专利名称：一种λ－卡拉胶寡糖在制备血管增生的抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种λ-卡拉胶寡糖的应用，尤其涉及λ-卡拉胶寡糖在制备血管增生的抑制剂的应用。
背景技术：
血管增生是在原来存在的血管结构上长出新血管的生物学过程，许多病理条件下可以发生异常的血管增生，如炎症、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎等，特别是肿瘤的形成与转移更是依赖于新血管的形成。因此抑制过度的新血管增生已经成为治疗有关疾病有效的重要策略，并且该策略不会产生骨髓抑制、胃肠道反应或脱发等毒副反应，也不易产生耐药性。
体内血管增生涉及的细胞主要是血管内皮细胞，其过程包括小血管基底膜和基质的降解，内皮细胞在趋化因子的作用下发生迁移，内皮细胞增殖，管腔形成并相互连接等。研究显示，在新血管形成过程中涉及一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，它广泛分布于内皮细胞表面和细胞外基质内，作为血管生长因子的辅助受体发挥调节作用，对维持细胞外基质的稳定性、影响细胞侵袭、迁移和粘附都有重要的作用。因此外源性给予肝素样硫酸化物质可干扰HSPG的调节作用，从而影响血管生成；如苏拉明和多硫酸戊聚糖已用于临床治疗；来源于褐藻的多硫酸化岩藻糖能够抑制血管生长因子与受体的结合；国际专利(PCT/AU96/00238)也公开了一类硫酸化寡糖的制备，制备的产物是单糖单位间以1-2，1-3，1-4和/或1-6糖苷键连接的聚合物，其目的是对乙酰肝素酶的有效抑制作用，从而可以用来抑制人类的血管形成、肿瘤转移及各类炎症。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种λ-卡拉胶寡糖在制备血管增生的抑制剂的应用；其在肿瘤、炎症、糖尿病等疾病的治疗和预防时用作血管增生的抑制剂。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为本发明提供一种具有下述结构式的λ-卡拉胶寡糖在制备血管增生的抑制剂的应用
其中n＝2-20。
所述的λ-卡拉胶寡糖是来自于红藻多糖的λ型卡拉胶的降解产物，平均分子量为3351Da。
所述的λ型卡拉胶降解时所用的介质为经过酸处理的阳离子交换树脂。
用该寡糖为活性成分可制备成保健品、药物或食品用来治疗和预防各种疾病引起的血管增生，由于λ-卡拉胶寡糖是从红藻多糖中降解得到的低分子量糖，具有重复的α-(1-4)-D-半乳吡喃糖-β-(1-3)-D-半乳吡喃糖的二糖单元骨架结构，其结构单元内含有高硫酸基团，可以用作外源性给予肝素样硫酸化物质，干扰体内的HSPG的调节作用，所以其可以在肿瘤、炎症、糖尿病等疾病引起的血管增生用作血管增生抑制剂，抑制各种疾病引起的血管增生。
本发明的优点在于其原料来源于纯天然的海洋藻类，该λ-卡拉胶寡糖具有无毒、低副作用的特点，使用安全性高；该寡糖其结构单元内含有高硫酸基团，可以用作外源性给予肝素样硫酸化物质，干扰体内的HSPG的调节作用，所以其可以在肿瘤、炎症、糖尿病等疾病引起的血管增生用作血管增生抑制剂，抑制各种疾病引起的血管增生；该寡糖具有明确的单糖化合物寡聚体，其作用机理比较明确，并且抑制活性较好；可用于制药及保健品、食品等领域中，预防和治疗由于各种疑难杂症所引起的各种血管增生和形成。
图1A为对照组的鸡胚尿囊膜上血管形成显微镜示意图；图1B为对照组的鸡胚尿囊膜组织切片显微镜示意图；图2A实验组的鸡胚尿囊膜血管形成的显微镜示意图；图2B为实验组的鸡胚尿囊膜组织切片显微镜示意图；图3为实验组的脐静脉内皮细胞的管腔形成显微镜示意图；图4为对照组的脐静脉内皮细胞的管腔形成显微镜示意图。
具体实施例方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。本发明不仅局限于此。
制备例1将角叉菜属植物红藻Chondrus ocellatu 20g于40℃烘干，粉碎成100目，加适量水(藻水比为1∶80)，沸水浴搅拌1小时后，纱布过滤，滤渣重复提取一次，合并两次滤液，自来水透析24小时，蒸馏水透析24小时。在高速离心机上离心分离后取上清液在冰箱里冻透，95％酒精融化脱水，85％酒精浸洗二次，红外灯下干燥。将此角叉菜多糖加3000ml水溶解，加入KCl至最终浓度为0.3mol/L，在冰水浴中搅拌1h，5000rpm离心30mins，得上清液，减压浓缩，冰箱中冻透过夜、95％酒精脱水，烘干、得λ-卡拉胶1.45g。
将λ-卡拉胶配成1.5％的溶液，按体积比1∶4加入介质为001×7型阳离子交换树脂到溶液中，在90℃水浴，搅拌反应6h，过滤去除树脂，滤液减压浓缩至近干，冷冻干燥得到λ-卡拉胶寡糖0.98g；按端基法测定寡糖平均分子量为3351Da。
制备例2用市售的λ-卡拉胶作为寡糖的作为制备原料，制备λ-卡拉胶寡糖方法同上。
试验例1鸡胚尿囊膜(CAM)模型用新鲜海兰种蛋以消毒水擦干其表面，取胚龄4d的胚蛋，分为对照组和实验组，每组8枚；将蛋剥于杯中，胚蛋在37℃，60％相对湿度的孵箱中孵至CAM展开，培育8天，此时将剪好的约为1mm3的无菌明胶海绵置于对照组和实验组的尿囊绒毛膜上，吸取5μl(相当于200μg活性成分/egg)卡拉胶寡糖加到无菌明胶海绵上置于实验组的尿囊绒毛膜上，而对照组以磷酸缓冲液代替寡糖样品。鸡蛋在孵箱中继续孵育两天，待鸡胚尿囊膜毛细血管网彻底形成后，取出鸡蛋，以载体为中心剪下鸡胚尿囊膜，在10％甲醛中固定12-24h，显微观察，分别随机各选取4个视野计数血管分支点数(对照组为57±6.78条；实验组为23±0.85条)。另外各做组织学切片，片厚5μm，HE染色，封片将对照组和实验组的作比较，分别得到图1、图2的实验结果。
本实验例使用鸡胚尿囊膜作为血管新生的模型，在鸡胚生长至约第10天，对照组的鸡胚尿囊膜内形成大量的血管网图1A，实验组使用λ-卡拉胶寡糖(200μg/egg)会使血管新生明显减少图2A，实验组的结果图2A与对照组的结果图1A比较，血管密度明显减少，并且膜内的微血管数也大大减少；从中对比得出使用λ-卡拉胶寡糖(200μg/egg)对血管生成的抑制率达到54.90％；其组织切片的结果也显示，实验组的结果图2B比对照组的结果图1B在尿囊膜内的毛细血管明显减少。
试验例2脐静脉内皮细胞模型本实验例以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型，取HUVEC 150μl，细胞密度3×104/cells，加入到预铺以无血清MEM培养基(MEM为一种培养基的名称缩写)1∶1稀释的Matrigel(基底膜基质)的96孔板内，37℃下凝固30分钟的培养基中，实验组的人脐静脉内皮细胞中加入λ-卡拉胶寡糖，体系的最终浓度为125μg/ml(ml是细胞溶液的量)，37℃孵育48h后，显微镜下分别观察各自的管腔的形成情况，分别得到图3、图4的结果。
在此试验中，对照组的结果图3显示镜下可见明显的管腔出现，实验组的结果图4显示镜下可见管腔无法生成，所以对HUVEC施用125μg/ml的λ-卡拉胶寡糖即可以破坏内皮细胞管腔的生成。
权利要求
1.一种具有下述结构式的λ-卡拉胶寡糖在制备血管增生的抑制剂的应用 其中n＝2-20。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的λ-卡拉胶寡糖是来自于红藻多糖的λ型卡拉胶的降解产物，平均分子量为3351Da。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的λ型卡拉胶降解时所用的介质为经过酸处理的阳离子交换树脂。
全文摘要
本发明涉及一种λ－卡拉胶寡糖的应用，尤其涉及在制备血管增生的抑制剂的应用；其在肿瘤、炎症、糖尿病等疾病的治疗和预防时用作血管增生的抑制剂；本发明的原料来源于纯天然的海洋藻类，使用安全性高，具有无毒、低副作用的特点；其作用机理比较明确，并且抑制活性较好；可广泛应用于制药及保健品、食品等领域中，防止和治疗由于各种疑难杂症所引起的各种血管增生和形成。
文档编号A61P35/00GK1899293SQ20061005258
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者陈海敏, 严小军, 徐继林 申请人:宁波大学