专利名称：从羊胚胎中提取活化小分子羊胎素的方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，该技术应用于制备和生产活化小分子羊胎素，以此为原料可生产外用美容产品。
背景技术：
羊胎素是通过生物技术，从羊胎盘中提取活细胞MIENS，百分之百的保持胚胎的活性物质。羊胎素中含有丰富的卵磷脂、脑磷脂(脑细胞营养素)、脂多糖、多种维生素和人体必需的常量、微量元素、多种免疫球蛋白、多种抗体、干扰素、胸腺肽(维持细胞免疫功能、抗衰老)、活性肽、表皮生长因子(维持皮肤弹性)，类胰岛素生长因子，血小板衍生因子(消除造血障碍)、转换生长因子、白细胞元素及抗癌物质。并含有体液因子(调节人体内分泌的)、多种活性酶(改善消化系统功能，促进营养的转化、分解和吸收)、歧化酶SOD(消除使细胞衰老的氧自由基，将过氧化物还原，防止黑色素沉积，减轻对细胞的损伤)。此外羊羔的胆汁也具有极强的抗氧化性能，能够消除黄褐斑防止皮肤粗糙。
八十年代末，在瑞士卡洛林教授在日本科学家的成果基础上，率先开发出羊胎素针剂，它的问世，在医学美容营养界引起了全球性的轰动，展示了羊胎素神奇的抗衰老、促进皮肤细胞的分化更新、改善皮肤细胞的微循环、舒缓皱纹、调节内分泌、减退各种色斑、改善睡眠质量和免疫调节，具有全面恢复身体肌能的功能。羊胎素被国际医学界一致公认为划时代的美容和强身的保健极品。
但是，羊胎素的这些作用必须在一定的条件下才能发挥作用。其一是充分被人体吸收，并不破坏其成份；其二是羊胎素必须得到活化。因此国外效果较好的羊胎素产品都是针剂。但针剂注射的风险较大，对新产品的要求也很高。
本发明的关键是创建了提取活化小分子羊胎素的方法，并将此活化小分子羊胎素外用，能被人皮肤吸收，起到美容作用。从而既降低了羊胎素的使用风险，又获得了祛皱、美化人皮肤的效果。
发明内容
本发明目的在于发明一种可外用的、具有美容功效的从羊胚胎中提取活化小分子羊胎素的方法。
本发明包括以下步骤1)将去除肠胃肠的40～90日龄新鲜羊胚胎切碎后，加蒸馏水，制成匀浆；2)将匀浆在-20℃条件下反复冻融，调pH值为3.0～3.5，过滤，再调滤液pH值为7.0；3)将滤液加热至70±1℃，保温30±2分钟后，在离心力为8000g的条件下离心30±2分钟，分别取得滤过液A及沉淀物A；4)将滤过液A超滤，所述超滤条件是pH值为7.0、流速20～40ml/min，取透明淡黄色滤过液B和沉淀物B；5)将沉淀物A及沉淀物B合并，调pH至2.0，加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶浓度为5g/L，在37±2℃条件下保温4～6小时；6)再调pH至7.0，在100±2℃条件下保温2～3分钟，过滤，取滤过液C；7)将滤过液B和滤过液C合并，即为活化小分子羊胎素。
本发明的创新性及优越性表现在1、小分子羊胎素的提取采用低温反复冻融和超滤提取，取得滤过液B，即分子量控制在3000～6000之间的羊胎素，在这一分子量范围，大部分为小分子肽及细胞因子成份。其特点是减少了过敏等副作用，并提高了皮肤吸收率。
2、70±1℃加温处理，对活化羊胎素起到了较好的作用。经动物试验和检测确定其活化是有效的。
3、小分子活化羊胎素可以直接作用于人皮肤，并起到美容祛皱的作用。
4、胃蛋白酶消化羊胚胎中大分子物质，不仅增加了小分子肽，而且提高了包括氨基酸等生物活性物质的含量。
本发明的第二个目的是为活化小分子羊胎素提供实用的用途。
将以上方法制得的活化小分子羊胎素用于制备外用祛除皱纹、美化皮肤用品。
用于制备冻干粉。可将活化小分子羊胎素与海澡溏、甘露醇混合，分装于容器中，冻干；其中，活化小分子羊胎素、海澡溏、甘露醇的质量比是1～2∶4∶4。
用于制备面膜纸。可将活化小分子羊胎素灭菌处理后，加芳香剂，吸附于面膜纸。
用于制备眼贴。可将活化小分子羊胎素灭菌后，加芳香剂，吸附于眼贴纸。
用于制备美容液。可将活化小分子羊胎素灭菌处理后分装。
通过小鼠实验，SOD检测、白细胞介素-2(IL-2)、端粒酶检测、T细胞亚群测试以及美容院试用，证明通过本方法提取的活化小分子羊胎素用于人面部等皮肤，具有祛除皮肤细小皱纹、增加皮肤光泽的作用，由此原料制作的羊胎素冻干粉、面膜、眼帖、精华素，可用于日常皮肤美容。
具体实施例方式
一、按以下步骤制备活化小分子羊胎素1、取40～90日龄新鲜山羊胚胎，去除肠胃肠，洗净。
2、剪或切碎。
3、加蒸馏水，搅拌，制成匀浆。
4、将匀浆在-20℃条件下-20℃反复冻融3次，调pH值为3.0-3.5，过滤，再调滤液的pH值为7.0。
5、将滤液加热至70±1℃，保温30±2分钟后，在离心力为8000g的条件下离心30±2分钟，分别取得滤过液A及沉淀物A；6、将滤过液A超滤，所述超滤条件是pH 7.0，流速20-40ml/min。超滤后上清液应为透明淡黄色，取滤过液B和沉淀物B。
7、将沉淀物A及沉淀物B合并，调pH至2.0，加入胃蛋白酶，在37±2℃条件下保温4～6小时；加入的胃蛋白酶浓度为5g/L。
8、再调pH至7.0，在100±2℃条件下保温2～3分钟，过滤，取滤过液C。
9、将滤过液B和滤过液C合并，即为活化小分子羊胎素。
二、成份分析及活性检测活化小分子羊胎素进行CurrentChromatogram测定、动物试验活性检测(T细胞免疫、体液免疫、胸腺增重、自由基SOD、端粒酶含量检测。
1、成份分析Current Chromatogram测定结果为主要成份分子量为3500，总的分子量在3000～6000之间；总蛋白含量1克/升；可见7个峰，其中含多种氨基酸及其它生物活性成份，包括白细胞介素、生长激素、SOD、EGF。
2、小鼠活体试验羊胎素生物活性活化小分子羊胎素动物实验结果BALB/c小鼠80只，分成8组，样品因浓度不够，不冻干。
羊胎0.8mg/ml编号 A10.8mg/ml0.4mg/ml A20.4mg/ml0.2mg/ml A30.3mg/ml胎盘0.8mg/ml B10.8mg/ml0.4mg/ml B20.4mg/ml0.2mg/ml B30.2mg/ml新生羊 0.4mg/ml C 0.4mg/ml对照生理盐水 0.1mg/ml以上溶液按体重，每10G注射0.1mg/ml连续腹腔注射10天，实验组动物胃口欠佳，体重下降，停药4天后，改为隔日注射，小鼠恢复正常，第16天取血进行各项检查，结果见下页。
表1自由基检测结果
自由基检测结果表明活化小分子羊胎素可明显提高SOD、EGF，表明有促进表皮生长；抗氧化作用。
表2抗体及白介素检测
抗体及白介素检测结果表明活化小分子羊胎素具有调节免疫机能及增强抵抗力作用。
表3T细胞亚群
T细胞亚群试验结果表明活化小分子羊胎素有提高免疫力作用。
表4小鼠的体重变化
小鼠体重试验结果表明活化小分子羊胎素对小鼠体重无明显变化。
三、应用1、制备冻干粉。
将活化小分子羊胎素与海澡溏、甘露醇混合，分装于容器中，冻干；其中，活化小分子羊胎素、海澡溏、甘露醇的质量比是1～2∶4∶4。
洗净脸后使用，将冻干粉敷于面部有皱纹、色斑的脸上，每日两次，经7～10日后观察，有明显皱纹减少、皮肤光洁的现象。
2、制备面膜纸或眼贴。
将活化小分子羊胎素灭菌处理后，加芳香剂，吸附于面膜纸或眼贴纸。
将面膜纸每周一次贴在洗净的脸上，待干后去除。经四次使用，有明显皱纹减轻和皮肤光洁的效果。
将眼贴纸每日一次贴在洗净的眼部，待干后去除。连续一周，有明显减轻眼部细小皱纹的效果。
3、制备美容液。
将活化小分子羊胎素灭菌处理后分装。
洗净脸后使用，将美容液敷于面部有皱纹、色斑的脸上，每日两次，经7～10日后观察，有明显淡化皱纹、增加光泽的效果。
权利要求
1.从羊胚胎中提取活化小分子羊胎素的方法，其特征在于包括以下步骤1)将去除肠胃肠的40～90日龄新鲜羊胚胎切碎后，加蒸馏水，制成匀浆；2)将匀浆在-20℃条件下反复冻融，调pH值为3.0～3.5，过滤，再调滤液pH值为7.0；3)将滤液加热至70±1℃，保温30±2分钟后，在离心力为8000g的条件下离心30±2分钟，分别取得滤过液A及沉淀物A；4)将滤过液A超滤，所述超滤条件是pH值为7.0、流速20～40ml/min，取透明淡黄色滤过液B和沉淀物B；5)将沉淀物A及沉淀物B合并，调pH至2.0，加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶浓度为5g/L，在37±2℃条件下保温4～6小时；6)再调pH至7.0，在100±2℃条件下保温2～3分钟，过滤，取滤过液C；7)将滤过液B和滤过液C合并，即为活化小分子羊胎素。
2.一种如权利要求1所述方法制得的活化小分子羊胎素的用途，其特征在于用于制备外用祛除皱纹、美化皮肤用品。
3.根据权利要求2所述活化小分子羊胎素的用途，其特征在于用于制备冻干粉。
4.根据权利要求3所述活化小分子羊胎素的用途，其特征在于将活化小分子羊胎素与海澡溏、甘露醇混合，分装于容器中，冻干；其中，活化小分子羊胎素∶海澡溏∶甘露醇的质量比是1～2∶4∶4。
5.根据权利要求2所述活化小分子羊胎素的用途，其特征在于用于制备面膜纸。
6.根据权利要求5所述活化小分子羊胎素的用途，其特征在于将活化小分子羊胎素灭菌后，加芳香剂，吸附于面膜纸。
7.根据权利要求2所述活化小分子羊胎素的用途，其特征在于用于制备眼贴。
8.根据权利要求7所述活化小分子羊胎素的用途，其特征在于将活化小分子羊胎素灭菌后，加芳香剂，吸附于眼贴纸。
9.根据权利要求2所述活化小分子羊胎素的用途，其特征在于用于制备美容液。
10.根据权利要求2所述活化小分子羊胎素的用途，其特征在于将活化小分子羊胎素灭菌处理后分装。
全文摘要
从羊胚胎中提取活化小分子羊胎素的方法及其用途，属生物工程技术领域，将去除肠胃肠的40～90日龄新鲜羊胚胎切碎后，加蒸馏水，制成匀浆，在－20℃条件下反复冻融，过滤，将滤液加热后，分别取得滤过液A及沉淀物A；将滤过液A超滤，取透明淡黄色滤过液B和沉淀物B；将沉淀物A及沉淀物B合并，调pH至2.0，加入胃蛋白酶，再调pH至7.0，在100±2℃条件下保温后，取滤过液C；将滤过液B和滤过液C合并，即为活化小分子羊胎素。可用于制备外用祛除皱纹、美化皮肤用品。本发明的羊胎素分子量控制在3000～6000之间，大部分为小分子肽及细胞因子成份，活化性高，减少了过敏等副作用，并提高了皮肤吸收率。
文档编号A61K8/96GK1896268SQ20061008561
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月27日 优先权日2006年6月27日
发明者成勇 申请人:扬州大学