新型慢性乙肝治疗性dc疫苗的制作方法

专利名称：新型慢性乙肝治疗性dc疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用重组乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)和重组乙肝病毒核心抗原(hepatitis Bvirus core antigen，HBcAg)同时负载单核细胞来源的树突状细胞(monocytederived-DC，moDC)，使该树突状细胞得以负载抗原而成熟从而制成的HBV特异性DC疫苗。
背景技术：
乙型病毒性肝炎是由HBV引起的，以肝脏炎症核坏死病变为主的一组传染病，是当前严重危害人类健康的疾病之一。据世界卫生组织估计，全球范围内HBV感染者高达20亿以上，其中4亿为慢性感染者。慢性感染者中有10～20％可发展为肝硬化，肝硬化的1～5％可演变为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。因此肝细胞癌的发生与慢性HBV感染高度相关，慢性感染者发生肝细胞癌的机率是非感染者的100倍。我国是HBV慢性感染的高流行区，一般人群的HBsAg阳性率为9.09％(近1.2亿人为HBV携带者)，慢性乙型肝炎(chronicalhepatitis B，CHB)现症患者达3000万，每年因治疗慢性乙型肝炎及其相关的肝脏疾病(如肝硬化、肝癌等)约花费1000亿元人民币。慢性乙型肝炎已严重威胁国人健康，给患者个人与家庭带来了沉重负担，甚至影响国民经济的发展，因此，对病毒性肝炎的预防、控制、治疗的研究有着重大意义，国务院刚发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》已将“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”列入16个重大专项之中。
乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。完整的HBV颗粒直径为42nm，又名Dane颗粒，分为包膜与核心两部分。包膜厚约7nm，内含HBsAg、糖蛋白与细胞脂肪。包膜内为直径28nm的核心或核壳体。HBsAg在肝细胞内合成，大量释出于血液循环中，在电镜下呈球形，直径22nm，分子量24KD；或管状[(20～30)nm×(200～400)nm]，没有感染性。在血液中HBsAg的数量远多于Dane颗粒，可超过100～1000倍。核心部分含有环状双股DNA、DNA聚合酶(DNApolymerase，DNAP)和HBcAg，是病毒复制的主体。HBcAg是由HBV DNA负链上的开放读码区C区编码的核心(核衣壳)多肽，分子量21KD，在外周血中无游离的HBcAg存在。
HBV引起肝脏损伤的主要原因是宿主针对感染了HBV的肝细胞的免疫反应，即机体免疫系统释放出大量非溶细胞性的细胞因子所致的肝细胞损害。持续的HBV感染是造成乙型肝炎慢性化的主要原因，因此，抗病毒治疗是慢性HBV感染的一项基本治疗措施，但疗效不够满意，治疗后HBV DNA难以彻底清除，复发率高，最终清除病毒还须机体的特异性免疫功能。病毒特异性T细胞反应是机体抗病毒感染最主要的获得性免疫反应，其中CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的免疫反应在机体排斥、清除肝炎病毒的过程中具有关键作用，CD4+辅助T细胞(helper T lymphocyte，Th)也是体内有效调节抗病毒免疫反应不可缺少的因素。在急性自限性HBV感染的患者中，HBV特异性的CTL细胞反应在造成肝组织损伤的同时，可清除机体的病毒，使患者获得痊愈，Th细胞介导的免疫应答在清除病毒中也扮演了重要角色。但是，大部分的HBV感染者不能彻底清除病毒而导致慢性感染。大量研究表明，慢性HBV感染患者免疫应答水平低下或缺失，病毒特异性T细胞的数量和功能都降低，这种现象称为免疫耐受。加之病毒容易发生变异，更促使免疫耐受的形成。慢性肝炎患者体内HBV特异性的CTL反应和Th细胞介导的免疫反应微弱，甚至检测不到针对HBV的特异性的CTL反应，因此机体不能有效清除病毒，这就是HBV持续存在的原因之一。
目前常用的抗病毒治疗、保肝降酶治疗、抗纤维化治疗以及免疫学治疗(主要是细胞因子等)虽有一定疗效，但由于免疫耐受、病毒变异等原因，往往不能彻底清除体内病毒。因此有效控制病毒复制对抑制疾病的进展十分重要。预防性乙肝疫苗的接种，对保护易感人群免受HBV的感染以及HBV引起的疾病起十分重要作用。随着免疫学理论的发展和生物医学技术的进步，治疗性乙肝疫苗的开发和应用为慢性乙肝的治疗带来了新的希望。目前治疗性疫苗主要有以下几类有核酸疫苗、基因工程疫苗、合成肽疫苗、乙肝病毒表面抗原-抗体复合物疫苗、抗体化抗原疫苗等。目前我国进入临床试验阶段的疫苗有乙肝病毒表面抗原-抗体复合物疫苗、合成肽疫苗和蛋白疫苗，有的已进入临床III期。由于以上疫苗均为蛋白或多肽产物，接种体内后必须由抗原提呈细胞处理、加工和提呈后才能有效激活机体的免疫系统，因此抗原提呈的效率直接影响疫苗的疗效，其疗效和安全性问题还有待于进一步验证，在临床上的推广应用还有待于观察。
树突状细胞(dendritic cell，DC)是体内分布广泛的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，具有激活CD8+CTL和CD4+Th的能力，处于免疫应答的中心环节，在机体抗病毒、肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。DC可以通过激活体内特异性的CTL前体细胞或未致敏的T细胞、Th细胞，使机体产生扩增、放大的CTL效应，同时产生高水平、高亲合力的抗体反应。因此，在慢性乙肝或慢性乙肝合并肝细胞癌的治疗中，通过上调DC介导的特异性免疫反应来清除HBV已经成为目前的研究热点。近年研究表明，慢性HBV感染患者的体内HBV特异性T细胞免疫耐受的形成，其机制可能是DC的表型不成熟和DC的免疫调节和抗原提呈功能有特异性的缺陷。我们实验室的研究也发现慢性HBV感染者外周血中DC的增殖数量较正常人明显降低；表达于慢性乙肝患者DC表面的CD1a、CD86、CD80和HLA-DR的水平明显低于正常；在混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)中乙肝患者的DC刺激T淋巴细胞增殖的能力亦低于健康人；在MLR上清及纯的DC培养上清液中其产生IL-12的水平下降而NO水平升高，NO被认为可通过抑制多种酶的作用而损伤健康组织，由此可见慢性乙型肝炎患者不仅DC表型不成熟同时也存在功能缺陷。Kakumu在研究HBV、HCV感染的肝癌患者的外周血DC功能时，也认为DC功能的降低与HBV或HCV感染有一定关系。
DC疫苗是指负载了特异性抗原的成熟树突状细胞疫苗。随着对DC生物学特征的深入了解及其在抗病毒、抗肿瘤免疫反应中机理的研究，体外大量制备DC疫苗的方法日益成熟，将DC用抗原肽和蛋白抗原体外负载后回输到患者体内，在体内可诱导出抗原特异性的T细胞免疫应答和特异性抗体的生成。DC作为一种免疫佐剂在治疗黑色素瘤、前列腺癌、胃肠腺癌、肺腺癌、乳腺癌和肝癌中都发挥了较好的作用，而且作为预防性和治疗性的疫苗也是安全有效的。关于HBV治疗性的DC疫苗国外也已进入临床实验阶段，但是多用HBsAg负载DC以制备疫苗。Chisari研究组发现，DC经过HBsAg负载后可打破HBV转基因鼠(HBV-Tg)的免疫耐受，诱导抗HBV的CTL反应(Shimizu Y，Guidotti LG，Fowler P，Chisari FV.Dendritic cell immunization breaks cytotoxic T lymphocyte tolerance in hepatitis Bvirus transgenic mice.J.Immunol.1998，1614520-4529)。Akbar等应用HBsAg负载处于免疫抑制状态的HBV-Tg鼠的DC，再注射入HBV-Tg小鼠后能有效诱导产生anti-HBs(Akbar SMF，Furukawa S，Hasebe A，Horiike N，Michitaka K，Onji M.Production and efficacy of a dendritic cell-based therapeutic vaccine for murinechronic hepatitis B virus carrierer.Int.J.Mol.Med.2004，14295-299)。之后他们应用HBsAg负载正常自愿者DC后回输自愿者体内，结果表明能有效诱导机体产生anti-HBs，并且有很好的安全性(Akbar SMF，Furukawa S，Onji M，Murata Y，Niya T，Kanno S，Murakami H，Horiike N.Safety and efficacy of hepatitis B surfaceantigen-pulsed dendritic cells in human volunteers.Hepatol Res，2004，29136-141)。国内研究者应用CHB病人自体的PBMC诱导DC，经HBsAg负载后回输病人体内后病人HBV-DNA明显下降，52.6％发生HBeAg/anti-HBe血清转换，部分病人ALT复常，总反应率达57.9％(Chen M，Li YG，Zhang DZ，Wang ZY，Zeng WQ，Shi XF，Guo Y，Guo SH，Ren Hong.Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine onpatients with chronic hepatitis BA clinical study.World J Gastroenterol 2005，11(12)1806-1808)。由于HBV的HBcAg对于不同的病毒亚型是高度保守的，且在急性自限性和慢性肝炎中HBcAg是CD4+T细胞应答最跃的HBV蛋白，被认为是较理想的免疫治疗靶位，HBcAg具有多处T细胞识别表位，有保护性功能，还具有直接刺激B细胞应答的作用，现在认为还起佐剂作用，与其他保护性抗原融合可增强其免疫原性。
本发明在此基础上，提供HBsAg和HBcAg两种抗原联合负载的DC疫苗，该疫苗能有效诱导同时针对s181-193表位及c18-27表位的多特异性CTL反应，并且分泌细胞因子如IL-12也显著高于单纯HBcAg或HBsAg负载的DC。HBcAg的c18-27肽表位是HBV特异性CD8+T细胞的识别靶位，共负载HBsAg和HBcAg的DC能有效诱导针对HBV不同表位的多克隆特异性CTL，产生更强的抗HBV特异性和非特异性的免疫反应。

发明内容
本发明提供一种用HBsAg和HBcAg共负载单核细胞来源的树突状细胞，使该树突状细胞得以负载抗原而成熟从而制成HBV特异性DC疫苗。
本发明的特征在于用HBsAg和HBcAg共同负载未成熟的moDC，负载浓度5～100μg/ml，优选为20μg/ml，负载时间为HBsAg与HBcAg和未成熟的moDC细胞共同孵育12～48小时。此疫苗能诱导机体产生针对HBsAg和HBcAg的特异性免疫。
本发明的特征在于从单核细胞诱导moDC，在moDC未成熟阶段即5～6天时加入HBsAg与HBcAg各20μg/ml，共培养12～48小时，收集成熟moDC即为HBV特异性的DC疫苗。
本发明的疫苗使用时可以制成药物制剂，如注射剂，该注射剂是单位剂量形式，如每制剂单位含有DC数1×104～1×107个。该注射剂必要时可以加入药物可接受的载体，如稀释剂，赋型剂，稳定剂等药物学常规的辅料。
本发明的疫苗制剂，可通过皮下、肌肉或淋巴结内注射。
本发明的疫苗制剂，可与其他细胞因子治疗方法合用。
本发明的疫苗制剂，可与治疗慢性乙肝的其他治疗方法(如抗病毒治疗，中医中药治疗、过继细胞免疫治疗)联合应用。
本发明的术语解释如下HBsAg乙型肝炎病毒表面抗原，其来源属于现有技术。
HBcAg乙型肝炎病毒核心抗原，其来源属于现有技术。
DC树突状细胞，是体内提呈抗原功能强的抗原提呈细胞，其来源属于现有技术。
负载是抗原致敏细胞的过程，即将抗原加入DC的培养液中进行培养，DC摄取抗原后，在细胞内经过加工处理，将蛋白抗原分解成多肽后与MHC分子结合而提呈于DC表面，从而被免疫细胞识别而诱发免疫反应。
未成熟的moDC即未成熟的单核细胞来源的树突状细胞，其表型和功能均不完善，不能诱导有效的免疫反应。不成熟的DC经抗原致敏可成熟，表型和功能均得到明显的改善，可有效诱导免疫反应。
孵育即细胞的培养过程。细胞需要在一定的培养基中进行生长繁殖，并且需要保持一定的温度、湿度和CO2的浓度。
成熟moDC即成熟的单核细胞来源的树突状细胞，其表型和功能均完善，如负载了抗原后，其表面可呈现抗原肽与MHC分子结合的复合分子。
HBV特异性的DC疫苗即负载了HBV抗原、可诱导机体产生针对HBV的特异性免疫活性细胞的DC疫苗。
本发明的疫苗的制备过程可描述如下1.HBsAg和HBcAg的获得HBsAg来源于重组(酵母)乙肝疫苗不加免疫佐剂的半成品，HBcAg来源于本室构建的携带HBcAg全基因序列的质粒PMM2066，在大肠杆菌中表达后分离纯化而得。
2.0dPBMC的分离取外周抗凝血50～100ml，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，用预冷的PBS稀释成15～20ml，分置于2个灭菌10ml离心管中，离心10分钟，离心两次以去除细胞碎片和血小板，吸弃上清。将去除细胞碎片和血小板的PBMC用PBS稀释。在2个灭菌的离心管中加入预先恢复至室温的淋巴细胞分离液，将稀释后的PBMC沿管壁轻轻加在淋巴细胞分离液液面上使形成界面，淋巴细胞分离液与稀释PBMC的体积比为4∶6。离心20分钟，由上至下分出稀释液、PBMC带、淋巴细胞分离液和红细胞四条带。收集界面单个核细胞于离心管中，用PBS稀释至10～20ml，分别以1200rpm/10分钟离心洗涤细胞2～3次。镜下观察细胞状态，如果细胞碎片和血小板较多，1200rpm/8分钟再洗一次。将细胞合并到一个10ml离心管，以无血清AIM-V培养液悬浮细胞，计数细胞浓度，用台盼蓝染色测定细胞存活比例，计算存活细胞总数，做好记录。调整细胞浓度至2～5×106/ml，铺于6孔板中，每孔2～3ml，37℃、5％的CO2孵箱中温育1～2小时，使单核细胞贴壁。
3.0天DC培养当孵育结束时，首先用培养皿中的液体冲洗贴壁细胞，吸出上层未贴壁细胞，加入预热的培养基，再冲洗2次，以去除未贴壁细胞和大部分的贴壁的淋巴细胞。未洗尽的淋巴细胞比单核细胞小而圆亮。拍照记录。置37℃、5％的CO2温箱中培养3天。未贴壁细胞约占PBMC的50～80％，用含10％小牛血清的RPMA1640培养基调整细胞浓度为1～3×106/ml，加入维持剂量的IL-2(5～50U/ml)，于一洁净培养瓶中培养，每3天半量换液，并根据细胞状况随时调整培养基量，补加细胞因子，即为自体T淋巴细胞，待后续实验用。贴壁细胞数量＝总PBMC-总未贴壁细胞数，记录。冲洗时，用吸管上下吹吸几次，轻轻振荡培养皿。接着面向操作者倾斜培养皿，吸尽培养基。当吸下面的液体时，滴管头悬在液体中，沿培养皿四周边移动滴管边吸，不要用吸管刮培养皿的底面。按此法，吸出每个培养皿内的液体。整个操作过程要迅速，以免细胞在洗涤过程中缺水干死。加入预热的AIM-V培养基，内含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)。倒置显微镜下观察贴壁的单核细胞，按照细胞状态进行评分，由最差到最好划分标准并评分0～5分。观察的指标包括细胞密度、细胞碎片、悬浮细胞的数量、大细胞的数量和树枝状突起的状态。
4.3天半量换液倒置显微镜下观察细胞，按照细胞状态进行评分，由最差到最好划分标准并评分0～5分。观察的指标包括细胞密度、细胞碎片、悬浮细胞的数量、大细胞的数量和树枝状突起的状态。拍照记录。收集(用吸管轻柔抽吸)每孔细胞于一个离心管中，及时在每孔中添加预热的AIM-V培养液，以免贴壁细胞缺水干死。收集的细胞1200rpm/10分钟离心，吸弃一半上层的旧培养液，补加入等量新鲜的含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)的AIM-V培养液(补加培养液量应除去孔中添加的每孔0.5ml的液体量，以便使换液前后培养液总体积保持不变)；置37℃、5％的CO2温箱中培养。
5.5天半量换液倒置显微镜下观察细胞，按照细胞状态进行评分，由最差到最好划分标准并评分0～5分。观察的指标包括细胞密度、细胞碎片、悬浮细胞的数量、大细胞的数量和树枝状突起的状态。拍照记录。收集每孔的悬浮细胞(用吸管轻柔抽吸)，取出10μl细胞悬液用台盼蓝染色，测定DC细胞存活比例，细胞计数(计数时，只计数典型的DC，不要将淋巴细胞计数在内)。计算出第5天存活的DC细胞占第0天收集贴壁细胞总数的比例，记录。半量换液，操作如3天半量换液。换液的细胞因子浓度减半(GM-CSF 50～500U/ml、IL-4250～1000U/ml)。置37℃、5％的CO2温箱中培养。
6.6天收集未成熟DC(immature DC，iDC)和抗原负载倒置显微镜下观察细胞，按照细胞状态进行评分，包括细胞密度、细胞碎片、悬浮细胞的数量、大细胞的数量和树枝状突起的状态。拍照记录。然后吸取2～5×105细胞悬液，离心，搜集上清，留-20℃冰箱备测细胞因子IL-10、IL-12等，因子浓度可换算成/24小时/10000细胞，以利于比较。细胞用于流式细胞仪检测细胞iDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLA DR，CD40，CD83等)，iDC纯度通过光散射角G1门中的％加DC标志CD11c染色决定。吸取iDC培养液100μl作无菌试验(包括细菌和真菌培养，支原体，LPS检验)。孔内加入HBV抗原按5～100μg/ml的浓度加入HBsAg和HBcAg，置37℃、5％的CO2温箱中培养4～6小时。
7.7天成熟的HBV特异性DC(mature DC，mDC)疫苗的收获倒置显微镜下观察各组细胞，按照细胞状态进行评分，包括细胞密度、细胞碎片、悬浮细胞的数量、大细胞的数量和树枝状突起的状态。拍照记录。取出10μl细胞悬液用台盼蓝染色，测定细胞存活比例，细胞计数。计算出第7天存活细胞分别占第0天收集的PBMC总数和贴壁细胞的比例，记录。分别取对照组和抗原组1～5×105细胞悬液，离心，搜集上清，留-20℃冰箱(细胞因子可换算成/24小时/10000细胞)。细胞用于流式细胞仪检测细胞mDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLADR，CD40，CD83等)，mDC纯度通过光散射角G1门中的％加DC标志CD11c染色决定；细菌和真菌培养阴性、支原体、LPS检验阴性的HBcAg和HBsAg共同负载的成熟mDC即为HBV特异性DC疫苗。病人注射剂量为1～2×107/次，前臂皮下或淋巴结内注射。
8.HBV特异性DC疫苗的冻存收集成熟的DC疫苗冻存，以备1周、2周、4周后加强免疫。按5×106/ml加入冻存液(含10％DMSO)，冻存管放入预冷的乙醇中，首先置于-20℃2～4小时，-80℃24小时，再置于液氮中冻存。
9.冻存的HBV特异性DC疫苗的复苏分别在冻存后的1周、2周、4周将冻存的mDC解冻复苏。冻存管由液氮中取出后直接放入37℃水浴中。一旦细胞悬液融化后马上加入AIM-V(含1％AB血清)进行稀释。稀释液应逐滴加入，并且轻轻地摇动冻存管，使DMSO从mDC中释放出来。否则，太快加入稀释液，mDC细胞内的DMSO由于其渗透压会使水分很快渗入细胞，使mDC细胞肿涨裂解而死亡。用AIM-V培养基(含1％AB血清)洗涤3次，取出10μl细胞悬液用台盼蓝染色，测定细胞存活比例，细胞计数。计算存活细胞在冻存细胞中比例，记录。吸取各组解冻的mDC 100ul作无菌试验(包括细菌和真菌培养，支原体，LPS检验)。分别用解冻细胞进行①流式细胞仪测mDC表型；②mDC介导HBV特异性CD8+T淋巴细胞的产生；③混合淋巴细胞反应；④mDC介导自体T细胞分泌IFN-γ等实验(自体T细胞与mDC同步冻存，在mDC解冻前两天解冻培养)。
对本发明的疫苗进行了以下效果观察1.不同成熟阶段的DC表型测定结果应用以上技术方法可以有效诱导DC表型的成熟，这为HBV特异性DC疫苗的制备提供了技术保障，见表1。
表1成熟与未成熟DC的表型测定结果(％)

*与iDC组比较，p＜0.052.不同剂量HBV抗原负载后DC疫苗表型的变化应用不同剂量的HBsAg、HBcAg负载DC的效果是不一样的。但无论是HBsAg、HBcAg，当剂量为20μg/ml时其促进DC成熟的作用强于10μg/ml的剂量，当提高负载剂量时，并未能进一步提高DC的表型，故20μg/ml为最适宜的负载剂量，见表2。应用20μg/ml剂量的HBsAg联合HBcAg负载DC，其促进DC表型的功能均强于单独应用HBsAg和HBcAg，见表3。
表2不同剂量的HBsAg和HBcAg负载DC后表型的变化(％)

a与0μg/ml组比较，p＜0.05，b与10μg/ml组比较，p＜0.05
表3HBsAg和HBcAg单独应用或联合应用对DC表型的影响(％)

a与No-Ag组比较，p＜0.05；b与HBsAg组比较，p＜0.05；c与HBcAg组比较，p＜0.053.HBV特异性DC疫苗诱导自体T细胞分泌IFN-γ不同抗原负载的HBV特异性DC疫苗诱导T细胞产生IFN-γ的能力不一样，见图1，HBcAg或HBcAg联合HBsAg负载的HBV特异性DC疫苗诱导T细胞分泌IFN-γ的能力要优于HBsAg。
4.应用HBV特异性DC疫苗的适应症对不同免疫状态的病人研究结果如图2。从结果可知，HBVDNA＞105copies/ml，并且ALT＞80U/L时，HBV特异性DC疫苗产生IL-12以及诱导自体T细胞产生IFN-γ的能力均强于ALT＜80U/L的病人，因此HBV特异性DC疫苗在免疫激活期病人应用较为有效。
5.HBV特异性DC疫苗的特点HBcAg和HBsAg联合负载的HBV特异性DC疫苗能诱导体外培养的自体T细胞中产生针对s181-193、c18-27表位的特异性CD8+T细胞。说明应用HBV特异性DC疫苗可诱导机体产生针对HBV的多克隆特异性CTL，更有利于HBV的清除，见图3。
本发明的DC疫苗较其它疫苗有如下特点DC可采用患者自身的PBMC诱导而成，避免交叉感染，安全性好，同时也可用HLA配型相同的健康献血者的PBMC诱导而成；HBV感染的病人由于DC功能的数量减少和功能的受损，不能有效提呈抗原，经体外处理后可恢复或增强抗原提呈功能，且分泌细胞因子的功能增强，可有效激活机体的免疫状态；另外DC在体外已经过抗原的负载，抗原加工及提呈已完成，故可极大的提高疫苗的效率和免疫效果，有效地激活初始的T细胞和静息状态的记忆性T细胞，以及B细胞，少量DC疫苗即可诱发强烈的细胞免疫和体液免疫。本发明提供的疫苗不仅可诱导机体产生针对HBsAg的细胞免疫反应，还可诱导机体产生针对HBcAg的免疫反应，两者结合，相互促进，具有协同作用，抗病毒效果优于单纯HBsAg负载的DC疫苗。由于血液来源充分，可大规模分离PBMC制备树突状细胞，通过体外诱导以及HBsAg和HBcAg负载后可获得通用型HBV特异性DC疫苗，可供HLA配型相同广大的CHB患者使用，应用前景广阔。


图1不同类型的HBV特异性DC疫苗诱导T细胞产生IFN-γ的结果图2HBV特异性DC疫苗对不同免疫状态T细胞的作用图3HBV特异性DC疫苗诱导表位特异性CD8+T细胞的比例检测结果(▲HBV-s183-191-specific CTL的频率；●HBV-c18-27-specific CTL的频率；■HBV-pol575-583-specific CTL的频率)
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1，制备1.HBsAg和HBcAg的来源HBsAg来源于重组(酵母)乙肝疫苗不加免疫佐剂的半成品。HBcAg来源于本室构建的携带HBcAg全基因序列的质粒PMM2066，在大肠杆菌中表达后分离纯化而得。
2、0天PBMC的分离取外周抗凝血100ml，用淋巴细胞分离液分离PBMC，用预冷的PBS将分离出的PBMC稀释成20ml，分置于2个灭菌10ml离心管中，离心10分钟，共两次以去除细胞碎片和血小板，吸弃上清。将去除细胞碎片和血小板的PBMC再用PBS稀释。在2个灭菌的离心管中加入预先恢复至室温的淋巴细胞分离液，将稀释后的PBMC沿管壁轻轻加在淋巴细胞分离液液面上使形成界面，淋巴细胞分离液与稀释PBMC的体积比为4∶6。离心20分钟，由上至下分出稀释液、PBMC带、淋巴细胞分离液和红细胞四条带。收集界面单个核细胞于离心管中，用PBS稀释至10ml，分别以1200rpm/10分钟离心洗涤细胞3次。将细胞合并到一个10ml离心管，以无血清AIM-V培养液悬浮细胞，计数细胞数为6×107，用台盼蓝染色测定细胞存活比例为99％，存活细胞总数约为6×107。调整细胞浓度至2×106/ml，铺于6孔板中，每孔2.5ml，37℃、5％的CO2孵箱中温育2小时，使单核细胞贴壁。
3、0天DC培养当孵育结束时，首先用培养皿中的液体冲洗贴壁细胞，吸出上层未贴壁细胞，加入预热的培养基，再冲洗2次，收集未贴壁细胞和大部分的贴壁(但可被冲洗下来)的淋巴细胞，计数为4×107。用含10％FCS的RPMA1640培养基调整细胞浓度为2×106/ml，加入维持剂量的IL-2(5～50U/ml)，于一洁净培养瓶中培养，每3天半量换液，并根据细胞状况随时调整培养基量，补加细胞因子，即为自体T淋巴细胞，待后续实验用。剩余细胞加入预热的AIM-V培养基，内含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)。倒置显微镜下观察贴壁的单核细胞，按照细胞状态评分为5分，拍照记录。置37℃、5％的CO2温箱中培养3天。
4、3天半量换液倒置显微镜下观察DC细胞，按照细胞状态进行评分为5分。收集每孔细胞于一个离心管中，及时在每孔中添加预热的AIM-V培养液，以免贴壁细胞缺水干死。收集的细胞1200rpm/10分钟离心，吸弃一半上层的旧培养液，补加入等量新鲜的含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)的AIM-V培养液，置37℃、5％的CO2温箱中培养。
5、5d半量换液倒置显微镜下观察细胞，按照细胞状态进行评分为5分。收集每孔的悬浮细胞，取出10μl细胞悬液用台盼蓝染色，测定DC细胞存活比例为95％，细胞计数5×107，半量换液，操作如3d半量换液。换液的细胞因子浓度减半(GM-CSF 50～500U/ml、IL-4 250～1000U/ml)。置37℃、5％的CO2温箱中培养。
6、6天收集未成熟DC(immature DC，iDC)和抗原负载倒置显微镜下观察细胞，按照细胞状态进行评分为5分，吸取2×106细胞悬液，离心，搜集上清，留-20℃冰箱备测细胞因子IL-10、IL-12等，细胞用于流式细胞仪检测细胞iDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLADR，CD40，CD83等)。吸取iDC培养液100μl作无菌试验(包括细菌和真菌培养，支原体，LPS检验)。孔内加入HBV抗原按5～1000μg/ml的浓度加入HBsAg和HBcAg，置37℃、5％的CO2温箱中培养6小时。
7、7天成熟的HBV特异性DC(mature DC，mDC)疫苗的收获倒置显微镜下观察各组细胞，按照细胞状态进行评分为5分，取出10μL细胞悬液用台盼蓝染色，测定细胞存活比例为95％，细胞计数为5.7×107。分别取对照组和抗原组2×106细胞悬液，离心，留上清-20℃冰箱保存。细胞用于流式细胞仪检测细胞mDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLADR，CD40，CD83等)。细菌和真菌培养阴性，支原体、LPS检验阴性的HBcAg和HBsAg共同负载的成熟mDC即为HBV特异性DC疫苗。
8、HBV特异性DC疫苗的冻存收集成熟的DC疫苗冻存，以备1周、2周、4周后加强免疫。按5×106/ml加入冻存液(含10％DMSO)2.0ml，分装成10个冻存管冻存。冻存管先放入预冷的乙醇中，首先置于-20℃2～4小时，-80℃24小时，再置于液氮中冻存。
9、HBV特异性DC疫苗的复苏分别在冻存后的1周、2周、4周将冻存的mDC解冻复苏。复苏时将1个冻存管由液氮中取出后直接放入37℃水浴中。一旦细胞悬液融化后马上加入AIM-V(含1％AB血清)进行稀释。用AIM-V培养基(含1％AB血清)洗涤3次，取出10μl细胞悬液用台盼蓝染色，测定细胞存活比例为85％，细胞计数4.5×106。吸取复苏后的mDC 100ul作无菌试验(包括细菌和真菌培养，支原体，LPS检验)。分别用复苏细胞进行如下实验(1)流式细胞仪测mDC表型复苏后HBV特异性DC疫苗取6×105的量，用流式细胞仪检测细胞的表型。结果见表4。从表4可知冻存后1周、2周和4周表型DC的表型几乎无改变，说明冻存4周内对DC疫苗的表型无影响，保证的疫苗的质量。
表4HBV特异性DC疫苗在不同时间复苏后的表型检测(％)

(2)mDC诱导HBV特异性CD8+T细胞的产生将复苏HBV特异性DC疫苗与自体T细胞(自体T细胞与mDC同步冻存，在DC疫苗复苏前两天复苏培养)按1∶20混合培养7天后用Tetramer检测T细胞中HBV特异性CD8+T细胞的比例，3次复苏的结果混合培养之前，T细胞含特异性HBV-c18-27CD8+T细胞的比例均由0.01％上升到培养后的0.13％、0.15％、0.12％，特异性HBV-s183-191CD8+T细胞的比例由0.01％上升到培养后的0.08％、0.10％、0.09％，因此HBV特异性DC疫苗可诱导T细胞中HBV特异性CTL的产生。
(3)混合淋巴细胞反应复苏后的DC疫苗经丝裂霉素C灭活后按1∶25的比例与自体T细胞(自体T细胞与DC疫苗同步复苏，在DC疫苗复苏前两天解冻培养)混合培养，同时取相同数量的T细胞不加DC疫苗作为对照进行培养，4天后应用细胞增殖检测试剂盒(美国Promega公司产品)检测细胞的增殖情况，3次结果为经DC疫苗刺激的T细胞数量是未用DC疫苗刺激的T细胞数量的1.5倍、1.7倍和1.6倍。说明经HBV特异性DC疫苗刺激后可明显促进T细胞的增殖。
(4)HBV特异性DC疫苗诱导自体T细胞分泌IFN-γ取复苏后的HBV特异性DC疫苗2×104的量与T细胞按1∶12.5的比例(T细胞数为2.5×105)在ELISpot检测系统的96孔培养板中进行混合培养，以不与DC疫苗混合培养的相同数量的T细胞作为对照，48小时后检测分泌IFN-γ细胞的频率。3次复苏后实验的结果为，经HBV特异性DC疫苗刺激的T细胞分泌IFN-γ细胞的数量分别为35、31和38，而不经DC疫苗刺激的T细胞分泌IFN-γ细胞的数量分别为11、9和10。说明HBV特异性DC疫苗可诱导分泌IFN-γ的细胞产生，从而增强对病毒的抑制作用。
实施例2注射剂的制备取实施例1步骤7或9得到的疫苗按以下配方溶解在注射用水中，按照常规技术制备成注射液。
疫苗 1×107氯化钾 0.04mg磷酸二氢钾 0.04mg氯化钠 1.6mg磷酸氢二钠.7H2O0.432mg用蒸馏水配制成终体积为200μl注射液。
权利要求
1.一种HBV特异性DC疫苗，其特征在于，所述疫苗是用HBsAg和HBcAg负载单核细胞来源的树突状细胞，使该树突状细胞负载抗原并培养成熟后得到的。
2.权利要求1的疫苗，其特征在于，所述致敏的单核细胞来源的树突状细胞是用HBsAg和HBcAg共同负载未成熟的moDC。
3.权利要求2的疫苗，其特征在于，所述负载未成熟的moDC是在未成熟的moDC细胞液中加入5～100μg/ml的浓度的HBsAg和HBcAg，共同孵育。
4.权利要求3的疫苗，其特征在于，所述共同孵育时间为12～48小时。
5.权利要求4的疫苗，其特征在于，共同孵育后得到的成熟的致敏的树突状细胞即权利要求1的疫苗。
6.含有权利要求5的疫苗的疫苗制剂。
7.权利要求6的疫苗制剂是注射剂。
8.权利要求7的疫苗的制备方法，其特征在于，经过用HBsAg和HBcAg共同负载未成熟的moDC的步骤。
9.权利要求8的制备方法，其特征在于，经过以下步骤1)HBsAg和HBcAg的获得HBsAg来源于重组乙肝疫苗不加免疫佐剂的半成品，HBcAg来源于本室构建的携带HBcAg全基因序列的质粒PMM2066，在大肠杆菌中表达后分离纯化而得；2)0天PBMC的分离取外周抗凝血50～100ml，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用预冷的PBS稀释成15～20ml，分置于2个灭菌10ml离心管中，离心10分钟，离心两次以去除细胞碎片和血小板，吸弃上清；将去除细胞碎片和血小板的PBMC用PBS稀释；在2个灭菌的离心管中加入预先恢复至室温的淋巴细胞分离液，将稀释后的PBMC沿管壁轻轻加在淋巴细胞分离液液面上使形成界面，淋巴细胞分离液与稀释PBMC的体积比为4∶6；离心20分钟，由上至下分出稀释液、PBMC带、淋巴细胞分离液和红细胞四条带；收集界面单个核细胞于离心管中，用PBS稀释至10～20ml，分别以1200rpm/10分钟离心洗涤细胞2～3次；镜下观察细胞状态，如果细胞碎片和血小板较多，1200rpm/8分钟再洗一次；将细胞合并到一个10ml离心管，以无血清AIM-V培养液悬浮细胞，计数细胞浓度，用台盼蓝染色测定细胞存活比例，计算存活细胞总数，做好记录；调整细胞浓度至2～5×106/ml，铺于6孔板中，每孔2～3ml，37℃、5％的CO2孵箱中温育1～2小时，使单核细胞贴壁；3)0天DC培养当孵育结束时，首先用培养皿中的液体冲洗贴壁细胞，吸出上层未贴壁细胞，加入预热的培养基，再冲洗2次，以去除未贴壁细胞和大部分的贴壁的淋巴细胞；未洗尽的淋巴细胞比单核细胞小而圆亮；拍照记录；置37℃、5％的CO2温箱中培养3天；未贴壁细胞约占PBMC的50～80％，用含10％小牛血清的RPMA1640培养基调整细胞浓度为1～3×106/ml，加入维持剂量的IL-2，于一洁净培养瓶中培养，每3天半量换液，并根据细胞状况随时调整培养基量，补加细胞因子，即为自体T淋巴细胞，待后续实验用；贴壁细胞数量＝总PBMC-总未贴壁细胞数，记录；冲洗时，用吸管上下吹吸几次，轻轻振荡培养皿；接着面向操作者倾斜培养皿，吸尽培养基；当吸下面的液体时，滴管头悬在液体中，沿培养皿四周边移动滴管边吸，不要用吸管刮培养皿的底面；按此法，吸出每个培养皿内的液体；整个操作过程要迅速，以免细胞在洗涤过程中缺水干死；加入预热的AIM-V培养基，内含GM-CSF、IL-4；倒置显微镜下观察贴壁的单核细胞，按照细胞状态进行评分，由最差到最好划分标准并评分0～5分；观察的指标包括细胞密度、细胞碎片、悬浮细胞的数量、大细胞的数量和树枝状突起的状态；4)3天半量换液倒置显微镜下观察细胞，按照细胞状态进行评分，由最差到最好划分标准并评分0～5分；观察的指标包括细胞密度、细胞碎片、悬浮细胞的数量、大细胞的数量和树枝状突起的状态；拍照记录；收集每孔细胞于一个离心管中，及时在每孔中添加预热的AIM-V培养液，以免贴壁细胞缺水干死；收集的细胞1200rpm/10分钟离心，吸弃一半上层的旧培养液，补加入等量新鲜的含GM-CSF、IL-4的AIM-V培养液；置37℃、5％的CO2温箱中培养；5)5天半量换液倒置显微镜下观察细胞，按照细胞状态进行评分，由最差到最好划分标准并评分0～5分；观察的指标包括细胞密度、细胞碎片、悬浮细胞的数量、大细胞的数量和树枝状突起的状态；拍照记录；收集每孔的悬浮细胞，取出10μl细胞悬液用台盼蓝染色，测定DC细胞存活比例，细胞计数；计算出第5天存活的DC细胞占第0天收集贴壁细胞总数的比例，记录；半量换液，操作如3天半量换液；换液的细胞因子浓度减半；置37℃、5％的CO2温箱中培养；6)6天收集未成熟DC和抗原负载倒置显微镜下观察细胞，按照细胞状态进行评分，包括细胞密度、细胞碎片、悬浮细胞的数量、大细胞的数量和树枝状突起的状态；拍照记录；然后吸取2～5×105细胞悬液，离心，搜集上清，留-20℃冰箱备测细胞因子IL-10、IL-12等，因子浓度可换算成/24小时/10000细胞，以利于比较；细胞用于流式细胞仪检测细胞iDC表型，iDC纯度通过光散射角G1门中的％加DC标志CD11c染色决定；吸取iDC培养液100μl作无菌试验；孔内加入HBV抗原按5～100μg/ml的浓度加入HBsAg和HBcAg，置37℃、5％的CO2温箱中培养4～6小时；7)7天成熟的HBV特异性DC疫苗的收获倒置显微镜下观察各组细胞，按照细胞状态进行评分，包括细胞密度、细胞碎片、悬浮细胞的数量、大细胞的数量和树枝状突起的状态；拍照记录；取出10μl细胞悬液用台盼蓝染色，测定细胞存活比例，细胞计数；计算出第7天存活细胞分别占第0天收集的PBMC总数和贴壁细胞的比例，记录；分别取对照组和抗原组1～5×105细胞悬液，离心，搜集上清，留-20℃冰箱；细胞用于流式细胞仪检测细胞mDC表型，mDC纯度通过光散射角G1门中的％加DC标志CD11c染色决定；细菌和真菌培养阴性、支原体、LPS检验阴性的HBcAg和HBsAg共同负载的成熟mDC即为HBV特异性DC疫苗；病人注射剂量为1～2×107/次，前臂皮下或淋巴结内注射；8)HBV特异性DC疫苗的冻存收集成熟的DC疫苗冻存，以备1周、2周、4周后加强免疫；按5×106/ml加入冻存液，冻存管放入预冷的乙醇中，首先置于-20℃2～4小时，-80℃24小时，再置于液氮中冻存；9)冻存的HBV特异性DC疫苗的复苏分别在冻存后的1周、2周、4周将冻存的mDC解冻复苏；冻存管由液氮中取出后直接放入37℃水浴中；一旦细胞悬液融化后马上加入AIM-V进行稀释；稀释液应逐滴加入，并且轻轻地摇动冻存管，使DMSO从mDC中释放出来；否则，太快加入稀释液，mDC细胞内的DMSO由于其渗透压会使水分很快渗入细胞，使mDC细胞肿涨裂解而死亡；用AIM-V培养基洗涤3次，取出10μl细胞悬液用台盼蓝染色，测定细胞存活比例，细胞计数；计算存活细胞在冻存细胞中比例，记录；吸取各组解冻的mDC 100ul作无菌试验；分别用解冻细胞进行①流式细胞仪测mDC表型；②mDC介导HBV特异性CD8+T淋巴细胞的产生；③混合淋巴细胞反应；④mDC介导自体T细胞分泌IFN-γ等实验。
10.权利要求9的疫苗在制备用于诱导机体产生针对HBsAg和HBcAg的特异性免疫反应的疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种HBsAg和HBcAg共负载的乙肝特异性DC疫苗，该疫苗是用重组乙型肝炎病毒表面抗原和重组乙肝病毒核心抗原同时负载单核细胞来源的树突状细胞，使该树突状细胞得以负载抗原而成熟从而制成的HBV特异性DC疫苗。
文档编号A61P31/00GK1981866SQ200610078028
公开日2007年6月20日 申请日期2006年4月30日 优先权日2006年4月30日
发明者王福生, 施明, 金磊, 陈威巍 申请人:解放军三○二医院生物治疗研究中心