专利名称：一种小鼠皮肤朗格汉斯细胞缺失模型的构建方法
技术领域：
本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种用于筛选、评价皮肤免疫性疾病药物，研究皮肤免疫缺失机理的动物模型构建方法。
背景技术：
研究表明皮肤在整个免疫系统中的地位非常重要，这对免疫学和皮肤病学都产生了巨大的推动作用。皮肤的免疫性研究在整个免疫系统中的地位也凸现其重要性。
皮肤组织除了已发现的物理屏障作用和生化屏障作用，还具有很强的非特异性免疫和特异性免疫功能。近年来研究表明皮肤是独特的免疫器官，具有独特的免疫功能，1986年BOS提出的皮肤免疫系统(SIS)确立了皮肤在整个免疫系统中的重要地位，对免疫学和皮肤病学都将产生巨大推动作用。皮肤免疫系统包括细胞和蛋白质分子，其中细胞包含朗格汉斯细胞。
皮肤中朗格汉斯细胞可见于表皮与真皮中，属于单核-吞噬细胞系统，小鼠朗格汉斯细胞表达33D1特异性抗原，目前发现其主要功能为递呈抗原作用。在未摄取抗原前处于未活化状态，外源性抗原进入表皮后被朗格汉斯细胞摄取与加工，朗格汉斯细胞随即被活化，开始从表皮迁移至局部引流淋巴结；在淋巴结的T细胞区，朗格汉斯细胞将已经处理的抗原多肽递呈给T细胞并使其激活。朗格汉斯细胞还参与免疫调节(参见文献Meunier L，Bohjanen K，Voorhees JJ，et al.Retinoic acid upregulates human Langerhans cell antigen presentation andsurface expression of HLA-DR and CD 11c，a beta 2 integrin criticallyinvolved in T-cell activation.J Invest Dermatol，1994，103(6)775-9.)、免疫监视(参见文献Udey MC.Langerhans cells on guard in the epidermispoised to dSEARCH and…J Invest Dermatol，2006，126(4)705-7.)、免疫耐受、皮肤移植物排斥反应和接触性变态反应(参见文献Bennett CL，van Rijn E，Jung S，et al.Inducible ablation of mouse Langerhans cellsdiminishes but fails to abrogate contact hypersensitivity.J Cell Biol，2005，169(4)569-76.)等。皮肤中朗格汉斯细胞密度降低可能导致皮肤免疫递呈作用的降低，抑制皮肤免疫系统免疫作用。
丙酸氯倍他索(Clobetasol Propionate Ointment，16β-甲基-11β-羟基-17-(1-氧代丙基)-9-氟-21-氯-孕甾-1，4-二烯-3，20-二酶)是目前临床应用的高效外用皮质类固醇药物(参见文献Khalid M，Mujtaba G，Haroon TS.Comparison of 0.05％clobetasol propionate cream and topicalPuvasol in childhood vitiligo.Int J Dermatol，1995，34(3)203-5.和AustadJ，Bjerke JR，Gjertsen BT，et al.Clobetasol propionate followed bycalcipotriol is superior to calcipotriol alone in topical treatment of psoriasis.J Eur Acad Dermatol Venereol，1998，11(1)19-24.)。对皮肤的渗透作用较好，维持时间较长。外用主要通过毛囊皮脂和表皮吸收。具有明显抑制表皮角质形成细胞有丝分裂，使表皮层变薄(参见文献Wrench R.Epidermal thinningevaluation of commercial corticosteroids.ArchDermatol Res，1980，267(1)7-24.)，而且对表皮朗格汉斯细胞也有一定抑制作用，促进朗格汉斯细胞迁移，降低表皮朗格汉斯细胞密度，但长时间较大剂量给药会造成毛囊炎、皮肤萎缩等不良反应。
发明内容
本发明目的在于提供一种小鼠皮肤朗格汉斯细胞缺失模型的构建方法。
本发明以丙酸氯倍他索软膏作为造模药物，均匀涂抹至去毛后小鼠胸腹部皮肤上实现的。
一种小鼠皮肤朗格汉斯细胞缺失模型的构建方法，包括用药物经皮给药刺激，所用动物为BALB/c近交系小鼠，6～8周龄，SPF级，雄性；经皮药物为丙酸氯倍他索软膏，构建方法是将小鼠胸腹部毛去净，正常饲养24～72小时后，在胸腹部无毛部位均匀涂抹规格0.2mg/g丙酸氯倍他索软膏，给药剂量为0.06～0.12g，每天一次，涂抹8次即可。
本发明的造模方法，病理检查结果表明，BALB/c小鼠在经皮给药8天后，给药处皮肤中朗格汉斯细胞密度降至最低，只有空白对照小鼠皮肤朗格汉斯细胞密度的一半左右，同时可见表皮增殖被明显抑制，表皮变薄。这些现象与皮肤免疫系统被抑制的状况相似，表明该模型可较好模拟皮肤朗格汉斯细胞缺失状态，故可用于皮肤免疫药物的筛选，研究皮肤免疫系统被抑制的机制和药物的作用机理。
本发明与其他皮肤免疫抑制模型相比，可较好地模拟皮肤中朗格汉斯细胞被抑制的状态，且克服了传统造模方法周期长、成本高、成模率不高等缺点，具有方法简单、周期短、重现性好、成本低等优点。
图1小鼠造模过程中皮肤中朗格汉斯细胞密度与时间的时效柱形2采用ELISA双抗体夹心法检测血浆样本中小鼠IL-18蛋白质在经皮给重组人干扰素α2b软膏后24的变化趋势3采用Real-time PCR法检测RNA样本中小鼠IL-18mRNA在经皮给重组人干扰素α2b软膏后24h相对管家基因β-Actin mRNA表达的变化趋势图
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述实施例11.实验动物与材料BALB/c小鼠，(6～8周龄，SPF级，雄性)，购自上海西普尔—必凯实验动物有限公司，动物合格证号SCXK(沪)2003-0002。
药物0.2mg/g(0.02％)丙酸氯倍他索软膏(第二军医大学附属长海医院的医院制剂)，文号为(南制字(2006)F50030)。
2.实验方法BALB/c小鼠40只，将小鼠随机分为5组，分别为正常对照组8只，造模组分4组，每组8只，分别经皮给药6天、8天、10天和12天。所有实验小鼠在实验前全部进行胸腹部去毛处理，然后再常规饲养48～72h。正常对照组在整个实验过程中按常规饲养，其余各组每天在胸腹部无毛处涂抹丙酸氯倍他索软膏一次(剂量为0.06～0.12g)，分别给药6天、8天、10天、12天。造模后，断颈处死小鼠，取小鼠皮肤，采用ATP组织化学染色和33D1免疫组化染色，进行病理组织学检测，观察不同给药段皮肤中朗格汉斯细胞数量、形态变化的情况。
3.实验结果如图1所示，模型组小鼠在给药后6天、8天、10天、12天皮肤朗格汉斯细胞密度分别为729±98；484±45；558±96；624±29个/mm2；而空白对照组的皮肤朗格汉斯细胞密度为1125±42个/mm2(P＜0.01)。结果表明，在给药8天后，朗格汉斯密度最小，形态变成肾形且突起减少变细，病理切片进行33D1特异性染色结果表明，表皮树突状细胞特异性抗体染色变弱，真皮中染色也减弱，同时表皮角质形成细胞增殖被明显抑制，表皮变薄。
上述结果表明，本发明构建方法所建立的小鼠皮肤朗格汉斯细胞缺失模型能较好地模拟皮肤中朗格汉斯细胞的缺失状态，故可用于皮肤免疫药物的筛选及皮肤免疫缺陷和药物的作用机理。
实施例21.实验动物与材料BALB/c小鼠，(6～8周龄，SPF级，雄性)，购自上海西普尔—必凯实验动物有限公司，动物合格证号SCXK(沪)2003-0002。
药物0.2mg/g(0.02％)丙酸氯倍他索软膏(第二军医大学附属长海医院的医院制剂)，批准文号为(南制字(2006)F50030)。
(2wu/g)重组人干扰素α2b乳膏(Recombinant Human Interferonα2bCream，安徽安科生物工程(集团)股份有限公司)，批准文号为(国药准字S20020032)。
2.实验方法BALB/c小鼠100只，将小鼠按体重随机分为20组，每组5只，包括正常小鼠10组和造模小鼠10组，各50只。其中所有实验小鼠在实验前应全部进行胸腹部去毛处理，再常规饲养48～72h。正常小鼠10组在实验过程中按常规饲养，另10组造模小鼠每天在胸腹部无毛处涂抹丙酸氯倍他索软膏一次(剂量为0.06～0.12g)，共给药8天。造模结束后，除各自空白对照组外正常小鼠在去毛处，造模小鼠在造模处涂抹(0.110±0.002)g重组人干扰素α2b乳膏，测定该模型小鼠与正常小鼠在经皮给重组人干扰素α2b对皮肤、血液中IL-18基因和蛋白质表达水平的差异。经皮给药后，分别于0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、12h、24h各取一组正常组和造模组给药小鼠，眼眶后静脉丛取血。4℃，10000r/min(离心半径＝7cm)离心10min后取血浆上清后立即置-80℃保存；取血后立即取皮肤块，除皮下组织后用铝箔包好，迅速置液氮中冻存，并置-80℃保存备用。
皮肤块用研钵在液氮中将其碾碎成粉末，用1.5ml无酶无菌Eppendorf管保存至液氮中。采用TRizol法抽提皮肤中的RNA，并即时逆转录成cDNA，同时采用琼脂糖凝胶电泳抽提RNA以检查抽提效果，并用紫外检测法检测抽提RNA的纯度和总量。
采用ELISA双抗体夹心法检测血浆样本中小鼠IL-18蛋白质在经皮给重组人干扰素α2b软膏24h的变化趋势，结果见图2。
采用Real-time PCR法检测RNA样本中小鼠IL-18mRNA在经皮给重组人干扰素α2b软膏24h相对看家基因β-Actin mRNA表达的变化趋势，结果见图3。
结果表明，相比正常小鼠，模型小鼠血液中IL-18浓度明显升高(P＜0.01)；同时在皮肤中，模型小鼠皮肤的IL-18mRNA表达水平明显降低(P＜0.01)；同时模型小鼠表皮的朗格汉斯细胞数量和密度明显减少；有可能在造模过程中，朗格汉斯细胞内迁，造成表皮朗格汉斯细胞数量和密度下降，从而使小鼠皮肤组织的基础免疫水平下降，同时朗格汉斯细胞内迁造成小鼠体内的基础免疫水平明显升高。
权利要求
1.一种小鼠皮肤朗格汉斯细胞缺失模型的构建方法，其特征在于用药物经皮给药刺激，所用动物为BALB/c近交系小鼠，6～8周龄，SPF级，雄性；经皮药物为0.2mg/g的丙酸氯倍他索软膏；构建方法是将小鼠胸腹部毛去净，常规饲养24～72小时后，在胸腹部无毛部位均匀涂抹定量丙酸氯倍他索软膏，给药剂量为0.06～0.12g软膏，每天一次，涂抹8次即可。
全文摘要
本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种小鼠皮肤朗格汉斯细胞缺失模型的构建方法。朗格汉斯细胞在皮肤免疫系统占有重要地位。本发明的模型构建方法以丙酸氯倍他索软膏作为造模药物，均匀涂抹至去毛后小鼠胸腹部皮肤上。本发明的模型经过组织化学染色和免疫组化实验证实，可较好地模拟皮肤朗格汉斯细胞缺失的状态，可用于皮肤免疫类药物的筛选及研究皮肤免疫系统被抑制的机制和药物的作用机理。本发明还克服了基因敲除、转基因、基因静默等造模方法周期长、成本高、成模率不高等缺点，具有方法简单、周期短、重现性好、成本低等优点。
文档编号A61K31/57GK101032625SQ20071003918
公开日2007年9月12日 申请日期2007年4月6日 优先权日2007年4月6日
发明者胡晋红, 李晋, 朱全刚 申请人:中国人民解放军第二军医大学