羟基脂肪酸寡聚物及其在调节细胞内钙离子浓度中的应用的制作方法

专利名称：羟基脂肪酸寡聚物及其在调节细胞内钙离子浓度中的应用的制作方法
羟基脂肪酸寡聚物及其在调节细胞内钙离子浓度中的应用 抹水领域
本发明涉及羟基脂肪酸寡聚物及其在调节细胞内钙离子浓度和调 节细胞生长中的用途.
背景技术：
钙离子生理功能概述
人的身体中，钙元素含量超过1000克，人体中的钙99%沉积在骨 骆和牙齿中，促进其生长发育，维持其形态与硬度；剩下的只有不到 10克存在于血液和软组织细胞中，恰恰是这少量的钙，在生命过程中 起着至关重要的作用.19世纪末的英国心脏生理学家悉尼'林格
(Sydney Ringer)在研究蛙心的收缩功能的实验中，意识到钙是一种 能维持心脏功能的特殊因子，从此揭开了研究钙离子的序幕
(Sydney,1884),到了20世纪60年代，钩离子驱动肌肉收缩的机理 也得以基本阐明.随着认识的不断深入，钙离子越来越多的功能被揭 示.钙调蛋白的发现，使得钙离子被确认为是一种细胞信号传导的栽 体，钙信号在细胞功能控制中的关键地位也得以最终确立
(Cheung，1980).目前为止研究的比较多的钙离子的功能如下:作为调 节细胞功能的信使，细胞外Ca"是重要的第一信使，通过细胞膜上的 钙通道(电压依赖性或受体门控性)或钙敏感体(CaSR)发挥重要调 节作用.CaSR是G蛋白耦联受体超家族C家族的成员，它存在于各 种细胞膜上，细胞外钓离子是其主要配体和激动剂，两者结合后，通 过G蛋白激活碑脂酶C(PLC)-IP3通路及酪氨酸激酶-丝裂原蛋白激酶 通路，引起肌浆网和内质网释放钙离子，以及细胞外钙离子经钙库搮 纵性钾流通内流，使细胞内钙离子增加.细胞内钙离子作为第二信使， 例如肌肉收缩的兴奋-收缩輛联因子，参与骨輅肌，心肌，平滑肌兴
奋收缩.作为激素和神经递质的刺激-分泌辆联因子，对人体内分泌腺 激素的分泌有决定性作用，对维持循环、呼吸、消化、泌尿、神经、 内分泌、生殖等系统器官的功能至关重要(Petersen etal，1994),此外它还是体温中枢调节点的主要调控介质等.此外，调节酶的活性， 维持神经-肌肉兴奋性，对细胞的粘着、细胞膜功能的维持也有重要作 用，钙离子参与血液凝固，参与免疫过程，钙离子呈弱碱性，有效补 钙可以调节人体的酸碱平衡.最近发现在每个细胞外都会有一层由钩 离子组成的波状物进行有节奏的振动，如果缺钙，振动就会减慢，细
胞的寿命就会减少，人的寿命也就会缩短(Ernesto, 2002).
总之，钙是人体不可或缺的微量元素，它既是身体的构造者，又 是身体的调节者，是我们人体的生命之源.细胞的活动几乎时时刻刻 都离不开钙离子信号的调节，无论是精子与印子的结合、胚胎发育的 启动，还是体细胞的凋亡；无论是基因的表达、激素的分泌，还是记 忆系统的构筑等，无不有钙信号参与其中，钙元素与细胞的关系之密 切，可谓生死相依.钙就是一切(Cheng etal， 2006).
与有机分子不同，钙离子既不能被制造，也不能被降解，只能被 束绰或转移.研究表明细胞在静止(非激活)状态时，细胞内钙离子浓度 一般是大约100-200纳摩(1纳摩等于10'9摩尔)，而细胞外液的钙
离子浓度则在毫摩量级上(l毫摩等于10-3摩尔).胞浆游离Ca^浓度， 不但远低于细胞外液，而且低于肌浆网和线粒体内的Ca"浓度，随着 细胞的活动，胞浆Ca"浓度会发生变化，而这种变化正是调节机体多 种生命过程的基础.例如，心肌细胞胞浆游离Ca"浓度变化是心肌舒 缩活动的基础.内分泌细胞的分泌活动也伴随有细胞内钙的变化，因 此细胞溶质Ca"通过多种途径处于极为严格的调节控制之中，胞质内 游离钩来源有两条途径细胞外Ca"内流和细胞内钙库钙的释放.研 究发现细胞膜含有3种跨膜钙转运系统l.钙通道(Ca2+ channel)， 分为三类即电压依赖性钙通道(VOCs)、受体门控性钙通道(ROCs) 和储存开启性钙通道(SOCs)三个通道.2.^+/032+交换体(^+^82+ exchanger), 3.钾泵(Ca2+pump，又称Ca2+-ATP酶)，细胞内钙库082+ 转运系统l.内质网钙释放通道又叫受体门控离子通道，内质网的钙 释放通道包括两种类型蓝尼定(ryanodine)受体门控离子通道和三 磷酸肌醇(IP3)受体门控离子通道.2.肌浆网钙泵，3.肌浆网腔内钙结 合蛋白(Bootmanetal， 2001 ),可见生物体不仅有以"钙泵"为代表的 钙离子转运蛋白，还有作为緩冲剂的钙结合蛋白，它们共同作用，维 持正常细胞内外钙稳态，
正是由于钙离子在细胞的功能与代谢活动中发挥着关键性的调节作用，它不仅是细胞兴奋-收缩耦联中的重要因素，而且参与细胞内的 信号转导、动作电位的形成和各种代谢活动.因此一旦钾稳态失衡可
引起细胞功能障碍和代谢棄乱，甚至导致细胞死亡(Pierhiigi et al, 1990),离子通道病(channelopathy)是指离子通道的结构或功能异常所
引起的疾病，具体表现在编码离子通道亚单位的基因发生突变或表达 异常，或体内出现针对通道的病理性内源性物质时，离子通道的功能 发生不同程度的减弱或增强，导致机体整体生理功能素乱，形成某些 先天性或后天获得性疾病，主要累及神经、肌肉、心脏、肾脏等系统 和器官(Hatta，2002).钙离子通道广泛存在于机体的不同类型组织细 胞中，参与神经、肌肉、分泌、生殖等系统的生理过程.已经发现的 钙通道病有家族性偏瘫型偏头痛、低钾型周期性瘫痪、2-型发作性共济 失调、6-型脊拔小脑共济失调、中央脊號性肌病(central core disease of muscle)、恶性高热、Lambert-Eaton肌无力综合征(Nishimune， 2004 )、 癫痫等.
钙离子栽体说明
随着钙离子在心脏功能中的关键性作用愈趋明朗，人们开始试困 将其应用于临床治疗.维拉帕米(Verapamil)是人类获得的笫一种钙 通道阻滞药物，证实其作用机理是通过降低流入心肌细胞的钙离子总 量，来调节心脏的功能性活动(BN Singh et al, 1978).有时，我们
需要激活胞内钙，升高胞内钙离子浓度来为我们服务，激活钙通道或 转运钩离子的药物也受到了人们的关注，与阻断药物不同，这种药物 增加胞内钙离子浓度，从而调节细胞相关功能性代谢，
离子栽体(ionophore)是研究的较多的一种钙激动剂，它是疏水 性的小分子，与Ca^等离子形成脂溶性复合物，可溶于双脂层，提高 所转运离子的通透率，多为微生物合成，离子栽体也是以被动的运输 方式运输离子，可分成可动离子栽体(mobile ion carrier)和通道离子 栽体(channel former)两类可动离子栽体栽体型分为中性离子栽 体和具有羧酸的羧基离子栽体二种.羧基离子栽体本来是一端具有羧 基的直链分子，但两端通过氢键而形成环状结构.在其内部包以一价 或二价的阳离子.所以在膜内的离子(M+， M2+)-离子栽体(r)复合 体作为]^+ r或M" r而存在.作为羧基离子栽体的A23187进行Ca"的运输，可使膜对CaZ+的透性增高，通道离子栽体包括直链肽的短 杆菌肽、多烯型抗生素的菲律宾菌素、制審菌素、两性審素B等.短 杆菌肽A ( granmicidin )形成长2.5-3 mn的螺旋状的二分子结合体， 在膜上形成直径0.4mn的穴，对H+有选择能力，离子透性与越膜电位 无关.后者被认为与胆固醇形成复合体，多数集合起来形成管道，对 离子的特异性小，与阳离子相比对阴离子的透性更大，且对水那样的 中性分子也可透过，同时离子的透性与电位大小有关.这种通道并不 稳定，不断形成和解体，其运输效率远高于可动离子栽体.(杨宝峰， 2005)
下面是一些示例性的激动剂ionophoreRO 2-2985， Calcium Ionophore X-537A， calcium ionophore A23187,离子莓素(Ionomycin )， 血管紧张素II,三辨酸肌醇(内释)，蓝尼定(Ryanodine内释)， 乙酰胆械(ACh)，緩激肽BK ( bradykinin )，依马卡林(Emakalim ) 等，但是目前大部分只是在实验室阶段使用，况且价格昂贵(刘道明， 2000)。
聚羟基脂肪酸酯及其塞聚体简要说明
聚羟基脂肪酸醋(Polyhydroxyalkanoates， PHA)是微生物在生长 不平衡的环境下积累的能源和碳源贮藏物(Doi & Steinbttchel， 2002) . PHA优良的生物降解性和生物相容性使其成为最为引人稱目 的组织工程材料(Chen & Wu，2005).组成PHA的单体多种多样， 截至目前，已发现组成PHA的单体有100多种(Doi & Steinbiichel， 2002) . 3-羟基丁酸(3HB)是组成PHA的最常见的单体，也是动物 体内酮体的基本成分之一.越来越多的证据表明，聚3-羟基丁酸
(PHB， 一种最为常见的PHA)不仅仅是某些细菌积累的贮藏物质， 而且是广泛存在的、涉及许多重要生理功能的生物活性物质(Reusch， 1995).低分子量PHB和其他生物大分子的结合体存在于多种生物中
(Reusch, 1995)。
3HB的线状或环状寡聚物以及其其他衍生物可以提高体内的明体 水平从而起到营养或治疗的作用(Martin et al， 1999) , Tasaki等发现 二聚或三聚3HB可以作为受伤病人的能源底物(Tasaki etal， 1999), 3HB单体可以作为钾离子内流促进剂，使胞内钙离子浓度上升，从而 减少鼠成纤维细胞L929在高密度培养条件下的死亡率(Cheng et al，2006).寡聚羟基脂肪酸及其衍生物有其特别的优点l.本来是细胞膜 上的一种成分，无毒，血液中存在，可以注射使用.2借助脂质体的 靶向性，作用于目标.
本发明一方面提供了寡聚羟基脂肪酸(OHgo hydroxyalkanoic acid 或OHA)，其结构通式如下
<formula>formula see original document page 8</formula>
(I)
其中
中括号内为结构单元，各结构单元可以相同或不同； n表示结构单元的总数，选自1~100的整数； 各结构单元的m独立地选自1 ~ 3的整数；
各结构单元的Ri独立地选自由H、 d-C9的烷基、d-C9的烷氧基
和芳基构成的组；
R2选自由H、 C,-C9的烷基、芳基和无毒金属离子构成的组.
根据本发明的一个优选实施方式，R2选自由H、 d-Cs的烷基和无 毒金属离子构成的组；更优选地，R2逸自由H、 d-C3的烷基、Na+、 K+和Ca^构成的组.
根据本发明的一个优选实施方式，Ri选自由H、 d-Cs的烷基、 CrCs的烷氧基构成的组；更优选地，R选自由H、 d-C3的烷基构成 的组。
根据本发明的一个特别优选的实施方式，Ri选自由H、 d-C2的烷 基构成的组，R2选自由H、 CrC2的烷基、Na+和K+构成的组，
优选地，m为1或2, ii为1 ~ 50的整数，并且当m=l时，不 为甲基.通常，式(I)化合物的数均分子量不超过10000.
本发明另一方面提供了一种用于调节细胞内钙离子浓度的制刑，含有作为活性成分的式(I)化合物或其对映异构体.
所述制刑中还可以含有适当的栽体或赋形剂，例如蒸慵水、矿物 油、淀粉等，本领域技术人员可以根据具体情况确定.该制剂可用于 提高细胞内钙离子浓度，例如成纤维细胞、食管癌细胞、心肌细胞、 胰腺细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞等.
本发明再一方面提供了一种用于调节细胞生长的制剂，含有作为
活性成分的权利要求i-io之任一項的化合物或其对映异构体.
优选地，所述制剂抑制细胞的增殖或者促进细胞凋亡，优选地， 所述细胞为癌细胞.该制剂用于治疗癌症.
本发明又一方面提供了式(I)化合物或其对映异构体在制备用于调 节细胞内钙离子浓度的制剂中的用途，在制备用于调节细胞生长的制 剂中的用途，以及在制备用于治疗钙离子通道疾病的药物中的用途. 所述钙离子通道疾病例如为心脏壤停或心力衰竭.
四甲基噻唑蓝(Thiazolyl blue或MTT)法检测证明本发明的寡聚 物可以抑制癌细胞的增殖，并且呈浓度依赖型.低浓度(1 ~ 20 mg/L) 的寡聚物抑制效果不明显，高浓度(>40 mg/L)寡聚物显著抑制癌细 胞的增殖；细胞凋亡实验证明，寡聚物(40mg/L)能够诱导细胞的凋 亡和死亡；流式细胞仪检测细胞周期显示，寡聚物(40 mg/L)可以延长 细胞的Gi期，降低癌细胞的分裂程度，进一步的钙成像技术检测显示， 寡聚物可以刺激细胞胞内游离钙离子浓度的升高，上述作用可能是通 过提高胞内游离钙离子浓度实现的。
附图简要说明
图la-图lb显示了 OHB对鼠成纤維细胞L929生长的影响，图la. 24 小时，图lb. 48小时，* p<0.05 OHB liposome vs Blank liposome treatment
图2a-图2b显示了 OHB对食管癌细胞EC109生长的影响图2a. 24小时，图2b. 48小时。* p<0.05 OHB liposome vs Blank liposome treatment
图3a-图3b显示了 OHB对原代食管癌细胞生长的影响闺3a. 24 小时，困3b. 48小时，* p<0.05 OHB liposome vs Blank liposome treatment困4a-困^显示了 OmclHA对食管癌细胞EC109生长的影响困 4a. 24小时，困4b. 48小时.* p<0.05 Omcl HA liposome vs Blank liposome treatment
图5a-图5b显示了 OHBHHx对食管癌细胞EC109生长的影响困 5a. 24小时，困5b. 48小时，* p<0.05 OHBHHx liposome vs Blank liposome treatment
图6显示了 OHB对鼠成纤维细胞L929细胞凋亡的影响^p〈0.05 OHB liposome vs Blank liposome treatment
图7显示了 OHBHHx对原代食管癌细胞细胞消亡的影响，* p<0.05 O朋HHx liposome vs Blank liposome treatment
图8显示了 03HB4HB对食管癌细胞EC109细胞凋亡的影响，* p<0.05 03BB4HB liposome vs Blank liposome treatment
图9显示了 OHB对鼠成纤维细胞L929细胞周期的影响,p〈0.05 OHB liposome vs Blank liposome treatment
困10显示了 03HB4HB对食管癌细胞EC109细胞周期的影响，* p<0.05 03HB4HB liposome vs Blank liposome treatment


图11显示了 Omcl HA对原代食管癌细胞细胞周期的影响，* p<0.05 Omcl HAliposome vs Blank liposome treatment
图12a-图12b显示了 OHB刺激小鼠成纤维细胞L929胞内游离钙 离子荧光强度变化.图12a.细胞外液中有/无钙离子条件下刺激细胞胞 内游离钾离子变化.图12b.添加不同钙离子阻断刑的对比。
图13a-困13b显示了 OHBHHx刺激小鼠成纤維细胞L929胞内游 离钙离子荧光强度变化.图13a.细胞外液中添加钙离子螯合刑与不加 钙离子螯合剂条件的对比.图13b.添加加钙离子阻断剂的对比.
困14显示了 03HB4HB刺激大鼠原代心肌细胞胞内游离鈣离子爽 光强度变化，
图15显示了 Omc旧A刺激大鼠原代心肌细胞胞内游离钙离子爽 光强度变化.
具体实施例方式
本文所用的术语"Mn"是指数均分子量(number-average molecular weight),术语"OHA"是指寡聚羟基脂肪酸，或称羟基脂肪酸寡聚物，可 以是由一种单体构成的均聚物，也可以是由两种或多种单体构成的共 聚物.
本发明所指的羟基脂肪酸单体(hydroxyalkanoic acid或HA)可 以是单一立体结构的化合物，如R、 S型，也可以是R、 S的混合物或 者外消旋物.寡聚羟基脂肪酸OHA包括寡聚的3-羟基丁酸(01igo hydroxybutyrate或OHB)、 3-羟基戊酸(01igo hydroxy valerate或 OHV)、 3-幾基己酸(OHgo hydroxyhexanoate或OHHx)、 3-轻基庚酸 (Oligo hydroxyHeptanoate 或 OHHp) 、 3-鞋基辛酸(Oligo hydroxyoctanoate或OHO)、 3-鞋基姿酸(01igo hydroxydecanoate或 OHD)、 4-羟基丁酸(01igo (4-hydroxybutyrate)或0-4HB)、 4-鞋基戊酸 (OUgo (4-hydroxyvalerate)或0-4HV)等的均聚物或共聚寡聚物，也包 括上述寡聚物的混合物，比如寡聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚91 (Oligo (3勿droxybutyrate-co-4勿droxybutyrate)或03HB4HB), 寡聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯(Oligo (hydroxybutyrate-co-hydroxyhexanoate)或OHBHHx)，寡聚中长链脂肪酸共聚酯(OHgo medium chain length hydroxyalkanoate或OmclHA)等
本发明所述细胞包括成纤维细胞、食管癌细胞、心肌细胞、胰腺P 细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞等.本发明化 合物可以提高所述细胞胞内的游离钙离子浓度，从而促进癌细胞的凋 亡与坏死，神经突触的形成，激素的分泌等。
本发明所述的寡聚体可以通过高聚物的水解或酶解获得，也可以 化学合成获得.以脂质体包哀寡聚物可以提高寡聚物转入细胞的效 率，增大寡聚物的有效浓度，
为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给出本发明的实施 例，这些实施例仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对 本发明范围的限制.
实施例1 3-羟基丁酸塞聚体0)HB)的制备
准确称取3 g聚3 -羟基丁酸-4 -羟基丁酸(P3HB4HB )，加入 二氯甲烷200ml，于90"C回流。待PHB全部溶解后，加入对甲苯磺酸 0.3g，水0.5g，继续回流反应l小时后，补加水0.5g。 2小时后终止反应，过滤，以冷甲醇沉淀，过滤，索氏提取器抽提12小时后于50 X:真空条件下干燥48小时备用，经凝胶渗透色详(GPC， Waters 1515)检测数均分子量(number-average molecular weight或Mn )为 2000，核磁共振波谱(NMR， Bruker 400)分析产物不含烯键等细胞毒 害物质.
实施例2 塞聚3-羟基丁酸甲酯(OHB-CH3)的制备
取1 g PHB溶于幼mL三氯甲烷，在601C加热回流2 h充分溶解， 滴加50 mL浓硖酸甲醇溶液(10 %v/v) ， 90TC加热回流2b.加入50 mL 4TC预冷的甲醇，静置lh，将混合溶液在8000rpm、 4TC条件下离心20 min，弃上清，加入甲醇重悬.重复上述步碟2次，50"C真空条件下干 燥48小时备用，得到含有OHB-OCH3固体的白色粉末.经凝胶渗透 色谦(GPC， Waters 1515)检测Mn为2000，核磁共振波详(NMR， Bmker400)分析产物不含烯键等细胞毒害物质.
实施例3 塞聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸甲酯K)3HB4HB-CH^的制备
取1 g P3HB4HB溶于50mL三氯甲烷，在60"C加热回流2h充分 溶解，滴加50mL浓硫酸甲醇溶液(10%v/v) ， 90TC加热回流2h, 加入50mL41C预冷的甲醇，静置lh，将混合溶液在8000 rpm、 4TC条 件下离心20min，弃上清，加入甲醇重悬.重复上迷步骤2次，50"C 真空条件下干燥48小时备用，得到含有OHB-OCH3固体的白色粉末， 经凝胶渗透色谘(GPC, Waters 1515)检测Mn为2100，核磁共振波 详(NMR， Bruker 400)分析产物不含烯鍵等细胞毒害物质.
实施例4塞聚3-羟基丁酸3-羟基己酸甲醋(OHBHHx-CH^的制备
取lgPHBHHx溶于50mL三氯甲烷，在601C加热回流2 h充分 溶解，滴加50mL浓硫酸甲醇溶液(10%v/v) ， 90TC加热回流2h。 加入50mL4lC预冷的甲醇，静置lh，将混合溶液在8000rpm、 4TC条 件下离心20min，弃上清，加入甲醇重悬.重复上述步骤2次，50oC 真空条件下干燥48小时备用，得到含有OHB-OCH3固体的白色粉末， 经凝胶渗透色详(GPC， Waters 1515)检测Mn为2800，核磁共振波 详(NMR， Bruker 400)分析产物不含烯键等细胞毒害物质.实施例5塞聚中长链羟基脂肪酸甲酯(OmclHA-CHj)的制备
1.5 g mclPHA纯品溶于37.5 ml氯仿，701C搅拌^件下冷凝回流 30min，緩慢滴加15ml甲醇(5%体积的浓硫酸)，IOOTC高速搅拌冷 凝回流10h.冷却致室温，加15ml水振荡均匀，旋转蒸发有机溶刑氯 仿，甲醇，加15ml氯仿剧烈振荡，静置分层12h，取下相。对于上相 加5ml氯仿重新萃取一次.2g无水碟酸镁加入到收集的有机相中，剧 烈搅拌3h，稍加热后布氏漏斗抽滤.旋转蒸发除去大部分有机溶刑， 将样品oligomclPHA甲酯601C真空干燥。得到含有OmclHA-CH3的 油状液体.经凝胶渗透色详(GPC， Waters 1515)检测Mn为2300， 核磁共振波谱(NMR， Bruker 400)分析产物不含烯键等细胞毒害物 质。
实施例6 —系列塞聚体甲醋表征
分子量使用凝胶渗透色谦法(Gel-permeation chromatography, GPC)测定。在401C下，使用配备有A"14微分折光率检测器和紫 外检测器的water 1515高效液相色详仪测定样品的分子量和分子量分 布。使用色谦纯的氯仿为洗脱液，流速为lml/min.将待测样品以2.0 mg/ml的浓度溶解在氯仿中，进样量为50^.标准曲线根据窄分布聚 苯乙烯标样制定.通过分子量的测定我们可以确认我们甲醇解的产物为 寡聚体.
1H-NMR在Bmker AV 400 NMR核磁共振仪上于室温下分析溶于 氘代氯仿(CDC13) (20mg/mL)中的聚合物的结构，400MHz ^-NMR 谦图获得条件4jis的脉冲宽度，2T777.8 Hz的峰宽，32000个数据点， 2048个聚点.首先我们把制备的寡聚体的核磁波诿困与高聚物PHA对 比，在波谦图上发现出现新的位移位点就是-OCH3，根据端基OCBb和 重复单元中CH2核磁波详图中峰积分面积比值我门可以计算出寡聚体 的聚合度n (前面结构式中出现的n) 结合渗透凝胶色谱测定分子量 我们就可以判定此为我们预期的寡聚体甲酯衍生物，此外在核磁共振 波详图中PPM为6.0和7.1处分别表示烯鍵碳原子上的氩原子，在我 们得到的波谦图中没有发现这两个峰，判定我们制备的寡聚体中没有 出现烯鍵对细胞有毒害的产物.实施例7 OHA脂盾体的制备
称取0.10 g卵裤脂，O,O5 g胆固醇，溶于20 ml氯仿，充分溶解混匀， 緩慢加入0.002 g氯仿溶解的OHA (任何一种)，旋转蒸发仪挥发氯 仿，使混合物成膜贴附在圃底烧瓶内壁上，真空干燥48小时驱除干净 氯仿.加15 ml 4'C存放的N-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸緩冲液(即 HEPES， pH = 7.2 )水化30分钟，将膜充分振荡下来，补充5 ml PBS.水 浴条件下超声处理20'C l5minl00%功率，间歇15 min，重复两次， 获得脂质体悬液，测pH调整到7.2， 10000g离心，过滤除菌.脂质体 中OHA含量由气相色谦测定。
样品处理将一干净离心管计重，取脂质体溶液于管中，水冻干 燥程粉末，计算前后重量差，计算出脂质体寡聚体总重.将粉末置于 酯化管中，加入2mlSI化液，2ml氯仿，加盖密闭，1001C烘箱醋化4 h，冷却致室温，加入lml蒸镩水，充分振荡混匀，静置分层，取下层 氯仿相GC分析.
标样处理准确称量10mg左右系列剃度(最少5个梯度)标准 物质，于酶化管中加入2ml酯化液，2ml氯仿，加盖密闭，100X:煤箱 酯化4h，冷却致室温，加入lml蒸錄水，充分振荡混匀，静置分层， 取下层氯仿相GC分析。
酯化液组成浓碟酸(98%)与甲醇3:97体积混合，含有lg/L癸二
酸内标.
依照Agilent公司GC Agilent6820气相色谦仪的说明书操作气相色谱 仪。设定柱头温度为140TC,进样器温度为200X:，检测器温度为220TC, 柱头压力为0.25Mpa程序升温条件为80TC维持1.5分钟，以30*C/min 的速度升温至1401C ，并在此温度保持2分钟，以5TC/min的速度升温至 175TC，在此温度保持3分钟，样品的进样量为进样使用上海安亭微 量进样器厂生产的微量进样器.
处理标准样，以质量对峰面积做标准曲线，作出拟合方程，将样 品峰面积带入曲线，分別求出每个样品中每种单体的质量，从而计算 出寡聚体质量(每个寡聚甲酹上端基OC私忽略不计).将计算出的 脂质体质量除以做酯化反应的样品总重(脂质体寡聚体总重)即可计 算出脂质体中OHA含量。实施例8原代食道癌细胞的分离及培养
取新鲜食管癌组织切块(蜱癌，汕头大学肿瘤医院)约5g，置于 DMEM培养液(Dulbcco's Modifed Eagle Medium )带回.PBS緩冲液 漂洗三次至组织块变白.剪碎成2-3mn^的小块.加入0.25%胰酶溶 液5ml，消化10min,轻轻磨碎，以完全培养液冲洗，300目筛网过滤. 显微镜下观察细胞大小差异大，细胞核大，呈现典型的癌细胞特征. 取滤液加至细胞培养瓶，于37TC、 5。/。C02条件下在含10% FBS的 DMEM培养基中培养，至细胞生长至70。/。密度时传代培养，
实施例9大鼠原代心肌细胞的分离及培养
取K3天龄的SD大鼠，在无菌条件下开胸取出心脏，立即置入4 1C PBS液(磷酸緩沖液)中剪取心室肌，用移液管反复吹打充分洗净 残血，换新PBS液，剪成约1 11113大小的碎块，轻轻吹打后弃去PBS 液，然后碎块小心吸入25 ml无菌三角瓶中，加入0.1 %胰蛋白酶8 ml左 右，用盐水瓶胶塞盖紧瓶口，置室温在磁力搅拌器上搅拌消化10min， 再弃去首次的消化悬液(主要含血细胞)，加入0.1%胰蛋白蘇消化液 消化IO min，如此重复，直至组织块消失.分别收集每次消化悬液， 加等量含5%胎牛血清DMEM培养液终止消化，离心(1000 rpm/min，10 min)，弃上清，再加入含5%胎牛血清DMEM培养液，用吸管轻轻 吹散沉淀细胞，同条件下再次离心，将每次离心后沉淀细胞合并，用 含10。/n胎牛血清DMEM培养液制成细胞悬液，通过300目网筛滤过， 接种于玻璃培养瓶，置371C, 5%C02培养箱内，根据心肌细胞相对 成纤维细胞貼壁慢，采用差速贴壁lh，在培养液中获得心肌细胞，细 胞计数并调整好细胞浓度，接种于6孔培养板(已经提前加入了无菌 的细胞培养爬片)中，置37X:， 5%C02培养箱内.培养前4Sh，在心 肌细胞的培养液中，加入Brdu 0.1mmol/L，以抑制成纤维细胞的增殖. 在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况并摄像记录.
实施例10 MTT(^唑兰)法检测OHB对小鼠成纤維细胞L929增殖 的影响
生长状况良好的L929细胞(购于中国预防医学科学院)用胰酶消化液处理2分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液，血 球计数板检测细胞数量，接种于96孔板中(5xl()S个细胞/孔)，371C， 5% C02细胞贴壁培养24小时后去掉培养液，PBS (裤酸盐緩冲液， pH7,2)润洗2遍，更换新鲜培养液，并加入含一系列浓度梯度(OHB 终浓度为5、 20、 40、 60mg/L)过滤灭菌的OHB脂质体(Mn-2000， 磷脂浓度为2g/L)，每一浓度做6个平行孔；实验设置空白对照孔和 相同裤脂浓度的空白脂质体孔.继续培养24小时和48小时后，检测 细胞活性.每孔加入MTT(5,0g/L) lOjil， 371C温育4小时，弃上清， 加入DMSO (二甲基亚砜)100 fil，振荡数分钟，30分钟内在全自动 酶标仪上读取570 nm处吸光值，并计算实验孔和空白对照孔的比值， 40、 60mg/L的OHB处理鼠成纤维细胞L929 24小时后，细胞活 力分别为空白孔的99.2±7.2%、 105.5±9.3%，而相同磷脂浓度的空白脂 质体处理后细胞活力分别为对照孔的141.9±3.4%、 145.8±12.3%， 二 者相比差异显著(P<0.05) . 40、 60mg/L的OHB脂质体处理鼠成纤 维细胞L929 48小时后，细胞活力分别为空白孔的109.5±16.0%、 124.8±9.2 % ，而相同砩脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对 照孔的160.4±12.3%、 183.2±22.2%， 二者相比差异显著(P<0.05)(图 1).本实验说明了 OHB能够抑制成纤维细胞增殖.
实施例11 MTT法检測OHB对食管癌细胞系EC109增殖的彩响
生长状况良好的EC109细胞(购于中国预防医学科学院)用胰酶 消化液处理2分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液， 血球计数板检测细胞数量，接种于96孔板中(5xl()S个细胞/孔)，37 1C， 5% C02细胞贴壁培养24小时后去掉培养液，PBS (砩酸盐援冲 液，pH 7.2 )润洗2遍，更换新鲜培养液，并加入含一 系列浓度梯度(OHB 终浓度为5、 20、 40、 60mg/L)过滤灭菌的OHB脂质体(Mn = 2000， 礴脂浓度为2g/L)，每一浓度做6个平行孔；实验设置空白孔和相同 礴脂浓度的空白脂质体对照孔.继续培养24小时和48小时后，检测 细胞活性.每孔加入MTT(5.0g/L) 10jU， 37TC温育4小时，弃上清， 加入DMSO100jU,振荡数分钟，30分钟内在全自动酶标仪上读取570 nm处吸光值，并计算实验孔和空白对照孔的比值.
40、 60mg/L的OHB脂质体处理食管癌细胞系丑(:10924小时后，细胞活力分别为空白孔的100.5±12.0%、 113.4±5.9%,而相同浓度的空 白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的129,2±7.6%、 13S.2±S.8%， 二者相比差异显著(P<0.05) . 20、 60mg/L的OHB脂质体处理食管 癌细胞系EC109 48小时后，细胞活力分别为空白孔的101.5±8.3%、 122.2±lS.3o/。，而相同磷脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对 照孔的139.3±11.5%、 157.8±5.8%, 二者相比差异显著(P<0.05 )(图 2)。本实验说明了 OHB能够抑制食管癌细胞增殖。
实施例12 MTT法检测OHB对原代食管癌细胞增殖的彩响
生长状况良好的原代食管癌细胞(传至笫三代)用胰醉消化液处理 2分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液，血球计数板检 测细胞数量，接种于96孔板中(5"03个细胞/孔)，3710，5%(:02细 胞貼壁培养24小时后去掉培养液，PBS (磷酸盐緩冲液，pH7.2)润 洗2遍，更换新鲜培养液，并加入含一系列浓度梯度(OHB终浓度为 5、 20、 40、 60mg/L)过滤灭菌的OHB脂质体(Mn-2000，鳞脂浓 度为2g/L)，每一浓度做6个平行孔；实验设置空白孔和相同磷脂浓 度的空白脂质体对照孔.继续培养24小时和48小时后，检测细胞活 性，每孔加入MTT (5.0g/L) lOjil， 37"C温育4小时，弃上清，加入 DMSO100jU,振荡数分钟，30分钟内在全自动蘇标仪上读取570nm 处吸光值，并计算实验孔和空白对照孔的比值.
20-60 mg/L的OHB脂质体处理食管癌细胞24小时后，细胞活力 分别为空白孔的78,2±6.7%、 100.3±1.8%、 123.6±2.5%而相同磷脂浓 度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的125.8±5.7% 、 168.7±3.7%、 192.0±5.4%， 二者相比差异显著(P<0.05) , 20-60 mg/L 的OHB脂质体处理食管癌细胞48小时后，细胞活力分别为空白孔的 90.8±3.6%、 135.6±9.2%、 145.0±2.4%，而相同罅脂浓度的空白脂质体 处理后细胞活力分别为对照孔的150.1±3.6%、 175.4±9.2%、 220.36±2.4 %, 二者相比差异显著(P<0.05)(图3).本实验说明了 OHB能够 抑制食管癌细胞增殖.
实施例13 MTT法检测OHBHHx对食管癌细胞系EC109增殖的彩响 生长状况良好的EC109细胞(购于中国预防医学科学院)用胰酶 消化液处理2分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液，
17血球计数板检测细胞数量，接种于96孔板中(5xl()S个细胞/孔)，37 TC， 5% C02细胞贴壁培养24小时后去掉培养液，PBS (砩酸盐緩冲 液，pH 7.2)润洗2遍，更换新鲜培养液，并加入含一系列浓度梯度 (OHBHHx终浓度为5、 20、 40、 60 mg/L)过滤灭菌的OHBHHx脂 质体(Mn = 2800，含12mo1。/。 3-羟基己酸，磷脂浓度为2 g/L)，每 一浓度做6个平行孔；实验设置空白孔和相同礴脂浓度的空白脂质体 对照孔.继续培养24小时和48小时后，检测细胞活性，每孔加入 MTT (5.0g/L) lOjd， 371C温育4小时，弃上清，加入DMSO100nl， 振荡数分钟，30分钟内在全自动醉标仪上读取570nm处吸光值，并计
算实验孔和空白对照孔的比值.
40、 60 mg/L的OHBHHx脂质体处理食管癌细胞系EC109 24小 时后，细胞活力分别为空白孔的103.8±8,1%、 101.7±7.2%，而相同磷 脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的128.7±5.8% 、 145.8:t6.3 % ， 二者相比差异显著(P<0.05 ) 。 20、 60 mg/L的OHBHHx 脂质体处理食管癌细胞系EC109 48小时后，细胞活力分别为空白孔的 129.2±7.6%、 135.2±5.8%,而相同裤脂浓度的空白脂质体处理后细胞 活力分别为对照孔的139.3±11.5%、 157.8±5.8%， 二者相比差异显著 (P<0.05)(图4).本实验说明了 OHBHHx能够抑制食管癌细胞增 殖.
实施例14 MTT法检测OmdHA对食管癌细胞系EC109增殖的彩响 生长状况良好的EC109细胞用胰酶消化液处理2分钟，吸除消化 液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液，血球计数板检测细胞数量，接 种于96孔板中(5乂103个细胞/孔)，37"0，5%(:02细胞貼壁培养24小 时后去掉培养液，PBS(礴酸盐緩冲液，pH7.2)润洗2遍，更换新鲜 培养液，并加入含一系列浓度梯度(OmclHA终浓度为5、 20、 40、 60 mg/L)过滤灭菌的Omc旧A脂质体(Mn = 2300，含有1.6 mol% 3-羟 基己酸，24.6 rool% 3-鞋基辛酸，71.2 mol% 3-羟基癸酸和2.6 mol% 3-羟 基十二酸，辨脂浓度为2g/L)，每一浓度做6个平行孔；实验设置空 白孔和相同磷脂浓度的空白脂质体对照孔.继续培养24小时和站小 时后，检测细胞活性，每孔加入MTT (5.0g/L) lOpl， 37TC温育4小 时，弃上清，加入DMSO 100 jil，振荡数分钟，30分钟内在全自动酶标仪上读取570 nm处吸光值，并计算实验孔和空白对照孔的比值.
40、 60mg/L的OmdHA处理食管癌细胞系EC109 24小时后，细 胞活力分别为空白孔的105.6±10.5°/。和115.0±8,9%,而相同礴脂浓度 的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的128.7±5.8%、 145.8±6,3 %， 二者相比差异显著(P<0.05) . OmclHA脂质体处理食管癌细胞系 EC109 48小时后，和相同辨脂浓度的空白脂质体处理无统计学差异(图 5)。
实施例15 Annexin V-FITC检测OHB对小鼠成纤维细胞L929细胞凋 亡的彩响
0.25%胰酶溶液消化细胞，调节待测细胞的浓度为5xl()5-lxl(^个 /ml, 取lml细胞，1000 rpm， 4TC离心10分钟，弃上清。加入1 ml 冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮离心，重复两次.将细胞重悬于200^11 Binding Buffer,加入10 pl Annexin V-FITC和5 fil PI (北京宝赛试 剂)，轻轻混匀，避光室温反应15分钟，加入300 pi Binding Buffer, 在1小时内上机(Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪)检测.结果 显示，成纤维细胞经过40 mg/L的OHB(Mn-2000，砩脂浓度为2g/L) 处理24h和48h后，调亡率分别较空白处理组高1.2%和1.9%,死亡 率分别增加了 8.42%和8.67%，具有统计学差异(困6) 说明OHB 促进了细胞的凋亡和死亡。
实施例16 Annexin V-FITC检测OHBHHx对原代食管癌细胞凋亡的 触
0.25%胰酶溶液消化细胞，调节待测细胞的浓度为5xl0S-lxl()S个 /ml, 取lml细胞，1000 rpm， 4TC离心10分钟，弃上清。加入1 ml 冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮离心，重复两次.将细胞重悬于200^ Binding Buffer'加入10 Annexin V-FITC和5 pi PI (北京宝赛试 剂)，轻轻混匀，避光室温反应15分钟.加入300 ^ Binding Buffer, 在1小时内上机(Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪)检测。结果 显示，原代食管癌细胞(传至第三代)经过40 mg/L的OHBHHx (Mn =2800，含12moP/。3-羟基己酸，裤脂浓度为2 g/L)处理24 h和48 h 后，凋亡率分别较空白处理组高4.3%和1.7%，死亡率分别增加了8.5%和10.5%,具有统计学差异(闺7).说明OHBHHx促进了细胞的 凋亡和死亡，
实施例17 Annexin V-FITC检測Q3HB4HB对人原代食管癌细胞 EC109细胞凋亡的彩响
0.25%胰酶溶液消化细胞，调节待测细胞的浓度为5><105-1><106个 /ml。 取lml细胞，1000 rpm， 4TC离心10分钟，弃上清，加入1 ml 冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮离心，重复两次.将细胞重悬于200^1 Binding Buffer,加入10 pl Annexin V-FITC和5 PI (北京宝赛试 剂)，轻轻混匀，避光室温反应15分钟.加入300 pi Binding Buffer, 在1小时内上机检测，结果显示，成纤维细胞经过40 mg/L的03HB4HB (Mn=2100，含有7mo1。/。 4-羟基丁酸，蜂脂浓度为2 g/L)处理后24 h和48h后，凋亡率分别较空白处理组高3.1%和2.5%，死亡率分别 增加了 6.0%和6.5%，具有统计学差异(图8),说明03HB4HB促进 了细胞的凋亡和死亡.
实施例18 流式细胞术检测OHB对小鼠成纤维细胞L929细胞周期的 彩响
胰酶消化细胞，1 ml培养液吹匀，1000 rpm离心10分钟；弃去 上清，PBS清洗2次，0.5mlPBS吹匀；5ml注射器将细胞吸起并吹入 5 ml 70%预冷的乙醇中，4 TC固定过夜；1000 rpm离心10分钟收集 固定细胞，PBS清洗2次；0.5mlPBS重悬细胞并轻轻吹匀(防止细胞 破碎)；加入1.5jilRNaseA至终浓度为10 |ig/ml， 371C消化30分钟； 加入0,25 ml Pl溶液至终浓度为10 jig/ml，冰浴中遊光染色30分钟； 上机(Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪)检测，通过软件分析流 式细胞仪收集到的细胞群体，结果显示，成纤维细胞经过40 mg/L的 OHB ( Mn - 2000，罅脂浓度为2 g/L)处理24 h和48 h后，G"G，期 细胞数分别比空白脂质体处理组增加了 10.1%和12.0°/。，具有统计学差 异(图9)，说明了 OHB抑制成纤维细胞增殖的部分原因是延长了细 胞的Gt期所致。
实施例19 流式细胞术检测03HB4HB对食管癌细胞系EC109细胞周期的影响
胰酶消化细胞，1 ml培养液吹匀，1000 rpm离心10分钟；弃去 上清，PBS清洗2次，0.5mlPBS吹匀；5 ml注射器将细胞吸起并吹 入5ml70。/。预冷的乙醇中，4 TC固定过夜；1000 rpm离心10分钟收 集固定细胞，PBS清洗2次；0.5mlPBS重悬细胞并轻轻吹匀(防止 细胞破碎)；加入1.5(URNaseA至终浓度为10|ig/ml， 371C消化30分 钟；加入0.25 ml PI溶液至终浓度为10 jig/ml,冰浴中遊光染色30分 钟；上机检测，通过软件分析流式细胞仪收集到的细胞群体.结果显 示，食管癌细胞EC109经40 mg/L的03HB4HB ( Mn 2100,含7 mol % 4-羟基丁酸，裤脂浓度为2g/L)处理24h和48h后，Gg/G,期細胞 数分别比空白脂质体处理组增加了 11.3%和12.7°/。，具有统计学差异 (图10)，说明了 03HB4HB抑制食管癌细胞增殖的部分原因是延长 了细胞的G!期所致.
实施例20 流式细胞术检测Omc旧A对原代食營癌细胞细胞周期的影 响
胰酶消化细胞，1 ml培养液吹匀，1000 rpm离心10分钟；弃去 上清，PBS清洗2次，0.5mlPBS吹勻；5 ml注射器将细胞吸起并吹 入5ml70。/。预冷的乙醇中，4 TC固定过夜；1000 rpm离心10分钟收 集固定细胞，PBS清洗2次；0.5 ml PBS重悬细胞并轻轻吹匀；加入 1.5plRNaseA至终浓度为10 ng/ml，37TC消化30分钟'，加入0，25 ml PI 溶液至终浓度为10叫/ml，冰浴中避光染色30分钟；上机检测，通过
软件分析流式细胞仪收集到的细胞群体.结果显示，原代食管癌细胞 (传至第三代)经过40 mg/L的Omc旧A ( Mn - 2300，含有1.6 mol% 3-鞋基己酸，24,6 mol% 3-羟基辛酸，71.2 mol。/o3-羟基癸酸and 2.6 mol% 3-轻基十二酸，碑脂浓度为2 g/L)处理后24 h和48 h后，Go/Gt 期细胞数分别比空白脂质体处理组增加了 7.1%和6.7% (困11)，无 统计学差异.
实施例21 钙成像法检测塞聚3-羟基丁酸(OHB)对小鼠成纤維细 L929胞内钙离子浓度的彩响
消化后的小鼠成纤维细胞L929在含有圃形玻片的六孔板中爬片培养，细胞完全貼壁后，移去培养孔中的原培养液，用PBS液冲洗细胞1 遍，加入10 jimol/L Fluo-4染料液150 jU,置于37"的COz培养箱里 避光醉育30 min.将染色后的细胞用Hanks液沖洗3遍，加入600 pl Hanks液后置于激光共聚焦显微镜(Zeiss Meta 510) 20倍可见光下寻 找区域及层面.选择488nm氳离子激光，观察染色的细胞的某一层面 的荧光图像.连续扫描40张荧光图象，灌流加脂质体包衮的寡聚3-幾 基丁酸溶液(终浓度1 g/L)继续扫描.相同的条件下用对照药物处理.
钙离子浓度检测结果显示，脂质体包泉的OHB能够引起成纤维细 胞胞内钙离子荧光强度的突然升高了 400%,奉这个水平维持了 24秒， 而后钙离子焚光强度逐渐下降到原来水平，荧光强度从出现变化到恢 复持续时间102秒，而对照组空白脂质体的加入却几乎没有引起钙离 子荧光强度的任何变化，两者形成显著性差异(困12)，这个现象在 很多重复实验中得到验证，结果显示了 OHB可以引起成纤维细胞胞质 内钙离子浓度的短暂增加
为研究OHB引起胞内钙离子浓度升高的机理，研究胞内增加的钙 离子是来源于胞外溶液，还是来源于胞内钙库的释放，分别使用含有 Ca"的Hanks溶液以及无钾的Hanks溶液进行实验.结果显示，在含 有钙离子的Hanks液中，加入寡聚体之后，引起荧光强度升高400%， 而在无^5的Hanks液中，加入寡聚体，同样是荧光强度增加，却只是 升高了 100%,但是荧光强度下降比较援慢，两者荧光强度从出现变化 到恢复持续时间相同(图12).我们可以推测这种现象的原因是虽然 胞外没有钙离子，但是寡聚3-羟基丁酸借助脂质体，被运送到细胞内， 启动了胞内钾库的释放信号.
为了证实这种升高是由于药物OHB刺激了细胞膜上的钙通道及 胞内相关受体信号，还是由于OHB本身引起的胞内钙离子浓度增加， 使用有钙的Hanks液作为细胞外液，首先加入内质网的的钙释放通道 阻断剂普香卡因结果显示在使用普鲁卡因后，仍然观察到细胞中钙离 子荧光强度增加了 90%,持续了 90秒恢复(图13)，由此可以推测 胞内钙离子不仅来源于钙库，还来源于胞外.Hanks液中又添加了细 胞膜钙离子通道阻断剂氯化镧，仍然观察到细胞中钙离子荧光强度的 增加，但是增加幅度已经下降到60%，持续了 90秒才恢复(困13)， 显示了 OHB还具有携带钓离子进入细胞的能力.上述实验结果说明OHB促进胞内钙离子浓度的增加途径是多样 的，不仅能够通过钙离子通道内流引起胞内钙离子升高，也能够通过 引起胞内钙库的释放升高胞内钙离子浓度.更为关键的是也能连同脂 质体起到向胞内运输钙离子的作用.
实施例22钙成像法检测塞聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸(OHBHHx)对 小鼠成纤维细胞L929胞内钙离子浓度的彩响
消化后的小鼠成纤维细胞L929在含有圃形玻璃片的六孔板中爬片 培养，细胞完全貼壁后，移去培养孔中的原培养液，用PBS液沖洗细 胞1遍，加入10 jimol/L Fluo-4染料液150 置于37"C的C02培养 箱里避光孵育30mhi.将染色后的细胞用Hanks液冲洗3遍，加入600 W Hanks液后置于激光共聚焦显微镜(Zeiss Meta 510) 20倍可见光下 寻找区域及层面，选择488nm氩离子激光，观察染色的细胞的某一层 面的荧光图像.连续扫描40张荧光困象，灌流加脂质体包裒的寡聚-3 幾基丁酸-3-幾基己酸溶液(终浓度lg/L)继续扫描.相同的条件下用 对照药物处理.
钙离子浓度检测结果显示，脂质体包泉的OHBHHx也能够引起成 纤维细胞胞内钙离子荧光信号升高了 93%，而后钙离子荧光强度緩慢 下降，持续96秒恢复到原来水平.而对照组空白脂质体的加入却几乎 没有引起钙离子荧光强度的任何变化，两者差异性显著(图14),这 个现象在很多重复实验中得到验证，OHBHHx可以引起细胞胞质内钙 离子浓度的突然变化，
为研究OHBHHx引起胞内钙离子浓度升高的机理，研究胞内增加 的钙离子是来源于胞外溶液，还是来源于胞内钙库的释放，在含钙的 细胞外液中加入钙离子螯合刑EGTA，结果显示，在加入EGTA后， 同样观察到钙图象荧光强度緩慢增加，到最高点时也没有在含有钙离 子的Hanks液中荧光强度变化大(只有恥％ )(困14).我们可以推 测这种现象的原因是虽然胞外没有钙离子，但是OHBHHx借助脂质 体，被运送到细胞内，启动了胞内钙库的释放信号.
为了证实这种升高是由于OHBHHx刺激了细胞膜上的钙通道及 胞内的相关受体信号，还是由于OHBHHx本身引起的胞内钙离子浓度 增加，我们在细胞外液中加入了内质网的的钩释放通道阻断刑普香卡因和细胞膜钙离子通道阻断刑氯化铺.结果显示在使用了氯化镧和普
鲁卡因后，仍然观察到细胞中钙离子浓度的増加(困15),看来OHBHHx 还具有携带钙离子进入细胞的能力.
结合上述分析，OHBHHx促进胞内^5离子浓度的增加途径是多样 的，不仅能够通过钙离子通道内流引起胞内钙离子升高，也能够通过 引起胞内钙库的释放升高胞内钙离子浓度.更重要的是也能连同脂质 体起到向胞内运榆钙离子的作用.
实施例23钙成像法检测塞聚-3羟基丁酸-4-羟基丁酸(03HB4HB) 对SD大鼠原代心肌细胞胞内钙离子浓度的彩响
按照实施例4方法分离的心肌细胞在含有圃形玻璃片的六孔板中 爬片培养，细胞完全贴壁后，移去培养孔中的原培养液，用PBS液冲 洗细胞1遍，加入10 jimol/L Fluo-4染料液150 置于371C的C02 培养箱里避光孵育30 min.将染色后的细胞用Hanks液沖洗3遍，加 入600 )il Hanks液后置于激光共聚焦显微镜(Zeiss Meta 510) 20倍可 见光下寻找区域及层面.选择488nm氩离子激光，观察染色的细胞的 某一层面的荧光困像.连续扫描60张荧光困象，灌流加脂质体包袭的 寡聚-3鞋基丁酸-4-轻基丁酸溶液(终浓度l g/L)继续扫描致400张. 相同的条件下用对照药物处理.
钙离子浓度检测结果显示，脂质体包衮的03HB4HB能够引起细 胞胞内钙离子荧光信号的连续的波动，随着时间的延长，波动峰值逐 渐减小，而对照组空白脂质体的加入却几乎没有引起钙离子浓度的任 何波动变化(困16).两者存在差异在于寡聚物所起的作用，即 03HB4HB刺激心肌细胞胞内钙离子的波动.
实施例24钙成像法检测塞聚中长链3羟基脂肪酸(Omc旧A)对SD 大鼠原代心肌细胞胞内钙离子浓度的影响
细胞培养条件，荧光燃料染色，激光共聚焦显微镜参数选择和对 照组设定与实施例18中相同.
激光共聚焦显微镜对钙离子信号检测结果显示，脂质体包塞的 Omc氾A能够引起细胞胞内钙离子荧光强度的间断性变化，而对照组 空白脂质体的加入却几乎没有引起钙离子荧光强度的任何变化，两者
24存在明显差异(困17).这种胞质内钙离子浓度波动是由于加入 OmclHA引起，
本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等， 均以引用的方式将其全部内容包括在本文中.
应当理解，在不偏离本发明的精神和范闺的情况下，本领域的普 通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均 被认为落入了本发明的保护范围。春者文献
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1.式(I)化合物，其中中括号内为结构单元，各结构单元可以相同或不同；n表示结构单元的总数，选自1～100的整数；各结构单元的m独立地选自1～3的整数；各结构单元的R1独立地选自由H、C1-C9的烷基、C1-C9的烷氧基和芳基构成的组；R2选自由H、C1-C9的烷基、芳基和无毒金属离子构成的组。
2. 根据权利要求1的化合物，其中R2选自由H、 d-Cs的烷基和无毒金属离子构成的组.
3. 根据权利要求2的化合物，其中R2选自由H、 d-C3的烷基、Na+、 K+和Ca^构成的组.
4. 根据权利要求1的化合物，其中Rt选自由H、 d-Cs的烷基、 Q-Cs的烷氧基构成的组.
5. 根据权利要求4的化合物，其中R,选自由H、 d-C3的烷基构成的组.
6. 根据权利要求l的化合物，其中R,选自由H、 d-C2的烷基构 成的组，R2选自由H、 C广Cz的烷基、Na+和K+构成的组.
7. 根据权利要求l的化合物，其中，m为l或2，并且当m-l时， R^不为甲基.
8. 根据权利要求l的化合物，其中，n为l-50的整数.
9. 根据权利要求l的化合物，其数均分子量不超过10000.
10. 根据权利要求l的化合物，所述化合物选自由以下成员构成的 组寡聚3-羟基丁酸、寡聚3-羟基戊酸、寡聚3-羟基己酸、寡聚3-羟 基庚酸、寡聚3-羟基辛酸、寡聚3-羟基壬酸、寡聚3-羟基癸酸、寡聚4-羟基丁酸、寡聚4-羟基戊酸、寡聚3-羟基丁酸-4-幾基丁酸共聚薛、 寡聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚醋、寡聚中长链脂肪酸共聚癍.
11. 一种用于调节细胞内钙离子浓度的制剂，含有作为活性成分的 权利要求l-10之任一项的化合物或其对映异构体，
12. 根据权利要求11的制刑，其中所述制刑用于提高细胞内钙离 子浓度.
13. 根据权利要求11或12的制剂，其中所述细胞选自由成纤维细 胞、食管癌细胞、心肌细胞、胰腺细胞、成骨细胞、神经细胞、神经 胶质细胞、巨噬细胞构成的组.
14. 一种用于调节细胞生长的制剂，含有作为活性成分的权利要求 1-10之任一项的化合物或其对映异构体.
15. 根据权利要求14的制刑，其中所述制刑抑制细胞的增殖或者 促进细胞调亡.
16. 根据权利要求14或15的制剂，其中所述细胞为癌细胞.
17. 根据权利要求16的制剂，其中所述制剂促进癌细胞的凋亡.
18. 根据权利要求14的制刑，其中所述制剂用于治疗癌症.
19. 权利要求1-10之任一项的化合物或其对映异构体在制备用于调节细胞内钙离子浓度的制刑中的用途，
20. 权利要求1-10之任一项的化合物或其对映异构体在制备用于调节细胞生长的制剂中的用途.
21. 权利要求1-10之任一项的化合物或其对映异构体在制备用于治疗钙离子通道疾病的药物中的用途.
22. 根据权利要求21的用途，其中所述钙离子通道疾病为心脏骤停或心力衰竭.
全文摘要
本发明提供了羟基脂肪酸寡聚物及其在调节细胞生长和提高细胞内钙离子浓度中的用途。试验证明，本发明的羟基脂肪酸寡聚物可以抑制癌细胞的增殖，诱导细胞的凋亡和死亡；延长细胞的G₁期，降低癌细胞的分裂程度。进一步的钙成像技术检测显示，本发明的寡聚物还可以刺激细胞内游离钙离子浓度的升高。
文档编号A61P3/14GK101313900SQ20071010667
公开日2008年12月3日 申请日期2007年5月29日 优先权日2007年5月29日
发明者代忠伟, 杰 孙, 陈国强 申请人:汕头大学