专利名称：酪酸梭菌在制备治疗新生儿喂养不耐受组合物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酪酸梭菌的药物新用途，具体涉及酪酸梭菌作为主要活性成份 在制备治疗新生儿喂养不耐受组合物中的应用，属于生物药领域。
背景技术：
喂养不耐受是指由于新生儿尤其是早产儿和低出生体质量儿肠粘膜发育不 完善，消化系统功能发育不成熟，开始肠道喂养后，经常出现呕吐、腹胀、胃 潴留等喂养不耐受问题，影响新生儿的存活率和生存质量。同时，喂养不耐受
新生儿较长时间静脉营养，不利于新生儿肠粘膜增殖生长及消化系统功能发育 成熟，且易出现胆汁淤积、出血、黄染、坏死性小肠结肠炎等并发症，严重者 出现继发感染，促发多器官功能衰竭，使早产儿死亡率、致残率升高。目前主 要应用多潘立酮、甲氧氯普胺、西沙必利、胰岛素、红霉素等促进胃肠动力药 治疗新生儿喂养不耐受，不但不能快速促进肠道功能发育成熟，而且存在锥体 外系不良反应、心率紊乱、低血糖等副作用，虽然小剂量应用红霉素没有发现 明显副作用，但红霉素属于抗菌药，长期使用会引起肠道菌群失调及出现细菌 耐药性，具有潜在的副作用。
2007年的《实用儿科临床杂志》[2007， 22 (2): 138-139],贺湘英等发表 了 "金双歧片治疗极低出生体质量儿喂养不耐受"，通过应用双歧杆菌、保加利 亚乳杆菌和嗜热链球菌治疗低出生体质量儿喂养不耐受，但双歧杆菌、乳杆菌 和嗜热链球菌只是补充肠道有益菌，恢复肠道菌群平衡，且由于双歧杆菌、乳 杆菌和嗜热链球菌不能分泌酪酸(丁酸)，酪酸是肠粘膜70%的能量来源，因此， 不能促进消化系统功能发育成熟，治疗喂养不耐受疗效差。
因此，寻找能够有效促进新生儿胃消化系统发育成熟，消除喂养不耐受， 且安全没有任何毒副作用的药物是临床迫切需要的。本发明人经过深入研究发 现酪酸梭菌不同于双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌，酪酸梭菌药物或组合物进 入肠道能够分泌大量酪酸，提供肠粘膜细胞增殖和生长所需的能量，促进消化 系统发育成熟，快速消除喂养不耐受，安全没有任何毒副作用，不会损害新生 儿身体健康，社会意义巨大，且未见相关研究报道，特申请此发明专利
发明内容
本发明首次提供了酪酸梭菌在制备治疗新生儿喂养不耐受组合物中的应 用，其中所述药物组合物包含药品、保健品和饮品等。
本发明人经研究证实酪酸梭菌对新生儿喂养不耐受有显著的治疗作用。所 述新生儿包括早产儿、足月儿和过期产儿。
本发明人研究表明酪酸梭菌治疗新生儿喂养不耐受主要是通过进入肠道分
泌大量酪酸，提供肠粘膜70%的能量，促进肠粘膜细胞增殖生长及消化系统发育 成熟，消除新生儿喂养后经常出现呕吐、腹胀、胃潴留等喂养不耐受问题，促 进新生儿生长发育。本发明人研究证实酪酸梭菌经发酵培养，能产生高达 40mmol/L的酪酸。而双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌由于不产生酪酸， 它们分泌的乳酸、乙酸等短链脂肪酸也必须转化为酪酸才能被肠粘膜细胞代谢 利用，因此，不能有效促进消化系统发育成熟，治疗新生儿喂养不耐受远达不 到酪酸梭菌的治疗效果。但酪酸梭菌可以与双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、 链球菌、枯草芽孢杆菌等不产生酪酸的益生菌联合应用，同时补充多种有益菌， 快速建立肠道菌群平衡，起到协同治疗作用，进一步提高治疗新生儿喂养不耐 受的疗效。并且酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草 芽孢杆菌没有毒副作用，其应用剂量也是临床医生根据病情很容易掌握和调整 的。
本发明所述酪酸梭菌选自但不限于酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、 CGMCC、保存编号0313.1。
本发明所述双歧杆菌选自但不限于婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、 CGMCC、保存编号0313.2，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、 CGMCC、 保存编号0313.5，短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、CGMCC、保存编号0313.6， 两歧双歧杆菌，又称双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、 CGMCC、保存 编号0313.7。
本发明所述凝结芽孢杆菌选自但不限于凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、 CGMCC 、保存编号1207。
本发明所述乳杆菌选自但不限于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus), CGMCC、保存编号0313.4。
本发明所述链球菌选自但不限于嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、 CGMCC、保存编号0313.3。
本发明所述枯草芽孢杆菌选自但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 CGMCC、保存编号1887。
本发明所述的酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌指活生物个体。
本发明是以有效剂量的酪酸梭菌根据上面所述作为药物活性成份，按照一 定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润 剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料，制成任何一种适合于临床上 使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、灌肠剂等剂型。
本发明所述酪酸梭菌组合物可以是酪酸梭菌单独作为活性成份制成活菌制 剂，也可以是酪酸梭菌与双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽 孢杆菌中益生菌中的一种或几种或其他活性成份组合制成活菌制剂，以起到协 同治疗作用，提高对新生儿喂养不耐受的治疗效果。
本发明所指有效剂量是指以酪酸梭菌根据上面所述单独或组合作为药物活
性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于lX106CFU/g， 一般在IX 107CFU/g以上，最高可达到1X 1012CFU/g或1 X 1012CFU/g以上。
本发明所指有效剂量是指以酪酸梭菌根据上面所述单独或组合作为药物活 性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于lX106CFU/mL， 一般在1 X 107CFU/mL以上，最高可达到1 X 1012CFU/mL或1 X 1012CFU/mL以上。
本发明优选的制剂工艺为，先在液体培养基中接种菌种，进行培养或多级 扩增培养，然后将液态培养物离心，收集湿菌泥，并将所述菌泥干燥、过筛， 得到干燥菌粉。将所得干燥菌粉与药用载体混合，制成最终剂型。制剂工艺并 不局限于本发明所述，其它公知的制剂工艺均可以。
由于本发明首次公开了以酪酸梭菌为药物活性成份在制备治疗新生儿喂养 不耐受组合物中的应用，因此，以酪酸梭菌单独或组合作为药物活性成份与辅 料组合制成药剂，只要是该药剂用于治疗新生儿喂养不耐受，均属于本发明的 保护范围。
本发明所述的酪酸梭菌在制成任何一种剂型时，均具有治疗新生儿喂养不 耐受的作用。任何药剂，如果其组份中含有酪酸梭菌成份制备成药，在其包装 或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗新生儿喂 养不耐受的作用，则落入本发明的保护范围之内。
本发明所述酪酸梭菌可以制成保健品或饮品。将酪酸梭菌制成的保健品或 饮品，如果在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提 示具有治疗新生儿喂养不耐受的作用，则落入本发明的保护范围之内。
具体实施例方式
药物制备例说明酪酸梭菌制剂或酪酸梭菌与其他益生菌的联合制剂的制备是首先制备菌粉，然后按照需要填加相应辅料按常规方法制成最终剂型。菌粉制 备过程中所用的培养基，本技术领域人员公知的培养基均可以。本发明所述酪 酸梭菌制剂或酪酸梭菌与其他益生菌的联合制剂的制备按照本领域技术人员已 知的制剂工艺均可以，并不局限于下面所述的方法，本发明以口服酪酸梭菌活 菌散剂的具体制备为例，说明酪酸梭菌制剂的制备方法，本领域技术人员根据 本发明所述很容易掌握其它剂型或酪酸梭菌与其它益生菌的联合制剂的制剂工 艺，在此为说明简洁，其它剂型及酪酸梭菌与其它益生菌的联合制剂的制备方 法省略，不再一一叙述说明。
药物制备实施例口服酪酸梭菌活菌散剂的制备 1菌粉制备
取酪酸梭菌菌种管一支，溶于已灭菌装有lOmL生理盐水和适量玻璃珠的 100mL三角瓶中，75。C水浴活化10分钟，用lmL无菌吸管吸取lmL菌悬液，接 种装有50mL扩增培养基的250mL三角瓶中，置摇摆床内37。C恒温振荡(190rpm) 培养24小时，转接装有450mL扩增培养基2500mL档板三角瓶中，37。C恒温振 荡培养24小时，镜检无杂菌后再转接于装有4.51扩增培养基的种子罐中，厌 氧培养(充气量3: 1) 24小时，镜检无杂菌后转接有45L发酵培养基的发酵罐 中，37。C厌氧培养(充气量3: 1) 24小时，镜检芽孢率达80%以上，停止培养。 用连续离心机，12000 rpm离心。收集湿菌泥，称重，按1: 1 (w/v)添加冻干 保护剂，冻干，研细，过100目筛，常温保存备用。 2成品制备
据酪酸梭菌菌粉的活菌数，按比例添加脱脂奶粉、葡萄糖，使活菌数不低 于lX106CFU/g，然后装袋。
临床疗效观察实施例说明我们进行了酪酸梭菌治疗新生儿喂养不耐受的疗效 观察，并与双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌进行疗 效对比观察。
试验例酪酸梭菌治疗新生儿喂养不耐受疗效观察
1资料与方法
1. 1资料选择喂养不耐受新生儿100例，诊断标准临床出现呕吐、腹胀、 胃潴留等胃肠动力障碍表现，喂奶前从胃管内抽出残留奶汁。所有患儿均排除 胃肠道先天畸形、机械性肠梗阻、无脑肝肾功能不全及心肌损害。男48例，女 52例。按随机数字表将100例新生儿分为五组，A组(酪酸梭菌治疗组)、B组 (酪酸梭菌、双歧杆菌、乳杆菌和链球菌治疗组)、C组(双歧杆菌、乳杆菌和 链球菌治疗组)、D组(凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌治疗组)和对照组。每组20例患儿，五组患儿胎龄、性别、体重、病情轻重程度经统计学处理，差异无 显著性，具有可比性。
1.2方法所有患儿均给予常规护理，输液泵补液，治疗原发病及胃肠外营养 支持等常规综合治疗。
A组在常规综合治疗基础上给予口服酪酸梭菌活菌散剂(青岛东海药业有 限公司生产，500mg/袋，含酪酸梭菌为1.0X107CRJ/g) 口服，1包/次，3次/d， 喂奶后口服或鼻饲，疗程7天以上；
B组在常规综合治疗基础上给予口服酪酸梭菌、双歧杆菌、乳杆菌和链球 菌四联活菌散剂(青岛东海药业有限公司生产，500mg/袋，含酪酸梭菌、双歧 杆菌、乳杆菌和链球菌各为1.0X107CFU/g) 口服，l包/次，3次/d，喂奶后口 服或鼻饲，疗程7天以上；
C组在常规综合治疗基础上给予口服双歧杆菌、乳杆菌和链球菌三联活菌
散剂(青岛东海药业有限公司生产，500mg/袋，含双歧杆菌、乳杆菌和链球菌 各为1.0X107CFU/g) 口服，l包/次，3次/d，喂奶后口服或鼻饲，疗程7天以 上；
D组在常规综合治疗基础上给予口服凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌二联活 菌散剂(青岛东海药业有限公司生产，500mg/袋，含凝结芽孢杆菌和枯草芽孢 杆菌各为1.0X107CFU/g) 口服，l包/次，3次/d,喂奶后口服或鼻饲，疗程7 天以上；
对照组常规综合治疗，疗程7天以上。 1.3观察指标观察四组新生儿腹胀、呕吐、胃潴留和肠鸣音等症状变化，生理 性体重下降恢复至出生体重时间，奶量增加情况及记录停用静脉营养达到完全 胃肠道营养的时间，有无黄疸并发症及黄疸持续时间，每日大便次数，住院天 数及有无不良反应。
1.4疗效判断标准显效治疗3 5天腹胀、呕吐症状消失，肠鸣音正常，鼻 饲奶每隔2 3小时1次，能耐受，无胃内容物储留；好转治疗5 7天腹胀、 呕吐症状减轻，肠鸣音弱，鼻饲奶每隔2 3小时l次，胃内容物潴留<1/3; 无效治疗7天腹胀、呕吐症状无好转，肠鸣音弱，鼻饲奶每隔2 3小时l次， 胃内容物储留〉1/3。显效和好转合计为有效。
1.5统计学处理采用SPSS11.0软件进行统计学处理。数据均以lT土s表示， 组间比较采用xS检验或t检验，以P<0. 05为差异有统计学意义。 2结果
2.1四组疗效比较A组显效14例，好转4例，无效2例，总有效率90%; B组显效15例，好转5例，无效0例，总有效率100%; C组显效8例，好转4例， 无效8例，总有效率60%; D组显效6例，好转6例，无效8例，总有效率60%; 对照组显效5例，好转4例，无11效例，总有效率45%。经统计学检验，A组 和B组总有效率显著高于C组、D组和对照组，差异有统计学意义(P〈0.01)， B 组总有效率高于A组，差异有统计学意义(P〈0.05)。
2.2两组观察指标比较恢复至出生体重时间，达到完全胃肠道营养时间，呕 吐和腹胀消失时间，黄疸持续时间，A组和B组与C组、D组和对照组比较，差 异有统计学意义(P〈0.01)， B组与A组比较，差异有统计学意义(P〈0.05);每 曰大便次数及住院天数比较，A组和B组与C组、D组和对照组比较，差异有统 计学意义(P〈0.01)， B组与A组比较，差异有统计学意义(P〈0.05)见表1。
表l两组治疗前后观察指标比较(^士s)
观察指标 A组 B组 C组 D组
恢复至出 生体重时 间(天) 达到完全 胃肠道营 养时间 (天)
呕吐消失 时间(天) 腹胀消失 时间(天) 黄疸持续 时间(天) 每日大便 次数(次) 住院天数
8. 36±1.42
14. 14±1.56
7.01±1.23
13. 03±1.63
9. 98 ±1.83
15. 96±1. 54
9. 87±1. 75
15. 67±1.85
对照组
10. 85±2. 13
17. 32±2. 16
4. 59±1.32
4. 65 ±1.43
14. 46±2. 48
2. 52 ±0. 73 21.58±4. 46
3. 76±1.43
3. 11±1.43
13. 21 ±1.98
3. 10±0. 65 20. 14±3. 29
6. 45±1.68
6. 50±1.58
17. 56±1.64
2. 31±0. 52 24. 15±5. 76
6. 56±1.75
6. 70±1.61
17. 98±1. 76
2. 34±0. 61 24. 41 ±5. 24
7. 38±1.49
7. 45±1.57
19. 55±2.41
2. 02 ±0. 67 25. 74±5. 21
3讨论
试验结果表明，酪酸梭菌治疗新生儿喂养不耐受的疗效显著好于双歧杆菌、 乳杆菌和链球菌三联活菌治疗组及凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌二联活菌治疗 组。主要由于酪酸梭菌能够特异性分泌大量酪酸，提供肠粘膜增殖和生长的能
8量，促进消化系统发育成熟，而双歧杆菌、乳杆菌、嗜热链球菌、凝结芽孢杆 菌和枯草芽孢杆菌由于不产生酪酸，它们分泌的乳酸、乙酸等短链脂肪酸也必 须转化为酪酸才能被肠粘膜细胞代谢利用，因此，不能有效促进消化系统发育 成熟，治疗新生儿喂养不耐受远达不到酪酸梭菌的治疗效果。但酪酸梭菌与双 歧杆菌、乳杆菌和链球菌联合应用的效果好于酪酸梭菌单独应用的治疗效果， 表明酪酸梭菌与双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌中 的一种或多种菌联合应用具有协同治疗作用，主要由于双歧杆菌、凝结芽孢杆 菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌产生的乙酸和乳酸被酪酸梭菌利用，产生 了更多的酪酸为肠粘膜利用，提高了治疗效果。利用酪酸梭菌或酪酸梭菌与双 歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌中的一种或多种菌联 合应用治疗新生儿喂养不耐受疗效显著，并且酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢 杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌均属于有益菌，不会对新生儿产生任何 毒副作用，因此，酪酸梭菌或酪酸梭菌与双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、 链球菌、枯草芽孢杆菌中的一种或多种菌联合应用治疗新生儿喂养不耐是新生 儿喂养不耐受治疗史上的重大突破，具有重要意义。
本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已分别于1997年7月28日、2004 年8月23日和2006年12月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所邮编 100080)保藏，共九个下述微生物菌种，但本发明所述的酪酸梭菌、双歧杆菌、 乳杆菌、链球菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌并不局限于这九种微生物菌种。
(1) 分类命名酪酸梭菌Clostridium butyricum，保存编号0313.1。
(2) 分类命名婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis，保存编号0313.2。
(3) 分类命名嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus),保存编号0313.3。
(4) 分类命名嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),保存编号0313.4。
(5) 分类命名长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保存编号0313.5 。
(6) 分类命名短双歧杆菌Bifidobacterium breve，保存编号0313.6。
(7) 分类命名双歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum，保存编号0313.7。
(8) 分类命名凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，保存编号1207。
(9) 分类命名枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保存编号1887。 上述九个微生物菌种经该微生物中心检测，检测结果均为存活。
9
权利要求
1、酪酸梭菌在制备治疗新生儿喂养不耐受组合物中的应用，所述组合物包括药品、保健品和饮品。
2、 按权利要求l所述应用，其特征在于酪酸梭菌组合物可以是酪酸梭菌单 独作为活性成份制成活菌制剂，也可以是酪酸梭菌与双歧杆菌、乳杆菌、链球 菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的一种或一种以上活菌组合作为活性成份 制成活菌制剂。
3、 按权利要求2所述应用，其特征在于酪酸梭菌、双歧杆菌、乳杆菌、链 球菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌指活的生物个体。
4、 按权利要求2所述应用，其特征在于酪酸梭菌包含但不限于酪酸梭菌 CGMCC0313. 1株。
5、 按权利要求2所述应用，其特征在于双歧杆菌包含但不限于婴儿双歧杆 菌CGMCC0313. 2株，长双歧杆菌CGMCC0313. 5株，短双歧杆菌CGMCC 0313. 6株， 双歧双歧杆菌CGMCC0313. 7株；凝结芽孢杆菌包含但不限于凝结芽孢杆菌1207 株；乳杆菌包含但不限于嗜酸乳杆菌CGMCC0313. 4株；链球菌包含但不限于嗜 热链球菌CGMCC0313. 3株；枯草芽孢杆菌包含但不限于枯草芽孢杆菌CGMCC1887 株。
6、 按权利要求l所述应用，其特征在于新生儿包括早产儿、足月儿和过期 产儿。
全文摘要
本发明公开了酪酸梭菌在制备治疗新生儿喂养不耐受组合物中的应用，具体涉及酪酸梭菌或酪酸梭菌与双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌中的一种或多种菌联合应用治疗新生儿喂养不耐受的药物新用途，组合物包括药品、保健品和饮品。
文档编号A61K35/66GK101450083SQ20071019673
公开日2009年6月10日 申请日期2007年11月30日 优先权日2007年11月30日
发明者崔云龙, 李洪福 申请人:青岛东海药业有限公司;北京东方百信生物技术有限公司;北京天施康医药科技发展有限公司