的样品中TIGIT的表达和/或活性并将所述 TIGIT表达和/或活性与TIGIT表达和/或活性的参照量或来自正常受试者的样品中TIGIT 表达和/或活性的量比较。在一个方面，所述免疫相关疾病选自银屑病、关节炎、炎性肠病 或癌症。在另一个方面，所述癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，本发明提供一种评估受 试者中涉及异常免疫细胞应答的免疫相关疾病的严重程度的方法，包括评估来自所述受试 者的样品中TIGIT的表达和/或活性并将所述TIGIT表达和/或活性与TIGIT表达和/或 活性的参照量或来自正常受试者的样品中TIGIT表达和/或活性的量比较。在一个方面， 所述免疫相关疾病选自银屑病、关节炎、炎性肠病或癌症。在另一个方面，所述癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，本发明提供一种在受试者中预防涉及异常免疫细胞应答的免疫 相关疾病的方法，包括调控所述受试者中TIGIT的表达和/或活性。在一个方面，所述免疫 相关疾病选自银屑病、关节炎、炎性肠病或癌症。在另一个方面，所述癌症是乳腺癌。在另 一个实施方案中，本发明提供一种治疗或减轻受试者中涉及异常免疫细胞应答的免疫相关 疾病的严重程度的方法，包括调控所述受试者中TIGIT的表达和/或活性。在一个方面，所 述免疫相关疾病选自银屑病、关节炎、炎性肠病或癌症。在另一个方面，所述癌症是乳腺癌。附图简述

图1描绘人、小鼠、恒河猴和犬TIGIT蛋白质序列的比对。阴影指示在三个或四个 物种中含有相同氨基酸的位置。信号序列以虚线指示，免疫球蛋白V集结构域以双线指示， N-糖基化位点以必要位置上方的细线指示，跨膜结构域以粗线指示，而假定的延长的ITIM 基序以双虚线指示。人TIGIT与恒河猴、犬和小鼠序列分别共享88 %、67 %、和58 %同一性。图2A和2B描绘所示PVR家族蛋白质的IgV结构域的蛋白质序列的比对。在各序 列间贡献相似性的侧链依照特性标示。指示了 V框指纹残基(黑色圆圈)和PVR相关指纹 残基(粗线框示残基)。为了比较目的，还比对来自非PVR家族成员的六种IgV结构域序列 (在水平线下方列出)。图3描绘如实施例2中所述，评估TIGIT-Fc (浅灰色线)或对照-Fc蛋白质(黑 色线)结合各种蛋白质的能力的生物传感器分析的结果。编号1-8分别代表ESAM、0T0R、 TEK、TNFRSF10C, IGFBP4、PVR, IL-19、禾口 TEK。图4A描绘如实施例2所述，评估各种Fc融合蛋白结合固定的TIGIT-Fc的能力的 生物传感器测定法的结果。图4B-1至4B-6描绘如实施例2所述，评估生物素化Fc融合蛋 白结合表达受体的CHO稳定转染子的能力的FACS分析的结果。图5A和5B描绘如实施例2所述，测定TIGIT-Fc与表达PVR的CHO细胞之间结合 的Kd的一项代表性放射性配体结合测定法的结果。图6显示的图描绘如实施例2所述，TIGIT、PVR、⑶2 和⑶96间竞争结合研究的结果。图7显示如实施例2所述，评估抗PVR抗体阻断PVR结合TIGIT或⑶226的能力 的实验的结果。图7A描绘在10倍摩尔过量的抗体D171存在(虚线)或缺失(实线)下 生物素化PVR-Fc对表达⑶2 或TIGIT的CHO转染子的结合。来自匹配的同种型对照抗 体的结果以阴影区域指示。图7B描绘PVR-Fc (顶部的线)或缓冲液(底部的线)对加载 有⑶226-Fc或TIGIT-Fc的生物传感器的结合。中部的线指示PVR-Fc对预加载⑶226_Fc 或TIGIT-Fc、在暴露于PVR-Fc之前用抗体D171封闭的生物传感器的结合。图8A描绘如实施例2 (A)所述，多种免疫细胞类型中的TIGIT表达数据(左边小 图)或表达数据(右边小图)。图8B描绘如实施例2(A)所述，扁桃体TFh细胞中 TIGIT 和 ICOS mRNA 表达的 RT-PCR 分析。图9A-B描绘如实施例3所述，测试抗TIGIT抗体10A7结合细胞表面处的TIGIT 的能力的实验的结果。图9A显示抗TIGIT抗体10A7对稳定^3-TIGIT细胞系的结合(实 线)及PVR-Fc存在下该结合的消除(虚线)。灰色区域代表同种型匹配的对照抗体的结 合。图9B显示FACS分析的结果，证明TIGIT在GITR+⑶4T细胞中与R)xP3共表达。所示 数据代表两次独立实验。
图10A-F描绘如实施例3所述，通过mRNA分析或通过细胞表面处的结合研究评估 TIGIT表达的实验的结果。图10A-1至10A-2描绘如实施例2(A)所述，测定静息的或活化 的(一天或两天)CD4+CD45RA+(左边小图)或CD4+CD45R0+T细胞(右边小图)上的TIGIT和 ⑶2 表达的流式细胞计量实验的结果。图IOB显示条形图，指示与幼稚⑶4+⑶45RA+细胞 中的TIGITmRNA水平相比，自PBMC直接离体分选的不同类型免疫细胞中TIGITmRNA的倍数 变化。图IOC显示条形图，指示与未刺激的细胞相比，用抗⑶3和抗⑶观活化1或2天的分 选的 CD4+CD45R0+、CD4+CD45RA+ 和 CD4+CD25 高Tms 细胞或用 IL-2 活化 1 天的分选的 CD56+NK 细胞上TIGIT mRNA水平的倍数增加。所示FACS图来自一次代表性实验，而RT-PCR值是三 名供体的平均值。图IOD显示FACS测定法的结果，显示⑶25—人PBMC细胞缺乏TIGIT表 达。图IOE描绘评估表达低或高量的⑶25的人PBMC细胞上TIGIT细胞表面表达的FACS实 验的结果，而且显示TIGIT表达与F0XP3表达有关联。图IOF描绘评估用抗⑶3和抗⑶观 活化M小时的分选的⑶4+CD25sT细胞中TIGIT表达的FACS实验(左边小图)和静息的 或活化的⑶25-或⑶细胞中TIGIT mRNA水平的补充性RT-PCR分析的结果。图11提供的图显示如实施例2 (A)所述，静息的或活化的(一或两天)CD25、CD25+、 ⑶45RA+、⑶45R0+细胞上TIGIT或⑶2 表达的倍数变化。图12A描绘如实施例3所述，评估T细胞上TIGIT表达的稳定性的流式细胞术实 验的结果。图12B描绘如实施例3所述，评估暴露于不同浓度的抗CD3的分选的TIGIT+和 TIGir细胞中TIGIT表达的基于板的测定法的结果。图13A-C显示的图描绘如实施例5所述，评估TIGIT在缺乏B和T细胞的scid小 鼠中调控IL-10、IL-12p40和IL_12p70生成的能力的实验的结果。图14描绘如实施例2 (A)所述，评估生成IL-17的对生成IL_2的T辅助细胞上 TIGIT表达的流式细胞术的结果。每幅小图中的数据代表使用来自不同供体的PBMC的实验。图15描绘如实施例3所述，评估疾病组织样品中TIGIT表达水平的mRNA分析的 结果。最右边的小图提供来自取自类风湿性关节炎滑膜组织的分选的细胞的表达数据。在 这些样品中检测不到PVR和⑶2 表达。图16描绘相对于正常样品，评估于各个时间点取自胶原诱发的关节炎的小鼠模 型的组织中TIGIT(顶部小图)或⑶226(下部小图)表达的RT-PCR实验的结果。图17描绘如实施例3所述，评估来自哮喘和对照恒河猴的组织样品中TIGIT、PVR、 和⑶2 表达水平的mRNA分析的结果。图18A描绘评估正常或癌性细胞中的TIGIT表达水平(上部小图)或各种乳腺肿 瘤样品中的CD4表达(下部小图)的mRNA分析的结果。图18B-18D描绘如实施例3所述， 评估各种癌症样品中的TIGIT (图18B)、PVR (图18C)、和CD226 (图18D)表达水平的mRNA 分析的结果。图18B、18C、和18D中每一幅中的下部小图分别显示含有各种百分比的肿瘤细 胞的癌症样品中的TIGIT、PVR、或⑶2 表达水平。所有小图中的框代表统计学显著的数 据。图19A-D描绘如实施例4所述，评估TIGIT对T细胞活化的影响的实验的结果。 图19A描绘评估⑶14+单核细胞、iMDDC和MDDC上的PVR表达的FACS测定法的结果。抗 PVR实验以没有阴影的形式显示，而同种型匹配的对照以灰色显示。图19B描绘使用TNFa成熟的DC和分离的CD4+T细胞评估TIGIT-Fc对T细胞增殖的影响的体外MLR测定法的结 果。以星号标示的数据具有P <0.001。图19C描绘评估在自体⑶Ilc+DC和抗TIGIT抗体 10A7(黑色条)或同种型对照(白色条)存在下用可溶性抗⑶3活化的⑶4+T细胞中通过 [3H]-胸苷掺入(cpm)测定的T细胞增殖(左边小图)和通过ELISA测定的IFN-Y生成 (右边小图)的实验的结果。一个星号指示P <0.01 ；两个星号指示ρ <0.001。图19D描 绘评估在100μ g/mL TIGIT-Fc (灰色条)或同种型对照(白色条)存在下用自体⑶Ilc+DC 和可溶性抗⑶3活化的幼稚⑶4+⑶25_T细胞中的增殖和IFN- γ生成的实验的结果。一个 星号指示P < 0. 01 ；两个星号指示ρ < 0. 001。图20Α和20Β描绘如实施例4所述，评估在MLR测定法中分选的TIGIT+T细胞抑 制TIGIT_T细胞增殖的能力的实验的结果。图21A描绘如实施例4所述，评估在抗TIGIT抗体(10A7)存在和缺失下TIGIT+Treg 对其它T细胞和APC增殖的影响的增殖测定法的结果，以及那些细胞群中的IFNy和IL-10 生成。图21B描绘如实施例4A所述，评估与TIGITTms相比，TIGIT+Treg对幼稚T细胞增殖 的影响的增殖测定法的结果。图22A-D描绘如实施例5所述，评估成熟iMDDC和DC中TIGIT调控细胞因子生成 的能力的实验的结果。图22A-1至22A-3显示测量iMDDC、用TNF α刺激的iMDDC、用CD40L 刺激的iMDDC、用LPS刺激的iMDDC、或用Pam3CSK4刺激的iMDDC中的IL-10或IL_12p40生 成的ELISA测定法的结果。所示结果是来自三次实验的平均值。每幅小图中的线代表来自 三名不同供体中每一个的数据。图22B显示测量经过处理的细胞中的细胞表面成熟标志物 HLA-DR、⑶80、⑶83、和⑶86表达的FACS分析的结果。数值代表荧光强度均值(MFI)，而所 示数据代表三名供体。图22C显示来自测量TIGIT对TNF α成熟的或LPS成熟的MDDC生 成其它促炎性细胞因子的影响的实验的数据。所示数据代表三次实验。IL-6、IL12p70、和 IL-18水平是如实施例5所述，通过LUMINEX分析测定的。图22D显示的图呈现如实施例5 所述，iMDDC响应TIGIT. Fc或同种型匹配对照的TGFβ分泌的相对量。图23A-C描绘如实施例6所述，评估TIGIT处理对PVR活化下游信号传导的影响 的实验的结果。图23Α显示用TIGIT或对照处理的PVR的酪氨酸磷酸化状态的^iestern印 迹分析。图2!3Β显示用TIGIT-Fc、TIGIT-Fc-DANA、或对照处理iMDDC后的ERK 二聚化状态 的Wfestern印迹分析。图23C显示用TIGIT处理的对用对照处理的iMDDC中的有活性的对 总的β-联蛋白的Western印迹分析。
图24A-B描绘如实施例6所述，评估在TNF α成熟的MDDC中阻断各种下游信号传 导分子对TIGIT诱导的IL-12p40生成降低的影响的实验的结果。图24A显示测试MAH(激 酶抑制剂对TIGIT-Fc或TIGIT-Fc-DANA诱导的IL_12p40生成降低的影响的实验的结果。 图24B显示来自评估抗TIGIT抗体(10A7)、抗IL-10抗体、或抗⑶32抗体对TIGIT介导的 来自TNFa成熟的MDDC的IL_12p40生成降低的影响的实验的结果。图25A-B描绘如实施例7所述，评估TIGIT-Fc处理对T细胞活化的影响的实验的 结果。来自评估用TIGIT-Fc或对照抗体处理的iMDDC或TNF a /CD40L成熟的MDDC培养物 诱导的/中的T细胞增殖(图25A)或IL-2生成(图25B)的量的实验的数据的图。图沈描绘如实施例7所述，评估活化的人MDDC中TIGIT-Fc处理对ILT表达的影 响的实验的结果。
图27A-H描绘如实施例7所述，评估小鼠中TIGIT处理对迟发型超敏感性应答 的影响的实验的结果。图27A显示的图呈现来自用抗豚草抗体、TIGIT-Fc、或CTLA4处理 的野生型或IL-10敲除小鼠的耳部肿胀数据。图27B显示的数据呈现来自用TIGIT-Fc、 CTLA4-Fc、或对照处理的小鼠的脾细胞对KLH再刺激的增殖应答。数据显示为应答士标 准偏差(n = 3每组；体外回忆测定法(recall assay)在一式三份孔中实施)。图27C显 示的图呈现来自用TIGIT-Fc、TIGIT-Fc-DANA、或抗TIGIT抗体10A7处理的野生型小鼠的 耳部肿胀数据。图27D和27E描绘的图指示来自野生型(图27D)或IL-10敲除(图27E) TIGIT-Fc处理小鼠脾细胞对KLH再刺激的增殖应答。图27F和27G描绘的图指示来自脾 细胞的培养物上清液中的IL-2或IFN-Y水平，所述脾细胞是自用TIGIT-Fc处理，已经用 KLH再活化2天的野生型(图27F)或IL-10敲除(图27G)小鼠分离的。数据显示为均值 士标准偏差(n = 3每组；体外回忆在一式三份孔中实施)。一个星号指示ρ < 0. 001。图 27Η描绘的图显示通过qRT-PCR测定的(n = 8)，来自用TIGIT-Fc和同种型对照处理的野生 型或IL-10缺陷小鼠的⑶Ilc+脾细胞的IL-10 (左边小图)、IL-12/23p40(中央小图)、和 IL-12p35(右边小图)的相对mRNA水平。还测定来自WT CDllc消减的脾细胞的IL-IOmRNA 水平作为对照。数据代表相对于来自未免疫小鼠的相应mRNA水平的任意mRNA水平。一个 星号指示P < 0. 05。图^A-28E描绘如实施例4 (B)所述，评估通过TIGIT特异性siRNA敲低TIGIT表 达的影响的实验的结果。图28A显示TIGIT敲低功效对对照siRNA的qRT-PCR分析的结果。 测定CTLA4mRNA水平作为非靶对照。图28B显示用siRNA娜和siRNATKIT处理的细胞中的表 面TIGIT表达的FACS分析(汇总于表7)。图28C和28D显示在siRNA对照或siRNAtigit (图 27C)或抗TIGIT抗体10A7 (图27D)存在下用单独的板结合的抗CD3或联合抗CD^活化的 ⑶4+CD45R0+人T细胞的细胞增殖的FACS分析的结果。图28E描绘培养2天后来自图28C 中的测定法中所使用的细胞的细胞因子生成分析的结果。所示数据代表四个个别的个体和 实验。图^A_29E描绘评估各种细胞上和各种处理后的⑶2 表达的实验的结果。图29A 描绘使用抗⑶2 显示静息的和抗⑶3和抗⑶观活化(1和2天)的分选的幼稚⑶4+⑶45RA+ 细胞(顶部小图)或记忆⑶4+⑶45R0+细胞(底部小图)上⑶2 表面表达的FACS分析的 结果。图29B提供的图显示与未刺激的细胞相比，用抗CD3加抗CD^活化1或2天的分选 的 CD4+CD45R0+、CD4+CD45RA+ 和 CD8+ 细胞，及用 IL-2 加 IL-15 活化 1 天的分选的 CD56+NK 细胞上mRNA水平的倍数增加。图29C显示通过qRT-PCR测定的，相对于幼稚⑶4+⑶45RA+ 细胞，自PBMC直接离体分选的细胞上多种细胞标志物的相对mRNA水平，作为CD4+、CD8+、 ⑶4+CD45R0+、⑶4+CD25si;eg、NK和⑶Ilc+DC细胞群的指示剂。所示数据代表来自三名供体 的数据的平均值。图29D描绘用抗CD4、抗CD25、和抗染色的，测定取自总人PBMC群 的门选(gated)⑶4+细胞上⑶2 和⑶25共表达的FACS分析的结果。所示图代表两名个 体。图29E显示的图描绘自PBMC分离的活化的和静息的CD4+CD25_和CD4+CD25 ^细胞中的 TIGIT和⑶226mRNA水平。mRNA水平呈现为相对于静息的⑶4+⑶25_细胞的倍数变化，而且 是来自两名供体的数据的平均值。图30A-C描绘如实施例8所述，评估TIGIT缺陷小鼠中的免疫细胞功能性的实验 的结果。图30A显示的图比较在野生型抗原呈递细胞缺失(左边小图)或存在(中间小图)下TIGIT缺陷型(TIGIT. K0) T细胞对野生型T细胞的增殖。右边小图显示的图比较在 TIGIT. KO抗原呈递细胞存在下TIGIT. KO T细胞对野生型T细胞的增殖。图30B显示评估 TIGIT. KO对野生型T细胞中的IFNy和IL-4水平的FACS测定法的结果。图30C的图显示 在TIGIT. KO或野生型T细胞的上清液中测量得到的所示细胞因子的水平。发明详述TIGIT先前被鉴定为免疫功能的假定调控物(参见例如美国专利公开号 US20040121370，通过述及收入本文)。在此，申请人证明TIGIT是新描述的免疫相关蛋白质 家族的成员，该家族包括脊髓灰质炎病毒受体(PVR，也称作NECL5或CD15Q、PVR样蛋白质 1-4(PVRL1-4)、CD96、和CD226。申请人提供这个新家族(其成员在免疫调节和功能中发挥 作用)的保守结构元件，而且提供鉴定别的家族成员的方法。申请人:显示TIGIT紧密结合PVR，而且以较低的Kd结合PVRL3 (也称作柄蛋白 (netin)-3或CD113)和PVRL2 (也称作柄蛋白-2或CD112)。PVR是一种在树突细胞(DC)， 以及FDC、成纤维细胞、内皮细胞、和一些肿瘤细胞上高度表达的细胞表面受体(Sakisaka， T.&Takai， Y. ， Curr Opin Cell Biol 16,513-21(2004) ；Fuchs, A. &Colorm￡i， Μ. ， Semin Cancer Biol 16, 359-66 (2006)) 申请人通过mRNA和FACS分析显示TIGIT主要在多种活 化的T细胞上表达，特别是调节性T细胞(TMg)、记忆T细胞、NK细胞、和滤泡T辅助性细胞 (Tph)。本文所述研究证明TIGIT与DC上PVR相互作用，而且显示这种结合相互作用调控DC 功能，特别是细胞因子生成。TIGIT结合的人DC分泌高水平的IL-10和较少的促炎性细胞 因子(诸如IL-12p40和IL-12p70)。TIGIT结合未成熟T细胞(如使用TIGIT融合构建物 评估的)抑制T细胞活化和增殖。值得注意的是，这种抑制在ERK抑制剂存在下被逆转，指 示ERK活化可能是TIGIT调控DC活性的功能中的一个重要步骤。申请人在此显示TIGIT+T 细胞不仅遏制其它TIGIT-T细胞的增殖，而且还遏制抗原呈递细胞(当在混合免疫细胞群 中存在时)，而且TIGIT自身负责这种遏制效果，因为在混合物中包括阻断性抗TIGIT抗体 大大降低观察到的遏制。如本文中所示，TIGIT在关节炎、银屑病、炎性肠病、和乳腺癌组织中的表达相对于 正常对照组织升高。通过显示TIGIT融合蛋白抑制体外的人T细胞应答和迟发型超敏感性 体内测定法中的鼠T细胞活化，申请人还直接证明TIGIT调控免疫应答的能力。TIGIT显著 修饰成熟DC，而且较低程度地修饰未成熟DC，提示一旦DC变成完全活化的抗原呈递细胞， TIGIT-PVR相互作用在细调免疫应答中可能是重要的。本文所示实验提示TIGIT经在DC中 诱导IL-10经由抑制性反馈环抑制T细胞活化的机制。因而，本发明进一步提供通过调控 特定细胞因子子集或特定免疫细胞子集来调控免疫功能的新方法。下文更为详细地描述本 发明的这些和其它方面。I.定义术语“TIGIT多肽”、“TIGIT蛋白”和“TIGIT”在本文中可互换使用，指如本文中所 描述的特定多肽序列。本文中描述的TIGIT多肽可从多种来源分离，诸如人组织或来自非 人生物体的组织，或者通过重组或合成方法制备。在一个实施方案中，TIGIT多肽具有SEQ ID NO :1-4任一所列氨基酸序列。本说明书中涉及“TIGIT多肽”的所有公开内容适用于 个别的以及共同的每一种多肽。例如，关于多肽的制备、纯化、衍生、针对该多肽的抗体的形 成、施用、含有该多肽的组合物、用该多肽治疗疾病、等等的描述适用于本发明的单个的每14一种多肽。术语“TIGIT多肽”、“TIGIT蛋白”、或“TIGIT”还包括本文中公开的或本领域已 知的TIGIT多肽的变体。“天然序列TIGIT多肽”包括与衍生自自然界的相应TIGIT多肽具有相同氨基酸 序列的多肽。此类天然序列TIGIT多肽可从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。 术语“天然序列TIGIT多肽”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定TIGIT多肽(例 如胞外结构域序列)、该多肽的天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变 体。在本发明的多个实施方案中，本文中公开的天然序列TIGIT多肽是包含全长氨基酸序 列的成熟或全长天然序列多肽。然而，尽管附图中公开的TIGIT多肽据显示以本文中指派 为图中第1位氨基酸的甲硫氨酸残基开始，可以想到且有可能的是，可采用位于图中第1位 氨基酸上游或下游的其它甲硫氨酸残基作为TIGIT多肽的起始氨基酸残基。TIGIT多肽“胞外结构域”或“ECD”指基本上不含跨膜结构域和胞质结构域的 TIGIT多肽形式。通常，TIGIT多肽E⑶具有少于1 %的所述跨膜结构域和/或胞质结构域， 优选具有少于0.5%的所述结构域。可以理解，为本发明TIGIT多肽鉴定的任何跨膜结构域 是依照本领域常规用于鉴定该种类型疏水性结构域的标准鉴定的。跨膜结构域的精确边界 可以变化，但最有可能是本文中鉴定的结构域任一末端不超过约5个氨基酸。因此，任选的 是，TIGIT多肽的胞外结构域可含有跨膜结构域/胞外结构域边界任一侧的约5个或更少 氨基酸，而且本发明设想了具有或没有相关信号肽的此类多肽及编码它们的核酸。在一个 实施方案中，TIGIT ECD涵盖SEQ ID NO :1所列人TIGIT蛋白的氨基酸1-139。本文中所公开的各种TIGIT多肽的“信号肽”的大致位置可使用本领域已知方法 来鉴定。例如，SEQ ID NO 1所列人TIGIT多肽的信号序列预测跨越氨基酸1_15(参见 例如美国专利公开号US20040121370)。然而，应当注意，信号肽的C-末端边界可以变化， 但最有可能的是本文中最初鉴定的信号肽C-末端边界任一侧不超过约5个氨基酸，其中 信号肽的C-末端边界可依照本领域常规用于鉴定该种类型氨基酸序列元件的标准来鉴 定(例如 Nielsen 等，Prot. Eng.，10 :1-6(1997)及 von Heinje 等，Nucl. Acids. Res.，14 4683-4690(1986))。此外，还认识到，在有些情况中，从分泌多肽上切除信号序列不是完全 统一的，导致超过一种分泌种类。本发明涵盖这些成熟多肽，其中信号肽在本文中所鉴定的 信号肽C-末端边界任一侧不超过约5个氨基酸内切除，及编码它们的多核苷酸。"TIGIT多肽变体”意指与本文中所公开的全长天然序列TIGIT多肽序列、本文中 所公开的缺乏信号肽的TIGIT多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号肽的TIGIT多肽 胞外结构域、或全长TIGIT多肽序列的任何其它片段具有至少约80%的氨基酸序列同一性 的上文或下文所定义的活性TIGIT多肽。此类TIGIT多肽变体包括例如其中全长天然氨 基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的TIGIT多肽。通常，TIGIT 多肽变体与本文中所公开的全长天然序列TIGIT多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽 的TIGIT多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号肽的TIGIT多肽胞外结构域、或全长 TIGIT多肽序列的任何其它具体限定片段具有至少约80%的氨基酸序列同一性，或者至少 约81%的氨基酸序列同一性，或者至少约82%的氨基酸序列同一性，或者至少约83%的氨 基酸序列同一性，或者至少约84%的氨基酸序列同一性，或者至少约85%的氨基酸序列同 一性，或者至少约86%的氨基酸序列同一性，或者至少约87%的氨基酸序列同一性，或者 至少约88%的氨基酸序列同一性，或者至少约89%的氨基酸序列同一性，或者至少约90%的氨基酸序列同一性，或者至少约91 %的氨基酸序列同一性，或者至少约92 %的氨基酸序 列同一性，或者至少约93%的氨基酸序列同一性，或者至少约94%的氨基酸序列同一性， 或者至少约95%的氨基酸序列同一性，或者至少约96%的氨基酸序列同一性，或者至少约 97 %的氨基酸序列同一性，或者至少约98 %的氨基酸序列同一性和或者至少约99 %的氨 基酸序列同一性。通常，TIGIT变体多肽至少长约10个氨基酸，或者至少长约20个氨基酸， 或者至少长约30个氨基酸，或者至少长约40个氨基酸，或者至少长约50个氨基酸，或者至 少长约60个氨基酸，或者至少长约70个氨基酸，或者至少长约80个氨基酸，或者至少长约 90个氨基酸，或者至少长约100个氨基酸，或者至少长约150个氨基酸，或者至少长约200 个氨基酸，或者至少长约300个氨基酸或更多。关于本文中所鉴定的TIGIT多肽序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定义 为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代 视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定TIGIT多肽序列中的氨基酸残基相同的 氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行测定百分比氨基酸序列同 一性目的的序列对比，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较序列 全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明，％氨基酸序列同一性值是使用序列 比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中ALIGN-2程序的完整源代码是公众可得的。ALIGN-2 序列比较计算机程序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一起提交给美国版 权局(US Copyright Office, Washington D. C.，20559)，并以美国版权注册号 TXU510087注 册。公众通过 Genentech 公司(South San Francisco, California)也可得到 ALIGN-2 程 序。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4. OD上使用。所有序列比 较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与 (with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有 或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序 列A)如下计算分数X/Y 乘 100其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨 基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基 酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨 基酸序列同一性。作为使用这种方法的％氨基酸序列同一性计算的例子，表1和2演示了 如何计算指派为“比较蛋白质”的氨基酸序列相对于指派为“TIGIT”的氨基酸序列的％氨 基酸序列同一性，其中“TIGIT”代表目的假设TIGIT多肽的氨基酸序列，“比较蛋白质”代表 目的“TIGIT”多肽针对其进行比较的多肽的氨基酸序列，而“X”、“Y”和“Ζ”各自代表不同 假设氨基酸残基。表1感兴趣蛋白质ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧ (长度=15个氨基酸)比较蛋白质 ΧΧΧΧΧΥΥΥΥΥΥΥ(长度=12个氨基酸)%氨基酸序列同一性=
(ALIGN-2测定为两种多肽序列之间相同匹配的氨基酸残基数)+ (感兴趣蛋白质 的氨基酸残基总数)=5 + 15 = 33.3%表2感兴趣蛋白质XXXXXXXXXX(长度=10个氨基酸)比较蛋白质 WWVmYiTLTXL (长度=15个氨基酸)%氨基酸序列同一性=(ALIGN-2测定为两种多肽序列之间相同匹配的氨基酸残基数)+ (感兴趣蛋白质 的氨基酸残基总数)=5 + 10 = 50%除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段 及表1和2所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。然而，％氨基酸序列同一性值也可使用 WU-BLAST-2 计算机程序(Altschul et al.，Methods inEnzymology 266 :460-480(1996)) 如下所述获得。大多数WU-BLAST-2检索参数设成缺省值。不设成缺省值的参数，即可 调整参数设成如下值交叠跨度=1，交叠分数=0.125，词阈值(T) = 11，和评分矩阵= BL0SUM62。在采用WU-BLAST-2时，％氨基酸序列同一性值是通过将(a)通过WU-BLAST-2 确定的具有衍生自天然TIGIT多肽的序列的目的TIGIT多肽氨基酸序列和目的比较氨基酸 序列(即目的TIGIT多肽与之进行比较的序列，它可以是TIGIT变体多肽)之间的匹配相 同氨基酸残基数除以(b)目的TIGIT多肽的氨基酸残基总数确定的。例如，在叙述“包含 与氨基酸序列B具有至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列A的多肽”中，氨基酸序列 A是目的比较氨基酸序列，而氨基酸序列B是目的TIGIT多肽的氨基酸序列。百分比氨基酸序列同一性也可使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul et al.，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402(1997))确定。NCBI-BLAST2 序列比较程序 可从 http://www. ncbi. nlm. nih. gov 下载，或者以其它方式从 National Institute ofHealth(Bethesda, MD)获得。NCBI-BLAST2使用几项检索参数，其中所有这些检索参数 设成缺省值，包括例如未遮掩=是，链=全部，期望发生=10，最小低复杂性长度=15/5， 多通过e值=0.01，多通过常数=25，最终缺口对比的降低(dropoff) = 25，评分矩阵= BL0SUM62。在采用NCBI-BLAST2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A对、与、或 相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(可另外表述为给定氨基酸序列A具有或 包含对、与、或相对于给定氨基酸序列B的一定的％氨基酸序列同一性)计算如下X/Y 分数 X 100其中X是序列对比程序NCBI-BLAST2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的 氨基酸残基数，而Y是B中氨基酸残基总数。应理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸 序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性不等于B对A的％氨基酸序列同一性。术语“TIGIT多核苷酸”和“TIGIT核苷酸序列”在本文中可互换使用，指编码TIGIT 多肽的特定多核苷酸序列。这些多核苷酸可包含DNA或RNA或DNA和RNA 二者。本文中描 述的TIGIT多核苷酸可从多种来源分离，诸如人组织或来自非人生物体的组织，或者通过 重组或合成方法制备。本说明书中涉及“TIGIT多核苷酸”的所有公开内容适用于个别的以 及共同的每一种多核苷酸。例如，关于多核苷酸的制备、纯化、衍生、含有该多核苷酸的组合 物的施用、用该多核苷酸治疗疾病、等等的描述适用于本发明的个别的以及共同的每一种多核苷酸。术语“TIGIT多核苷酸”或“TIGIT核苷酸序列”还包括本文中公开的TIGIT多 核苷酸的变体。“天然序列TIGIT多核苷酸”包括与衍生自自然界的相应TIGIT多核苷酸具有相同 核酸序列的多核苷酸。此类天然序列TIGIT多核苷酸可从自然界分离，或者可通过重组或 合成手段生成。术语“天然序列TIGIT多核苷酸”明确涵盖编码天然存在的截短或分泌形 式的特定TIGIT多肽(例如胞外结构域序列)、该多肽的天然存在变体形式(例如可变剪接 形式)和天然存在等位变体的多核苷酸。在本发明的多个实施方案中，本文中公开的天然 序列TIGIT多核苷酸是包含全长核酸序列的成熟或全长天然序列多核苷酸。“TIGIT变体多核苷酸”或“TIGIT变体核酸序列”意指编码下文所定义的活性 TIGIT多肽且与编码全长天然序列TIGIT多肽序列、缺乏信号肽的全长天然序列TIGIT多 肽序列、具有或没有信号肽的TIGIT多肽胞外结构域、或全长TIGIT多肽序列的任何其它片 段的核苷酸序列具有至少约80%核酸序列同一性的核酸分子。通常，TIGIT变体多核苷酸 与编码本文中所公开的全长天然序列TIGIT多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的全长 天然序列TIGIT多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号序列的TIGIT多肽胞外结构域、 或本文中所公开的全长TIGIT多肽序列的任何其它片段的核酸序列具有至少约80%的核 酸序列同一性，或者至少约81%的核酸序列同一性，或者至少约82%的核酸序列同一性， 或者至少约83%的核酸序列同一性，或者至少约84%的核酸序列同一性，或者至少约85% 的核酸序列同一性，或者至少约86 %的核酸序列同一性，或者至少约87 %的核酸序列同一 性，或者至少约88%的核酸序列同一性，或者至少约89%的核酸序列同一性，或者至少约 90 %的核酸序列同一性，或者至少约91 %的核酸序列同一性，或者至少约92 %的核酸序列 同一性，或者至少约93%的核酸序列同一性，或者至少约94%的核酸序列同一性，或者至 少约95%的核酸序列同一性，或者至少约96%的核酸序列同一性，或者至少约97%的核酸 序列同一性，或者至少约98 %的核酸序列同一性和或者至少约99 %的核酸序列同一性。变 体不涵盖天然核苷酸序列。通常，TIGIT变体多核苷酸至少长约30个核苷酸，或者至少长约60个核苷酸，或 者至少长约90个核苷酸，或者至少长约120个核苷酸，或者至少长约150个核苷酸，或者至 少长约180个核苷酸，或者至少长约210个核苷酸，或者至少长约240个核苷酸，或者至少 长约270个核苷酸，或者至少长约300个核苷酸，或者至少长约450个核苷酸，或者至少长 约600个核苷酸，或者至少长约900个核苷酸或更多。关于本文中所鉴定的TIGIT编码核酸序列的“百分比(％ )核酸序列同一性”定 义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与目的 TIGIT核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进 行测定百分比核酸序列同一性目的的序列对比，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2 或 Megalign (DNASTAR)软件。ALIGN-2 序列比较计算机程 序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyright Office, Washington D. C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过 Genentech 公司(South San Francisco, California)得到 ALIGN-2 程序，或者可从公众可 得的源代码编译。AUGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4. OD上使用。 所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较核酸序列的情况中，给定核酸序列C相对于(to)、与 (with)、或针对(against)给定氨基酸序列D的％核酸序列同一性(或者可表述为具有或 包含相对于、与、或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下 计算分数ff/Ζ 乘 100其中W是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的C和D对比中评分为相同匹配的核 苷酸数，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以领会，若核酸序列C的长度与核酸序列D的长 度不相等，则C相对于D的％核酸序列同一性将不等于D相对于C的％核酸序列同一性。作 为％核酸序列同一性计算的例子，表3和4演示了如何计算指派为“比较DNA”的核酸序列 相对于指派为“TIGIT-DNA”的核酸序列的％核酸序列同一性，其中“TIGIT-DNA”代表目的 假设TIGIT编码核酸序列，“比较DNA”代表目的“TIGIT-DNA”核酸分子针对其进行比较的 核酸分子的核苷酸序列，而“N”、“L”和“V”各自代表不同假设核苷酸。表 3感兴趣DNA NNNNNNNNNNNNNN (长度=14 个核苷酸)比较 DNA NNNNNNLLLLLLLLLL (长度=16 个核苷酸)%核酸序列同一性=(ALIGN-2测定为两种核酸序列间相同匹配的核苷酸数)+ (感兴趣DNA核酸序列 的核苷酸总数)=6 + 14 = 42.9%表 4感兴趣DNA NNNNNNNNNNNN (长度=12个核苷酸)比较DNANNNNLLLVV (长度=9个核苷酸)%核酸序列同一性=(ALIGN-2测定为两种核酸序列间相同匹配的核苷酸数)+ (感兴趣DNA核酸序列 的核苷酸总数)=4+12 = 33.3%除非另有具体说明，本文中所使用的所有％核酸序列同一性值都是依照上一段及 表3和4所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。然而，％核酸序列同一性值也可使用 WU-BLAST-2 计算机程序(Altschul et al.，Methods inEnzymology 266 :460-480(1996)) 如下所述获得。大多数WU-BLAST-2检索参数设成缺省值。不设成缺省值的参数，即可 调整参数设成如下值交叠跨度=1，交叠分数=0.125，词阈值(T) = 11，和评分矩阵= BL0SUM62。在采用WU-BLAST-2时，％核酸序列同一性值是通过将(a)通过WU-BLAST-2确 定的具有衍生自天然序列TIGIT多肽编码核酸的序列的目的TIGIT多肽编码核酸分子的核 酸序列和目的比较核酸分子(即目的TIGIT多肽编码核酸分子与之进行比较的序列，它可 以是变体TIGIT多核苷酸)之间的匹配相同核苷酸数除以(b)目的TIGIT多肽编码核酸分 子的核苷酸总数确定的。例如，在叙述“包含与核酸序列B具有至少80%核酸序列同一性 的核酸序列A的分离的核酸分子”中，核酸序列A是目的比较核酸分子，而核酸序列B是目 的TIGIT多肽编码核酸分子的核酸序列。百分比核酸序列同一性也可使用序列比较程序NCBI-BLAST2 (Altschulet al.，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 (1997))确定。NCBI-BLAST2 序列比较程序可 从 http://www. ncbi. nlm. nih. gov 下载，或者以其它方式从 NationalInstitute ofHealth (Bethesda,MD)获得。NCBI-BLAST2使用几项检索参数，其中所有检索参数设成缺省 值，包括例如未遮掩=是，链=全部，期望发生=10，最小低复杂性长度=15/5，多通过e值 =0. 01，多通过常数=25，最终缺口对比的降低=25，评分矩阵=BL0SUM62。在采用NCBI-BLAST2用于序列比较的情况中，给定核酸序列C对、与、或相对于给 定核酸序列D的％核酸序列同一性(可另外表述为给定核酸序列C具有或包含对、与、或相 对于给定核酸序列D的一定的％核酸序列同一性)计算如下1/2分数父100其中W是序列对比程序NCBI-BLAST2在该程序的C和D对比中评分为相同匹配的 核苷酸数，而Z是D中核苷酸总数。应理解，当核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度 时，C对D的％核酸序列同一性不等于D对C的％核酸序列同一性。在其它实施方案中，TIGIT变体多核苷酸是编码活性TIGIT多肽且能够与编码本 文中所公开的全长TIGIT多肽的核苷酸序列杂交，优选在严格杂交和洗涤条件下杂交的核 酸分子。TIGIT变体多肽可以是那些由TIGIT变体多核苷酸编码的变体多肽。“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种多肽时，意指已经鉴定且与/由其天然 环境的成分分开和/或回收的多肽。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多肽的诊断 或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的 实施方案中，将多肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端 或内部氨基酸序列的程度，或( 根据使用考马斯蓝或优选银染色的非还原或还原条件下 的SDS-PAGE，达到同质。既然多肽天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括 重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的”TIGIT多肽编码核酸或其它多肽编码核酸指已经鉴定且与该多肽编码核 酸的天然来源中通常与之相关的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的多肽编 码核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的多肽编码核酸分子因此与存 在于天然细胞中时的特定多肽编码核酸分子有区别。然而，分离的多肽编码核酸分子包括 通常表达该多肽的细胞中所包含的多肽编码核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中 的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。术语“调控序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA 序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位 点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。若一条核酸与另一条核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接”的。 例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分 泌的前蛋白质(preprotein)，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码 序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与 编码序列可操作连接。通常，“可操作连接”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前 导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限 制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么依照常规实践使用合成的寡核苷 酸衔接头或接头。术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖例如单一抗TIGIT单克隆抗体或特异性结合 本文所述任何其它多肽的抗体(包括激动性、拮抗性、和中和性抗体)、具有多表位特异性的抗TIGIT或抗体组合物、单链抗TIGIT或其它抗体、和抗TIGIT或其它抗体片段(见下 文)。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群 体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。杂交反应的“严格性”可以容易的由本领域普通技术人员确定，而且通常根据探针 长度、洗涤温度、和盐浓度凭经验计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较 短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变 性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温 度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较 不严格。关于杂交反应严格性的另外细节和解释，参见Ausubel等人，((CurrentProtocols in Molecular Biology)), Wiley Interscience Publishers, 1995。“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，可如下鉴别(1)采用低离 子强度和高温进行洗涤，例如0. 015M氯化钠/0. 0015M柠檬酸钠/0. 十二烷基硫酸钠， 500C ； (2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50% (ν/ν)甲酰胺及0.1%牛血清 清蛋白/0. 1% Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6. 5，含750mM氯化 钠，75mM 柠檬酸钠，42°C;或(3)于 42°C 采用 50% 甲酰胺，5x SSC (0. 75M NaCl，0. 075M 柠檬 酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6. 8)，0. 1 %焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声波处理的鲑鱼精 DNA(50y g/ml),0. 1% SDS，和10%硫酸右旋糖苷，以及于42°C在0. 2x SSC (氯化钠/柠檬 酸钠)和50%甲酰胺中洗涤，接着在含EDTA的0. Ix SSC中于55°C进行高严格性洗涤。“中等严格条件”可以如 Sambrook 等人，《Molecular Cloning =ALaboratory Manual)),New York, Cold Spring Harbor Press，1989所述鉴别，包括使用比上文所述较不 严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％ SDQ。中等严格条件的一个例子是 于 37°C 在含20% 甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM 柠檬酸三钠)，50mM 磷酸钠(pH 7.6)， 5x Denhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育 过夜，接着在Ix SSC中于约37-50°C洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根据需要调整温度、 离子强度等以适应诸如探针长度等因素。术语“表位标记的”在用于本文时指包含与“标签多肽”融合的感兴趣多肽(作为 一个非限制性例子，TIGIT多肽)的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制 备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相 当独特的，使得所述抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至 少6个氨基酸残基且通常在约8个到约50个氨基酸残基之间(优选在约10个到约20个 氨基酸残基之间)。在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性 与免疫球蛋白恒定区的效应物功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不 同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和 免疫球蛋白恒定区序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或 配体的结合位点的连续(contiguous)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序 列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG_4亚型、IgA(包括IgA-I和 IgA-2)、IgE、IgD 或IgM。“有活性的”或“活性”为了本发明指保留多肽天然或天然存在形式的生物学和/21或免疫学活性(在下面的例子中，TIGIT活性)的多肽(作为一个非限制性例子，TIGIT多 肽)形式，其中“生物学”活性指由天然或天然存在多肽引起的，诱导针对天然或天然存在 多肽所具有的抗原性表位的抗体生成的能力以外的生物学功能(或是抑制性的或是刺激 性的)，而“免疫学”活性指诱导针对天然或天然存在多肽所具有的抗原性表位(在上面的 例子中，TIGIT抗原性表位)的抗体生成的能力。术语“适体”指能够结合靶分子(诸如多肽)的核酸分子。例如，本发明的适体能 特异性结合TIGIT多肽，或调控TIGIT表达的信号传导途径中的分子。适体的生成和治疗 用途是本领域已完善建立的。参见例如美国专利No. 5，475，096，及Macugen (Eyetech, New York)用于治疗年龄相关黄斑变性的治疗功效。术语“拮抗剂”以最广义使用，包括部分或完全阻断、抑制、或中和本文中所公开的 天然多肽的生物学活性的任何分子。类似的，术语“激动剂”以最广义使用，包括模拟本文 中所公开的天然多肽的生物学活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子明确包括激动 性或拮抗性抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机 小分子等。用于鉴定多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使多肽接触候选激动剂或拮抗剂 分子并测量通常与所述多肽有关的一种或多种生物学活性的可检测变化。术语“TIGIT”拮抗剂和“TIGIT活性或TIGIT表达的拮抗剂”可互换使用，指通过降 低TIGIT编码核酸的转录或翻译，或通过抑制或阻断TIGIT多肽活性，或二者来干扰TIGIT 正常发挥功能的化合物。TIGIT拮抗剂的例子包括但不限于反义多核苷酸、干扰性RNAJI 化性RNA、RNA-DNA嵌合物、TIGIT特异性适体、抗TIGIT抗体、抗TIGIT抗体的TIGIT结合 片段、TIGIT结合小分子、TIGIT结合肽、和其它特异性结合TIGIT的多肽(包括但不限于一 种或多种TIGIT配体的TIGIT结合片段，任选融合至一个或多个别的结构域)，使得TIGIT 拮抗剂与TIGIT之间的相互作用导致TIGIT活性或表达降低或停止。本领域普通技术人员 会理解，在有些情况中，TIGIT拮抗剂可拮抗一种TIGIT活性但不影响另一种TIGIT活性。 例如，供本文中某些方法中使用的想要的TIGIT拮抗剂是响应例如PVR相互作用、PVRL3相 互作用、或PVRL2相互作用之一而拮抗TIGIT活性但不影响或最低限度影响任何其它TIGIT 相互作用的TIGIT拮抗剂。术语“PVR拮抗剂”和“PVR活性或PVR表达的拮抗剂”可互换使用，指通过降低PVR 编码核酸的转录或翻译，或通过抑制或阻断PVR多肽活性，或二者来干扰PVR正常发挥功能 的化合物。PVR拮抗剂的例子包括但不限于反义多核苷酸、干扰性RNA、催化性RNA、RNA-DNA 嵌合物、PVR特异性适体、抗PVR抗体、抗PVR抗体的PVR结合片段、PVR结合小分子、PVR结 合肽、和其它特异性结合PVR的多肽(包括但不限于一种或多种PVR配体的PVR结合片段， 任选融合至一个或多个别的结构域)，使得PVR拮抗剂与PVR之间的相互作用导致PVR活 性或表达降低。本领域普通技术人员会理解，在有些情况中，PVR拮抗剂可拮抗一种PVR活 性但不影响另一种PVR活性。例如，供本文中某些方法中使用的想要的PVR拮抗剂是响应 TIGIT相互作用而拮抗PVR活性但不影响PVR-CD96和/或PVR-CDM6相互作用的PVR拮抗 剂。术语“TIGIT激动剂”和“TIGIT活性或TIGIT表达的激动剂”可互换使用，指通过 提高TIGIT编码核酸的转录或翻译，和/或通过抑制或阻断抑制TIGIT表达或TIGIT活性的 分子的活性，和/或增强正常TIGIT活性(包括但不限于增强TIGIT的稳定性或增强TIGIT对一种或多种靶配体的结合)来增强或刺激TIGIT正常发挥功能的化合物。例如，TIGIT激 动剂可选自抗体、抗原结合片段、适体、干扰性RNA、小分子、肽、反义分子、和其它结合多肽。 在另一个例子中，TIGIT激动剂可以是选自干扰TIGIT抑制性分子转录和/或翻译的适体、 干扰性RNA、或反义分子的多核苷酸。本领域普通技术人员会理解，在有些情况中，TIGIT激 动剂可激动一种TIGIT活性但不影响另一种TIGIT活性。例如，供本文中某些方法中使用 的想要的TIGIT激动剂是例如响应PVR相互作用、PVRL3相互作用、或PVRL2相互作用之一 而激动TIGIT活性，但不影响或最低限度影响任何其它TIGIT相互作用的TIGIT激动剂。术语“PVR激动剂”和“PVR活性或PVR表达的激动剂”可互换使用，指通过提高 PVR编码核酸的转录或翻译，和/或通过抑制或阻断抑制PVR表达或PVR活性的分子的活 性，和/或增强正常PVR活性(包括但不限于增强PVR的稳定性或增强PVR对一种或多种 靶配体的结合)来增强或刺激PVR正常发挥功能的化合物。例如，PVR激动剂可选自抗体、 抗原结合片段、适体、干扰性RNA、小分子、肽、反义分子、和其它结合多肽。在另一个例子中， PVR激动剂可以是选自干扰PVR抑制性分子转录和/或翻译的适体、干扰性RNA、或反义分 子的多核苷酸。本领域普通技术人员会理解，在有些情况中，PVR激动剂可激动一种PVR活 性但不影响另一种PVR活性。例如，供本文中某些方法中使用的想要的PVR激动剂是例如 响应TIGIT相互作用而激动PVR活性或模拟TIGIT与PVR相互作用，但不影响或最低限度 影响PVR-CD96或PVR-CDM6结合相互作用的PVR激动剂。“处理”或“治疗”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减 缓(减轻)所针对的病理学状况或病症。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以 及倾向于患上病症的受试者或要预防病症的受试者。“长期”施用指以与短期模式相反的连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果(活 性)维持较长的一段时间。“间歇”施用指并非连续不间断进行的处理，本质上是循环的。对于治疗而言，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人、家畜和牲畜，及动 物园、运动或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选的是，哺乳动物指人。“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时(共同)施用和任意次序的连续施 用。“载体”在用于本文时包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的 剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是PH缓 冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗 氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明 胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天 冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合 剂，诸如EDTA ；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性 剂，诸如 TTOEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS 。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗 体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata et al.， Protein Eng. 8 (10) :1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗 体。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处 理产生一个F (ab' )2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密、非共价结 合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中，各个可变区的 三个CDR相互作用而在Vh-Vl 二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗 体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个 Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(ChI)。Fab’片段因在重链ChI 结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或 多个半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的 称谓。F(ab' )2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半 胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。根据其恒定区的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻 链”可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别。免疫球蛋白有 五种主要的类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于一 条多肽链上。优选的是，Fv多肽在Vh和\结构域之间还包含多肽接头，使得sFv能够形成 抗原结合期望的结构。关于sFv的综述参见Pliickthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，vol. 113, Rosenburg 禾口 Moore 编，Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994。术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链 (Vh-Vl)中包含相连的重链可变区(Vh)和轻链可变区(\)。通过使用过短的接头使得同一 条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两 个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；Hollinger et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444-6448 (1993)。“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其 天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它 蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方 法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得 至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或C3)根据使用染料或染剂诸如但不 限于考马斯蓝或银染剂的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体天然 环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的 抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。“特异性结合”特定多肽或特定多肽上的表位或者对其“特异”的抗体指结合该特 定多肽或特定多肽上的表位且基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和 /或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认 为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al. , Immunity 13 :37-45(2000) Johnson and Wu, ψ =Methods in Molecular Biology 248 :1-25(Lo, ed.，HumanPress, Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体 在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al. , Nature363 446-448(1993) ；Sheriff et al. , Nature Struct. Biol. 3 :733-736(1996)。
本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(OTR)是以序列变异性 为基石出的，而且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991)) ο Chothia 改为指结构环的位置(Chothia and LeskJ. Mol. Biol. 196 901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触” HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分 析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
环 KabatAbMChothia接触LlL24--L34L24--L34L26--L32L30--L36L2L50--L56L50--L56L50--L52L46--L55L3L89--L97L89--L97L91--L96L89--L96HlH31--H35BH26--H35BH26--H32H30--H35B(Kabat 编号)Hl H31-H35 H26-H35H26-H32H30-H35(Chothia 编号)H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101HVR 可包括如下“延伸的 HVR" :VL 中的 24-36 或 24-34 (Li)、46-56 或 50-56 (L2) 和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102 (H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方 式”及其变体指Kabat et al.，见上文中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号 系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域 FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照 Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和 82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准” Kabat编号序列对 比同源区来确定。Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残 基 1-113)时使用(例如 Kabat et al. , Sequences of Immunological Interest. 5thEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。 “EU 编号系统”或“EU指数” 一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabatet al.，见上文中报道的EU指数)。“Kabat中的EU指数”指人IgGlEU抗体的残基编号方 式。除非本文中另有说明，提及抗体可变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编 号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编 号方式(例如参见美国临时申请60/640，323，关于EU编号方式的图)。“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致 该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施 方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成 熟的抗体可使用本领域已知的某些规程来生成。例如，Marks et al. , Bio/Technology 10 :779-783 (1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献 记载了 HVR和/或框架残基的随机诱变例如Bartas et al.，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809-3813(1994) ；Schieret al.，Gene 169:147-155(1995) ；Yelton et al.， J. Immunol. 155 :1994-2004(1995) Jackson et al.，J. Immunol. 154(7) :3310-9(1995)； 及 Hawkins et al.，J. Mol. Biol. 226 :889-896 (1992)。“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗 体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。“激动性抗体”在用于本文时指部分或完全模拟目的多肽的至少一项功能性活性 的抗体。词“标记物”在用于本文时指与抗体直接或间接偶联从而产生“经标记”抗体的可 检测化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标 记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。“固相”意指本发明的抗体可粘附其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子 包括但不限于那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯 酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些实施方案中，根据语 境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和层析柱)。此术语 还包括离散颗粒的不连续固相，诸如美国专利4，275，149中所述。“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投 递药物(诸如本文所述多肽或其抗体)的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成 分通常排列成双层形式。“小分子”在本文中定义为分子量小于约500道尔顿。术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中由哺乳动物免疫系统成分引起、介导、或以其 它方式促成发病的免疫相关疾病。还包括刺激或干预免疫应答对疾病发展具有改善作用的 疾病。此术语包括免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、感染性疾病、免疫缺陷病、 肿瘤等。术语“T细胞介导的疾病”指其中T细胞直接或间接介导或以其它方式促成哺乳动 物发病的疾病。T细胞介导的疾病可能与细胞介导的效应、淋巴因子介导的效应等有关，甚 至与B细胞有关的效应，如果B细胞受到刺激的话，例如受到由T细胞分泌的淋巴因子的刺激。可依照本发明治疗的免疫相关和炎性疾病的例子，其中有些是免疫或T细胞介 导的，包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬26化(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏(Sj5gren)综合征、系统性 血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白 尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、 甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲 状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、 中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏 (Guillain-Barre)综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、 乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆 汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性肠病(IBD)(溃疡性结肠炎、克罗恩氏 (Crohn)病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫性或免疫介导的皮肤病 包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特 应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维 化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病。感染性疾病(包 括病毒性疾病诸如AIDS (HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎等，细菌感染，真菌 感染，原生动物感染和寄生虫感染)也可具有免疫和/或炎性成分和/或病因。数种皮肤病与异常免疫应答和自身免疫有关联。疾病诸如银屑病的标志为皮肤起 泡、皮肤剥落、水肿和结合皮肤蛋白质的自身抗体的存在。在本申请中，实验确定TIGIT表 达在银屑病对正常皮肤中上调。调控TIGIT表达和/或活性在治疗银屑病的症状或潜在原 因中可以是有用的术语炎性肠病(“IBD”)描述了起因未知的一组慢性炎性病症，其中肠变成发炎， 常常引起反复的腹部绞痛或腹泻。IBD在美国的流行程度估计是约200例每100，000人。 IBD患者可分成两大组，具有溃疡性结肠炎(“UC”)的IBD和具有克罗恩氏(Crohn)病 (“CD”)的 IBD0在有UC的患者中，存在主要牵涉结肠粘膜的炎性反应。炎症通常是均勻且连续 的，没有正常粘膜的居间区。表面粘膜细胞以及隐窝上皮和粘膜下层牵涉炎性反应且伴有 嗜中性粒细胞浸润。最终，这种情形通常发展成上皮损伤，且上皮细胞的丧失导致结肠的多 处溃疡、纤维化、发育异常和纵向退缩。CD与UC的不同之处在于炎症延伸穿过肠壁的所有 层，而且牵涉肠系膜以及淋巴结。CD可影响消化道的任何部分，从口至肛门。该病常常是不 连续的，即严重患病肠段与表观无病区分开。在⑶中，肠壁还增厚，这可导致闭塞。另外， 瘘和裂隙不是罕见的。临床上，IBD的特征为常常导致慢性、不可预测的进程的多种多样表现。血性腹泻 和腹痛常常伴有发烧和体重减轻。贫血不是罕见的，正如严重的疲劳。范围从关节痛至急 性关节炎的关节表现以及肝功能异常常常与IBD有关。与一般人群相比，IBD患者还具有 升高的结肠癌风险。在IBD急性“发作”期间，工作和其它正常活动通常是不可能的，患者 通常入院。尽管IBD的起因仍然未知，已经发现与几种因素，诸如遗传、感染和免疫学易感性 有关。IBD在高加索人(白种人)中常见得多，尤其是犹太人后裔。该状况的慢性炎性性 质促使深入研究可能的感染原因。尽管已经找到了激发急性炎症的因素，尚未找到引起与 IBD有关的慢性炎症的因素。IBD是自身免疫病的假说得到先前所述IBD的肠外表现有关节关节炎及通过诸如肾上腺糖皮质激素、环孢霉素和硫唑嘌呤等治疗剂的处理对IBD的已 知积极响应已知遏制免疫应答的支持。另外，胃肠道比机体的任何其它器官更多的连续暴 露于潜在抗原性物质诸如来自食物的蛋白质、细菌副产物(LPS)等。另外，结肠癌的风险在具有严重溃疡性结肠炎的患者中高度升高，特别是如果 该病已经存在了数年的话。由于大量出血、慢性虚弱性不适、结肠穿孔、或癌症风险，约 20-25%的IBD患者最终需要手术切除结肠。在其它形式的医学处理失败时或者在类固醇 或其它药物的副作用威胁患者健康时，有时也进行手术。因为手术是侵入性的且彻底改变 生活，它不是非常想要的治疗方案，而且通常是最后求助的治疗方法。为了更好的理解这种 疾病及(可能的话)治疗它，进行实验以确定在CD和UC 二者中与正常组织相比都上调的 TIGIT0调控TIGIT的表达和/或活性可证明在一种或多种形式的IBD的治疗中是有用的。类风湿性关节炎(RA)是一种慢性系统性自身免疫性炎性疾病，主要牵涉多个关 节的滑膜，由此导致对关节软骨的损伤。发病机制依赖T淋巴细胞，而且与类风湿因子，针 对自身IgG的自身抗体的生成有关，由此导致免疫复合物的形成，它在关节液和血液中达 到高水平。关节中的这些复合物可诱发显著的淋巴细胞和单核细胞浸润到滑膜中及随后显 著的滑膜变化；关节腔/液受到类似细胞的浸润及添加许多嗜中性粒细胞。受影响的组织 主要是关节，常常是对称样式。然而，关节外疾病也存在两种主要形式。一种形式是形成关 节外损伤，伴有正在进行的渐进性关节病和肺纤维化、血管炎和皮肤溃疡的典型损伤。关节 外疾病的第二种形式是所谓的费尔提氏Owelty)综合征，它发生在RA病程晚期，有时在关 节病已经沉寂后，且牵涉出现嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和脾肿大。这可伴随着多 个器官中的血管炎及梗塞、皮肤溃疡和坏疽的形成。患者还常常在受影响关节上面的皮下 组织中形成类风湿性节结；晚期的节结具有由混合的炎性细胞浸润物包围的坏死中心。可 在RA中出现的其它表现包括心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、伴有肺纤维化的间质性肺炎、 干燥性角膜结膜炎和类风湿性节结。幼发型慢性关节炎是一种慢性特发性炎性疾病，常常开始于16岁之前。其表型与 RA有些相似；类风湿因子阳性的一些患者归入幼发型类风湿性关节炎。疾病细分为三种主 要类别少数关节的、多关节的和系统性的。关节炎可以是严重的，通常是破坏性的，并导致 关节僵硬和生长迟缓。其它表现可包括慢性前葡萄膜炎和系统性淀粉样变。术语“有效量”指导致具体所述目的得以实现的多肽和/或激动剂/拮抗剂的浓 度或量。多肽或其激动剂或拮抗剂的“有效量”可凭经验确定。另外，“治疗有效量”指有效 实现所述治疗效果的多肽和/或激动剂/拮抗剂的浓度或量。该量也可凭经验确定。术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的 物质。该术语意图包括放射性同位素(例如Im、I125、Y9°和Re186)、化疗剂、和毒素(诸如细 菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素)，或其片段。“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括阿霉 素(adriamycin) > 多柔比星(doxorubicin) > 表柔比星(epirubicin)、5_ M 尿 口密 啶(5-fluorouracil),阿糖胞苷(cytosine arabinoside)( “Ara-C”)、环磷酰胺 (cyclophosphamide)、塞替派(thiot印a)、白消安(busulfan)、环磷酰胺(Cytoxan)、类 紫杉醇(taxoids)例如紫杉醇(paclitaxel) (Taxol, Bristol-Myers SquibbOncology, Princeton, NJ)禾口多西他塞(doxetaxel) (Taxotere, Rhone -PoulencRorer, Antony,France)、泰索帝(taxotere)、甲氛蝶吟(methotrexate)、顺怕(cisplatin)、美法仓 (melphalan)、长春喊(vinblastine)、博来霄素(bleomycin)、依托泊昔(etoposide)、 异磷酰胺(ifosfamide)、丝裂霉素(mitomycin) C、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春新碱 (vincristine)、长春 卷滨(vinorelbine)、卡怕(carboplatin)、替尼泊昔(teniposide)、 道诺霉素(daunomycin)、洋红霉素(carminomycin)、氨基噪呤(aminopterin)、方文线菌素 D(dactinomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、埃斯波霉素类(esperamicins)(参见美国专 利4，675，187)、美法仑(melphalan)和其它相关氮芥类。该定义还包括作用为调节或抑制 激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如他莫昔芬(tamoxifen)和奥那司酮(onapristone)。“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞(尤其是过表达本文所鉴 定的任何基因的癌细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S 期、过表达此类基因的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处 于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导Gl停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括 长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉醇(taxol)、 和拓扑异构酶Π抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、柔红霉素 (daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞Gl的药剂也 溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、 达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺钼(cisplatin)、甲氨 蝶呤(methotrexate)、5_氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara_C。更多信息可参见例如 ((The Molecular Basis of Cancer〉〉，Mendelsohn 禾口 Israel 编，第 1 章，题为"Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs", Murakami 等 人’ WB Saunders, Philadelphia, 1995，尤其是第 13 页。术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白 质的通称。此类细胞因子的某些例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中 包括例如生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素； 甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、 促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎 盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β ；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素 相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因 子，诸如NGF-β ；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β ；胰岛 素样生长因子-I和-II ；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、-β 和-Y ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF (M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)和 粒细胞 CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如 IL-l、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 11^-8、11^-9、11^-11、11^-12;肿瘤坏死因子，诸如1咿-0或TNF-β ；及其它多肽因子，包括 LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培 养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性 与免疫球蛋白恒定区的效应物功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不 同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和 免疫球蛋白恒定区序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续(contiguous)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序 列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG_4亚型、IgA(包括IgA-I和 IgA-2)、IgE、IgD 或IgM。在用于本文时，术语“炎性细胞”指增强炎性应答的细胞，诸如单核细胞、嗜曙红细 胞、巨噬细胞和多形核嗜中性细胞(PMN)。II.本发明的组合物和方法TIGIT先前被鉴定为免疫功能的假定调控物(参见例如美国专利公开号 US20040121370，通过述及收入本文)。在此，申请人证明TIGIT是新描述的称作“TIGIT样蛋 白质”(TLP)家族的免疫相关蛋白质家族的成员，该家族包括脊髓灰质炎病毒受体(PVR，也 称作NECL5或0)15 、PVR样蛋白质1_4 (PVRL1-4)、CD96、和CD226。申请人提供这个新TLP 家族(其成员在免疫调节和功能中发挥作用)的保守结构元件，而且提供鉴定别的家族成 员的方法。PVRL 1-4和PVR共享共同的结构域构造(IgV-IgC-IgV)，而CDM6和CD96缺乏近 膜IgV结构域。这八种蛋白质的细胞内区段彼此在PVRL1-3之间共享的胞粘蛋白(afadin) 结合基序之外只显示有限的相似性；PVRL4缺乏这种序列，但是已知仍然结合胞粘蛋白。基 于 NECL-I 相关 IgV 结构域的晶体结构(Dong et al. ,J. Biol. Chem. 281 10610-17 (2006)), 第一和第三基序预测分别位于B与C及F与Gi3链之间的发夹环中。这两个环在IgV折叠 的一个末端处彼此邻近。第二基序包含C’和C”i3链，它们涉及形成NECL-I同二聚体界面 的一部分。如此，这些序列基序可能在PVR家族成员之间观察到的同型和异型相互作用中 发挥作用。TLP家族成员包含多个绝对保守的氨基酸，包括丙氨酸67、甘氨酸74、脯氨酸114、和 甘氨酸"6。另外，TLP家族成员包含数个结构上保守的氨基酸(例如在大多数家族成员，但 不是每一个家族成员中找到的)，包括位置M处选自缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的氨基酸、 位置55处选自丝氨酸和苏氨酸的氨基酸、位置56处的谷氨酰胺、位置112处的苏氨酸、和 位置113处选自苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸。TLP家族的成员还包含三个结构亚基序缬 氨酸/异亮氨酸54-丝氨酸/苏氨酸55-谷氨酰胺M ；丙氨酸67-χ68—73-甘氨酸74 (其中X是任 意氨基酸)；和苏氨酸112_苯丙氨酸/酪氨酸113_脯氨酸114-x115-甘氨酸116 (其中X是任意 氨基酸)。本领域普通技术人员会理解，上文所使用的编号方式是关于人TIGIT蛋白质序列 的，而且虽然这些保守残基和基序在TLP蛋白质家族的不同成员中的相对位置与那些氨基 酸在人TIGIT序列中的位置相同，但是那些残基在其它TLP家族成员中的决定编号可有所 不同。鉴于已鉴定的TLP家族成员涉及免疫调节和功能，这个蛋白质家族的其它成员可 能也涉及免疫调节和功能。因而，本发明提供确定给定蛋白质是否是TLP家族成员的方法， 其通过将所述蛋白质的序列与一种或多种上文鉴定的家族成员的序列比对并评估上文鉴 定的绝对保守残基、上文鉴定的基本上保守的残基、和/或上文鉴定的结构亚基序在所述 给定蛋白质序列中的存在或缺失来进行。本发明还提供鉴定TLP蛋白质家族的其它成员 的方法，其通过对一个或多个序列数据库搜索其氨基酸序列包含上文鉴定的绝对保守的残 基、上文鉴定的基本上保守的残基、和/或上文鉴定的结构亚基序的蛋白质来进行。本文中申请人对TLP家族的鉴定还呈现TLP家族成员的共同结构特征可容许TLP 家族的两个或更多个成员受到相似调控的可能性。例如，如果每个TLP家族成员中保守的和基本上保守的氨基酸残基和亚基序在每种蛋白质的一个或多个结构域中在那些家族成 员中产生相似的三维结构，那么可以靶向那些相似的三维结构以在同一时间同时调控超过 一个TLP家族成员，或甚至所有TLP家族成员。如此，本发明还提供与TLP家族成员此类保 守的或基本上保守的区域特异性相互作用的药剂(“TLP相互作用剂”)。此类药剂可用于 鉴定TLP家族的一个或多个别的成员，其通过评估候选蛋白质是否与TLP相互作用剂相互 作用来进行。候选蛋白质与TLP相互作用剂相互作用可指示该蛋白质也是TLP家族成员。 TLP相互作用剂可调控TLP活性。例如，TLP相互作用剂可以是TLP活性的拮抗剂，包括但 不限于小分子抑制剂、抑制性抗体或其抗原结合片段、适体、和抑制性肽。在另一个例子中， TLP相互作用剂可以是TLP活性的激动剂，包括但不限于稳定TLP蛋白质结构以促进TLP蛋 白质活性的激动性抗体或其抗原结合片段、激动性肽和小分子。TLP相互作用剂可以以多种 本领域已知的方式来鉴定，例如通过使用本文所述筛选方法。申请人:通过mRNA和FACS分析显示TIGIT主要在多种活化的T细胞上表达，特别 是调节性T细胞(Treg)、记忆T细胞、NK细胞、和滤泡B细胞辅助性T细胞(TFh)(自扁桃体 组织分离的)。如此，本发明提供鉴定选定细胞是否是Treg、记忆T细胞、NK细胞、或TFh细 胞的方法，这基于细胞是否表达TIGIT。本发明还提供使用TIGIT来纯化Treg、记忆T细胞、 NK细胞、和TFh细胞，除掉不表达TIGIT的其它类型免疫细胞的方法，这使用本领域已知的和 /或本文描述的任何纯化方法(作为一个非限制性例子，流式细胞术)。申请人还证明在活 化的TMg中发生这些细胞群中最高的TIGIT表达。如此，本发明还提供鉴定给定细胞是否 是活化的TMg的方法，这基于其TIGIT表达水平相对于一种或多种对照样品中的TIGIT表 达水平(其中所述对照样品可以是自例示性T细胞子集群预测定的值，或者所述对照样品 可以是来自已知T细胞亚群的其它样品，诸如活化的T,eg、未活化的T,eg、幼稚T细胞、记忆T 细胞、NK细胞、TFh细胞、或其它T细胞群)。还提供确定给定TMg细胞是否活化的方法，这 通过测定其TIGIT表达水平相对于一种或多种对照活化的或未活化的Treg样品中的TIGIT 表达水平或相对于在已知活化的或未活化的Treg细胞群中预测定的TIGIT表达值。进一步 提供自其它T细胞分开分离活化的Treg的方法，这使用本领域已知的和/或本文描述的任 何纯化方法，其中细胞中表达的TIGIT的量可用于自其它细胞分离所述细胞(作为一个非 限制性例子，通过流式细胞术)。申请人:在此显示TIGIT紧密结合PVR，而且以较低的Kd结合PVRL3(也称作柄蛋 白-3或CD113)和PVRL2(也称作柄蛋白-2或CD112)。如申请人所例示的，TIGIT结合PVR 阻断PVR与其它两种配体即CDM6和⑶96相互作用，而且⑶226作为TIGIT-PVR相互作用 的抑制剂的效率比TIGIT作为PVR-⑶2 相互作用的抑制剂低。申请人制备了抗TIGIT抗 体(例如本文所述抗TIGIT抗体10A7)，其抑制TIGIT或TIGIT融合蛋白结合细胞表面表达 的PVR。申请人进一步生成了在TIGIT上具有与10A7不同的表位特异性的其它抗体，诸如 本文所述抗体1F4。值得注意的是，⑶2 在Treg或TFh这两种高度表达TIGIT的细胞类型 中不显著表达。得到这些发现的支持，本发明提供TIGIT-PVR相互作用、TIGIT-PVRL2相互作用、 和TIGIT-PVRL3相互作用的激动剂和拮抗剂，及使用此类激动剂和拮抗剂在体外或在体 内调控TIGIT-PVR结合、TIGIT-PVRL2结合和TIGIT-PVRL3结合的方法。还提供在体外 或在体内通过施用TIGIT(PVR结合的竞争物)或抗TIGIT抗体或其抗原结合片段来调控⑶226-PVR相互作用和/或⑶96-PVR相互作用的方法。本发明进一步包括抗TIGIT抗体及 其片段(激动性的和拮抗性的二者)，特别是抗TIGIT抗体10A7和1F4及包含抗TIGIT抗 体10A7和/或1F4的CDR的备选类型抗体。本文所述研究证明TIGIT与DC上PVR相互作用，而且显示这种结合相互作用 调控DC功能，特别是细胞因子生成。PVR是一种已知在树突细胞(DC)，以及FDC、成纤维 细胞、内皮细胞、和一些肿瘤细胞上高度表达的细胞表面受体(Sakisaka，Τ. &Takai, Y.， Curr Opin Cell Biol 16,513-21(2004) ；Fuchs,A. &Colonna,Μ· ,Semin Cancer Biol 16, 359-66(2006)). TIGIT结合的人DC分泌高水平的IL-IO和较少的促炎性和其它细胞因子 (诸如 IL-12p40、IL-12p70、IL-6、IL-18、和 IFN γ ) TIGIT 对某些细胞因子诸如 IL-23 的 生成没有影响。只在经TNF α或⑶40/LPS刺激的细胞中观察到TIGIT结合后的这种细胞 因子滞后(skewing)，而在用TLR2或Pam3CSK4刺激的细胞中没有观察到，提示TIGIT是免 疫系统可细调DC功能的一种手段。TIGIT结合未成熟T细胞(如使用TIGIT融合构建物 评估的)抑制T细胞活化和增殖。然而，TIGIT处理不影响未成熟单核细胞衍生DC (iMDDC) 成熟的能力，它也不直接诱导那些细胞成熟。值得注意的是，这种抑制在ERK抑制剂存在下 被逆转，指示ERK活化可能是TIGIT调控DC活性的功能中的一个重要步骤。事实上，申请 人显示TIGIT结合PVR导致PVR磷酸化和pERK 二聚体而非pERK单体磷酸化升高。这不是 一般性效果，因为例如P38细胞内信号传导途径不受TIGIT-Fc处理细胞调控。申请人在此 证明TIGIT+T细胞不仅遏制其它TIGIT_T细胞的增殖，而且还遏制抗原呈递细胞(当在混合 免疫细胞群中存在时)。申请人进一步证明TIGIT-PVR相互作用介导上文观察到的效果，因 为在实验中包括抗TIGIT抗体或抗PVR抗体大大降低观察到的对增殖的抑制、对DC细胞因 子生成的调控、和对其它免疫细胞增殖的遏制。总之，申请人在此提供的数据提示TIGIT通 过负调节免疫应答而提供免疫系统反馈机制。因而，本发明提供通过调控TIGIT或PVR表达和/或活性来调控免疫细胞(例如 DC)功能的方法。例如，提供通过在体外或在体内用TIGIT、TIGIT表达和/或活性的激动 剂、或PVR表达和/或活性的激动剂处理免疫细胞来降低或抑制增殖免疫细胞(例如DC或 抗原呈递细胞)的方法。还提供通过在体外或在体内用TIGIT表达和/或活性的拮抗剂或 PVR表达和/或活性的拮抗剂处理免疫细胞来提高免疫细胞(例如DC或抗原呈递细胞)增 殖的方法。本发明还提供通过施用TIGIT表达和/或活性的拮抗剂或PVR表达和/或活性 的拮抗剂来提高/刺激免疫应答的方法。类似地，提供通过施用TIGIT、TIGIT表达和/或 活性的激动剂或PVR表达和/或活性的激动剂来降低/抑制免疫应答的方法。本发明还提供通过调控TIGIT或PVR表达和/或活性来调控来自免疫细胞(例如 DC)的细胞因子生成的类型和/或量的方法。具体而言，本发明提供通过在体外或在体内 用TIGIT、TIGIT表达和/或活性的激动剂、或PVR表达和/或活性的激动剂处理细胞来提 高免疫细胞(例如DC)生成IL-10的方法。还提供通过在体外或在体内用TIGIT、TIGIT表 达和/或活性的激动剂、或PVR表达和/或活性的激动剂处理细胞来降低免疫细胞(例如 DC)生成和/或释放促炎性细胞因子的方法。类似地，还提供通过在体外或在体内用TIGIT 表达和/或活性的拮抗剂或PVR表达和/或活性的拮抗剂处理细胞来降低免疫细胞(例如 DC)生成IL-10的方法。本发明进一步提供通过在体外或在体内用TIGIT表达和/或活性 的拮抗剂或PVR表达和/或活性的拮抗剂处理细胞来提高免疫细胞(例如DC)生成和/或释放促炎性细胞因子的方法。还提供通过用TIGIT、TIGIT表达和/或活性的激动剂、或PVR 表达和/或活性的激动剂处理细胞来刺激一种或多种细胞中ERK磷酸化和/或经由ERK途 径的细胞内信号传导的方法。类似地，本发明提供通过用TIGIT表达和/或活性的拮抗剂 或PVR表达和/或活性的拮抗剂处理细胞来抑制或降低一种或多种细胞中ERK磷酸化和/ 或经由ERK途径的细胞内信号传导的方法。如本文中所示，TIGIT在关节炎、银屑病、炎性肠病、和乳腺癌组织中的表达相对于 正常对照组织升高。关于乳腺癌组织，申请人显示TIGIT表达与肿瘤细胞本身无关联，但是 与肿瘤中的CD4+免疫细胞浸润物有关联。通过显示TIGIT融合蛋白抑制体外的人T细胞 应答和迟发型超敏感性体内测定法中的鼠T细胞活化，申请人还直接证明TIGIT调控免疫 应答的能力。因而，本发明提供诊断受试者中涉及异常免疫细胞应答的疾病/病症的方法， 其通过评估来自所述受试者的样品中TIGIT的表达和/或活性并将所述表达和/或活性与 TIGIT表达和/或活性的参照量或来自正常对照受试者的样品中TIGIT表达和/或活性的 量比较来进行。本发明还提供评估受试者中涉及异常免疫细胞应答的疾病或病症(即免疫 相关疾病)的严重程度的方法，其通过评估来自所述受试者的样品中TIGIT的表达和/或 活性并将所述表达和/或活性与TIGIT表达和/或活性的参照量或来自正常受试者的样 品中TIGIT表达和/或活性的量比较来进行。还提供预防涉及异常免疫细胞应答的疾病或 病症(即免疫相关疾病)的方法，其通过调控TIGIT表达和/或活性来进行。进一步提供 治疗或减轻涉及异常免疫细胞应答的疾病或病症(即免疫相关疾病)的严重程度的方法， 其通过调控TIGIT表达和/或活性来进行。当TIGIT的负调节活性促成疾病状态时，调控 TIGIT表达和/或活性可采取抑制TIGIT活性和/或表达的形式(即用TIGIT拮抗剂或PVR 拮抗剂)。例如，当想要DC增殖增加和/或DC生成促炎性细胞因子增加时，可能想要拮抗 TIGIT表达和/或活性。当想要TIGIT的负调节活性来控制疾病状态时，调控TIGIT表达和 /或活性可采取活化或提高TIGIT表达和/或活性的形式(即通过施用TIGIT、TIGIT激动 剂或PVR激动剂)。例如，当想要DC增殖降低和/或DC生成促炎性细胞因子降低时，可能 想要激动TIGIT表达和/或活性。下文更为详细地描述本发明的这些和其它方面。A.全长 TIGIT 多肽本发明提供了分离的核苷酸序列，其编码本申请中称为TIGIT多肽的多肽。具体 的说，已经鉴定并分离了编码各种TIGIT多肽的cDNA，正如下文说明书和实施例进一步详 细公开的。本领域普通技术人员会理解，本发明还提供在本发明的方法中有用的其它多肽 (即PVR)，而且本文中具体关于TIGIT多肽的创建、生成、标记、翻译后修饰、使用的方法或 其它方面的任何描述也会适用于其它非TIGIT多肽。B. TIGIT 多肽变体在本文所述全长天然序列TIGIT多肽之外，可制备TIGIT变体。TIGIT变体可通过 将适宜的核苷酸变化引入TIGIT多核苷酸和/或通过合成期望TIGIT多肽来制备。本领域 技术人员将领会，氨基酸变化可改变TIGIT的翻译后加工，诸如改变多肽糖基化位点的数 目或位置或者改变膜锚定特征。可在本文所述天然全长序列TIGIT中或在TIGIT的各个结构域中进行变异，例如 使用例如美国专利No. 5，364，934所述的保守和非保守突变的任何技术和指导方针。变异 可以是编码TIGIT的一个或多个密码子的替代、删除和/或插入，其导致TIGIT的氨基酸序列与天然序列TIGIT相比的变化。任选的是，变异是通过TIGIT的一个或多个结构域中至 少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代。通过比较TIGIT的序列与同源已知蛋白质分子 的序列，并将高同源区中进行的氨基酸序列变化的数目最少化，可发现确定哪些氨基酸残 基可插入、替代或删除而不会对期望活性有不利影响的方针。氨基酸替代可以是将一个氨 基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替代的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨 酸，即保守氨基酸替代。插入或删除可任选在约1个至5个氨基酸的范围内。可通过在序 列中系统进行氨基酸插入、删除或替代，并对所得变体测试由全长或成熟天然序列展示的 活性来确定可容许的变异。本文还提供了 TIGIT多肽的片段。例如，在与全长天然蛋白质比较时，此类片段可 在N-末端或C-末端截短，或者可缺少内部残基。某些片段缺少对于TIGIT多肽的期望生 物学活性不是至关重要的氨基酸残基。TIGIT片段可通过多种常规技术中的任一种来制备。期望肽片段可化学合成。一种 备选方法牵涉通过酶促消化产生TIGIT片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的 位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或者通过用合适的限制酶消化DNA并分离期望片段。 还有一种合适的技术牵涉分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码期望多肽片段的DNA 片段。限定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCR中用作5'和3'引物。优选的是，TIGIT 多肽片段与本文所公开的天然TIGIT多肽共享至少一种生物学和/或免疫学活性。在某些实施方案中，感兴趣的保守替代见表5标题“优选替代”下所示。如果此类 替代导致生物学活性的变化，那么可引入表5中称为“例示替代”的更实质性变化，或者如 下文关于氨基酸类别进一步所述的，并筛选产物。表5原始残基例示替代优诜替代Ala(A)val ；Ieu ；ilevalArg(R)Iys ；gin ；asnIysAsn(N)gin ；his ；Iys ；argginAsp (D)glugluCys(C)serserGln(Q)asnasnGlu(E)aspaspGly(G)pro ；alaalaHis(H)asn ；gin ；Iys ；argargIle(I)Ieu ；val ；met ；ala ；phe ；正亮氨酸leuLeu(L)正亮氨酸；ile ；val ；met ；ala ；pheileLys(K)arg ；gin ；asnargMet (M)Ieu ；phe ；ileleuPhe (F)Ieu ；val ；ile ；ala ；tyrleuPro (P)alaalaSer(S)thrthrThr(T)serser
Trp (W) tyr ；phetyrTyr (Y) trp ；phe ；thr ； serpheVal (V) ile ；Ieu ；met ；phe ；ala ；正亮氨酸 Ieu对多肽的功能或免疫学身份的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显 著不同的替代来实现(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b) 靶位点处分子的电荷或疏水性，或(C)侧链的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可 如下分组(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ；(2)中性、亲水性的Cys、Ser、Thr ；(3)酸性的Asp、Glu ；(4)碱性的Asn、Gin、His、Lys、Arg ；(5)影响链取向的残基Gly、Pro ；和(6)芳香族的 ρ、ΤΥΓ、Ρ1 Θ。非保守替代需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。还可以将此类 替代残基引入保守替代位点，或者更优选的是，引入剩余的(非保守)位点。变异可使用本领域知道的方法来进行，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨 酸扫描、和PCR诱变。可对所克隆的DNA进行定点诱变[Carter等，Nucl. Acids Res. 13 4331(1986) Joller 等，Nucl. Acids Res. 10 :6487 (1987)]、盒式诱变[Wells 等，Gene 34: 315 (1985)]、限制性选择诱变(restriction selectionmutagenesis) [Wells 等，Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317 :415(1986)]或其它已知技术以产生变体 DNA。还可采用扫描氨基酸分析来鉴定沿着连续(contiguous)序列的一个或多个氨 基酸。在优选的扫描用氨基酸中有相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、 甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这组中的优选扫描用氨基酸，因为它消除了 β-碳上的侧链，而且不大可能改变变体的主链构象[Cunninghan^P flfells，Science 244 1081-1085(1989)]。丙氨酸还因为它是最常见的氨基酸而通常成为优选的。另外，常常 在隐蔽位置和暴露位置都发现它[Creighton, The Proteins, W. H. Freeman&Co.，N. Y.； Chothia,J. Mol.Biol. 150 :1 (1976)]。如果丙氨酸替代不产生足够量的变体，那么可使用等 排(isoteric)氛基酸。C. TIGIT 的修饰对TIGIT的共价修饰包括在本发明的范围内。一种类型的共价修饰包括使多肽的 靶定氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生化试剂能够与TIGIT多肽的选定侧链 或者N-或C-末端残基起反应。用双功能试剂进行的衍生化可用于例如使TIGIT多肽与不 溶于水的支持基质或表面交联，以用于抗TIGIT抗体的纯化方法，反之亦然。常用的交联剂 包括例如1，1_双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与4-叠氮水 杨酸形成的酯、同双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚氨基酯诸如3，3' -二硫代双(琥珀酰亚 氨基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷和诸如甲基-3-[(-叠 氮苯基)二硫代]丙亚氨酸酯(propioimidate)等试剂。其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰和天 冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(Τ. Ε. Creighton, Proteins Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman&Co. , SanFrancisco, pp. 79-86 (1983)), N-末端胺的 乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。本发明范围内所包括的对TIGIT多肽的另一类共价修饰包括改变多肽的天然糖 基化样式。“改变天然糖基化样式”在本文中意图指删除一个或多个在天然序列TIGIT中发 现的碳水化合物模块(moiety)(或是通过消除潜在糖基化位点，或是通过以化学和/或酶 促手段删除糖基化)，和/或添加一个或多个在天然序列TIGIT中不存在的糖基化位点。另 外，此短语包括天然蛋白质糖基化中的定性改变，牵涉所存在的各种碳水化合物模块的本 质和比例的变化。向TIGIT多肽中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列而实现。改变可通过例如 向天然序列多肽中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于0-连接的糖 基化位点)。可任选通过DNA水平的变化来改变多肽氨基酸序列，特别是通过在预先选择的 碱基处突变编码多肽的DNA，从而产生会翻译成期望氨基酸的密码子。增加多肽上碳水化合物模块的数目的另一种方法是通过使糖苷与多肽化学或酶 促偶联。本领域对此类方法有描述，例如1987年9月11日公布的W087/05330及Aplin和 ffriston, CRC Crit. Rev. Biochem.，pp. 259—306(1981)。消除多肽上存在的碳水化合物模块可通过化学或酶促方法来实现，或者通过编码 充当糖基化靶物的氨基酸残基的密码子的突变替代来实现。化学脱糖基化技术是本领域已 知的，而且描述于例如 Hakimuddin 等，Arch. Biochem. Biophys. 259 :52(1987)及 Edge 等， Anal. Biochem. 118 :131 (1981)。酶促切割多肽上的碳水化合物模块可通过使用多种内切和 外切糖苷酶来实现，如 Thotakura 等，Meth. Enzymol. 138 =350(1987)所述。对本文中所公开的多肽的另一类共价修饰包括，以美国专利No. 4，640，835 ； 4，496，689 ；4, 301，144 ；4, 670，417 ；4, 791，192 或 4，179，337 所述方式，将多肽与 多种非蛋白质性质的聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯 (polyoxyalkylene)。还可以形成嵌合分子的方式修饰本发明的多肽，所述嵌合分子包含与另一种异源 多肽或氨基酸序列融合的多肽。在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的感兴趣多肽的融合物， 所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于感兴趣多肽 的氨基或羧基末端。此类带表位标签形式的感兴趣多肽的存在可使用针对所述标签多 肽的抗体来检测。而且，表位标签的提供使感兴趣多肽易于使用抗标签抗体或另一类结 合所述表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领 域公知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标 签；流感 HA 标签多肽及其抗体 12CA5 (Field 等，Mol. Cell. Biol. 8 :2159-2165 (1988))； c-myc 标签及其抗体 8F9、3C7、6E10、G4、B7 和 9E10(Evan 等，Molecular and Cellular Biology 5 :3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky 等，Protein Engineering 3(6) :547-553 (1990))。其它标签多肽包括但不限于 Flag 肽(Hopp 等，BioTechnology 6:1204-1210(1988)) ；KT3 表位肽(Martin 等， Science 255 :192-194(1992)) ；α -微管蛋白表位肽(Skinner 等，J. Biol. Chem. 266 3615163-15166(1991))；及 T7 基因 10 蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397(1990))。在一个备选实施方案中，嵌合分子可包括多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区 域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为“免疫粘附素”)，此类融合物可以是与IgG 分子Fc区的融合。Ig融合物优选包含用可溶形式(跨膜结构域删除或失活)的多肽置换 Ig分子内至少一个可变区的替代。在一个实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的 铰链区、CH2区和CH3区，或者铰链区、CHl区、CH2区和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的 制备还可参见1995年6月27日公告的美国专利No. 5，428，130。P.多肽制备下面的描述主要涉及通过培养经包含编码感兴趣多肽的核酸的载体转化或转染 的细胞来生成多肽。当然设想了可采用本领域公知的备选方法来制备多肽。例如，可使用 固相技术通过直接肽合成来生成多肽序列或其部分(参见例如Mewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H.Freeman Co. , SanFrancisco, CA,1969 ；Merrifield, J. Am.Chem. Soc. 85 :2149-2154(1963)).体外蛋白质合成可使用手工技术或通过自动化来进行。自动 化合成可例如使用Applied Biosystems肽合成仪(Foster City, CA)依照制造商的说明书 来完成。多肽的各个部分可分开化学合成，并使用化学或酶促方法组合以生成全长多肽。1.编码多肽的DNA的分离编码感兴趣多肽的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库从认为具有所述多 肽mRNA且以可检测水平表达它的组织制备。因此，编码多肽的人DNA可以方便地从以人组 织制备的cDNA文库获得。多肽编码基因也可从基因组文库或通过已知的合成流程(例如 自动化核酸合成)获得。可以用设计用于鉴定目的基因或由其编码的蛋白质的探针(诸如多肽的抗体或 至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。用选定探针筛选cDNA或基因组文库可使用标 准流程进行，诸如 Sambrook 等，Molecular Cloning ALaboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory I^ress，1989所述。分离编码多肽的基因的一种备选方法是使 用 PCR 方法学(Sambrook 等，见上文；Dieffenbach 等，PCR Primer :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press,1995)。下文实施例描述了用于筛选cDNA文库的技术。选作探针的寡核苷酸序列应该足 够长且足够明确(unambiguous)，使得假阳性降到最低。寡核苷酸优选是标记的，使得它 在与所筛选文库中的DNA杂交时可检测出。标记方法是本领域公知的，包括使用放射性标 记物，像32P标记的ATP、生物素化或酶标记。杂交条件，包括中等严格性和高度严格性，见 Sambrook et al，见上文。在此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与保藏的和公共数据库诸如GenBank或 其它私有序列数据库中可得到的其它已知序列比较和对比。分子限定区域内的或跨越全长 序列的序列同一性(或是在氨基酸水平上或是在核苷酸水平上)可使用本领域知道的和本 文描述的方法来测定。具有蛋白质编码序列的核酸可通过使用本文首次公开的推断氨基酸序列筛选选 定cDNA或基因组文库来获得，并且必要时，使用Sambrook等，见上文所述常规引物延伸流 程来检测可能不会逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间产物。
2.宿主细胞的选择和转化将宿主细胞用本文所述用于多肽生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了 诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中 培养。培养条件，诸如培养基、温度、PH等等，可以由熟练技术人员无需过多实验就选择。 通常，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实用技术可参见Mammalian Cell Biotechnology :a PracticalApproach, Μ. Butler 编，IRL Press, 1991 禾口 Sambrook 等，见 上文。真核细胞转染和原核细胞转化的方法是普通技术人员所知道的，例如CaCl2、 CaPO4、脂质体介导的和电穿孔。根据所用宿主细胞，转化使用对此类细胞适宜的标准技术 进行。采用氯化钙的钙处理，如Sambrook等，见上文所述，或电穿孔通常用于原核细胞。根 瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染用于某些植物细胞的转化，如Siaw等， Gene 23 =315(1983)及1989年6月四日公布的WO 89/05859所述。对于没有此类细胞壁 的哺乳动物细胞，可采用Graham和van der Eb, Virology 52:456-457(1978)的磷酸钙沉 淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般情况参见美国专利No. 4，399，216。进入酵母的转 化通常依照 Van Solingen 等，J. Bact. 130 :946(1977)及 Hsiao 等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76 :3829(1979)的方法来进行。然而，也可使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸 如核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、或聚阳离子例如Polybrene、聚鸟 氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的各种技术见Keown等，Methods in Enzymology 185 527-537 (1990)及 Mansour 等，Nature 336 :348-352 (1988)。适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母、或高等真核 细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如 肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，诸如大肠杆菌K12菌株 MM294 (ATCC 31，446)；大肠杆菌 X1776 (ATCC 31，537)；大肠杆菌菌株 W3110 (ATCC 27，325) 和K5 772(ATCC53，63Q。其它合适的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科，诸如埃希氏菌 属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E. coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、 欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属 (Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia) 例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌 属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis) (例如1989年4月12日公布的DD 266，710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属 (Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、和链霉菌属(Str印tomyces)。这些例 子是例示性的而非限制性的。菌株W3110是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用 于重组DNA产物发酵的常用宿主菌株。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例 如，菌株W3110可以修饰，在编码对宿主而言内源的蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿 主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA ；大肠杆菌W3110菌株9E4， 其具有完整基因型tonA ptr3 ；大肠杆菌W3110菌株27C7 (ATCC55，M4)，其具有完整基因型 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr ；大肠杆菌 W3110 菌株 37D6，其具有完 整基因型 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr ；大肠杆菌W3110 菌株40B4，它是具有非卡那霉素抗性degP删除突变的菌株37D6 ；及具有1990年8月7日公告的美国专利No. 4，946，783中公开的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克 隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是合适的。在原核生物之外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是多肽编码载体的合 适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的 低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (Beach 和 Nurse, Nature 290 :140(1981) ；EP139, 383，1985 年5月 2 日公布)；克鲁维 酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利 No. 4，943，529 ；Fleer 等，Bio/Technology 9 :968-975(1991))诸如例如乳酸克鲁维酵母(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574 ； Louvencourt 等，J. Bacteriol. 154(2) :737-742 (1983))、脆壁克鲁维酵母(K. fragilis) (ATCC12, 424)、保加利亚克鲁维酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克克鲁维 酵母(K. wickeramii) (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56,500)、果蠅克鲁维酵母 (K.drosophilarum)(ATCC 36, 906 ；Van den Berg 等，Bio/Technology 8 135 (1990))、耐 热克鲁维酵母(K. thermotolerans)、和马克思克鲁维酵母(K. marxianus)；亚罗酵母属 (Yarrowia) (EP 402, 226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris) (EP 183, 070 ；Sreekrishna 等，J.Basic Microbiol. 28 :265-278(1988))；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉 (Trichoderma reesia) (EP 244, 234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) (Case 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 :5259-5263(1979))；许旺酵母属 Gchwanniomyces)诸如西方许旺 酵母(Schwanniomycesoccidentalis) (EP 394，538，1990 年 10 月 31 日公布)；和丝状真 菌诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium) (W091/00357,1991年1月10日公布)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉 (A. nidulans) (Balance 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 112 :284-289 (1983) ；Tilburn 等，Gene 26:205-221 (1983) ；Yelton 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 81:1470-1474(1984)) 和黑曲霉(A.niger) (Kelly 和 Hynes，EMBO J. 4 :475-479 (1985))。甲基营养型酵母 (Methylotropic yeast)适于本发明，包括但不限于能够在甲醇上生长的、选自以下属的酵 母汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克氏酵母属Kloeckera)、毕 赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、和红酵母属 (Rhodotorula)。作为这类酵母的例子的具体物种列表可参见C. Anthony, TheBiochemistry of Methylotrophs，269(1982)。适用于表达糖基化多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子 包括昆虫细胞诸如果蝇(Drosophila) S2和夜蛾(Spodoptera) Sf9，以及植物细胞。有用哺 乳动物宿主细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)和COS细胞。更具体的例子包括经SV40 转化的猴肾CVl系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾系093或为了在悬浮培养中生长而亚 克隆的 293 细胞，Graham 等，J. Gen Virol. 36 :59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/_DHFR(CH0， Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216(1980))；小鼠基托禾丨J (Sertoli)细 胞(TM4，Mather，Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))；人肺细胞(Wl38, ATCC CCL 75)；人肝 细胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳腺肿瘤(MMT060562, ATCC CCL 51)。认为适宜宿主细胞 的选择在本领域技术范围内。3.复制型载体的选择和使用可以将编码多肽的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体用于克隆(DNA扩增)或表达。多种载体是公众可得到的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体 的形式。可以通过多种规程将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术将 DNA插入适宜的限制性内切核酸酶位点中。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种 信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。包含一 种或多种这些构件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。多肽不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽来生产，所述 异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信号序列或其它多 肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体中的多肽编码DNA的一部 分。信号序列可以是原核信号序列，选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒 素II前导。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导、α因子前导(包括糖酵 母和克鲁维酵母的α -因子前导，后者见美国专利No. 5，010, 182)、或酸性磷酸酶前导、白 色假丝酵母葡糖淀粉酶前导(1990年4月4日公布的EP 362，179)、或1990年11月15日 公布的WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列 来指导蛋白质的分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌 前导。表达和克隆载体都包含使能够载体在一种或多种选定宿主细胞中复制的核酸序 列。众所周知多种细菌、酵母、和病毒的此类序列。来自质粒PBR322的复制起点适合于大多 数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、 VSV、或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。表达和克隆载体通常会包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如 下蛋白质(a)赋予针对抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四 环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢 杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。适于哺乳动物细胞的选择标志的例子是能够鉴定有能力摄取多肽编码核酸的细 胞的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性 缺陷的 CHO 细胞系，其制备和繁殖如 Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216(1980) 所述。适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trpl基因(Minchcomb 等，Nature 282 :39(1979) ；Kingsman 等，Gene 7 :141(1979) ；Tschemper 等，Gene 10 157(1980))。trpl基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No. 44076或 PEP4-1 提供了选择标志(Jones，Genetics 85:12(1977))。表达和克隆载体通常包含与多肽编码核酸序列可操作连接的启动子以指导mRNA 合成。受到多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子包 括β -内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等，Nature275 :615(1978) ；Goeddel等，Nature 281 :544(1979))、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel,Nucleic acids Res. 8 4057(1980) ；EP 36，776)、和杂合启动子诸如 tac 启动子(deBoer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25(1983))。用于细菌系统的启动子还会包含与编码多肽的DNA可操作连接的 Shine-Dalgarno (S. D.) ·歹Ij。适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman 等，J. Biol. Chem. 255 :2073 (1980))或其它糖酵解酶(Hess 等，J. Adv. EnzymeReg. 7 149(1968) ；Holland,Biochemistry 17 :4900(1978))的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛_3_磷 酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸 变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、和葡糖激酶。作为具有由生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是 醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷 酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子 进一步描述于EP 73,657。在哺乳动物宿主细胞中由载体转录多肽受到例如由病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒 (1989年7月5日公布的UK 2，211，504)、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤 病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿病毒40 (SV40)基因组、由异源哺乳动物启动 子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、及由热休克启动子获得的启动子的控制，倘 若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。可通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码多肽的DNA的转录。 增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10至300bp，作用于启动子以增加转录。现在知 道来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序 列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强 子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和 腺病毒增强子。增强子可以剪接到载体中，位于多肽编码序列的5'或3'位置，但是优选 位于启动子的5'位点。用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体 的有核细胞)的表达载体还会包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可 以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码 多肽的mRNA的非翻译部分中转录成多腺苷酸化片段的核苷酸区段。适合在改动后在重组脊椎动物细胞培养物中合成感兴趣多肽的其它方法、载 体和宿主细胞见 Gething 等，Nature 293 :620-625(1981) ；Mantei 等，Nature 281 40-46(1979) ；EP 117，060;及 EP 117,058。4.检测基因扩增/表达基因的扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如根据本文提供的序列，使 用经适当标记的探针，通过常规的Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :5201-5205 (1980)]、点印迹(DNA 分析)或原位杂 交。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及 DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可标记抗体，并可进行测定法，其中将双链 体结合到表面上，从而在双链体在表面上形成时，可检测与双链体结合的抗体的存在。或者，为了直接对基因产物的表达定量，可通过免疫学方法测量基因表达，诸如细 胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的测定法。可用于免疫组化染色和/或 样品液体测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方 便的是，可针对天然序列多肽或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与编码多肽 的DNA融合且编码特定抗体表位的外源序列来制备抗体。5.多肽的纯化
可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的感兴趣多肽。如果是膜结合 的，那么可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促裂解使其从膜中释放 出来。多肽表达中所采用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处 理、机械破裂、或细胞溶解剂。可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化多肽。下面的流程是合适纯化流程的例 示在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC ；在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上 的层析；层析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸铵沉淀；使用例如kphadex G-75的凝胶过滤；蛋白 A kpharose柱以清除污染物诸如IgG;及结合带表位标签形式的多肽的金属螯合柱。可 采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher，Methods in Enzymology,182(1990) ；Scopes, Protein Purification !Principles and Practice, Springer-Verlag,New York(1982)。所选择的纯化步骤将取决于例如所用生成过程的性质 和所产生的具体多肽。E.组织分布表达多肽的组织的位置可通过测定各种人组织中的mRNA表达来鉴定。此类基因 的定位提供了关于哪些组织最有可能受刺激和抑制多肽活性影响的信息。基因在特定组织 中的定位还为下文讨论的活性阻断/活化测定法提供了样品组织。如前所述，各种组织中的基因表达可根据本文中提供的序列，使用恰当标记的探 针，通过常规Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹(Thomas，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,77 :5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)、或原位杂交来测量。或者，可采用识 别特定双链体，包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体 的抗体。或者，多种组织中的基因表达可通过免疫学方法来测量，诸如组织切片的免疫组 化染色及细胞培养物或体液的测定法，以直接对基因产物的表达定量。可用于免疫组化染 色和/或样品液测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制 备。方便的是，可针对天然序列多肽或针对基于编码多肽的DNA序列的合成肽或针对与编 码多肽的DNA融合且编码特定抗体表位的外源序列制备抗体。下文提供了用于生成抗体的 通用技术及Northern印迹和原位杂交的专用方案。F.抗体结合研究本发明多肽的活性可进一步通过抗体结合研究来验证，其中测试抗多肽抗体抑制 多肽多肽对组织细胞的作用的能力。例示性抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特 异性的、和异源偶联的抗体，下文会描述它们的制备。抗体结合研究可以以任何已知测定法来实施，诸如竞争性结合测定法、直接和间 接三明治式测定法、及免疫沉淀测定法。参见例如hlaWMonoclonalAntibodies =A Manual ofTechniques)),H 147-158 页，CRC Press, Inc.，1987。竞争性结合测定法依赖于经标记标准品与测试样品分析物竞争与有限量的抗体 结合的能力。测试样品中靶蛋白质的量与变成与抗体结合的标准品的量成反比。为了便于 测定变成结合的标准品的量，优选在竞争之前或之后使抗体不溶解，使得与抗体结合的标 准品和分析物可方便地与仍然未结合的标准品和分析物分开。三明治式测定法牵涉使用两种抗体，每一种都能够结合待检测蛋白质的不同免疫42原性部分或表位。在三明治式测定法中，使测试样品分析物受到固定化在固相支持物上的 第一抗体的结合，此后使第二抗体结合分析物，如此形成不溶性三元复合物。参见例如美国 专利No. 4，376，110。第二抗体自身可以是用可检测模块标记的(直接三明治式测定法)， 或者可以使用用可检测模块标记的抗免疫球蛋白抗体来测量(间接三明治式测定法)。例 如，三明治式测定法的一种类型是ELISA测定法，在这种情况中可检测模块是酶。对于免疫组化，组织样品可以是新鲜的或冷冻的，或者可以是例如在石蜡中包埋 的且用防腐剂诸如福尔马林固定的。G.基于细胞的测定法免疫相关疾病的动物模型和基于细胞的测定法可用于进一步理解本文中所鉴定 的基因和多肽与免疫相关疾病的形成和发病机理之间的关系。在一种不同的方法中，将已知牵涉特定免疫相关疾病的细胞类型的细胞用本文所 述cDNA转染，并分析这些cDNA刺激或抑制免疫功能的能力。合适细胞可用期望基因转染， 并监测免疫功能活性。然后此类转染细胞系可用于测试多克隆或单克隆抗体或者抗体组合 物抑制或刺激免疫功能，例如调控T细胞增殖或炎性细胞浸润的能力。用本文中所鉴定的 基因的编码序列转染的细胞可进一步用于鉴定用于治疗免疫相关疾病的药物候选物。另外，衍生自转基因动物(如下文所述)的原代培养物可用于本文中的基于细胞 的测定法，尽管本领域更通常的是使用稳定的细胞系。从转基因动物衍生连续细胞系的技 术是本领域众所周知的(参见例如Small等，Mol. Cell. Biol.，5 :642-648 (1985))。一种合适的基于细胞的测定法是混合淋巴细胞反应(MLR)。《CurrentProtocols in Immunology》，单兀 3· 12, J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober IS,National Institutes of Health, John Wiley&Sons，Inc. 。 贝 1] +，iij 定测试化合物刺激或抑制激活的T细胞增殖的能力。将响应者T细胞的悬浮液与同种异基 因刺激物细胞一起培养，并通过氚化胸苷摄取测量T细胞增殖。此测定法是T细胞反应性 的通用测量方法。由于大多数T细胞在激活时响应并生成IL-2，因此此测定法中响应度的 差异部分反映了响应性细胞的IL-2生成的差异。MLR结果可通过标准淋巴因子(IL-2)检 测测定法来验证。《Current Protocols in Immunology》，见上文，3· 15，6· 3。MLR测定法中的增殖性T细胞响应可能是由于所测定分子的直接促有丝分裂特性 或外部抗原诱导的激活。还可以通过共刺激测定法来获得对多肽的T细胞刺激活性的验 证。T细胞激活要求经由T细胞受体(TCR)介导的抗原特异信号和经由第二配体结合相互 作用例如Β7(⑶80，⑶86)/⑶观结合相互作用介导的共刺激信号。⑶观交联提高激活的T 细胞的淋巴因子分泌。T细胞激活具有正负两种控制，经由具有积极或消极作用的配体的结 合来实现。⑶观和CTLA-4是Ig超家族中结合Β7的相关糖蛋白。结合Β7的⑶观对T细 胞激活具有积极的共刺激效果；相反，结合Β7的CTLA-4具有T细胞解激活效果。Chambers, C. Α.禾口 Allison，J. P. , Curr. Opin. Immunol. ,9 :396(1997) ；Schwartz, R. H. , Cell, 71 1065(1992) ；Linsey, P. S.禾口 Ledbetter，J. A.，Annu. Rev. Immunol. ,11 :191(1993) June, C. H.等，Immunol. Today, 15 :321 (1994) Jenkins, M. K.，Immunity, 1 :405 (1994)。在共朿Ij 激测定法中，对多肽测定T细胞共刺激或抑制活性。如在本发明中那样刺激性化合物的直接使用在使用4-1BB糖蛋白的实验中得到 验证，4-1BB是肿瘤坏死因子受体家族的成员，结合接触过抗原的(primed) T细胞上表达的配体(4-1BBL)并发出T细胞激活和生长信号。Alderson, Μ. E.等，J. Immunol. (1994)24 2219。激动剂刺激性化合物的使用也已经通过实验得到验证。作为一个例子，通过激动 性抗4-1BB抗体处理进行的4-1BB激活增强肿瘤的根除。Hellstrom, I.和Hellstrom， K. Ε. ,Crit. Rev. Immunol. (1998) 18 :1。下文更详细描述的肿瘤治疗的免疫辅助疗法是本发 明刺激性化合物的用途的另一个例子。或者，免疫刺激或增强效果还可通过施用具有血管通透性增强特性的多肽来实 现。血管通透性增强对可通过局部免疫细胞(例如单核细胞、嗜曙红细胞、PMN)浸润削弱 的病症和炎症会是有益的。另一方面，TIGIT多肽，以及作为T细胞增殖/激活、促炎性细胞因子分泌、和/或 血管通透性的直接抑制物的本发明的其它化合物，可直接用于遏制免疫应答。这些化合物 可用于降低免疫应答的程度和治疗以过度活跃的、超过最佳的或自身免疫性的应答为特征 的免疫相关疾病。本发明化合物的此用途已经通过上文所述实验得到验证，其中结合受体 B7的CTLA-4使T细胞解激活。本发明的直接抑制性化合物以类似方式发挥功能。遏制血 管通透性的化合物的使用会减轻炎症。此类用途在治疗与过度发炎有关的疾患中会是有益 的。
类似地，结合TIGIT抑制性多肽并阻断这些TIGIT抑制性多肽的效果的化合物，例 如抗体，产生净抑制效果且也可通过让TIGIT自由抑制T细胞增殖/激活和/或淋巴因子分 泌而用于遏制T细胞介导的免疫应答。对多肽抑制效果的阻断遏制哺乳动物的免疫应答。或者，对于与T细胞介导的免疫应答不足和/或严重有关的状况，抑制或减少 TIGIT活性和/或表达或干扰TIGIT结合PVR和/或经PVR发信号的能力对于治疗可能是 有益的。此类抑制或减少可以通过施用TIGIT表达和/或活性的拮抗剂和/或PVR表达和 /或活性的拮抗剂来提供。H.动物模型基于细胞的体外测定法的结果可进一步使用体内动物模型和T细胞功能的测定 法来验证。多种众所周知的动物模型可用于进一步理解本文中所鉴定的基因在免疫相关疾 病的形成和发病机理中的作用，及测试候选治疗剂的功效，包括抗体及天然多肽的其它拮 抗剂，包括小分子拮抗剂。此类模型的体内本质使得它们能预报在人类患者中的响应。免 疫相关疾病的动物模型包括非重组的和重组的(转基因的)这两类动物。非重组动物模型 包括例如啮齿类，例如鼠模型。此类模型可使用标准技术，例如皮下注射、尾静脉注射、脾植 入、腹膜内植入、肾囊下的植入等，通过将细胞导入同基因小鼠来生成。移植物抗宿主病在将有免疫能力的细胞移植到免疫遏制或耐受患者中时发生。供 体细胞识别并应答宿主抗原。应答可从危及生命的严重炎症至腹泻和体重减轻的轻微病例 变化。移植物抗宿主病模型提供了评估针对MHC抗原和次要移植物抗原的T细胞反应性 的手段。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元 4. 3。皮肤同种异体移植物排斥的动物模型是测试T细胞介导体内组织破坏的手段及 其在移植物排斥中的作用的测量方法。最常用的和公认的模型使用鼠尾部皮肤移植物。 重复实验显示了皮肤同种异体移植物排斥是由T细胞、辅助T细胞和杀伤-效应T细胞而非抗体介导的° Auchincloss, H. Jr.和 Sachs, D. H.,《Fundamental Immunology》，第 2 版，W. Ε. Paul 编，Raven Press, NY，1989，889-992。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols ^11讓皿01呢7》，见上文，单元4.4。可用于测试本发明化合物的其它移植物排 斥模型有异基因心脏移植物模型，记载于Tanabe，Μ.等，Transplantation (1994) 58 :23及 Tinubu, S. Α.等，J. Immunol. (1994)4330-4338。迟发型超敏感性的动物模型同样提供了细胞介导的免疫功能的测定法。迟发型 超敏感性反应是T细胞介导的体内免疫应答，特征为在抗原考验后一段时间流逝后才达 到峰值的炎症。这些反应也在组织特异性自身免疫病中发生，诸如多发性硬化(MS)和实 验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE，MS的一种模型)。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols in Immunology〉〉，见上文，单兀 4· 5。EAE是T细胞介导的自身免疫病，特征为T细胞和单个核细胞炎症和随后中枢神 经系统中轴突的脱髓鞘。EAE通常认为是人MS的相关动物模型。Bolton，C.，Multiple kler0SiS(1995)l :143。急性的和复发-缓和型的这两种模型都已开发。本发明的化合物 可针对免疫介导的脱髓鞘病测试T细胞刺激性或抑制性活性，使用《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元15. 1和15. 2中所述方案。还可参见髓磷脂疾病的模型，其中将 少突胶质细胞或施旺Gchwarm)细胞移植到中枢神经系统中，如Duncan，I. D.等，Molec. Med. Today (1997) 554-561 所述。接触超敏感性是细胞介导的免疫功能的一种简单的迟发型超敏反应体内测定法。 在此流程中，使皮肤暴露于外源半抗原，它引起迟发型超敏反应，对此测量和定量。接触敏 感性牵涉初始致敏阶段，随后是引发阶段。引发阶段在T淋巴细胞遭遇它们先前已经接触 过的抗原时发生。发生肿胀和炎症，使之成为人过敏性接触性皮炎的卓越模型。一种合适 的流禾呈详细记载于《Current Protocols in Immunology》，J. Ε· Cologan, A. Μ· Kruisbeek, D. H. Marglies,E. Μ. Shevach，和 W. Strober 编，John ffiley&Sons, Inc.，1994，单元 4. 2。还 可参见 Grabbe，S.和 khwarz，Τ, Immun. Today 19(1) :37-44(1998)。关节炎的动物模型是胶原诱发的关节炎。此模型分享人自身免疫性类风湿性关节 炎的临床、组织学和免疫学特征，是人自身免疫性关节炎的公认模型。小鼠和大鼠模型的特 征为滑膜炎、对软骨和软骨下骨的侵蚀。本发明的化合物可使用《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元15. 5中记载的方案来测试针对自身免疫性关节炎的活性。还可 参见使用 Issekutz，Α. C.等，Immunology (1996)88 :569 中记载的 CD18 和 VLA-4 整联蛋白 的单克隆抗体的模型。由于与人类风湿性关节炎(RA)的许多免疫学和病理学相似性、涉及局部主要组 织相容性、完全II类限制性T辅助性淋巴细胞激活、和组织学损害的相似性，胶原诱发的关 节炎(CIA)模型被视为适于研究在人关节炎中有活性的潜在药物或生物制剂的模型。此 CIA模型的与RA患者中所找到的相似的特征包括关节边缘处的软骨和骨侵蚀(如可在放 射照片中看到的)、增殖性滑膜炎、对称累及附肢骨骼而不是中轴骨骼中小尺寸和中等尺寸 的外周关节。Jamieson 等，Invest. Radiol. 20 :3M-9 (1985)。此外，IL-1 和 TN-α 似乎涉 及 CIA，如在 RA 中的情况。Joosten 等，J. Immunol. 163 :5049-5055 (1999)。TNF 中和性抗体 和 TNFR. Fc 分别减轻该模型中 RA 的症状(Williams 等，PNAS，89 :9784-9788(1992) ；Wooley 等，J. Immunol.，151 :6602-6607 (1993))。
在RA的该模型中，从牛关节软骨中纯化II型胶原(Miller，Biochemistryll 4903(1972))，并用于免疫小鼠(Williams 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 :2762 (1994))。 关节炎的症状包括肢体的红斑和/或肿胀以及软骨和骨的侵蚀或缺损，正如组织学所测 定的。该广泛使用的模型还记载于例如Holmdahl等，APMIS,97 :575(1989)及Current Protocols in Immunology,见上文，单兀 15. 5,及于 Issekutz 等，Immunology,88 569(1996)，以及下文实施例。已经记载了一种哮喘模型，其中通过用卵清蛋白使动物致敏，然后用通过气雾剂 投递的相同蛋白质攻击验动物而诱导抗原诱发的气道高反应性、肺嗜曙红细胞增多和炎 症。数种动物模型(豚鼠、大鼠、非人灵长类)在用气雾剂抗原攻击后显示与人的特应性哮 喘相似的症状。鼠模型具有人哮喘的许多特征。测试本发明化合物在治疗哮喘中的活性和 效力的合适流程记载于 Wolyniec，W. W.等，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1998) 18 :777 及 其引用的参考文献。另外，本发明的化合物可在银屑病样疾病的动物模型上测试。有证据提示银屑病 的T细胞发病机理。本发明的化合物可在khon，Μ. P.等，Nat. Med. (1997)3 :183记载的 scid/scid小鼠模型中测试，其中小鼠展示与银屑病类似的组织病理学皮肤损伤。另一种 合适的模型是如Nickoloff, B. J.等，Am. J. Path. (1995) 146 :580所述制备的人皮肤/scid 小鼠嵌合体。重组(转基因)动物模型可使用用于生成转基因动物的标准技术通过将本文中 所鉴定的基因的编码部分导入目的动物的基因组来改造。可充当转基因操作对象的动物 包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪和非人灵长类，例如狒狒、黑猩猩和 猴。本领域已知的用于将转基因导入此类动物中的技术包括原核显微注射(pronucleic microinjection) (Hoppe和Wanger，美国专利No. 4，873，191)；逆转录病毒介导的基因转移 进入种系中(例如 Van der Putten 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，82 :6148-615 (1985))； 胚胎干细胞中的基因寻靶(Thompson等，Cell，56 :313-321 (1989))；胚胎电穿孔(Lo， Mol. Cel. Biol.，3 :1803-1814(1983))；精子介导的基因转移(Lavitrano 等，Cell,57 717-73(1989))。综述参见例如美国专利No. 4，736，866。为了本发明的目的，转基因动物包括那些只在其部分细胞中携带转基因的动物 (“镶嵌动物”)。转基因可作为单一转基因或者串联物例如头-头或头-尾串联物整合。还 可能如下将转基因选择性导入特定细胞类型中，例如Lasko等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :6232-636(1992)的技术。转基因在转基因动物中的表达可通过标准技术来监测。例如，Southern印迹分析 或PCR扩增可用于验证转基因的整合。然后可使用诸如原位杂交、Northern印迹分析、PCR 或免疫细胞化学的技术分析mRNA表达水平。动物可进一步检验免疫病病理学的征候，例如通过组织学检验以测定免疫细胞进 入特定组织中的浸润。还可进行阻断实验，其中用本发明的化合物处理转基因动物以测定 化合物刺激或抑制T细胞增殖的程度。在这些实验中，将如上所述制备的结合本发明多肽 的阻断性抗体施用于动物并测定对免疫功能的效果。或者，可构建“敲除”动物，它由于编码本文中所鉴定的多肽的内源基因和导入 动物胚胎细胞中的改变的编码该多肽的基因组DNA之间的同源重组而具有缺陷的或改变的编码该多肽的基因。例如，可依照已建立的技术用编码特定多肽的cDNA克隆编码该多 肽的基因组DNA。可以将编码特定多肽的基因组DNA的一部分删除或用另一基因替换， 诸如可用于监测整合的、编码选择标志的基因。通常，载体中包含数千碱基未改变的侧 翼DNA (5 ‘和3'末端都有)(关于同源重组载体的描述参见例如Thomas和Capecchi， Cell，51 :503(1987))。将载体导入胚胎干细胞系中(例如通过电穿孔)，并选择其中所导 入DNA与内源DNA发生了同源重组的细胞(参见例如Li等，Cell,69 :915(1992))。然后 将所选择的细胞注射到动物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合体(参见例如 Bradley,在《Teratocarcinomas and Embryonic StemCells :A Practical Approach》中， Ε. J. Robertson编，IRL, Oxford, 1987，第113-152页)。然后可将嵌合胚植入合适的假孕雌 性代孕动物中，并使胚胎足月产生“敲除”动物。在其生殖细胞中包含同源重组DNA的后代 可通过标准技术鉴定，并用于繁殖其中动物的所有细胞都包含同源重组DNA的动物。敲除 动物可以在例如由于缺乏该多肽而具有抵御某些病理疾患的能力和形成病理疾患方面进 行表征。I.免疫辅助疗法在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性化合物可用于肿瘤(癌症)治疗的免疫 辅助疗法。现在已经明确确立了 T细胞识别人肿瘤特异抗原。由MAGE、BAGE和GAGE基 因家族编码的一组肿瘤抗原在所有成人正常组织中是沉默的，但在肿瘤中以显著量表达， 诸如黑素瘤、肺肿瘤、头和颈肿瘤、及膀胱癌。DeSmet, C.等，(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93 :7149.已经显示了 T细胞的共刺激在体外和在体内都诱导肿瘤消退和抗肿瘤应 胃。Melero， I.等，Nature Medicine (1997) 3 682 ；Kwon, E. D.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94 :8099 ；Lynch, D. H.等，Nature Medicine (1997) 3 :625 ；Finn, 0. J.和 Lotze， Μ. Τ.，J. Immunol. (1998)21 :114。本文中所提供的数据证明TIGIT表达与乳腺癌肿瘤中的 免疫细胞浸润有关联。本文中还证明TIGIT抑制DC和其它免疫细胞的增殖及抑制此类细胞 生成促炎性细胞因子。如此，肿瘤免疫浸润细胞中的TIGIT过表达可能是异常的，因为肿瘤 中降低的T细胞活性会是不想要的。TIGIT拮抗剂和/或TIGIT-PVR信号传导相互作用的 拮抗剂(即PVR拮抗剂)可作为佐药单独施用，或者联合生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂， 以刺激T细胞增殖/激活和对肿瘤抗原的抗肿瘤应答。生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂可 以使用已知施用方案以常规量施用。本发明的TIGIT拮抗性和TIGIT活性拮抗性化合物的 免疫刺激活性容许降低生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂的量，由此潜在降低对患者的毒性。J.药物候选物的筛选测定法药物候选物的筛选测定法设计成鉴定与本文中所鉴定的基因编码的多肽或其生 物学活性片段结合或复合或者以其它方式干扰所编码多肽与其它细胞蛋白质相互作用的 化合物。此类筛选测定法包括可适应化学文库高通量筛选，使之特别适于鉴定小分子药物 候选物的测定法。所涵盖的小分子包括合成的有机或无机化合物，包括肽，优选可溶性肽、 (多)肽-免疫球蛋白融合物、和特别是抗体，包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片 段、单链抗体、抗独特型抗体、及此类抗体或片段的嵌合的或人源化的型式，以及人抗体和 抗体片段。测定法可以多种形式进行，包括蛋白质-蛋白质结合测定法、生化筛选测定法、 免疫测定法和基于细胞的测定法，它们在本领域已全面表征。所有测定法的共同之处在于 它们要求使药物候选物接触由本文中所鉴定的核酸编码的多肽，接触的条件和时间足以容许这两种成分相互作用。在结合测定法中，相互作用指结合，而且可分离或检测反应混合物中形成的复合 物。在一个具体的实施方案中，将由本文中所鉴定的基因编码的多肽或药物候选物通过共 价或非共价附着固定化在固相上，例如微量滴定板上。非共价附着通常是通过用多肽溶液 包被固相表面并干燥来实现的。或者，可将对待固定化多肽特异的固定化抗体，例如单克隆 抗体，用于将该多肽锚定至固相表面。测定法如下进行，将非固定化成分(它可以用可检测 标记物标记)添加至固定化成分(例如含锚定成分的经包被表面)。当反应完成后，除去未 反应成分，例如通过清洗，并检测锚定在固相表面上的复合物。若最初的非固定化成分携带 可检测标记物，则固定化在表面上的标记物的检出指示发生了复合。若最初的非固定化成 分不携带标记物，则可通过例如使用特异性结合固定化复合物的经标记抗体来检测复合。如果候选化合物与由本文中所鉴定的基因编码的特定蛋白质相互作用但不结合 它，那么与该蛋白质的相互作用可通过众所周知的用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的 方法来测定。此类测定法包括诸如交联、免疫共沉淀、及经由梯度或层析柱的共纯化的传 统方法。另外，蛋白质-蛋白质相互作用可通过如Chevray和Nathans，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,89 :5789-5793(1991)所公开的使用Fields及其同事记载的基于酵母的遗传系统 (Fields 和 Song, Nature (London), 340 :245-246(1989) ；Chien 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88 :9578-9582(1991))来监测。许多转录激活物，诸如酵母GAL4，由两个物理上离散的 模块结构域组成，一个起DNA结合结构域的作用，另一个发挥转录激活结构域的功能。前述 出版物中记载的酵母表达系统(通常称为“双杂交系统”)利用了这种特性，采用两种杂合 蛋白，在其中之一中靶蛋白质与GAL4的DNA结合结构域融合，在另一中候选活化性蛋白质 与激活结构域融合。GALl-IacZ报道基因在GAL4激活的启动子控制下的表达依赖于GAL4 活性经蛋白质-蛋白质相互作用的重建。含相互作用多肽的菌落用半乳糖苷酶的显色 底物来检测。使用双杂交技术来鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完 整试剂盒(MATCHMAKER )可以从Clontech购得。此系统还可延伸至对参与特定蛋白质相 互作用的蛋白质结构域的作图以及指出对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。为了找到干扰本文中所鉴定的基因(的产物)与其它胞内或胞外组分相互作用的 化合物，通常在足以容许两种产物相互作用和结合的条件和时间下制备包含基因产物及胞 内或胞外组分的反应混合物。为了测定测试化合物抑制结合的能力，在缺乏和存在测试化 合物时进行反应。另外，可以向第三份反应混合物中加入安慰剂，以充当阳性对照。如上所 述监测混合物中存在的基因产物和胞内或胞外组分之间的结合(复合物形成)。对照反应 中形成复合物但含有测试化合物的反应混合物中没有形成复合物表明，测试化合物干扰基 因产物与其反应配偶体的相互作用。K.用于治疗免疫湘关疾病的組合4勿禾Π方法可用于治疗免疫相关疾病的组合物包括但不限于抑制或刺激免疫功能，例如T细 胞增殖/激活、淋巴因子释放、或免疫细胞浸润的蛋白质、抗体、有机小分子、肽、磷酸肽、反 义和核酶分子、三股螺旋分子等。例如，反义RNA和DNA分子通过与靶mRNA杂交并阻止蛋白质翻译来直接阻断mRNA 的翻译而起作用。在使用反义DNA时，优选自翻译起始位点衍生的寡脱氧核糖核苷酸，例如 靶基因核苷酸序列的约-10和+10位置之间。
核酶是能够催化RNA特异切割的酶活性RNA分子。核酶通过与互补靶RNA的序列 特异性杂交及后续内切核酸切割起作用。潜在RNA靶物内的特定核酶切割位点可通过已知 技术来鉴定。进一步细节参见例如Rossi，CurrentBiology 4 :469-471 (1994)及PCT公开 号 W 97/33551 (1997 年 9 月 I8 日公布)。用于抑制转录的三股螺旋结构中的核酸分子应当是单链且由脱氧核苷酸构成。 这些寡核苷酸的碱基组成设计成使其经Hoogsteen碱基配对原则促进三股螺旋形成，这 通常要求双链体的一条链上有一长段嘌呤或嘧啶。进一步细节参见例如PCT公开号WO 97/33551，见上文。这些分子可通过上文讨论的任何筛选测定法或其任意组合和/或通过本领域技 术人员众所周知的任何其它筛选技术来鉴定。L 抗 TIGIT 抗体本发明还提供了抗TIGIT抗体。例示性的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化 的、双特异性的、和异源偶联的抗体。本领域普通技术人员会理解，本发明还提供针对其它 多肽的抗体(即抗PVR抗体)，而且本文中具体关于抗TIGIT多肽的创建、生成、变化、使用 的方法或其它方面的任何描述也会适用于对其它非TIGIT多肽特异性的抗体。1.多克隆抗体抗TIGIT抗体可包括多克隆抗体。用于制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员 已知的。多克隆抗体可在哺乳动物中生成，例如通过一次或多次注射免疫剂和根据需要的 佐剂。通常，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射而注射到哺乳动物中。免疫 剂可包括TIGIT多肽或其融合蛋白。将免疫剂与已知在所免疫哺乳动物中有免疫原性的蛋 白质偶联可能是有用的。此类免疫原性蛋白质的例子包括但不限于匙孔i成血蓝蛋白、血清 清蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂 和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成的海藻糖dicorynomycolate)。免疫方案可以由本 领域技术人员无需过多实验做出选择。2.单克隆抗体或者，抗TIGIT抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可使用杂交瘤法制备，诸如 Kohler and Milstein，Nature 256 :495(1975)所述。在杂交瘤法中，小鼠、仓鼠或其它适 宜的宿主动物通常用免疫剂免疫以引发生成或能够生成将特异性结合免疫剂的抗体的淋 巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫剂将通常包括TIGIT多肽或其融合蛋白。通常，或是使用外周血淋巴细胞 (“PBL”)，若希望人起源的细胞，或是使用脾细胞或淋巴结细胞，若希望非人哺乳动物来源。 然后，使用合适的融合剂，诸如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细 胞(Goding,Monoclonal Antibodies :Principles and Practice,Academic Press(1986), PP. 59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人起源的骨髓 瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基中培养，所述 培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本 细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常 将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的永生化细胞系是那些高效融合、支持选定的抗体生成细胞稳定的高水平的表达抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠 源骨髓瘤系，可从例如索尔克研究所细胞分配中心(Salklnstitute Cell Distribution Center, San Diege, California, USA)和美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,USA)获得。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤 和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J. Immunol. 133 =3001(1984) ；Brodeur et al. , Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc.，New York(1987)pp. 51-63)。然后可对杂交瘤细胞在其中培养的培养基测定针对多肽的单克隆抗体的存在。 优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫 吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测 定法是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107 :220(1980)的 Scatchard 分析来测定。在鉴定得到期望的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通 过标准方法进行培养(Goding，见上文)。适于这一目的的培养基包括例如Dulbecco氏改 良的fegle氏培养基或RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物中作为腹水进 行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-kpharose、羟磷灰石层析、凝 胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基或腹水分开或纯化。单克隆抗体还可通过重组DNA技术来生成，诸如美国专利4，816，567中所述。编 码本发明单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序(例如使用能够特异性结合编码 鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞是此类DNA的优选来 源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生免疫球蛋白 蛋白质的宿主细胞中，诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重 组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以修饰DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链 恒定区的编码序列代替同源鼠源序列(美国专利4，816，567 ；Morrisonet al.，见上文)，或 者通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可用此 类非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定区，或者可用它替代本发明抗体的一个抗原结 合位点的可变区以产生嵌合二价抗体。抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域众所周知的。例如，一 种方法牵涉免疫球蛋白轻链和经修饰重链的重组表达。重链通常在Fc区中的任何点截短， 从而防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基用另一种氨基酸残基替代或者删除，从而防止 交联。体外方法也适于制备单价抗体。消化抗体以生成其片段，特别是Fab片段，可使用 本领域已知的常规技术来完成。3.人抗体和人源化抗体本发明的抗TIGIT抗体还可包括人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠源)抗体 的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋 白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化 抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)中的互补决定区(CDR)残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基替换的抗体。在有些情 况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受 体抗体和输入⑶R或框架序列中都没有发现的残基。通常，人源化抗体将包含至少一个、 通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个CDR对应于非人免疫球蛋白的 ⑶R，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白共有序列的FR。人源化抗体任选还将包含 至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones et al. , Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann et al.，Nature 332 :323-329(1988) ；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。用于人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的。通常，人源化抗体中弓丨入了一 个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通 常取自“输入”可变区。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones et al., Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann et al.，Nature 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen et al. ,Science 239 :1534-1536 (1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的相应序 列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4，816，567)，其中基本上少于整个人 可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基 和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。还可使用本领域已知的多种技术生成人抗体，包括噬菌体展示库(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227 :381 (1991) ；Marks et al. , J. Mol. Biol. 222 :581 (1991)) Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, p. 77 (1985) ；Boerner et al., J. Immunol. 147(1) :86-95 (1991))。类似的，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座导入 内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物，例如小鼠来生成。在攻击时， 观察到人抗体生成，在所有方面与在人体中看到的非常相像，包括基因重排、装配和抗 体全集。此方法记载于例如美国专利5，545，807 ；5, 545,806 ；5, 569,825 ；5, 625, 126 ； 5, 633, 425 ；5，661，016，及下列科学出版物Marks et al.，Bio/Technology 10 779-783(1992) ；Lonberg et al. , Nature 368:856-859(1994) ；Morrison, Nature 368 812-13(1994) ；Fishwild et al. , Nature Biotechnology 14:845-51(1996) ；Neuberger， NatureBiotechnology 14:826(1996) ；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995)。抗体还可以如上所述使用已知的选择和/或诱变方法进行亲和力成熟。优选的亲 和力成熟的抗体具有比用于制备该成熟抗体的起始抗体(通常是鼠的、人源化的或人的) 高5倍，更优选10倍，甚至更优选20或30倍的亲和力。4.双特异性抗体双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆，优选人或人源化 抗体。在这种情况中，一种结合特异性是对TIGIT，另一种是对任何其它抗原，优选对细胞表 面蛋白或者受体或受体亚基。用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生 成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein and Cuello, Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些51杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具 有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来完成。1993年5月13 日公开的 W093/08^9 及 Traunecker et al. , EMBO J. 10:3655-3659(1991)中披露了类似 的流程。可将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒 定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。 优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CHl)。将编 码免疫球蛋白重链融合物及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共 转染到合适的宿主生物体中。关于生成双特异性抗体的更多详情参见例如Suresh et al., Methods inEnzymology 121:210(1986)。根据WO 96/27011中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，将从 重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定区的至少部 分Ch3区。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例 如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸 侧链，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提 供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。文 献中描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性 抗体。Brennan et al. ,Science 229 :81(1985)描述了通过蛋白水解切割完整抗体以生成 F(ab' )2片段的流程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠以稳定邻近的二硫醇并防 止分子间二硫键的形成的情况下还原。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯 (TM)S生物。然后将Fab' -TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫 醇，并与等摩尔量的另一种Fab' -TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性 抗体可用作酶的选择性固定化试剂。Fab'片段可直接从大肠杆菌中回收，并化学偶联以形成双特异性抗体。Sialaby et al. , J. Exp. Med. 175 :217-225(1992)描述了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab' )2 分子。每个Fab'片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗 体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触 发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶的溶解活性。还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。 例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al. , J. Immunol. 148(5) 1547-1553(1992)。将来自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗 体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗 体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 =6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段 的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变区(Vh)和轻链可变区(\)，所述接头 太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的Vh和\结构 域与另一个片段上的互补\和Vh结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通 过使用单链Fv(sFv) 二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.,J. Immunol. 152 :5368(1994)。涵盖具有超过两个效价的抗体。作为一个非限制性例子，可制备三特异性抗体。参 见例如 Tutt et al.，J. Immunol. 147 :60(1991)。例示性的双特异性抗体可结合本文中给定TIGIT多肽上的两种不同表位。或 者，可以将抗TIGIT多肽臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2、 CD3、C拟8、或 B7)或 IgG 的 Fc 受体(Fe y R)诸如 Fc y RI (CD64), FcyRII (CD32)和 FcyRIII (⑶16)的臂联合起来，从而将细胞防御机制聚焦于表达特定TIGIT多肽的细胞。 双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达特定TIGIT多肽的细胞。这些抗体拥有 TIGIT结合臂及结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。 另一种感兴趣的双特异性抗体结合TIGIT多肽，还结合组织因子(TF)。5.异源偶联抗体异源偶联抗体也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构 成。此类抗体建议例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4，676，980)及 用于治疗HIV感染(W0 91/00360 ；WO 92/200373 ；ΕΡ03089) 设想了可在体外使用合成蛋 白质化学的已知方法制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反 应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐 (iminothiolate)禾口4-基丁亚氛酸甲酉旨(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美国 专利4，676，980中所公开的。6.效应物功能工程改造可能希望在效应物功能方面修饰本发明的抗体，从而增强例如抗体在治疗癌症中 的效力。例如，可向Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此 生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体 依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见 Caron etal.，J. Exp. Med. 176 :1191-1195(1992)和 Shopes, J. Immunol. 148 J918-2922 (1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使 用如 Wolff et al.，Cancer Research 53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来 制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见 Stevenson et al. , Anti-Cancer Drug Design 3 :219-230 (1989)。7.免疫偶联物本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗 剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即 放射偶联物)。本发明还提供包含偶联有一种或多种细胞毒剂的抗体的免疫偶联物(可互换的 称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素 (例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位 素(即放射偶联物)。免疫偶联物已经在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂(即杀死或抑制细胞生 长或增殖的药物) (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology5 :543-549 ；Wu 等(2005)Nature Biotechnology 23(9) :1137-1146 ；Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos 和 Epenetos(1999)Anticancer Research 19 :605-614 ；Niculescu-Duvaz 和Springer (1997)Adv. Drug Deliv. Rev. 26 :151-172 ；美国专利 No. 4，975，278)。免疫偶联 物容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用未经偶联的药 物可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin等， Lancet (1986 ^Ξ 3 ^ 15 H ) H 603-05 M ；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy :A Review",在《Monoclonal Antibodies ' 84 :Biological And ClinicalApplications))中，A. Pinchera 等人编，第 475-506 页，1985)。多克隆抗体 和单克隆抗体皆有报导可用于这些策略(Rowland等，Cancer Immunol. Immunother. 21 183-87 (1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daimomycin)、多柔比星 (doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine) (Rowland 等，1986， 见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素 诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin) (Mandler等，J. Nat. Cancer Inst. 92(19) :1573-1581(2000) ；Mandler 等，Bioorganic&Med. Chem. Letters 10: 1025-1028(2000) ；Mandler 等，Bioconjugate Chem. 13 :786-791 Q002))、美登木素生物碱 类(EP1391213 ;Liu 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :8618-8623 (1996))、和加利车霉素 (Lode 等，Cancer Res. 58 :2928(1998) ；Hinman 等，Cancer Res. 53 :3336-3342 (1993)) 毒 素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性效果。 有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。ZEVALIN (ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性 B淋巴细胞表面上发现的⑶20抗原的鼠IgGl κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂 所结合的IlUn或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等， Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7) :766-77(2000) ；Wiseman 等，Blood99(12) :4336-42(2002)； Witzig 等，J. Clin. Oncol. 20(10) :2453-63(2002) ；Witzig 等，J. Clin. Oncol. 20(15) 3262-69(2002))。尽管观VALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的 活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYL0TARGTM(gemtuZumab ozogamicin，WyethPharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的 抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future25 (7) :686(2000)；美国专利 No. 4970198 ；5079233 ；5585089 ；5606040 ；5693762 ； 5739116 ；5767285 ；5773001)。Cantuzumab mertansine(Immunogenlnc.),艮口 由 huC242 抗 体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物模块DMl连接而构成的抗体-药物偶联 物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试 验。MLN-2704(Millennium Pharm. , BZLBiologics, Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异 性膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块DMl连接而构成的抗体-药物 偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成 类似物auristatin肽，auristatin E(AE)和单甲基auristatin (MMAE)与嵌合单克隆抗 体cBR96 (对癌瘤上的Lewis Y特异)和cACIO (对血液学恶性肿瘤上的⑶30特异)偶联 (Doronina 等，Nature Biotechnol. 21(7) :778-784 Q003))，且正在进行治疗性开发。在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗体和化疗剂或其它毒素。本文(例如上 文)描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉 毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(I^eudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin) A链、相思豆毒蛋白(abrin) A链、蒴莲根毒蛋白 (modeccin)A 链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹 (dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦 瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂 草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogel 1 in)、 局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素 (trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多种放射性核素可 用于生成放射偶联抗体。例子包括212Bi、mI、mIn、9°Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可 使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸 酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如 辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲 酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸 如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5_ 二氟-2，4-二硝基苯)的双功能 衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238 =1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒 素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将 放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11(^6。本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美 登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀类(dolostatins)、aurostatins、单端孢霉 素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。a.美登素和美登木素生物碱类在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的抗 体(全长或片段)。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制 剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利 No. 3，896，111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登 醇酯(美国专利No. 4，151，042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类 似物4, 137，230 ；4，248，870 ；4，256，746 ；4，260，608 ；4，265，814 ；4，294，757 ；4，307，016 ； 4，308，268 ；4，308，269 ；4，309，428 ；4，313，946 ；4，315，929 ；4，317，821 ；4，322，348 ； 4，331，598 ；4，361，650 ；4，364，866 ；4，424，219 ；4，450，254 ；4，362，663 ；及 4，371，533。美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它 们(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非 二硫化物接头的偶联抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿 瘤细胞系。例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备方法和治疗 用途美国专利No. 5，208，020 ;5，416，064;及欧洲专利EP 0 425 235B1，明确将其公开内 容收入本文作为参考。Liu 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 :8618-8623 (1996)记载了包含 与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DMl的美登木素生物碱的免疫偶联物。 发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中 显示抗肿瘤活性。Chari等，Cancer Research 52:127-131 (1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因 的另一种鼠单克隆抗体TA. 1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试 了 ΤΑ. 1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3xl05个HER-2表面 抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物程度相似的细胞毒性，这可通过增加 每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠 中显示低系统性细胞毒性。抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接 且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利 No. 5，208，020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体分子偶联平均3_4个美登 木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有 负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美 登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例 如美国专利No. 5，208，020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木 素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修 饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例 如美国专利 No. 5，208，020 或欧洲专利 0 425 235B1 ；Chari 等，CancerResearch 52 127-131 (1992) ；2004年10月8日提交的美国专利申请No. 10/960, 602中所公开的，明确 将其公开内容收入本文作为参考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物 可以如2004年10月8日提交的美国专利申请No. 10/960, 602中所披露的来制备。连接基 团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不 稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。本文中描述和例示了 别的连接基团。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如 N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨 基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸 二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物 (诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)_乙 二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5_ 二氟-2， 4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基 二硫代)丙酸酯(SPDP) (Carlsson 等，Biochem. J. 173 :723-737(1978))和 N-琥珀酰亚氨 基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫化物连接。根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用 常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟 甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的 实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。b. Auristatin 禾口多拉司他汀在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀类(dolastatins)或多拉司他 汀肽类似物及衍生物、auristatin类偶联的抗体(美国专利No. 5，635，483 ；5, 780，588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂 (Woyke 等 U001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12) :3580-3584)且具有抗癌 (US 5，663，149)和抗真菌活性(Pettit 等(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42 2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或 C(羧基)末端附着于抗体(W002/088172)。例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块 DE 禾口 DF，露于 “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands", 2004年11月5日提交的美国流水号10/983，340，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间 形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参 JAL E. Schroder 禾口 K. Lilbke, The Peptides,卷 1, pp 76—136,1965, Academic Press)。 auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备US 5，635，483 ； US 5, 780, 588 ；Pettit 等(1989)J.Am. Chem. Soc. Ill :5463-5465 ；Pettit 等(1998) Anti-Cancer Drug Design 13 :243-277 ；Pettit φ, Synthesis,1996,719-725 ； Pettit φ (1996)J.Chem. Soc. Perkin Trans. 15 :859-863 ； R Doronina (2003)Nat. Biotechnol. 21(7) :778-784 ；"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，2004年11月5日提交的美国流水号10/983，340，将其完整收入本文作为参 考(披露了例如制备诸如MMAE和MMAF偶联至接头的单甲基缬氨酸化合物的接头和方法)。c.加利车霉素在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗体。 加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族 偶联物的制备参见美国专利 5，712，374 ；5, 714，586 ；5, 739，116 ；5, 767，285 ；5, 770，701 ； 5，770，710 ；5, 773，001 ；5, 877，296(都授予美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构 类似物包括但不限于Y II、α 21、α 31、N-乙酰基-γ II、PSAG和θ Il (Hinman等，Cancer Research 53:3336-3342(1993) ；Lode 等，Cancer Research 58:2925-2928(1998)；及上述 授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一 种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂 经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。d.其它细胞毒剂可与抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(str印tozoicin)、长春新碱 (vincristine)、5_氟尿嘧啶、美国专利5，053，394,5, 770，710中记载的统称为LL-E33288 复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5，877，296)。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、 外毒素A链(来自铜绿假单胞菌O^seudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A 链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin) A链、α-帚曲霉素(sarcin)、 油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯 树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素 (phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年 10月28日公布的WO 93/21232。本发明还涵盖抗体和具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核 酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生 成放射偶联抗体。例子包括 At211、I131、I125、y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212 和 Lu 的放 射性同位素。在将偶联物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc9、 或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如 碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。可以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽， 或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。 可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc%!或I123、Re186、Re188和h111。可以经 赖氨酸残基来附着钇-90。I0D0GEN 法(Fraker 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 80 49—57(1978)) "SJMf 入石典—123。 〈〈Monoclongil Antibodies in Immunoscintigraphy)) (Chatal, CRC Press, 1989)详细记载了其它方法。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀 酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲 基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲 酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸 如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)_乙二 胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5_ 二氟-2， 4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238 =1098(1987)中所述 制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙 酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见W094/ll(^6。接 头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶 敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52: 127-131 (1992)；美国专利 No. 5，208，020)。化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC 商品化(例如购自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford, IL, U. S. Α.)的 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS、 MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、 sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo_SMPB、和SVSB (琥珀酰亚氨基-乙烯基砜)苯甲酸 酯)。见 2003-2004 年度应用手册和产品目录(Applications Handbook and Catalog)第 467-498 页。e.抗体-药物偶联物的制备在抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物模块 (D)偶联，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物模块。可采用本领域技术人员知道的有 机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括(1)抗体的亲核基团经共 价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物模块D反应；和( 药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于 制备ADC的别的方法。Ab-(L-D)p I接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基 己酰基(“MC")、马来酰亚氨基丙酰基(“MP")、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit")、丙氨 酸-苯丙氨酸(〃 ala-phe")、对氨基苄氧羰基(〃 PAB" )、N_琥珀酰亚氨基4_吡啶 基硫代)戊酸酯(“SPP" )、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸 酯(〃 SMCC')、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(〃 SIAB“)。本领域 知道别的接头构件，本文也描述了一些。还可参见"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands，，，2004年11月5日提交的美国流水号10/983，340，将其完整 内容收入本文作为参考。在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、 三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙 氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括甘氨酸_缬氨酸_瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨 酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括那些天然存 在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构 件可以在它们的特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶)的 酶促切割的选择性方面进行设计和优化。抗体的亲核基团包括但不限于(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii) 侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、硫醇基、和羟基 是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括(i)活性 酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苯甲基卤化物，诸如卤 代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键， 即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT (二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂偶联的反 应性。每个半胱氨酸桥理论上会如此形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚 氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。可 以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非 天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体)而将反应性硫醇基导入抗体(或其片段)。还可通过修饰抗体来生成抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲 核取代基反应的亲电子模块。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可 与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺khiff碱基可形成稳定的 连接，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化 抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和 酮)基团，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques) 在另 一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在 第一个氨基酸处生成酸(Geoghegan 和 Mroh，Bioconjugate Chem. 3 :138-146(1992) ；US 5，362，852)。此类醛可与药物模块或接头亲核体反应。同样，药物模块上的亲核基团包括但不限于胺、硫醇、羟基、酰胼、肟、胼、缩氨基 硫脲、胼羧酸酯、和芳基酰胼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括⑴活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii) 烃基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA 的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分 开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤 预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶 联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。8.免疫脂质体本文中所公开的抗体还可配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体可通过本领域已 知方法来制备,诸如Epstein et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985) ；Hwang et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；美国专利 4，485，045 和 4，544，545。循环 时间延长的脂质体披露于美国专利5，013，556。可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物 通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，产生具有期 望直径的脂质体。可如Martin et al. , J. Biol. Chem. 257 =286-288 (1982)中所述，将本发 明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂(诸 如多柔比星(Doxorubicin))。参见 Gabizon et al. , J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484(1989)。Μ.药用组合物本发明的活性分子(例如TIGIT多肽、抗TIGIT抗体、它们的各自变体、HGIT激动 剂、TIGIT拮抗剂、PVR激动剂和PVR拮抗剂)以及通过上文公开的筛选测定法鉴定的其它 分子，可以药用组合物的形式施用以治疗免疫相关疾病。本发明的活性分子，优选例如多肽或抗体的治疗用配制剂如下制备供贮存，即以 冻干剂型或水溶液的形式，将具有期望纯度的活性分子与任选的药学可接受的载体、赋形 剂或稳定剂混合(Remington' s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A. Ed.， 1980)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括 缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐 剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯 甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇； 3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶 或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬 酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合剂，诸如EDTA ；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属 复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENtm、PLUR0NICS 或 聚乙二醇(PEG)。通过本文公开的筛选测定法鉴定的化合物可使用本领域众所周知的标准技术以 类似方式配制。脂转染或脂质体也可用于将活性分子投递到细胞中。在使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小抑制性片段。例如，基于抗体的可变区序列，可设计 保留结合靶蛋白质序列的能力的肽分子。此类肽可化学合成和/或通过重组DNA技术生成 (参见例如 Marasco et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :7889-7893 (1993))。本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选 活性互补且彼此没有不利影响的。或者/另外，组合物还可包含细胞毒剂、细胞因子或生长 抑制剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。活性分子还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如 分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系 统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此 类技术公开于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed., 1980。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实 现。可制备活性分子的持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体 疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的 例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美 国专利3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸Y -乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、 可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞 林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙 醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶 囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37°C的潮湿环境而变性或聚集，导致 生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如， 如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基 残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳 定。N.治疗方法设想了本发明的多肽、抗体和其它活性化合物可用于治疗多种免疫相关疾病和状 况，诸如T细胞介导的疾病，包括那些特征为炎性细胞浸润进入组织、刺激T细胞增殖、抑制 T细胞增殖、提高或降低细胞因子生成、和/或提高或降低血管通透性或其抑制的。鉴于本 文中关于TIGIT在调控T细胞增殖和细胞因子生成中的作用的公开内容，调控TIGIT表达 和/或活性对预防和/或治疗这些疾病可能是有效的。将用本发明的多肽、抗体和其它化合物治疗的例示性状况或病症包括但不限于 系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼发型慢性关节炎、骨关节炎、脊椎关节病、系统性硬 化(硬皮病)、特发性免疫性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、系统 性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白 尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、 甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲 状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、 中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barre)综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙 型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性 肝硬化、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎、炎性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn)病)、 麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮 肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食 物过敏和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺 炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病。在系统性红斑狼疮中，疾病的主要介质是生成对自身蛋白质/组织的自身反应性 抗体及随后生成免疫介导的炎症。抗体或是直接或是间接介导组织损伤。尽管T淋巴细胞 未显示出直接参与组织损伤，然而T淋巴细胞是形成自身反应性抗体所需要的。疾病的发 生因此依赖T淋巴细胞。多个器官和系统在临床上受到影响，包括肾、肺、肌肉骨骼系统、粘 膜皮肤、眼、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓和血液。类风湿性关节炎(RA)是一种慢性系统性自身免疫性炎性疾病，主要累及多个关 节的滑膜，由此导致对关节软骨的损伤。发病机制依赖T淋巴细胞，而且与类风湿因子，针 对自身IgG的自身抗体的生成有关，由此导致免疫复合物的形成，它在关节液和血液中达 到高水平。关节中的这些复合物可诱发显著的淋巴细胞和单核细胞浸润到滑膜中及随后显 著的滑膜变化；关节腔/液受到类似细胞的浸润及添加许多嗜中性粒细胞。受影响的组织 主要是关节，常常是对称样式。然而，关节外疾病也存在两种主要形式。一种形式是形成关 节外损伤，伴有正在进行的渐进性关节病和肺纤维化、血管炎和皮肤溃疡的典型损伤。关节 外疾病的第二种形式是所谓的费尔提氏Owelty)综合征，它发生在RA病程晚期，有时在关 节病已经沉寂后，且牵涉出现嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和脾肿大。这可伴随着多 个器官中的血管炎及梗塞、皮肤溃疡和坏疽的形成。患者还常常在受影响关节上面的皮下 组织中形成类风湿性节结；晚期的节结具有由混合的炎性细胞浸润物包围的坏死中心。可 在RA中出现的其它表现包括心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、伴有肺纤维化的间质性肺炎、 干燥性角膜结膜炎和类风湿性结节。幼发型慢性关节炎是一种慢性特发性炎性疾病，常常开始于16岁之前。其表型与 RA有些相似；类风湿因子阳性的一些患者归入幼发型类风湿性关节炎。疾病细分为三种主 要类别少数关节的、多关节的和系统性的。关节炎可以是严重的，通常是破坏性的，并导致 关节僵硬和生长迟缓。其它表现可包括慢性前葡萄膜炎和系统性淀粉样变。脊椎关节病是具有一些普遍临床特征且普遍与HLA-B27基因产物表达有关 的一组病症。这些病症包括强直性脊柱炎、莱特尔氏(Reiter)综合征(反应性关节 炎)、与炎性肠病有关的关节炎、与银屑病相关的脊椎炎、幼发型脊椎关节病及无差别 (undifferentiated)脊椎关节病。区别性特征包括具有或没有脊椎炎的骶髂关节炎；炎性 不对称关节炎；与HLA-B27有关(血清学上定义的MHC I型HLA-B基因座的等位基因)；眼 炎症；及与其它类风湿性疾病有关的自身抗体的缺乏。对于诱发疾病来说关键的最相关细 胞是⑶8+T淋巴细胞，靶向由MHC I型分子呈递的抗原的细胞。⑶8+T细胞可与MHC I型等 位基因HLA-B27反应，就像它是由MHC I型分子表达的外源肽。已有假设，HLA-B27的表位 可能模拟细菌或其它微生物的抗原性表位，因此诱导CD8+T细胞应答。如本文中所显示的， TIGIT在⑶8+T细胞中表达，而且调控那些细胞中的TIGIT表达和/或活性可能调控这种疾病的症状和/或预防这种疾病。系统性硬化(硬皮病)的病因学未知。疾病的特点是皮肤硬化；这可能是由活动 性炎性过程诱导的。硬皮病可以是局部的或系统性的；血管损伤是普遍的，而且微血管系统 中的内皮细胞损伤是系统性硬化发展中的早期且重要的事件；血管损伤可能由免疫介导。 皮肤损伤中存在单核细胞浸润物及在许多患者中存在抗核抗体暗示免疫学基础。ICAM-I常 常在皮肤损伤中成纤维细胞的细胞表面上调，说明T细胞与这些细胞相互作用可能在疾病 的发病机理中起作用。牵涉的其它器官包括胃肠道平滑肌萎缩和纤维化，导致异常蠕动 /运动；肾同中心内皮下内膜增生，影响小弓形和叶间动脉，从而降低肾皮质血流，导致蛋 白尿、氮血症和高血压；骨骼肌萎缩、间质性纤维化、炎症；肺间质性肺炎和间质性纤维 化；及心收缩带坏死、疤痕化/纤维化。特发性炎性肌病，包括皮肌炎、多肌炎和其它，是导致肌肉软弱的未知病因的慢性 肌肉炎性病症。肌肉损伤/发炎常常是对称的和渐进的。自身抗体与大多数形式有关。这 些肌炎特异性自身抗体针对并抑制牵涉蛋白质合成的成分、蛋白质和RNA的功能。斯耶格伦氏(SSgren)综合征是由免疫介导的炎症及随后泪腺和唾液腺功能破坏 引起的。该病可能与炎性结缔组织疾病有关或伴随着炎性结缔组织疾病。该病与针对Ro 和La抗原的自身抗体生成有关，这两种抗原都是小RNA-蛋白质复合物。损害导致干燥性 角膜结膜炎、口干燥、及其它表现或关联，包括胆汁性肝硬化、外周或感觉神经病、和可触知 的紫癜。系统性血管炎是这样的疾病，其中原发性损伤是炎症，后续对血管的损伤导致由 受影响血管供应的组织缺血/坏死/变性，且在有些情况中最终导致终端器官功能障碍。血 管炎病还可作为其它免疫-发炎介导疾病诸如类风湿性关节炎、系统性硬化等的继发损伤 或后遗症发生，特别是在还与免疫复合物形成有关的疾病中。原发性系统性血管炎组中的 疾病包括系统性坏死性血管炎节结性多动脉炎、过敏性血管炎和肉芽肿病、多脉管炎； 韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病；淋巴瘤样肉芽肿病；和巨细胞性动脉炎。各种各样的血管 炎病包括粘膜与皮肤淋巴结综合征(MLNS或川畸氏(Kawasaki)病)、分离的CNS血管炎、 贝切特氏(Behet)病、血栓闭塞性血管炎(伯格氏(Buerger)病)和皮肤坏死性小静脉炎。 所列大多数类型的血管炎的发病机理认为主要是由于免疫球蛋白复合物在血管壁中沉积 及随后经ADCC、补体活化或者两者诱导的炎性应答。结节病(sarcoidosis)是病因学未知，特征在于几乎机体任何组织中都存在上皮 样肉芽肿的状况；最常见累及肺。发病机理涉及患病部位持续存在活化的巨噬细胞和淋巴 样细胞及随后由这些细胞类型释放局部和系统性活性产物而导致的慢性后遗症。自身免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血、免疫性全血细胞减少症和 阵发性夜间血红蛋白尿，是由于生成与红细胞(和在有些情况中以及其它血细胞，包括血 小板)表面表达的抗原反应的抗体的结果，是经补体介导的溶解和/或ADCC/Fc受体介导 的机制去除那些抗体包被细胞的反映。在自身免疫性血小板减少症，包括血小板减少性紫癜，和其它临床背景中免疫介 导的血小板减少症中，由于抗体或补体附着于血小板及随后经补体溶解、ADCC或Fc受体介 导的机制去除而发生血小板破坏/去除。甲状腺炎，包括格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼发型淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎，是由于针对甲状腺抗原的自身免疫应答及产生与存 在于甲状腺中且通常对甲状腺特异的蛋白质反应的抗体。现有的实验模型包括自发性模 型大鼠(BUF和BB大鼠)和鸡(肥胖鸡品系)；可诱导模型用甲状腺球蛋白、甲状腺微粒 体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫动物。I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病是胰岛β细胞的自身免疫性破坏；该破坏由自 身抗体和自身反应性T细胞介导。胰岛素或胰岛素受体的抗体也可产生胰岛素不响应的表 型。免疫介导的肾病，包括肾小球肾炎和肾小管间质性肾炎，是由于抗体或T淋巴细 胞介导的对肾组织的损伤，或是直接由于生成针对肾抗原的自身反应性抗体或T细胞，或 是间接由于针对其它非肾抗原有反应性的抗体和/或免疫复合物在肾中沉积。因此，导致 免疫复合物形成的其它免疫介导的疾病也可作为间接后遗症诱导免疫介导的肾病。直接和 间接的免疫机制都导致炎性应答，它在肾组织中产生/诱导损伤形成，导致器官功能受损， 在有些情况中发展成肾衰竭。体液和细胞两种免疫机制都可参与损伤的发病机理。中枢和周围神经系统的脱髓鞘病，包括多发性硬化；特发性脱髓鞘多神经病或 格-巴二氏(GuilIain-Ban^)综合征；和慢性炎性脱髓鞘多神经病，认为具有自身免疫基 础，而且由于对少突胶质细胞或对髓鳞脂直接造成损害而导致神经脱髓鞘。在MS中，有证 据表明该病的诱导和发展依赖T淋巴细胞。多发性硬化是依赖T淋巴细胞的脱髓鞘病，而 且具有复发-缓和过程或漫长的渐进过程。病因未知；然而，病毒感染、遗传恶病质、环境和 自身免疫性都会起作用。损伤含有主要由T淋巴细胞介导的浸润物、小胶质细胞和浸润的 巨噬细胞；CD4+T淋巴细胞是损伤处的主要细胞类型。少突胶质细胞死亡和随后脱髓鞘的 机理未知，但是可能是由T淋巴细胞驱动的。炎性和纤维化肺病，包括嗜曙红细胞性肺炎；特发性肺纤维化和超敏性肺炎，可能 牵涉不受调控的免疫-发炎应答。抑制该应答将具有治疗益处。自身免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎，由 自身抗体介导，其发生依赖T淋巴细胞。银屑病是T淋巴细胞介导的炎性疾病。损伤含有T淋巴细胞、巨噬细胞和抗原加 工细胞，及一些嗜中性粒细胞的浸润物。变应性疾病，包括哮喘；变应性鼻炎；特应性皮炎；食物超敏性；和荨麻疹，依赖T 淋巴细胞。这些疾病主要由T淋巴细胞诱导的炎症、IgE介导的炎症或二者组合介导。移植相关疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)，依赖T淋巴细胞；抑制T 淋巴细胞功能具有改善作用。其中干预免疫和/或炎性应答有益的其它疾病有感染性疾病，包括但不限于病毒 感染(包括但不限于AIDS、甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎和疱疹)、细菌感染、真菌感染、 及原生动物和寄生虫感染(刺激MLR的分子(或衍生物/激动剂)可在治疗上用于增强对 传染因子的免疫应答)；免疫缺陷病(刺激MLR的分子/衍生物/激动剂可在治疗上用于 增强对遗传性、获得性、感染诱发的(如在HIV感染中)或医源性(即如源自化疗)免疫缺 陷的状况的免疫应答)；和瘤形成。已经证实，有些人癌症患者形成了对瘤细胞上抗原的抗体和/或T淋巴细胞应答。 还在瘤形成的动物模型中证明，增强免疫应答可导致该特定瘤的排斥或消退。在MLR中增强T淋巴细胞应答的分子可用于在体内增强针对瘤形成的免疫应答。在MLR中增强T淋巴 细胞增殖性应答的分子(或以激动性方式影响相同受体的小分子激动剂或抗体)可在治疗 上用于治疗癌症。在MLR中抑制淋巴细胞应答的分子(即TIGIT)在体内在瘤形成过程中 也起到遏制对瘤的免疫应答的作用；此类分子可以是由瘤细胞自身表达的，或者它们的表 达是由瘤在其它细胞中诱导的。此类抑制性分子的拮抗作用(或是用抗体、小分子拮抗剂 或是通过其它手段)增强免疫介导的肿瘤排斥。另外，抑制具有促炎特性的分子在再灌注损伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、急 性肺损伤、失血性休克、烧伤、败血病/感染性休克、急性肾小管坏死、子宫内膜异位症、变 性关节病和胰腺炎中可能具有治疗效益。依照已知方法，诸如静脉内施用，如推注或通过持续一段时间的连续输注，通过肌 肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入(鼻内、肺内)路径， 将本发明的化合物例如多肽、小分子或抗体施用于哺乳动物，优选人。最常用静脉内、皮下 或吸入施用多肽和抗体。在免疫辅助疗法中，可将其它治疗方案，诸如施用抗癌药，与施用本发明的蛋白 质、抗体或化合物联合。例如，将用例如本发明的免疫佐药治疗的患者还可接受抗癌药(化 疗剂)或放射疗法。此类化疗剂的制备和剂量给药方案可依照制造商的说明书使用，或者 由熟练从业人员凭经验决定。此类化疗剂的制备和剂量给药方案还记载于《Chemotherapy Service)), Μ. C. Perry 编，ffilliams&ffilkins, Baltimore, MD(1992)。化疗剂可在施用免疫 佐药之前或之后，或者可以与它同时给予。另外，抗雌激素化合物诸如他莫昔芬或抗孕酮诸 如奥那司酮(参见EP 616812)可以以此类分子知道的剂量给予。可能希望还施用针对其它免疫疾病相关或肿瘤相关抗原的抗体，包括但不限于结 合0020、0)11&、0)183计8236 1 3计833计84或血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。或 者/另外，可将本文中所公开的结合相同或者两种或多种不同抗原的两种或多种抗体共施 用于患者。有时，还对患者施用一种或多种细胞因子可能是有益的。例如，在一个实施方案 中，TIGIT多肽与生长抑制剂共施用。例如，可首先施用生长抑制剂，后续TIGIT多肽。然 而，还设想了同时施用或首先施用。生长抑制剂的合适剂量就是那些目前所使用的，而且可 由于生长抑制剂和例如TIGIT多肽的联合作用(协同作用)而降低。对于免疫相关疾病的治疗或严重程度降低，本发明化合物的适宜剂量将取决于如 上文所定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程，无论施用药剂是为了预防还是 治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对化合物的响应、及主治医师的判断。可以将化 合物恰当的一次性或通过一系列治疗施用于患者。例如，根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量是约Iyg/ kg-15mg/kg(例如0. l-20mg/kg)多肽或抗体，无论是例如通过一次或多次分开的施用，或 是通过连续输注。典型日剂量的范围可以是约lyg/kg-100mg/kg或更多，取决于上文所述 因素。对于持续数天或更长的重复施用，根据状况，持续治疗直至出现期望的对疾病症状的 遏制。然而，其它剂量方案可能是有用的。此疗法的进程易于通过常规技术和测定法监测。0.制品在本发明的另一个实施方案中，提供了包含可用于诊断或治疗上文所述病症的物 质(例如，包含TIGIT分子、TIGIT激动剂、TIGIT拮抗剂、PVR激动剂、或PVR拮抗剂)的制品。制品包含容器和用法说明书。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器和试管。容器 可以由多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有有效诊断或治疗状况的组合物，而且可 具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小 管)。组合物中的活性剂通常是本发明的多肽或抗体。容器上或与容器相关的用法说明书 或标签指明该组合物用于诊断或治疗所选择的状况。制品还可包含第二容器，其中装有制 药学可接受的缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和/或右旋糖溶液。它 还可包含商业和使用者立场上所期望的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注 射器和带有使用说明书的包装插页。P.免疫相关疾病的诊断和预后细胞表面蛋白质，诸如在某些免疫相关疾病中过表达的蛋白质(即TIGIT)，是药 物候选物或疾病治疗的卓越调控靶物。此类蛋白质及由在免疫相关疾病状态中扩增的基因 编码的分泌型蛋白质在这些疾病的诊断和预后中找到了额外用途。例如，针对在类风湿性 关节炎或其它免疫相关疾病中扩增的基因的蛋白质产物的抗体可用作诊断剂或预后剂。例如，抗体，包括抗体片段，可用于定性或定量检测由扩增的或过表达的基因编码 的蛋白质(“标志物基因产物”)的表达。抗体优选配备了可检测的，例如荧光标记物，而且 可通过光学显微镜检术、流式细胞术、荧光测定法或本领域知道的其它技术来监测结合。这 些技术是特别合适的，如果过表达的基因编码细胞表面蛋白质的话。此类结合测定法基本 上如上文所述进行。抗体结合标志物基因产物的原位检测可通过例如免疫荧光或免疫电子显微镜检 术来进行。为此目的，自患者采集组织学标本，并对它施加经标记抗体，优选将抗体覆盖在 生物学样品上。此流程还容许测定标志物基因产物在所检验组织中的分布。对于本领域技 术人员显而易见的是，极其多种组织学方法可容易的用于原位检测。其它技术是本领域公 知的，例如荧光辅助细胞分选(FACS)。提供下列实施例仅仅为了例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。在此完整收入本说明书中引用的所有专利、专利出版物和文献作为参考。实施例实施例1 对TIGIT的进一步表征先前(参见例如美国专利公开号US20040121370，通过述及完整收入本文)在靶 向免疫细胞特异性表达的基因的基因组范围搜索策略中鉴定了 TIGIT，其具有由细胞外Ig 结构域、I型跨膜区、和细胞内免疫受体基于酪氨酸的活化或抑制(ITAM/ITIM)基序组成的 结构域结构(Abbas, A. R. et al. Genes Immun 6，319-31 (2005) ；Burshtyn, D. N. et al.，J Biol Chem 272,13066-72(1997) ；Kashiwada, Μ. et al. , J Immunol 167,6382-7(2001)) 人TIGIT及来自小鼠(提交给Genbank)、恒河猴(Genbank登录号XP 001107698)和犬 (Genbank登录号XP 545108)的同系物的序列显示于图1。为了进一步阐明TIGIT在免疫功 能中的作用，实施了同源性搜索，其鉴定出TIGIT Ig结构域与脊髓灰质炎病毒受体(PVR) 蛋白质和PVR样蛋白质l-4(PVRLl-4)的N端IgV结构域，以及CD96和CD226的N端IgV 结构域相似(见图2A-2B)。这些蛋白质的比对显示定义规范IgV结构域的高度保守的残基 在TIGIT中是保守的，而且进一步提示那八种蛋白质可构成Ig家族的一个相关子集。保守的V框残基显示出对于建立V框折叠是重要的(ffiesmann, C. &de Vos, A.M. CellMol Life Sci 58,748-59(2001))。在V框折叠附近鉴定出多个残基在八种蛋白质间是保守的，包括 四个绝对保守的残基(A67jG74, P114, ^P G116)和五个保守的残基(V/I/L54，S/T55，Q56，T112和F/ Y113)，它们构成三个亚基序(V/I54-S/T55-Q56)、(A67-X (6)-G74)和(T112-F/Y113-P114X-G116) 0 在 TIGIT的情况中，这些亚基序表现出在物种间是保守的(见图1)，而且在其它当前记载的含 有IgV结构域的蛋白质中不存在。那些保守残基可定义一类PVR样蛋白质，包括PVR、PVR 样蛋白质 1-4、CD96、CD226、和 TIGIT0PVRL1-4和PVR共享共同的结构域构造(IgV-IgC-IgV)，而CDM6和CD96缺乏近 膜IgV结构域。TIGIT是该家族最经济的成员，由一个IgV结构域组成。这八种蛋白质的 细胞内区段彼此在PVRL1-3之间共享的胞粘蛋白结合基序之外只显示有限的相似性。基于 NECL-I 相关 IgV 结构域的晶体结构(Dong, X. et al.，J Biol Chem 281，10610-7 (2006)), 第一和第三基序预测分别位于B与C及F与Gi3链之间的发夹环中。这两个环在IgV折叠 的一个末端处彼此邻近。第二基序包含C’和C”i3链，它们涉及形成NECL-I同二聚体界面 的一部分。如此，在TIGIT/PVR家族中观察到的序列基序可能在PVR家族成员之间观察到 的特定同型和异型相互作用中发挥作用。PVR先前被表征为柄蛋白样蛋白质，但是上述序列 分析提示它应当改为考虑作PVR家族成员，某些柄蛋白(即PVRL1-4)被归类为PVR家族的 一个分支。实施例2 =PVR配体的鉴定通过筛选分泌型蛋白质的大型文库来寻找结合固定化TIGIT的蛋白质，鉴定了 TIGIT的潜在结合配偶。简言之，通过将人TIGIT的氨基酸1-138克隆入载体，刚好在人 IgGlFc区的前面(TIGIT-Fc)，构建了 TIGIT的Fc融合物(TIGIT-Fc)。通过使用标准定点 诱变技术将两处突变引入TIGIT-Fc的Fc尾，即D256A和N297A，还构建了一种备选型式的 11611^^，其中消除了？(^1 结合(TIGIT-Fc-DANA)。在CHO细胞中瞬时表达所得融合蛋白， 并使用标准亲和层析技术自CHO细胞纯化所得融合蛋白。使用Octet系统(ForteBio)对融 合至六组氨酸或Fc标签的各分泌型蛋白质的文库筛选对TIGIT-Fc的结合。在HBS-P (IOmM Hepes, pH 7. 4 ；0. 15M NaCl ；0. 005%表面活性剂P20)中对蛋白质测试结合。将TIGIT-Fc 或对照Fc融合蛋白加载到抗人Fc生物传感器上至饱和。将生物传感器在缓冲液中清洗(30 秒)，放置入装有5 μ g/mL蛋白质的孔达3分钟，并再次清洗30秒。每两个结合循环后将传 感器再加载并清洗。结合以响应水平的升高大于0. 2nm来指示，并且通过与对照Fc融合蛋 白比较来确定特异性。在所分析的超过1000种蛋白质中鉴定出一种结合TIGIT的蛋白质。 如图3所示，固定化到抗人Fc生物传感器上的TIGIT-Fc融合蛋白与PVR-Fc融合蛋白特异 性相互作用。这种相互作用的特异性得到了 TIGIT与文库中任何其它蛋白质的特异性相互 作用缺失的支持，而且得到了用其它含Ig结构域的蛋白质加载的生物传感器不引发对PVR 的应答的事实的进一步支持。因为先前已经知道PVR、PVRL1-4, CD96、禾口 CD226彼此相互作用(He，Y. et al.，J Virol 77,4827-35(2003) ；Satoh-Horikawa, K. et al.，J Biol Chem275,10291-9(2000)； Bottino, C. et al. J Exp Med 198,557-67(2003) ；Fuchs, A. et al. , J Immunol 172， 3994-8 (2004) ；Reymond，N. et al. ,J Exp Med 199，1331-41 Q004))，所以使用上文所述生 物传感器系统评估TIGIT与这些蛋白质中每一种的相互作用。如上文关于TIGIT-Fc所述，为要测试的每一种蛋白质构建并纯化Fc融合蛋白。具体而言，将PVR样蛋白I(PVRLl)的氨 基酸1-343、PVR样蛋白2 (PVRL2)的氨基酸1-360、PVR样蛋白3 (PVRL3)的氨基酸1-411、 PVR样蛋白4 (PVRL4)的氨基酸1-349、CD226的氨基酸1-259、或CD96的氨基酸1-500刚 好融合到人IgGl Fc区的前面。对所得Fc融合蛋白测试对TIGIT-Fc的结合。PVR-Fc、 PVRL3-Fc 和 PVRL2-Fc 结合 TIGIT-Fc，而 CD226_Fc、CD96_Fc、PVRLl-Fc、和 PVRL4_Fc 不结 合TIGIT-Fc (图4A)。在三种观察到的结合物中，PVR-Fc显示对TIGIT-Fc的最大结合，接 着是PVRL3-Fc，而对PVRL2 Fc观察到三者中最小量的对TIGIT-Fc的结合。还实施了 FACS分析来评估上文构建的PVR家族成员Fc融合物对表达TIGIT的 CHO细胞的结合。使用PBS中的NHS-PE04-生物素(Pierce)经胺偶联将Fc融合蛋白生物 素化。使用藻红蛋白偶联的链霉亲合素(Caltag)检测生物素-配体的结合。将针对gD标 签的小鼠单克隆抗体(Genentech)偶联至AlexaFluor647 Qnvitrogen)。使用标准技术将 抗体偶联至适宜的荧光标记物。依照制造商的指令对细胞染色。在染色之前，将细胞用适 宜的血清或纯化的IgG封闭。在FACSCalibur (BD Biosciences)上实施获取，并用JoFlo 软件(Tree Star, Inc.)分析。以前向和侧向散射门选(gated)可存活细胞。结果显示于 图4B-1至4B-6，而且显示了在人造生物传感器测定法中观察到的结合样式与在细胞表面 在更加生理性的背景下观察到的相同。为了测定 PVR-TIGIT、PVRL2-TIGIT 和 PVRL3-TIGIT 结合相互作用的强 度，使用经那些蛋白质稳定转染的CHO细胞实施了直接放射性配体结合测定法。为 了 CHO细胞表面表达，将TIGIT、PVR、PVRL2、PVRL3、CD226和CD96全长DNA克隆入 载体，丙丨」好在 gD 信号序列(MGGTAARLGAVILFWIVGLHGVRG(SEQ ID NO 19))和 gD 标 签(KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVL(SEQ ID NO :20))后面。 使用 Lipofectamine LTX(Invitrogen)将质粒转染入CHO细胞。使用Alexa-647抗gD偶联物通过流式细胞术来 验证带gD标签的蛋白质的表达。通过FACS分选稳定转染的细胞系两次以在使用前达到纯 度。使用Iodogen方法碘化(125I)如上所述构建的Fc融合蛋白。用0. 1_3ηΜ碘化配体一 式三份对稳定转染子进行了结合研究。将碘化蛋白质与lxl05-2x105个细胞一起在未标记 的竞争物蛋白质的稀释系列05ρΜ-5μΜ)存在下于4°C温育4小时。将细胞悬浮液收获到 硝酸纤维素膜(Millipore)上，并彻底清洗。对干燥的滤膜计数，并使用NewLigandl.05软 件(Genentech)实施katchard分析以确定结合亲和力(Kd)。图5A和5B显示放射性标记的TIGIT-Fc蛋白对表达PVR的CHO细胞的结合。四 次实验里TIGIT-Fc-PVR相互作用的平均Kd为3. 15nM。表6以表格形式显示所有分析的结^ ο表6。PVR家族蛋白质的细胞结合。受体是在CHO细胞上表达的，而所有配体是-Fc 构建物。对受体阳性细胞门选后，用生物素化的Fc-配体通过流式细胞术测定MFI。通过竞 争放射性配体结合测定法测定结合亲和力(Kd)。显示了 Kd(nM)，是至少3次独立测定的平 均值，除了标示之处(*)。68
权利要求
1.一种确定测试免疫细胞是否是活化的或正常的Treg、记忆T细胞、NK细胞、或TFh细 胞的方法，包括评估所述测试免疫细胞中TIGIT的表达水平并将其与已知活化的或正常的 Treg、记忆T细胞、NK细胞、或TFh细胞中TIGIT的表达水平比较，或通过将所述测试免疫细 胞中TIGIT的表达水平与已知标准TIGIT表达值比较。
2.一种分离的多肽，包含如下的氨基酸序列，该氨基酸序列包含一个或多个下述氨基 酸与人TIGIT氨基酸位置67对应的氨基酸位置处的丙氨酸，与人TIGIT氨基酸位置74对 应的氨基酸位置处的甘氨酸，与人TIGIT氨基酸位置114对应的氨基酸位置处的脯氨酸，和 与人TIGIT氨基酸位置116对应的氨基酸位置处的甘氨酸。
3.权利要求2的多肽，其中所述多肽不是PVR、PVRLUPVRL2、PVRL3、PVRL4、TIGIT、 CD96、或 CDM6。
4.权利要求2或3的多肽，其中所述多肽进一步包含下述一项或多项与人TIGIT氨 基酸位置M对应的氨基酸位置处的选自缬氨酸、异亮氨酸、和亮氨酸的氨基酸，与人TIGIT 氨基酸位置55对应的氨基酸位置处的选自丝氨酸和苏氨酸的氨基酸，与人TIGIT氨基酸位 置56对应的氨基酸位置处的谷氨酰胺，与人TIGIT氨基酸位置112对应的氨基酸位置处的 苏氨酸，和与人TIGIT氨基酸位置113对应的氨基酸位置处的选自苯丙氨酸和酪氨酸的氨 基酸。
5.权利要求2或3的多肽，其中所述多肽进一步包含一个或多个选自下组的结构亚基序a.氨基酸位置M处的选自缬氨酸和异亮氨酸的氨基酸-氨基酸位置55处的选自丝氨 酸和苏氨酸的氨基酸-氨基酸位置56处的谷氨酰胺；b.位置67处的丙氨酸-氨基酸位置68-73每一个处的任意氨基酸-氨基酸位置74处 甘氨酸；和c.氨基酸位置112处的苏氨酸-氨基酸位置113处的选自苯丙氨酸和酪氨酸的氨基 酸-氨基酸位置114处的脯氨酸-氨基酸位置115处的任意氨基酸-氨基酸位置116处的 甘氨酸，且其中所述氨基酸位置的编号方式与人TIGIT的氨基酸位置对应。
6.一种确定测试多肽是否是TLP多肽家族成员的方法，包括将所述测试多肽的氨基酸 序列与TLP多肽家族的一个或多个成员的氨基酸序列比对并评估权利要求2所列任何氨基 酸在所述测试多肽氨基酸序列中的存在或缺失。
7.一种用于鉴定TLP蛋白质家族的一个或多个成员的方法，其通过鉴定一个或多个序 列数据库中其氨基酸序列包含权利要求2所列至少一个氨基酸的蛋白质来进行。
8.一种分离的药剂，其与TLP家族成员的一个或多个保守的或基本上保守的区域特异 性相互作用。
9.权利要求8的药剂，其中所述药剂是TLP家族成员的表达和/或活性的拮抗剂。
10.权利要求9的药剂，其中所述拮抗剂选自小分子抑制剂，抑制性抗体或其抗原结合 片段，适体，抑制性核酸，和抑制性多肽。
11.权利要求8的药剂，其中所述药剂是TLP家族成员的表达和/或活性的激动剂。
12.权利要求11的药剂，其中所述药剂选自激动性抗体或其抗原结合片段，激动性肽， 和活化TIGIT结合至PVR和/或由PVR介导的TIGIT细胞内信号传导的小分子或蛋白质。
13.一种鉴定或检测一个或多个TLP家族成员的方法，其通过使假定的TLP家族成员多 肽与权利要求8的药剂接触并测定该药剂对所述假定的TLP家族成员的结合来进行。
14.一种用于调控免疫系统功能和/或活性的方法，包括调控TIGIT对PVR、PVRL3、和 PVRL2中一项或多项的结合。
15.一种抗TIGIT抗体或其片段，包含至少一个HVR，该HVR包含选自SEQID NO 23-28 或SEQ ID NO :31-36所列氨基酸序列的氨基酸序列。
16.权利要求15的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO 21或四所列氨基酸序列。
17.权利要求15的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链包含SEQID NO 22或30所列氨基酸序列。
18.权利要求15的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO 21或四所列氨基酸序列且所述抗体的重链包含SEQ IDNO 22或30所列氨基酸序列。
19.权利要求15的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自人源化抗体、嵌 合抗体、双特异性抗体、异源偶联抗体、和免疫毒素。
20.权利要求15的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中所述至少一个HVR与SEQID NO 23-28或31-36任一所列HVR至少90%相同。
21.权利要求16或17的抗TIGIT抗体或其片段，其中所述轻链和/或重链分别包含与 SEQ ID NO 21或四，或者22或30所列氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。
22.一种调控⑶226-PVR相互作用和/或⑶96-PVR相互作用的方法，包括在体内或在 体外施用TIGIT、TIGIT表达和/或活性的激动剂、或TIGIT表达和/或活性的拮抗剂中至 少一项。
23.权利要求22的方法，其中施用TIGIT或TIGIT表达和/或活性的激动剂且 CD226-PVR相互作用和/或CD96-PVR相互作用受到抑制。
24.权利要求22的方法，其中施用TIGIT表达和/或活性的拮抗剂且⑶226-PVR相互 作用和/或⑶96-PVR相互作用受到刺激。
25.一种调控免疫细胞功能和/或活性的方法，其通过调控TIGIT和/或PVR表达和/ 或活性，或通过调控由TIGIT结合PVR介导的细胞内信号传导来进行。
26.权利要求25的方法，其中所述调控是降低或抑制一种或多种免疫细胞增殖或一种 或多种免疫细胞释放促炎性细胞因子，其通过在体外或在体内用TIGIT、TIGIT表达和/或 活性的激动剂、PVR表达和/或活性的激动剂处理所述细胞来进行，或通过刺激由TIGIT结 合PVR介导的细胞内信号传导来进行。
27.权利要求25的方法，其中所述调控是提高或刺激一种或多种免疫细胞增殖或一种 或多种免疫细胞分泌促炎性细胞因子，其通过在体外或在体内用TIGIT表达和/或活性的 拮抗剂、PVR表达和/或活性的拮抗剂处理所述细胞来进行，或通过抑制由TIGIT结合PVR 介导的细胞内信号传导来进行。
28.—种抑制免疫应答的方法，其通过在体外或在体内施用TIGIT、TIGIT表达和/或 活性的激动剂、PVR表达和/或活性的激动剂来进行，或通过刺激由TIGIT结合PVR介导的 细胞内信号传导来进行。
29.一种提高或刺激免疫应答的方法，其通过在体外或在体内施用TIGIT表达和/或活性的拮抗剂、PVR表达和/或活性的拮抗剂来进行，或通过抑制由TIGIT结合PVR介导的细 胞内信号传导来进行。
30.一种调控来自免疫细胞的细胞因子生成的类型和/或量的方法，其通过在体外或 在体内调控TIGIT或PVR表达和/或活性来进行。
31.权利要求30的方法，其中通过施用TIGIT表达和/或活性的拮抗剂、PVR表达和/ 或活性的拮抗剂，或通过抑制由TIGIT结合PVR介导的细胞内信号传导来刺激和/或提高 促炎性细胞因子生成。
32.权利要求30的方法，其中通过施用TIGIT表达和/或活性的激动剂、PVR表达和/ 或活性的激动剂，或通过刺激由TIGIT结合PVR介导的细胞内信号传导来抑制促炎性细胞 因子生成。
33.一种刺激一种或多种免疫细胞中ERK磷酸化和/或经由ERK途径的细胞内信号传 导的方法，包括用TIGIT、TIGIT表达和/或活性的激动剂、或PVR表达和/或活性的激动剂 处理所述一种或多种免疫细胞。
34.一种诊断受试者中涉及异常免疫细胞应答的免疫相关疾病的方法，包括评估来自 所述受试者的样品中TIGIT的表达和/或活性并将所述TIGIT表达和/或活性与TIGIT表 达和/或活性的参照量或来自正常受试者的样品中TIGIT表达和/或活性的量比较。
35.一种评估受试者中涉及异常免疫细胞应答的免疫相关疾病的严重程度的方法，包 括评估来自所述受试者的样品中TIGIT的表达和/或活性并将所述TIGIT表达和/或活性 与TIGIT表达和/或活性的参照量或来自正常受试者的样品中TIGIT表达和/或活性的量 比较。
36.一种在受试者中预防涉及异常免疫细胞应答的免疫相关疾病的方法，包括调控所 述受试者中TIGIT的表达和/或活性。
37.一种治疗或减轻受试者中涉及异常免疫细胞应答的免疫相关疾病的严重程度的方 法，包括调控所述受试者中TIGIT的表达和/或活性。
38.权利要求34-37任一项的方法，其中所述免疫相关疾病选自银屑病、关节炎、炎性 肠病或癌症。
全文摘要
本发明涉及组合物及使用那些组合物来诊断和治疗免疫相关疾病的方法。
文档编号G01N33/50GK102057272SQ200980121734
公开日2011年5月11日 申请日期2009年4月8日 优先权日2008年4月9日
发明者丹·伊顿, 于昕, 克里斯丁·D·哈登, 小利诺·冈萨雷斯, 希拉里·克拉克, 简·L·格罗甘, 贾森·哈克尼 申请人:健泰科生物技术公司