专利名称：：治疗感音神经性耳聋的中药组合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种治疗感音神经性耳聋的中药组合物；本发明还涉及该中药组合物的用途。
背景技术：
：耳聋是一种常见的多发疾病，是影响人类生活质量最主要的问题之一。近些年来的临床调査表明，明显听力障碍者约占世界总人口的7%_10%。而我国耳聋发病率很高，据相关统计，我国听力语言障碍人数高达2057万，其中儿童患者约为200万人，7岁以下儿童约80万，^性聋949万。新生儿听力损伤总发病率为9.52%。，此外，听力障碍者数量还以每年24万的速度递增。耳聋防治与听力康复将成为医药卫生和全社会共同关注的重要问题，我国政府将每年的3月3日定为全国"爱耳日"。感音神经性聋是由于外源性或自身衰老导致的内耳听毛细胞的变性和逐渐消失，血管纹、嫘旋神经节、听神经或听觉中枢的退行性病变引起的听力减退和听力丧失。目前这被认为是一种不可逆的病变，目前尚无特效药物或手术疗法能使感音神经性聋病人完全恢复听力。西医治疗感音神经性聋的主要方法有药物疗法、人工耳蜗植入、助听器等。药物治疗除根据病因采用对症治疗外，常用的辅助治聋药物有血管扩张剂、降低血液粘稠度和血栓溶解药物、神经营养药物以及能量制剂等。这些药物对于改善听功能有一定效果，但十分有限，有些药物还有较大的毒副作用。电子耳蜗植入和助听器的应用均依赖于螺旋神经节神经元的存活，螺旋神经节神经元的缺失会影响其效果。近年来，细胞移植被认为是治疗感音神经性耳聋的潜在方法，但这有赖于细胞生物技术的发展。因此，寻找一种有效且低毒的治聋药物仍是一条重要途径。中医中药对耳聋的预防和治疗积累了丰富的经验。近年来，中药治聋的研究也取得了很大发展。许多单味中药、传统古方以及现代专家的经验组方，都通过临床治疗观察及动物实验证实了治聋效果(林文森，石志兴，马恩明，等.补肾聪耳片治疗感音神经性耳聋的临床和实验研究.中国中西医结合杂志，1996，16(11):658-660;李同德，史永芝，史献军,等.加减味耳聋左慈丸对庆大霉素耳毒性的防治及其机制研究.中国临床康复，2004，8(28):6150~6152;许蕾,高下,张倩,等.银杏叶提取物对豚鼠卡那霉素耳毒性早期干预作用的效果评价.听力学及言语疾病杂志，2006,14(5):354-356)。在中医药这样一个宝库中寻找一种简单而疗效肯定的治聋中药组合物很有必要。中医对耳鸣耳聋病因病机的认识可以归纳为风热侵袭、邪毒外犯、痰浊上扰、肝阳上亢、肝胆湿热、肾精亏损、脾胃虚弱等。常用的内治法主要有疏风清热、泻火解毒、利水渗湿、补肾填精、散瘀排浊、行气通窍、平肝降逆等。朱梅菊等(朱,，谭敬书，李凡成，等.历代疗耳聋方150首用药规律分析.湖南中医学院学报，1996，16(2):1617)研究了从唐至清的历代方书，收集整理出治耳聋方150首，用药162味，平均每方用药16.3味。其中石菖蒲、磁石、附子、桂心、黄芪、防风、人参、熟地、肉苁蓉使用频率最高，显著高于其它药物。若按药物功效分类，则每类药物使用频率的百分比分别为补肾30%,补气养血19.6%，芳香通窍10%，解表9.3%，利水渗湿6.9%，清热5.4%，化痰4.4%，平肝熄风4.1%,温里3.7%，理气3.4%，活血化瘀2.4%，收涩0.8%。可见，中医对耳鸣耳聋的认识相当丰富，治疗方法颇多，用药也非常广泛。拆方研究则有利于深化对药物作用机制的认识，有助于探讨并发现可能的活性部位，也能够为临床组方用药提供一定的指导。我们还检索了已经公开的、与治疗耳聋中药相关的专利文献。大多中药组合物均由较多中药组成，成分复杂。其相关专利文献有中国专利CN1173371A于1998年02月18日公幵了一种治疗耳聋的中药，由葛根、丹参、柴胡、石菖蒲、熟地、金银花、野菊花等l9味中药配制而成，功能通窍开闭，活血通络，滋肾聪耳，主治突发性耳聋、神经性耳聋、老年性耳聋、药物中毒性耳聋，经临床848例验证，痊愈率为94%。中国专利CN1876152A于2006年12月13日公开了一种治疗神经性耳聋的药物(淫羊藿、制何首乌、熟地黄、黄精、龟甲、磁石、川芎、郁金、炙黄芪和僵蚕)及其制备工艺。制作方法按中药原料性质不同分别进行煎煮三次，滤液、混合、乙醇提取，再将滤液混合，浓縮干燥，制成胶囊。具有补肾填精，益气活血，通窍聪耳的作用，对于肾虚耳聋及感音神经性耳聋具有很好的治疗作用。中国专利CN1775254A于2006年05月24日公开了一种治疗耳聋的药物制剂及其制备方法(龙胆、黄芩、地黄、泽泻、川木通、栀子、当归、九节菖蒲、甘草、羚羊角等中药原料制成)。无临床疗效资料及动物实验资料的支持。
发明内容本发明要解决的技术问题是针对西药尚无治聋特效药且辅助药物副作用大，大量治聋中药复方药物繁多、配伍复杂的缺点，获得一种简单有效的中药组合物。本发明解决上述技术问题采用的技术方案是用庆大霉素(GM)造成耳聋模型，以传统经典治聋中药复方耳聋左慈丸为基础，通过体内和体外动物实验拆方研究，筛选出一种治疗感音神经性耳聋的中药组合物，该中药组合物是由下述重量配比的原料制备而成熟地黄22-48份和泽泻8-18份。作为优选技术方案，本发明上述中药组合物的重量配比熟地黄优选24份、泽泻优选9份。生地黄为玄参科多年生草本植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的根。主产于河南、内蒙古及东北。熟地黄为生地黄经加黄酒拌蒸至内外色黑、油润，或直接蒸至黑润而成。性味甘、微温，归肝、肾经。有补血滋阴，益精填髓的功效。《神农本草经》载地黄"逐血痹，填骨髓，长肌肉"。《药品化义》云"熟地，藉酒蒸熟，味苦化甘，性凉变温，专入肝脏补血，更补肾水。其气味浓厚，为浊中浊品，以补肝肾，用滋阴血，所谓阴不足者，补之以味"。熟地黄含梓醇、地黄素、甘露醇、维生素A类物质、糖类及氨基酸等。熟地黄有强心、利尿、降血糖和升高外周白细胞，增强免疫功能等作用。泽泻为泽湾科多年生沼泽植物泽泻Alis腿orientalis(SanL)Juz印.的块茎。主产于福建、四川、江西等地。性味甘、淡、寒，归肾、膀胱经。有利水渗湿，清热泻火的功效。《神农本草经》载泽泻"主风寒湿痹，乳难，消水，养五脏，益力气，肥健，久服耳聪明"。《日华子本草》载其"主头旋，耳虚鸣"。泽泻含皂甙、槲皮素、泽泻醇、P—谷甾醇，大黄素等。泽泻具有利尿作用，能加快机体的水液代谢，并可使尿素的排泄量增加，还可抑制肾小球细胞浸润及肾小管变性，减少尿蛋白的排泄量。熟地黄和泽泻二者均归肾经，具有补肾滋阴、利水泄热的功效。本发明中药组合物的制备并无特别之处，采用常规的水煎、醇提工艺即可。本发明随后的体内、外实验结果显示，本发明的中药组合物可显著降低GM造成的耳蜗毛细胞的损失率、降低ABR阈移，表现出了拮抗GM耳毒性、改善听功能的作用。随后的体内、外实验表明，本发明中药组合物对内耳毛细胞损伤相关的感音神经性耳聋有一定的防治作用。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例l称取熟地黄24g、泽泻9g，加入10倍量双蒸水浸泡2h，武火煮沸后，文火煎煮0.5h，取药液。再次加入8倍量的双蒸水，浸泡lh，武火煮沸后，文火煎煮0.5h，取药液。将两次药液合并，90"C水浴浓缩。按体积比2:3加入无水乙醇，充分混匀，4t:静置24h，1500rpm离心15min，取上清，弃沉淀。90*€水浴挥发乙醇，三蒸水定容至270ml液体。0.22um小滤器过滤除菌，制得补肾药。4T:保存，5天内使用，直接加入培养系统。实施例2称取熟地黄22g、泽泻8g,加入10倍量水浸泡2h,武火煮沸后，文火煎煮0.5h，取药液。再次加入8倍量的水，浸泡lh,武火煮沸后，文火煎煮0.5h，取药液。将两次药液合并，901C水浴浓縮，蒸馏水定容至135ml液体，制得补肾药。4TC保存，IO天内使用，口服。实施例3称取熟地黄22g、泽泻18g，其余步骤同实施例2，制得补肾药。实施例4称取熟地黄48g、泽泻8g，其余步骤同实施例l,制得补背药。实施例5称取熟地黄48g、泽泻18g，其余步骤同实施例l，制得补肾药。实施例6称取山茱萸(制)12g，丹皮9g，其余步骤同实施例l，制得养肝药。实施例7称取熟地黄山药12g，茯冬9g，其余步骤同实施例l，制得健脾药。实施例8称取熟地黄泽泻9g,茯茶9g，其余步骤同实施例l,制得利水药。试验例依据中医理论，以中医经典治聋复方耳聋左慈丸为基本方，拆分为四个药对组合补肾药(熟地黄，泽泻)，养肝药(山茱萸(制)，丹皮)，健脾药(山药，茯苓)，利水药(泽泻，茯苓)。l.体外实验1.1分组分为5个组，分别为补肾组、养肝组、健脾组、利水组、GM组。补肾药采用上述制备实施例卜5中任一实施例制得的产物。养肝药、健脾药和利水药分别采用实施例6、实施例7和实施例8制得的产物。1.2试验方法1.2.1耳蜗基底膜毛细胞的原代培养方法。云南昆明小鼠，出生2—3天，雌雄均用。用75%酒精喷洒小鼠全身消毒，断头后将头颅置于无菌培养皿中。在超净台内剪开头顶骨，清除脑组织，在放大20—40倍的解剖显微镜下，取出听泡，放入盛有Hanks液的培养皿中，拨开耳蜗壳，去掉蜗轴和嫘旋韧带等其他结构，分离出整个基底膜，将耳蜗基底膜移入无血清培养液中，再逐步将其移到配制好的胶原凝胶滴的表面铺放平整。在C02培养箱(371C,5%C02)中培养，24小时后换液。1.2.2荧光免疫组化观察内、外毛细胞。样本分为5组，即GM模型组、补肾组、养肝组、健脾组、利水组。在培养基中直接加入用无血清培养液稀释的GM(0.3mM)及中药(IO3)，作用24小时后，终止培养，用10%福尔马林磷酸盐缓冲液固定样品2小时以上。用细镊刮脱带有基底膜的胶滴，0.1MPBS缓冲液洗涤3次，再用1:200TRITIC标记的Phalloidin磷酸盐缓冲液避光染色30分钟，经0.1MPBS磷酸盐缓冲液漂洗3次，样品用50%甘油磷酸盐缓冲液封固于玻片上。1.2.3全耳蜗毛细胞计数做定量分析。在放大400倍的荧光显微镜下，从蜗尖向蜗底逐个视野依次进行内、外毛细胞计数。计数结果输入到计算机全耳蜗定量分析软件，作耳蜗毛细胞损失图,计算毛细胞损失率。1.3试验结果，如表1所示。表1.0.5mMGM及四个药对的毛细胞损失率(％)(^土S)组别nIHCOHC0.5mMGM1870.6±7.979.8±7.5补肾组1863.5±11.9*71.9±9.1林养肝组1858.3±15.6林71.6±9.5**健脾组1862.7±10.0*76.0±8.7利水组1863.9±12.673.5±8.5**P<0.05，与GM组相比；**P<0.01，与GM组相比。2.体内实验2.1动物分组与造模按照随机数字表法将实验动物分为5组，即GM模型组、补肾组、养肝组、健脾组、利水组。补肾药采用上述制备实施例1-5中任一实施例制得的产物。养肝药、健脾药和利水药分别采用实施例6、实施例7和实施例8制得的产物。各组动物每日肌注硫酸庆大霉素注射液100mg/kgd,连续用药10天。4个中药组动物同时灌服按实施例2制备的中药水煎液，药量为lml/100g体重。GM组动物则按照同等体积灌服饮用水。造模10天后均停止肌注GM，中药组继续灌服相应的中药水煎液，GM组动物仍然灌服饮用水，直至实验第33天。2.2试验方法听性脑干反应(ABR)检測虔验开始的第11天、第22天、第33天进行ABR检测，检测当日不用药。ABR记录系统为Neuropack2型诱发电位仪(日本光电公司)。2%戊巴比妥钠(3040mg/kg)腹腔麻醉，并维持动物麻醉状态，动物体温维持在37"±0.5°C。针形电极，记录电极置于双耳廓上缘连线中点之颅顶骨膜面，参考电极置于同侧耳廓，接地电极置于对恻上肢。声刺激由SS-1型声刺激器产生，短音刺激(tonepip)，重复频率为lHz，包络上升及下降时间为lms，平台时程为5ms，频率分别为2kHz、6kHz、8kHz、10kHz、12kHz。带通滤波503000Hz，叠加1000次，观察时程为20ms，阈值判断以IH波为准，记录各频率的阈值。刺激声强度为阈值上90dB，以10dB递减，接近阈值时，改为5dB递减，直至m波消失。阈值限定在m波消失后再提高5dB，2次重复后波形相同，即定为阈值。以动物用药后与用药前的阈值变化(阈移，他reshoklshift)作为统计指标，将各动物所測频率阐移的均数进行统计分析。另外，由于GM所导致的听力损伤主要以高频为主，其损伤程度常表现为从高频向低频递减，因此本研究亦对实验结果中的高频(8kHz、10kHz、12kHz)阈移进行分析。2.3试验结果，如表2、表3和表4所示。表2.GM组及四个药对组第11天的阈移(dBSPL)(i±S)组别ii2kHz6kHz8kHz10kHz12kHz平均GM组95.9±4.76.9±8.59.1±9.814.3±12.120.1±11.012.ftt8.6补肾组101.3±6.62.5±6.73.0±5.83.5±6.7*2.5±8.6**2.7±4.3林养肝组155.1±7.010.8±12.917.7±23.916.8±23.016.5±21.513.4±16.5健脾组88.0±11.7".4±14.618.6±14.319.0±17.920.8±21.817.6±16.7利水组103.9±7.76.3±5.26.8±9.27.2±11.111.8±13.77.4±7.9*P<0.05，与GM组相比；**P<0.01,与GM组相比。表3.GM组及三个药对组第22天的阈移(dBSPL)(i±S)组别ii2kHz6kHz8kHz10kHz12kHz平均(;m组83.6±8.66.3±5.28.6±6.814.6±13.614.5士17.99.5±8.6补肾组101.0±4.82.0±10.40.5±2.62.0±5.0*3.9±5.81.肚2.3*养肝组910.2±16.218.1±23.423.0±17.1123.7±25.326.2±23.720.2±19.4健脾织68.8±15.310.8±14.717.2±18.819.0±21.419.5±25.715.1±17.9禾J水组71.6±12.53.2±11.05.1±8.16.5±5.02.4±8-63.8±7.7*P<0.05，与GM组相比。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*P<0.05,与GM组相比。根据上述体内、外实验结果显示，在诸多拆方中，只有补肾药(熟地黄、泽泻)可显著降低庆大霉素造成的耳蜗毛细胞的损失率、降低ABR阈移，表现出了拮抗庆大霉素耳毒性、改善听功能的作用。上述实验表明，该中药组合物对内耳毛细胞损伤相关的感音神经性耳聋有一定的防治作用。权利要求1.一种治疗感音神经性耳聋的中药组合物，其特征是，该中药组合物是由下述重量配比的原料制备而成熟地黄22-48份；泽泻8-18份。2.如权利要求l所述，一种治疗感音神经性耳聋的中药组合物,其特征是，该中药组合物是由下述重量配比的原料制备而成熟地24份；泽泻9份。3.权利要求1或2所述的中药组合物在制备治疗感音神经性耳聋的药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种治疗感音神经性耳聋的中药组合物。该中药组合物由含以下重量配比的原料制备而成熟地黄22-48份，泽泻8-18份。本发明还涉及该中药组合物在制备治疗感音神经性耳聋的药物中的应用。本发明的中药组合物具有补肾滋阴、利水泄热的功效，可抵抗庆大霉素造成的耳蜗毛细胞损伤，改善听功能，对于感音神经性耳聋具有一定的防治效果，具有疗效可靠、稳定性好、配方简单等优点。文档编号A61K36/884GK101439131SQ20071009425公开日2009年5月27日申请日期2007年11月20日优先权日2007年11月20日发明者宋海燕,施建蓉,静王,王毅敏,杨董,郭瑞新申请人:上海中医药大学