专利名称：一种内酯单体化合物及其在制备治疗抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗癌药物，具体地说是以番荔枝种子为原料提取的一种番荔枝内酯单体化合物及其在制备治疗抗癌药物中的应用。
背景技术：
癌症是危害人类健康的大敌。我国每年新发癌症病例约有160万人，每年死于癌症的约有130万人，全国因癌症而死亡的人数逐年上升，我国为肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌症的高发区域，癌症死亡率居高不下。
目前尚无有效的药物治愈大多数癌症患者。化疗药物对癌症虽有一定疗效，但毒副作用大，中成药对癌症的疗效普遍较低，如参莲胶曩对肺、胃癌的癌灶缓解率仅为3.5％，疗效均不理想。
本发明人研究了番荔枝(Annona squamosa Linn)的树皮、枝叶、种子的抗癌有效物质和化学成分，从中提取出多种抗癌单体化合物(活性成分)，经抗癌实验研究表明，对人肝癌细胞、人胃癌细胞、人食管癌细胞和动物移植性肿瘤(如S180、H22和Heps)均有显著的体外和体内抗癌治疗效果，并已申请获得3项抗癌产品发明专利证书(专利号分别为ZL02148474.0、ZL02148475.9、ZL03112707.X)。在上述研究的基础上，本发明人继续提取分离、筛选番荔枝(Annona squamosa Linn)种子的抗癌有效化学成分，从中又发现了4种内酯单体成分具有特别显著抗癌活性的抗癌用途(其抗癌活性数倍高于化疗药5-氟脲嘧啶)。
发明内容
1、发明目的本发明的目的是提供一种抗癌活性高、抗癌谱广的抗癌单体化合物，具体地说是以番荔枝种子为原料提取的一种番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)在制备抗癌药物方面的应用。
2、技术方案本发明从番荔枝(Annona squamosa Linn)种子提取分离到一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物(经资料查阅目前还没有文献报道该化合物有抗癌活性)，其特征是白色粉末状物质，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿等有机溶剂。其鉴定为expoxyrolin B，分子式为C36H66O3，化学结构式如下
一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，它是从番荔枝种子中提取得到的抗癌单体化合物。其制备方法是番荔枝种子风干后，粉碎成粗粉，先用10倍量石油醚冷浸提取3次(室温)，每次2天；回收石油醚得红色油状液体，室温放置，底部有大量白色沉淀析出，过滤出白色沉淀，白色沉淀经多次硅胶柱层析；用石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，得到一种番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)。经体内外抗癌药理实验，其对人肝癌细胞、小鼠移植性肝癌的生长有明显的抑制作用，其抗癌活性数倍高于化疗药5-氟脲嘧啶。
本发明涉及一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)在制备抗癌药物中的应用。
采用MTT显色法，取2×104/m1活细胞(人肝癌细胞SMMC-7721或HepG2)接种于96孔板，每孔90ul，设四复孔。待细胞贴壁后分别加入不同浓度的药物10ul，对照孔加入10ulPBS，置37℃、5％CO2条件下培养至预定时间，每孔加浓度为1mg/ml的MTT50ul/孔，继续培养4小时，去全部上清，加DMSO100ul/孔，微型振荡器振荡5min使结晶完全溶解，用酶联仪，于570nm波长处测定吸光度值(OD)，调零孔只含有培养液。细胞活力用加药细胞平均吸光度值/对照细胞平均吸光度值×100％，抑制率(％)＝(1-加药细胞平均吸光度值/对照细胞平均吸光度值)×100％。
结果显示，抗癌药物番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)对人肝癌细胞的抑制活性非常高，其对人肝癌细胞的抑制活性数倍高于化疗药5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
3、有益效果本发明的一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，它是从番荔枝种子中提取得到的抗癌单体化合物。抗癌实验结果显示，抗癌药物番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)对癌中之王——肝癌的抑制活性非常高，其对肝癌的体内抑制活性数倍高于化疗药5-氟脲嘧啶(5-Fu)。这为提高抗癌临床疗效提供了非常有前景的高效预选药物。
具体实施例方式
实施例1一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)提取方法一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，它是从番荔枝种子中提取得到的抗癌单体化合物。其制备方法是番荔枝种子风干后，粉碎成粗粉，先用10倍量石油醚冷浸提取3次(室温)，每次2天；回收石油醚得红色油状液体，室温放置，底部有大量白色沉淀析出，过滤出白色沉淀，白色沉淀经多次硅胶柱层析；用石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，得到一种番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)。
实施例2一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，其特征是白色粉末状物质，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿等有机溶剂。其鉴定为expoxyrolin B，分子式为C36H66O3，化学结构式如下 实施例3一种番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)对人肝癌细胞的抑制作用1、细胞培养SMMC-7721或HepG2细胞株接种于培养瓶中，加入RPMI-1640培养液(含10％小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100ug/ml)，于37℃、5％CO2培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每3～5天传代一次，传代时用0.25％胰酶消化3min，以培养液吹打制成细胞悬液后接种。
2、药物处理取对数生长期的细胞按2×105/ml接种于细胞培养瓶中，待细胞完全贴壁(约4小时)后，再换加含药物的培养液，培养至预定时间。实验药物是经化学结构鉴定的一种番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)；对照药物是5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
2、实验方法采用MTT显色法，取2×104/ml活细胞接种于96孔板，每孔90ul，设四复孔。待细胞贴壁后分别加入不同浓度的药物10ul，对照孔加入10ulPBS，置37℃、5％CO2条件下培养至预定时间，每孔加浓度为1mg/ml的MTT 50ul/孔，继续培养4小时，去全部上清，加DMSO100ul/孔，微型振荡器振荡5min使结晶完全溶解，用酶联仪，于570nm波长处测定吸光度值(OD)，调零孔只含有培养液。细胞活力用加药细胞平均吸光度值/对照细胞平均吸光度值×100％，抑制率(％)＝(1-加药细胞平均吸光度值/对照细胞平均吸光度值)×100％。
3、实验结果结果如表1、表2显示，随着内酯单体化合物(expoxyrolin B)浓度的升高，对人肝癌细胞的抑制率也升高，其对人肝癌细胞的抑制活性数倍高于化疗药5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
表1 expoxyrolin B对SMMC-7721肝癌细胞生长的抑制作用(n＝9)
*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较表2 expoxyrolin B对HepG2肝癌细胞生长的抑制作用(n＝9)
*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较实施例4一种番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)对移植性肝癌的抑制作用1、实验动物和瘤株雄性健康昆明种小鼠体重，18-22g，鼠龄6-8周，来自本校动物实验中心，昆明鼠传代腹水型鼠肝癌Heps瘤株均购自江苏省肿瘤研究所动物实验中心。小鼠在南京中医药大学动物实验中心的动物实验房饲养，温度21～25℃，湿度为45％～55％。
2、造模(移植性肝癌Heps)昆明种雄性小白鼠60只，按比例随机留10只为阴性对照组，其余50只进行造模。无菌抽取接种Heps瘤种8天的小鼠的腹水，以生理盐水稀释10倍，0.02％伊红染色，滴加到细胞计数板上计数后，调细胞浓度至1×107/ml，迅速地分别将50只小鼠右腋皮肤消毒，每鼠接种0.2mlHeps肿瘤细胞悬液于皮下。整个接种过程须在无菌罩内以无菌操作进行，1h内完成接种。
接种后随机分为5组，每组10只，分别为肿瘤模型对照组、15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg试验组、5-fu阳性对照组，另加阴性对照组，共6组。接种瘤细胞24h后，试验组腹腔注射expoxyrolin B，剂量分别为15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg试验组，阴性对照组和肿瘤模型对照组等体积注射药物溶媒，5-FU对照组以生理盐水为溶剂，剂量为10mg/kg，各组动物均按0.2ml在腹腔注射，连续给药8d。末次给药后次日，进行如下观察①完整剥离瘤块，并称重计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率＝(对照组肿瘤重量-治疗组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量×100％；②组织学检查将肿瘤组织用4％甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色后用光镜检查，并切取上述各组大鼠肿瘤组织，经4％戊二醛及1％四氧化锇预固定和后固定后，酒精及丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，作0.5μm厚薄切片，醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，透射电镜观察。
3、实验结果番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)对小鼠移植性肿瘤Heps的生长抑制作用不同剂量的expoxyrolin B均能显著抑制小鼠肿瘤的生长(P＜0.01)。番荔枝内酯单体化合物(expoxyrolin B)的剂量极小，其抗癌活性是化疗药5-氟脲嘧啶(5-FU)的百倍以上，见表3。
表3 expoxyrolin B对小鼠移植性肝癌Heps作用结果
肿瘤组织细胞超微结构的透射电镜观察结果电镜观察是检测细胞凋亡形态的重要手段之一，尤其是透射电镜对细胞超微结构的观察，为鉴定凋亡提供了最直接和客观的证据。番荔枝内酯单体化合物用药组小鼠的肿瘤细胞，电镜下可见较为典型的凋亡细胞形态学改变，如胞体缩小细胞质密度增高，核固缩，细胞核内染色质浓缩并聚集成块，有边集现象，并可见到类圆形的凋亡小体，核碎裂，线粒体空泡样变等；5-Fu化疗对照组则主要表现为细胞坏死，凋亡少见。
权利要求
1.一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，其特征在于该内酯单体化合物鉴定为expoxyrolin B，分子式为C36H66O3，化学结构式如下
2.根据权利要求1所述的番荔枝内酯单体化合物，其特征在于该内酯单体化合物为白色粉末状物质，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿。
3.权利要求1所述的番荔枝内酯单体化合物expoxyrolin B在制备治疗抗癌药物中的应用。
全文摘要
一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，它是从番荔枝种子中提取得到的抗癌内酯单体化合物expoxyrolin B。其制备方法是番荔枝种子风干后，粉碎成粗粉，先用石油醚冷浸提取；回收石油醚得红色油状液体，室温放置，底部有大量白色沉淀析出，过滤出白色沉淀，白色沉淀经多次硅胶柱层析；用石油醚，石油醚－乙酸乙酯，乙酸乙酯－甲醇梯度洗脱，得到一种番荔枝内酯单体化合物。经体内外抗癌药理实验，其对人肝癌细胞、小鼠移植性肝癌的生长有明显的抑制作用，其抗癌活性数倍高于化疗药5－氟脲嘧啶。
文档编号A61P35/00GK1861597SQ20061008544
公开日2006年11月15日 申请日期2006年6月16日 优先权日2006年6月16日
发明者章永红 申请人:南京中医药大学