专利名称：槐糖脂在制备抗皮肤癣菌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用拟威克酵母变种(Wc7fer/ a/M'eWa ^o/ erc^ae sop力oroh'/^d发酵产生的生物表面活性剂槐糖脂的应用，尤其涉及槐糖脂在制 备抗皮肤癣菌药物中的应用。
背景技术：
槐糖脂是一种重要的生物表面活性剂，对于它的研究始于二十世纪五、六十 年代，主要是通过微生物发酵获得。与化学合成的表面活性剂相比，槐糖脂具有 表面性能优良、环境友好等许多优点。
近年来，关于槐糖脂抑菌作用的研究己经有所报道，申请人也曾对槐糖脂抑 制细菌的作用进行了初歩研究，并于2007年1月申请了中国发明专利"槐糖脂 在制备抗生素药物中的应用，专利号200710013200.0"。然而，经文献和专利检 索，利用微生物产生的槐糖脂生物表面活性剂用于制备抗皮肤癣菌(特别是真菌) 药物的研究还未见报道。
目前临床上皮肤癣菌造成的感染日益增多，而用于治疗皮肤癣的药品品种单 一，很多患者在痛苦的折磨下，选用了内服或注射皮质类固醇激素，结果非但治 不好，还会出现脸肿、血压升高、头暈等副作用，导致病情加重。因此，研究和 开发替代易产生耐药性的常规抗真菌药物及有严重副作用的皮质类固醇激素等 治疗皮肤癣病的药物具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中所述的不足，本发明要解决的问题是提供一种槐糖脂在制备 抗皮肤癣菌药物中的应用。
本发明所述槐糖脂在制备抗皮肤癣菌药物中的应用。同时还包括以槐糖脂为 有效成分的组合物在制备抗皮肤癣菌药物中的应用。
其中，所述皮肤癣是头癣、体癣、股癣、甲癣和/或手足癣；所述皮肤癣菌 是真菌。
其中，所述真菌主要是指红色毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样毛癣菌和/或糠 枇孢子菌。
上述应用中，所述槐糖脂有效抑制皮肤癣菌的药物浓度为O. l 5.0g/L;优 选的有效抑制皮肤癣菌的药物浓度为0. 2 4. 0g/L;最优选的有效抑制皮肤癣菌 的药物浓度为0. 5 3. 0g/L。
利用本发明所述槐糖脂加入药学上可接受的辅料或赋形剂可以制成任何--种药剂学上所说的剂型。
以本发明所述槐糖脂为有效成分加入抑真菌组分和药学上可接受的辅料或 赋形剂组成抑皮肤癣菌的药物组合物，同样也可以制成任何一种药剂学上所说的 剂型。
本发明所述抗皮肤癣菌药物的剂型优选软膏剂、液体制剂之一。
其中，液体制剂优选液体擦剂。
上述软膏剂、液体制剂的药物制剂可以按照本行业已知的方法制备，在制备 过程中使用可药用辅料或赋形剂，例如黏合剂(如预胶化淀粉、聚乙烯吡咯烷酮 或羟丙基纤维素)、填料(例如乳糖、蔗糖、甘露醇等)、润滑剂(例如硬脂酸、 聚乙二醇、硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)、崩解剂(例如淀粉、羧甲基纤维素 钠)或者润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。
为了更好地理解本发明的实质，下面以槐糖脂的药理实验及结果来说明槐糖 脂作为抑制红色毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样毛癣菌、糠秕孢子菌的抗皮肤癣菌 药物的应用。
本发明所述槐糖脂的制备
(1) 菌禾中选择拟威克酉孝母变禾中 f/cAerAafflie^s c/cwei-c^j'se var. 50/ / aroh'jW't/ CGMCC No. 1576;
(2) 斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为 1.5 2.0%的琼脂，25 35 'C条件下，静止培养24 48小时；
(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2 环于20 100 mL含有质量体积比为4 14%的葡萄糖和1 8°/。的菜籽油的基本无 机盐培养基中，25 35 'C条件下，振荡培养24 48小时，制得种子液；
(4) 扩大培养以5 10%的体积比的接种量，将种子液接种于100 1000mL 含有质量体积比为4 14%的葡萄糖和1 8%的菜籽油的基本无机盐培养基中， 25 35 'C条件下，振荡培养96 288小时；
(5) 收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集 沉积在摇瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以4000 7000转/分钟将所述粘稠物质 离心，收集沉淀部分，即为槐糖脂粗提物；
(6) 减压蒸馏将步骤(5)所得槐糖脂粗提物，在温度50 7(TC，压力 0. 2 0. 8Kg/cm2，真空度为0. 02 0. 08Mpa的条件下进行减压蒸馏，蒸发去除其 中的水分；
(7) 收集物千燥将上述收集的减压蒸馏残渣，在50 100°C，真空度 0.02 0.08 Mpa条件下，真空干燥12 24小时，制得固体槐糖脂。
皮肤癣菌的菌体制备
将斜面保存的红色毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样毛癣菌和糠秕孢子菌各取一 接种环分别转接到液体沙保氏培养基中，在25 37"C下培养10 20小时，分别 制得红色毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样毛癣菌和糠秕孢子菌的菌悬液。
皮肤癣菌抑菌试验
将本发明方法制得的槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。 取槐糖脂母液分别加到沙保氏固体平板培养基中，倒平板并使各平板终浓度 呈0. 1 5.0 g/L的梯度浓度。取红色毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样毛癣菌和糠 秕孢子菌悬液各O. 1 mL涂布到上述呈梯度浓度的固体平板培养基中，在25 35r 下培养12 120小时，观察平板上的皮肤癣菌的生长情况，计算平均菌落数。
上述液体沙保氏培养基(用于真菌培养)的配方是蛋白胨10 g/L，葡萄 糖40 g/L,pH 6. 5。
上述固体沙保氏培养基(用于真菌培养)的配方是蛋白胨10 g/L,葡萄 糖40 g/L，琼脂粉20 g/L， pH 6. 5。
抑菌试验结果显示
添加了较低剂量的槐糖脂(lg/L)平板在较长时间G20h)内，仅有少量菌 落生长，当添加槐糖脂浓度达到2g/L时，红色毛癣菌的生长被完全抑制(见图 1)。
对于犬小孢子菌、石膏样毛癣菌和糠秕孢子菌，在添加了较低剂量的槐糖脂 (0.5 g/L)平板上，其生长即可以被完全抑制(见图2，图3，图4)。
本发明所述槐糖脂在制备抗皮肤癣菌药物中的应用中，槐糖脂利用拟威克酵 母变种发酵生产，具有工艺方法简便、成本低、纯度高的特点，因此制备的制剂 价格低廉，且用量少，抑菌效果显著，对人体无任何毒副作用。将其开发为临床 外用洗液、软膏剂等药物剂型，可以在某些方面作为替代易产生耐热性的常规抗 真菌药物及有严重副作用的皮质类固醇激素等治疗皮肤癣病的药物，具有极大的 应用前景。
图1槐糖脂平板对红色毛癣菌生长的抑制
显示槐糖脂浓度在2 g/L下，能够完全抑制红色毛癣菌的生长。 A没有添加槐糖脂的对照；B添加了二甲亚砜的对照；C添加了浓度为式 1. 0%的槐糖脂;D添加了浓度为2. 0%的槐糖脂。
图2槐糖脂平板对犬小孢子菌生长的抑制
显示槐糖脂浓度在l.O g/L下，能够完全抑制犬小孢子菌的生长。 A没有添加槐糖脂的对照；B添加了二甲亚砜的对照；C添加了浓度为 0.5%的槐糖脂;D添加了浓度为1.0%的槐糖脂。 图3槐糖脂平板对石膏样毛癣菌生长的抑制
显示槐糖脂浓度在l.O g/L下，能够完全抑制石膏样毛癣菌的生长。 A没有添加槐糖脂的对照；B添加了二甲亚砜的对照；(:添加了浓度为0.5% 的槐糖脂；D添加了浓度为1.0%的槐糖脂。 图4槐糖脂对糠秕孢子菌生长的抑制
显示槐糖脂浓度在l.O g/L下，能够完全抑制糠秕孢子菌的生长。 A没有添加槐糖脂的对照；B添加了 二甲亚砜的对照；C添加了浓度为0. 5% 的槐糖脂；D添加了浓度为1.0%的槐糖脂。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明内容作进一歩的说明。 实施例l:槐糖脂的制备
(1)菌禾中选择拟威克酵母变禾中(伊icAer/ 3迈/e^a G/0fflerc9iae var. sop/ oroh》iW) CGMCC No. 1576;
(2) 斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为 1.6%的琼脂，25 'C条件下，静止培养24小时；
(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2 环于20 mL含有质量体积比为4%的葡萄糖和1%的菜籽油的培养基中，25'C条件 下，振荡培养24小时，制得种子液-，
(4) 扩大培养以5%的体积比的接种量，将种子液接种于100 mL含有质 量体积比为1%的菜籽油的培养基中，25 'C条件下，振荡培养96小时；
(5) 收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集 沉积在摇瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以5000转Z分钟将上述粘稠物质离心， 收集固态部分，即为槐糖脂粗提物。
(6) 减压蒸馏将歩骤(5)所得槐糖脂粗提物，在温度6(TC，压力0.4 kg/cm2，真空度为0.04Mpa的条件下进行减压蒸馏，蒸发去除其中的水分；
(7) 收集物干燥将上述收集的减压蒸馏残渣，在7(TC，真空度0.04Mpa 条件下，真空干燥16小时；制得固体槐糖脂。
实施例2:槐糖脂的制备
(1) 菌禾中选择拟威克酉孝母变禾中(/ficAer力a/Hie7Ja c/offlarcgiae var. s叩/wroh'/wW) CGMCC No. 1576;
(2) 斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为 1.6%的琼脂，3(TC条件下，静止培养36小时；
(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2 环于50 mL含有质量体积比为8%的葡萄糖和3%的菜籽油的培养基中，3(TC条件 下，振荡培养36小时，制得种子液；
(4) 扩大培养以7%的体积比的接种量，将种子液接种于500 mL含有质 量体积比为3%的菜籽油的培养基中，30 'C条件下，振荡培养200小时；
(5) 收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集 沉积在摇瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以6000转/分钟将上述粘稠物质离心， 收集固态部分，为槐糖脂粗提物。
(6) 减压蒸馏将步骤(5)所得槐糖脂粗提物，在温度7(TC，压力0.8 kg/cm2，真空度为0.08 Mpa的条件下进行减压蒸馏，蒸发去除其中的水分；
(7) 收集物干燥将上述收集的减压蒸馏残渣，在10(TC，真空度0.08Mpa 条件下，真空干燥24小时；制得固体槐糖脂。
实施例3:槐糖脂作为抑制红色毛癣菌的抗皮肤癣菌药物的应用
红色毛癣菌的菌体制备将斜面保存的红色毛癣菌取一接种环转接到液体沙 保氏培养基中，在37'C下培养20小时，制得红色毛癣菌悬液。 将实施例1制得的槐糖脂以二曱亚砜溶解制成母液，备用。 取槐糖脂母液分别加到沙保氏固体培养基中，倒平板并使各皿终浓度呈 0. 1 5. 0 g/L的梯度浓度。取红色毛癣菌悬液0. 1 mL涂布到上述呈梯度浓度的 固体平板培养基中，在35。C下培养120小时，观察平板上的皮肤癣菌的生长情
况，计算平均菌落数。
上述液体沙保氏培养基(用于真菌培养)的配方是蛋白胨10 g/L，葡萄
糖40 g/L， pH 6. 5。
上述固体沙保氏培养基(用于真菌培养)的配方是蛋白胨10 g/L，葡萄 糖40 g/L，琼脂粉20 g/L， pH 6.5。
抑菌试验结果显示
添加了较低剂量的槐糖脂(1.0g/L)平板在较长时间(120h)内，仅有少量 菌落生长，当添加槐糖脂浓度达到2.0 g/L时，红色毛癣菌的生长被完全抑制 (见图1)。
实施例4:槐糖脂作为抑制犬小孢子菌的抗皮肤癣菌药物的应用
犬小孢子菌的菌体制备将斜面保存的犬小孢子菌取一接种环转接到液体沙
保氏培养基中，在3(TC下培养20小时，制得犬小孢子菌悬液。 将实施例l制得的槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。 取槐糖脂母液分别加到沙保氏固体培养基中，倒平板并使各皿终浓度呈
0. 1 5. 0 g/L的梯度浓度。取犬小孢子菌悬液0. 1 mL涂布到上述呈梯度浓度的
固体平板培养基中，在3(TC下培养120小时，观察平板上的犬小孢子菌的生长
情况，计算平均菌落数。
上述液体沙保氏培养基(用于真菌培养)的配方是蛋白胨10 g/L，葡萄
糖40 g/L， pH 6. 5。
上述固体沙保氏培养基(用于真菌培养)的配方是蛋白胨10 g/L，葡萄
糖40 g/L，琼脂粉20 g/L， pH 6.5。 抑菌试验结果显示
犬小孢子菌在添加了较低剂量的槐糖脂(0.5 g/L)平板上，其生长即可以 被完全抑制(见图2)。
实施例5:槐糖脂作为抑制石膏样毛癣菌的抗皮肤癬菌药物的应用
石膏样毛癣菌的菌体制备将斜面保存的石膏样毛癣菌取一接种环转接到液
体沙保氏培养基中，在25 37'C下培养10 20小时，制得石膏样毛癣菌悬液。 将实施例1制得的槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。 取槐糖脂母液分别加到沙保氏固体培养基中，倒平板并使各皿终浓度呈
0. 1 5. 0 g/L的梯度浓度。取石膏样毛癣菌悬液0. 1 mL涂布到上述呈梯度浓度
的固体平板培养基中，在32"下培养120小时，观察平板上的石膏样毛癣菌的
生长情况，计算平均菌落数。
上述液体沙保氏培养基(用于真菌培养)的配方是蛋白胨10 g/L，葡萄
糖40 g/L， pH 6. 5。
上述固体沙保氏培养基(用于真菌培养)的配方是蛋白胨10 gZL，葡萄
糖40 g/L，琼脂粉20 g/L， pH 6.5。 抑菌试验结果显示
石膏样毛癣菌在添加了较低剂量的槐糖脂(0.5 g/L)平板上，其生长即可 以被完全抑制(见图3)。
实施例6:槐糖脂作为抑制糠秕孢子菌的抗皮肤癣菌药物的应用
糠秕孢子菌的菌体制备将斜面保存的糠秕孢子菌取一接种环转接到液体沙 保氏培养基中，在27'C下培养20小时，制得糠秕孢子菌悬液。
将实施例2制得的槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。
取槐糖脂母液分别加到沙保氏固体培养基中，倒平板并使各皿终浓度呈
0. 1 5. 0 g/L的梯度浓度。取糠秕孢子菌悬液0. 1 mL涂布到上述呈梯度浓度的 固体平板培养基中，在27'C下培养120小时，观察平板上的糠秕孢子菌的生长 情况，计算平均菌落数。
上述液体沙保氏培养基(用于真菌培养)的配方是蛋白胨10 g/L,葡萄 糖40 g/L， pH 6.5。
上述固体沙保氏培养基(用于真菌培养)的配方是蛋白胨10 g/L，葡萄 糖40 g/L，琼脂粉20g/L， pH 6. 5。
抑菌试验结果显示
糠秕孢子菌在添加了较低剂量的槐糖脂(0.5 g/L)平板上，其生长即可以 被完全抑制(见图4)。
实施例7:槐糖脂作为治疗红色毛癣菌感染的抗皮肤癣菌药物软膏剂的制备 取实施例1制取的槐糖脂45g加入液状石蜡125g加热至8(TC，另取甘油 50g，羟苯乙酯lg，加蒸馏水至830g，也加热至8(TC，然后将油相加入水相中， 边加边搅拌至冷，装入塑料软管，每管装入量为25g，即得槐糖脂软膏剂。 实施例8:槐糖脂作为治疗犬小孢子菌感染的抗皮肤癣菌药物软膏剂的制备 取实施例2制取的槐糖脂40g加入液状石蜡125g加热至8(TC ，另取甘油50g， 羟苯乙酯lg，加蒸熘水至835g，也加热至8(TC，然后将油相加入水相中，边加 边搅拌至冷，装入塑料软管，每管装入量为25g，即得槐糖脂软膏剂。 实施例9:槐糖脂作为治疗石膏样毛癣菌的抗皮肤癣菌药物软膏剂的制备 取实施例1制取的槐糖脂40g加入液状石蜡125g加热至8(TC，另取甘油50g， 羟苯乙酯lg，加蒸馏水至835g，也加热至8(TC，然后将油相加入水相中，边加 边搅拌至冷，装入塑料软管，每管装入量为25g，即得槐糖脂软膏剂。 实施例10:槐糖脂作为治疗糠秕孢子菌的抗皮肤癣菌药物软膏剂的制备 取实施例1制取的槐糖脂40g加入液状石蜡125g加热至80°C ，另取甘油50g， 羟苯乙酯lg，加蒸馏水至835g，也加热至8(TC，然后将油相加入水相中，边加 边搅拌至冷，装入塑料软管，每管装入量为25g，即得槐糖脂软膏剂。
实施例11:槐糖脂作为治疗红色毛癣菌感染的抗皮肤癣菌药物液体洗剂制备 取实施例l制取的槐糖脂45g，加入二甲亚砜至1000g，使槐糖脂溶解，装 入100mL塑料瓶中，即得。
实施例12:槐糖脂作为治疗犬小孢子菌感染的抗皮肤癣菌药物液体洗剂制备 取实施例2制取的槐糖脂40g，加入二甲亚砜至1000g，使槐糖脂溶解，装 入100mL塑料瓶中，即得。
实施例13:槐糖脂作为治疗石膏样毛癣菌感染的抗皮肤癣菌药物液体洗剂制
备
取实施例1制取的槐糖脂40g,加入二甲亚砜至lOOOg，使槐糖脂溶解，装 入100mL塑料瓶中，即得。
实施例14:槐糖脂作为治疗糠秕孢子菌感染的抗皮肤癣菌药物液体洗剂制备 取实施例2制取的槐糖脂40g，加入二甲亚砜至1000g，使槐糖脂溶解，装 入100mL塑料瓶中，即得。
实施例15:以槐糖脂为有效成分的组合物作为抗皮肤癣菌药物软膏剂的制备 取实施例1制取的槐糖脂4g和克霉唑10g，加入液状石蜡125g加热至80°C 。 另取甘油50g，羟苯乙酯lg ，加蒸馏水至835g，也加热至8(TC，然后将油相加 入水相中，边加边搅拌至膏状，装入塑料软管，每管装入量为10g，即得槐糖脂 软膏剂，其中含槐糖脂O. l克(0. 4%),克霉唑0.25g (1%)。 实施例16:槐糖脂制剂在动物实验中的应用
取实施例11中制取的作为治疗红色毛癣菌感染的槐糖脂抗皮肤癣菌药物液 体洗剂用于动物实验。
取小鼠60只，在每只鼠右前肢腋下切开小的创口，接种红色毛癣菌。72h 后从伤口处取样进行显微观察，发现有45只小鼠已感染有红色毛癣菌， 一周之 后创口有皮毛脱落，形成癣块。将感染有红色毛癣菌的小鼠分为9组，5组作为 处理组，用上述槐糖脂液体制剂每日分三次进行涂擦，另外4组作为阴性对照组， 用生理盐水进行相同次数的涂擦。连续给药10天。观察处理组和对照组伤口愈 合情况，并分别从处理组和对照组伤口处取样，用培养真菌的沙保氏固体平板进 行培养。
实验结果显示，处理组在24h内无菌落出现，在24h到96h之间，5组处理 组的平板中只有零星菌落出现，平均菌落数为l。对照组在24h内有大量菌落出 现，无法计数。
权利要求
1.槐糖脂在制备抗皮肤癣菌药物中的应用。
2. 以槐糖脂为有效成分的组合物在制备抗皮肤癣菌药物中的应用。
3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述皮肤癣是头癣、体癣、 股癣、甲癣和/或手足癣；所述皮肤癣菌是真菌。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述真菌是红色毛癣菌、犬小 孢子菌、石膏样毛癣菌和/或糠秕孢子菌。
5. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述槐糖脂有效抑制皮肤 癣菌的药物浓度为0. 1 5g/L。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述槐糖脂有效抑制皮肤癣菌 的药物浓度为0. 2 4g/L。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述槐糖脂有效抑制皮肤癣菌 的药物浓度为0. 5 3g/L。
8. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抗皮肤癣菌药物的剂 型是软膏剂、液体制剂之一。
全文摘要
本发明公开了一种槐糖脂在制备抗皮肤癣菌药物中的应用；同时还包括以槐糖脂为有效成分的组合物在制备抗皮肤癣菌药物中的应用。本发明的制剂价格低廉，且用量少，抑菌效果显著，对人体无任何毒副作用，可以在某些方面作为替代易产生耐热性的常规抗真菌药物及有严重副作用的皮质类固醇激素等治疗皮肤癣病的药物，具有极大的应用前景。
文档编号A61K31/7024GK101199539SQ20071011479
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月10日 优先权日2007年12月10日
发明者欣 宋, 曲音波, 慧 李, 邵凌健, 马晓静 申请人:山东大学