专利名称：淮山药多糖制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及淮山药多糖制备方法及其用途。
背景技术：
山药的最早记录见于《山海经》中，《神农本草经》列薯蓣为上品。除薯蓣之名外，本草中还有诸署、署豫、薯药、署预等名称。在苏颂《图经本草》、唐慎微《证类本草》、李时珍《本草纲目》、吴其浚《植物名实图考》等书中均有记述。自古以来即被国人利用为上品之补虚保健食品，传统名方如六味丸、八味丸、参苓白术散及四神汤中均有山药，历代利用山药组配方剂达三百余方，在中药中占有十分重要的地位，是营养价值很高的药食同源食品。如《饮膳正要》中的山药面，常服可补虚羸，益元气。对健身延年、为极佳的补虚养生品。
淮山药来源于薯蓣科薯蓣属Dioscorea L薯蓣组Sect.Enantiophyllum植物薯蓣Dioscoreaopposita Thunb.、参薯D.alata L.、褐苞薯蓣D.persimilis Prain et Burkill或山薯D.fordii Prain etBurkill的块茎，薯蓣组中多数种类植物的块茎均可食用，且具有相似的营养和药用价值。山药广泛分布于各地，既可食用，又可药用。南北朝刘敬叔的《异苑》云“薯蓣一名山芋，根既可入药又复可食。”古代本草记载已有最佳产地，如《本草经集注》认为南康间(今江西)最大而美；《唐本草》认为蜀道(今四川)者良。《图经本草》认为北都(今山西太原)、四明(今浙江四明山)者最佳。自明朝后渐出现药用山药和食用山药之分，根据《救荒本草》和《植物名实图考》记载，药用山药分布较北。有人认为，产于淮河一带的山药药效最好，就以“淮山药”来专指产于淮河的山药。
山药为历次《中国药典》收载的品种，山药味甘性平，补脾胃之气，又能补胃之阴，用于治疗脾胃虚弱证，如食少、倦怠、便溏、久泻、小儿营养不良、妇女脾虚带下等，常与人参(或党参)白术配伍使用，如名方参苓白术散。山药能补益肺，肾，用于肺肾阴虚病证。如肺虚久咳，或肺肾两虚久咳久喘，常配麦冬、五味子等同用。山药治疗肾虚遗精，尿频等病，常与熟地黄、山萸肉、菟丝子等同用。山药治疗消渴症(糖尿病)可以单独大剂量水煎代茶饮，也可配知母，天花粉、地黄等同用，鲜山药捣烂外敷可消散结核、初起痈肿。白术和山药都可以补脾健脾，但白术性燥，山药性润。湿困中焦，白术适宜；肺肾阴亏，则山药最宜。淮山药产量巨大，目前基本上都是作为原料药材或食品使用，没有深加工产品，附加值低。本发明用淮山药为原料，经加工制备方法提得多糖，进一步提高了淮山药产品质量及附加值。
发明内容
本发明所用淮山药，系指淮河流域人工栽培的淮山药Dioscorea opposita L.。
本发明的目的是提供一种淮山药多糖制备方法。
本发明的目的可以通过以下措施来达到一种提取淮山药多糖的方法，其特征为采用热水浸提，提取工艺条件为浸提温度70-90℃，浸提时间4-10h，淮山药干原料与加水量的重量比为1∶30-1∶100。
本发明的另一目的是提供一种淮山药多糖在治疗降血糖、糖尿病药中以及在提高机体免疫力、抗衰老和抗氧化药中的应用。
本发明淮山药多糖制备方法的特征是将新鲜的淮山药块茎轻轻刮去表面的泥土，削去表皮，横切成约2～3mm薄片，迅速置于日光下晾干，以防淮山药褐化；将晾干的淮山药片粉碎，装密封袋置于干燥皿中备用。按每克干重加30-100倍的蒸馏水量，于70-90℃沸水浴浸提4-10h。提取液过滤，将滤液于3000r·min-1离心5min，取上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品，水复溶、醇析，过滤，无水醇洗涤得到总多糖。经ICR种小鼠动物进行降糖实验，ICR种小鼠淋巴细胞增殖能力的作用的实验，增强小鼠碳廓清能力的作用的实验，致衰老模型小鼠血清和脑中SOD活力和MDA含量的实验表明，本发明得到的总多糖可作为降血糖、提高机体体液免疫和细胞免疫力、抗氧化、抗衰老的健康食品。淮山药产量巨大，由于相关研究基础不足，基本上都是作为药材或食品使用，没有深加工产品，附加值低。
本发明的有益效果是本发明利用的植物原料来源广泛，又兼为药食两用品种，安全性好，生产工艺简便高效，保健和辅助治疗效果确切。是进一步提高淮山药产品及附加值的有效途径。
具体实施例方式
实施例1将新鲜的淮山药块茎并轻轻刮去表面的泥土，削去表皮，横切成约2-3mm薄片，迅速置于日光下晾干，以防淮山药褐化；将晾干的淮山药片100克粉碎，装密封袋置于干燥皿中备用。按每克干重加3000克的蒸馏水量，于70℃沸水浴浸提4h。提取液过滤，将滤液于3000r·min-1离心5min，取上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品，水复溶、醇析，过滤，无水醇洗涤得到总多糖。
接种后随机分为5组，每组10只，分别为肿瘤模型对照组、15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg试验组、5-fu阳性对照组，另加阴性对照组，共6组。接种瘤细胞24h后，试验组腹腔注射annonareticin，剂量分别为15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg试验组，阴性对照组和肿瘤模型对照组等体积注射药物溶媒，5-FU对照组以生理盐水为溶剂，剂量为10mg/kg，各组动物均按0.2ml在腹腔注射，连续给药8d。末次给药后次日，进行如下观察①完整剥离瘤块，并称重计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率＝(对照组肿瘤重量-治疗组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量×100％；②组织学检查将肿瘤组织用4％甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色后用光镜检查，并切取上述各组大鼠肿瘤组织，经4％戊二醛及1％四氧化锇预固定和后固定后，酒精及丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，作0.5μm厚薄切片，醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，透射电镜观察。
3、实验结果番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)对小鼠移植性肿瘤Heps的生长抑制作用不同剂量的annonareticin均能显著抑制小鼠肿瘤的生长(P＜0.01)。番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)的剂量极小，其抗癌活性是化疗药5-氟脲嘧啶(5-FU)的百倍以上，见表3。
表3 annonareticin对小鼠移植性肝癌Heps作用结果
肿瘤组织细胞超微结构的透射电镜观察结果内酯单体化合物用药组小鼠的肿瘤细胞，电镜下可见较为典型的凋亡细胞形态学改变，如胞体缩小细胞质密度增高，核固缩，细胞核内染色质浓缩并聚集成块，有边集现象，并可见到类圆形的凋亡小体，核碎裂，线粒体空泡样变等；5-Fu化疗对照组则主要表现为细胞坏死，凋亡少见。
小鼠随机分为对照组(给予蒸馏水)及山药多糖200mg/kg.、400mg/kg和800mg/kg 3个剂量组，每组10只。灌胃体积0.1ml/10g bw，1次/d，连续8d。
1640培养液用微孔滤膜过滤除菌，加入10％小牛血清、1％谷氨酰胺(200/ml)、青霉素(100/ml)、链霉素(100L/ml)及2-巯基乙醇(5μmol/ml)，用无菌HCl(1mol/L)或无菌NaOH(1mol/L)调PH至7.0～7.2，制成完全培养液；用7.2～7.4的PBS缓冲液作溶剂，现用现配MTT溶液(5mg/ml)；以3.5％的无菌NaHCO3将无菌Hanks液PH调至7.2～7.4；用双蒸水配制成100μg/ml的ConA液，过滤除菌后，-20℃保存；在96ml异丙醇中加入4ml HCl(1mol/L)制成酸性异丙醇溶液。各组动物连续灌胃至第8d，每鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液，200目过滤，用Hanks液多次洗涤、离心后悬浮于2ml完全培养液中，用台酚兰染色记数活细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml，分两孔放入培养孔中，每孔1ml，一孔加50μl Con A液，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃培养72hr，培养结束前4hr，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的1640培养液，同时加入50μl MTT液，继续培养4h。培养结束，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，移入1ml比色杯中，于分光光度计，570nm处测定光密度。
*P＜0.05*p＜0.01 与正常对照组比较以上结果表明淮山药粗多糖400、800mg/kg·bg/d剂量时，具有增强小鼠淋巴细胞增殖能力的作用。
实施例3将新鲜的淮山药块茎并轻轻刮去表面的泥土，削去表皮，横切成约2-3mm薄片，迅速置于日光下晾干，以防淮山药褐化；将晾干的淮山药片150克粉碎，装密封袋置于干燥皿中备用。按每克干重加7500克的蒸馏水量，于80℃沸水浴浸提6h。提取液过滤，将滤液于3000r·min-1离心5min，取上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品。
淮山药粗多糖，用蒸馏水配制成混悬液。
各组动物连续灌胃至3d时，每鼠腹腔注射2％(v/v)绵羊红细胞悬液0.2mL。5d(期间不停止灌胃)后，小鼠经眼眶取血于离心管中，放置1h，3500r/min离心15min，收集血清，血清用生理盐水缓冲液稀释320倍。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(v/v)SRBC量(0.8，1.6，3.2g/kg体重)组，每组10只。灌胃给药，1次/天，连续4天。第4天给药后，将0.6％醋酸注射入小鼠腹腔内，出现扭体反应。以15min内小鼠扭体次数为疼痛定量指标。按下式计算药物对扭体反应的抑制百分率，评判药物镇痛效果
试验结果见表二。
表二 本发明药物对小鼠醋酸化学刺激痛的影响(X±S)
与对比组比较*p＜0.05，**p＜0.01实验结果用PEMS(《中国医学百科全书医学统计学》)统计软件包的方差分析方法进行处理。
以上结果显示与生理盐水对照组比较，阳性对照阿司匹林组的扭体次数明显减少，p＜0.01；与生理盐水对照组比较，本发明药物各剂量组的扭体次数明显减少，p＜0.01。
结果表明，本发明药物对醋酸化学刺激痛有明显疗效。与热板法相比较，本发明药物对扭体法的效果更为显著，提示本发明药物对化学性因素所至疼痛更为有效。
1.2本发明药物的抗炎作用1.2.1本发明药物对二硝基氟苯所致小鼠迟发型超敏反应的影响取50只体重20～22g的雌性ICR小鼠随机分成5组，即阴性对照组(生理盐水)，阳性对照组(醋酸泼尼松龙，剂量0.1g/kg)和本发明药物低、中、高剂量(0.8，1.6，3.2g/kg体重)组，每组10只。小鼠腹部去毛(3×3cm)，用1％DNFB丙酮麻油溶液(DNFB50mg加5ml丙酮麻油液。丙酮与麻油的比例为1∶1)均匀涂抹腹部致敏。致敏后灌胃给约，1次/天，连续6天。在
**P＜0.01与正常对照组比较淮山药粗多糖具有增强小鼠碳廓清能力的作用。
实例4证明本发明所得淮山药总多糖可用于提高机体免疫力。
实施例5将新鲜的淮山药块茎并轻轻刮去表面的泥土，削去表皮，横切成约2-3mm薄片，迅速置于日光下晾干，以防淮山药褐化；将晾干的淮山药片200克粉碎，装密封袋置于干燥皿中备用。按每克干重加16000克的蒸馏水量，于85℃沸水浴浸提9h。提取液过滤，将滤液于3000r·min-1离心5min，取上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品。
淮山药粗多糖，用蒸馏水配制成混悬液。
ICR种小鼠18-22g，雄性。
ICR小鼠根据体重随机分组，每组10只，共分成以下5组正常对照组、模型组、阳性对照组(绞股兰总皂苷100mg/kg)、山药多糖低剂量组(100mg/kg)和高剂量组(200mg/kg)。其中正常对照组每天颈背部皮下注射生理盐水0.1ml/10g，其余各组每天颈背部皮下注射D-半乳糖200mg/kg。皮下注射同时各给药组每天按0.1ml/10g灌胃给予不同药物，模型组、正常组每天灌胃给予等量生理盐水。在实验过程中每周各鼠称重记录一次，观察外观形态。第30天时灌胃两个小时后，小鼠眼眶取血，3500r/min离心15min，取上层血清备用，处死小鼠，取脑组织。按试剂盒方法测定血与脑组织中MDA、SOD。
血清中的MDA与SOD含量
**P＜0.01*P＜0.05 VS MOD脑组织中的MDA与SOD含量
ΔΔP＜0.01 VS Nor，**P＜0.01*P＜0.05VS MOD淮山药多糖能显著增高D-半乳糖致衰老模型小鼠血清和脑中SOD活力，降低MDA含量，具有抗氧化、抗衰老作用。
权利要求
1.一种提取淮山药多糖的方法，其特征为采用热水浸提，提取工艺条件为浸提温度70-90℃，浸提时间4-10h，淮山药干原料与加水量的重量比为1∶30-1∶100。
2.如权利要求1所述方法提取的淮山药总多糖，其组成为D-半乳糖、D-甘露糖、葡萄糖、D-阿拉伯糖组成的杂多糖，分子量为45970Dal～45990Dal。
3.如权利要求1所述淮山药多糖，其制剂在治疗降血糖、糖尿病药中的应用。
4.如权利要求1所述淮山药多糖，其制剂在提高机体免疫力、抗衰老和抗氧化药中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种采用淮山药为原料提得总多糖的制备方法及其用途。其特征是将淮山药除去表皮后切片晾干，按每克淮山药干重加30－100倍水，沸水浴浸提4－10h。提取液过滤，滤液离心，上清液加入多量乙醇静置，醇析。析出沉淀离心，得多糖粗品，水复溶、醇析，过滤，无水醇洗涤得到总多糖。其制剂可作为降血糖、提高机体体液免疫和细胞免疫力、抗氧化、抗衰老的健康食品。淮山药产量巨大，目前基本上都是作为食品使用，没有深加工产品，附加值低。本发明利用的植物原料来源广泛，又兼为药食两用品种，安全性好，生产工艺简便高效，保健和辅助治疗效果确切。是进一步提高淮山药产品质量及附加值的有效途径。
文档编号A61P3/10GK1861637SQ20061008551
公开日2006年11月15日 申请日期2006年6月20日 优先权日2006年6月20日
发明者徐增莱, 汪琼, 蔡学海, 孙义高, 史云云 申请人:江苏省中国科学院植物研究所