专利名称：：一种海胆提取物及其制备方法和抗癌应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种海胆提取物，还涉及该提取物的制备方法以及它在抑制癌细胞生长方面的应用。
背景技术：
：海胆始载于《本草原始》，为棘皮动物门(Echinoderniata)海胆纲(Echinoidea)动物。海胆性"咸"，"平"(《中药志》)，"有小毒"(《山东中草药手册》)，"主治心疼"(《本草原始》)，有"软坚散结，化痰消肿，消瘰疬痰核，积痰不化，胸肋涨痛等证"的功效，可用于治疗淋巴结核等症。现代医学证明，它的骨壳，棘刺，生殖腺等部位有良好的药用价值，是开发海洋药物的主要资源。海胆的基本结构由棘刺，骨壳和内脏组成。它的主要成分有色素，毒素，甾醇，脂肪酸，磷脂，各种氨基酸，维生素，激素，大量的钙镁铁钾钠等无机盐。目前还未从海胆中发现有抗癌作用的提取物。
发明内容本发明的目的在于从从棘皮动物门^b^'/70Gfen肪ta游在亚门"e""erozoa海胆纲￡b/i/oiGte3拱齿目Ca忍aroob/ta毒棘海月旦禾斗7b;ro;7"e"5^jVae白棘三歹jJ海胆rriyMet/5"tes^ati^a中分离出对癌细胞有强抑制作用的提取物，另一个目的是提供该提取物的制备方法，进一步的目的是提供该提取物在制备抗癌药物中的应用。本发明从毒棘海胆科7b;ra//7e""J'o!3e白棘三列海胆7r力。/7ei/stesgratj7h中分离得到一种主要含有下述式(1)化合物的提取物，该提取物有中等细胞毒性，对HeLa宫颈癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、H印G2肝癌细胞三种肿瘤细胞株具有较明确的生长抑制作用，从而实现了本发明的目的。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式(1)本发明海胆提取物，其特征是主要含有上述式(1)化合物，并由下述方法制备得到以白棘三列海胆7rj'/wei/stesgra"77a动物为原料，用甲醇或乙醇提取，最好提取3次，甲醇或乙醇提取物用三氯甲垸和水分液，得三氯甲垸层和水层，三氯甲垸层浓縮，再用正己烷和含水甲醇萃取，分别得正己垸层和含水甲醇层，含水甲醇层部位经过ODS反相硅胶快速层析，用体积比90:10的甲醇-水洗脱，收集比移植为0.4的洗脱液，再用0DS反相硅胶快速层析纯化。本发明海胆提取物的制备方法，其特征是包括以下步骤以白棘三列海胆7yi/7/7e""es《ra"Wa动物为原料，用甲醇或乙醇提取，最好提取3次，甲醇或乙醇提取物用三氯甲垸和水分液，得三氯甲垸层和水层，三氯甲垸层浓縮，再用正己垸和含水甲醇萃取，分别得正己垸层和含水甲醇层，含水甲醇层部位经过ODS反相硅胶快速层析，用体积比90:10的甲醇-水洗脱，收集比移植为0.4的洗脱液，再用0DS反相硅胶快速层析纯化。经实验证明本发明海胆提取物有中等细胞毒性，对HeLa宫颈癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、H印G2肝癌细胞三种肿瘤细胞株，其IC5。值均在80ug/mL左右，显示其对癌细胞具有较明确的生长抑制作用，可在治疗癌症尤其是宫颈癌、胃癌、肝癌中应用。具体实施例方式以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。实施例l:本发明海胆提取物的制备取白棘三列海胆7^'/we""esgraf/77a湿重4公斤，用10升甲醇室温提取3次，80克甲醇提取物用5升水悬浮，加入5升三氯甲烷分液，三氯甲垸部分浓縮得浸膏30克，再用3升体积分数90%的甲醇和3升正己烷分液，得90%的甲醇提物12克和正己烷提物13克，90%的甲醇提取物经过ODS反相硅胶快速层析(600克反相硅胶，柱高10cm，柱径10cm,流速20mL/min)，用5升体积比80:IO的甲醇-水洗脱，合并得4.4克，用ODS反相硅胶快速层析(200克反相硅胶，柱高10cm，柱径5cm,流速10mL/min)分离，用1升体积比90:10的甲醇-水洗脱，收集比移植为0.4的洗脱液，再用ODS反相硅胶快速层析纯化，蒸干，得白色固体5mg。由'H和13C隨R谱可以看出该提取物有1个《3.98ppm附近的多重峰指示甾核上的3OH的存在。H-26和H-27的化学位移在復86，0.87，H-26和H-27表现为d峰，偶合常数在6.6Hz,H-6的化学位移在^6.25ppra,H-7的化学位移在<6.51卯m.过氧甾醇的13CNMR的特征为在《66.5ppm附近有SP3杂化的次甲基(C-3);在打9.5ppm(C-8)和《82.2ppm(C-5)附近有两个连氧叔碳信号；C-6和C-7的化学位移经常分别在^135.4ppm(CH)和^130.8ppm(CH)附近。(见表l)。上述鉴定表明该提取物主要含有化学式为5",8o-印idioxycholest-6—en-3P-o1的式(1)表示的化合物，用HPLC测定其纯度为92%。表1实施例1得到的海胆提取物的'H，13c核磁共振数据No.13C5'H5[mult.，/(Hz)]134.7230.1366.53.98(m)437.0582.26135.46.25(d,8.5)7130.86.51(d,8.5)879.5951.11037.01123.41239.41344.71451.61520.61628.31756.41812.60.81(s)1918.20.89(s)2035.22118.60.91(d，6.5)2236.02323.82439.42528.02622.60.86(d,6.6)2722.80.87(d，6.6)实施例2:实施例1得到的海胆提取物体外抗肿瘤实验研究采用HeLa宫颈癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、H印G2肝癌细胞三种肿瘤细胞系；一种正常细胞，即L02人胚胎肝细胞，进行MTT实验。(1)取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，用含10%血清的RPMI1640培养基，调节细胞浓度为1Xl05个/mL，每孔100叱细胞悬液的量加入至96孔细胞培养板，在饱和湿度、37'C、5%0)2培养箱中培养；(2)24h后，吸弃旧培养基，空白组加入100叱5%的RPMI1640培养基，给药组加入不同浓度梯度，即100、10、1、(^g/mL的供试样品，各组均为3个复孔，继续培养48h;(3)在实验结束前4h，每孔加入20PLMTT(四甲基偶氮唑盐，5mg/mL，用PBS缓冲液配置)，继续在5MC02培养箱中培养4h;(4)小心吸弃上清，每孔各加入100HL的二甲基亚砜(DMS0)，振荡600s，酶标仪570nm处测定OD(吸光值)值。抑制率(CI)=(对照组OD训一样品组0D57。)X100M+对照组0D570，用SPSS软件，计算药物的ICs。值。结果见表25。表2实施例1得到的海胆提取物对L02的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3实施例l得到的海胆提取物对HeLa的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表4实施例1得到的海胆提取物对SGC-7901的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表5实施例1得到的海胆提取物对H印G2的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>体外实验表明，样品对三种体外培养的人癌细胞均有一定的增殖抑制作用，对L02的IC5。值为215Pg/inL，对肿瘤细胞的ICs。值为6090Pg/niL，表明在安全剂量范围内，有体外抗肿瘤活性。提示其对上述3种类型的肿瘤细胞株具有较明确的生长抑制作用。权利要求1.一种海胆提取物，其特征是主要含有下述式(1)化合物，并由下述方法制备得到以白棘三列海胆Tripneustesgratilla动物为原料，用甲醇或乙醇提取，甲醇或乙醇提取物用三氯甲烷和水分液，得三氯甲烷层和水层，三氯甲烷层浓缩，再用正己烷和含水甲醇萃取，分别得正己烷层和含水甲醇层，含水甲醇层部位经过ODS反相硅胶快速层析，用体积比90∶10的甲醇-水洗脱，收集比移植为0.4的洗脱液，再用ODS反相硅胶快速层析纯化。式(1)2.权利要求1所述海胆提取物的制备方法，其特征是包括下述步骤以白棘三列海胆Tripenustesgratilla动物为原料，用甲醇或乙醇提取，甲醇或乙醇提取物用三氯甲垸和水分液，得三氯甲垸层和水层，三氯甲垸层浓縮，再用正己烷和含水甲醇萃取，分别得正己烷层和含水甲醇层，含水甲醇层部位经过ODS反相硅胶快速层析，用体积比90:10的甲醇-水洗脱，收集比移植为0.4的洗脱液，再用ODS反相硅胶快速层析纯化。3.权利要求1所述海胆提取物在制备治疗宫颈癌、胃癌和肝癌药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种海胆提取物，其特征是主要含有下述式(1)表示的具有5α，8α-双氧环基团的化合物，并从白棘三列海胆Tripneustesgratilla动物中分离得到。本发明还涉及该提取物的制备方法以及它在治疗癌症中的应用。本发明的提取物经实验证明有中等的细胞毒性，对HeLa宫颈癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、HepG2肝癌细胞细胞株产生抑制，其IC<sub>50</sub>值均在60-90μg/mL左右，显示其对癌细胞具有较明确的生长抑制作用，对正常细胞LO2的IC<sub>50</sub>值为215μg/ml，表明在安全剂量范围内，有抗肿瘤活性。文档编号A61K35/56GK101204401SQ20071003247公开日2008年6月25日申请日期2007年12月14日优先权日2007年12月14日发明者珅任,刘永宏,徐暾海,红阎申请人:中国科学院南海海洋研究所