一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb联结体、制备方法及其应用的制作方法

专利名称：：一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb联结体、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种联结体，尤其是涉及一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)联结体、制备方法及其应用。
背景技术：
：目前，临床上常规使用的磁共振对比剂Gd-DTPA(由二乙三胺五乙酸(DTPA)与Gd"的螯合物)，属于细胞外间隙对比剂，没有特异性。其增强原理是含礼(Gd+3)对比剂进入动脉血管随血流被分配至富于血供的组织结构中，并很快回流至静脉内，最后通过肾脏排泄。钆剂能引起分布区域组织的Tl时间明显缩短，导致在T1WI上信号强度显著升高，即所谓强化。Gd-DTPA广泛应用于全身多个系统的MR成像，譬如，对乳腺癌等肿瘤性病变的诊断和鉴别i貪断。Gd-DTPA是非特异性对比剂，用于磁共振成像时，其成像有效时间窗很窄，没有靶向性，只受组织或病灶血供程度影响，血供丰富者强化显著，反之，则强化较轻。在疾病诊断中有一定价值，但是，采用非特异性对比剂的磁共振成像不能准确鉴别病变的良、恶性，不能针对某一基因或细胞结构成像，无靶向性，难以达到早期诊断疾病的目的。近年来，MRI因其具有很高的软组织分辨率和良好的空间分辨率等优点，MR耙向成像已逐渐成为分子影像学的研究热点。单克隆抗体磁共振对比剂是将单克隆抗体与MR顺磁性或超顺磁性粒子结合,从而使新形成的螯合剂既具有靶向功能即特异性，又具备常M^MR对比剂的作用，其不仅能与某些器官、组织及病变特异性地结合，而且能改变它们的MR信号强度，从而达到靶向"^断的目的。分子生物学和分子病理学研究揭示，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在乳&泉良恶性肺瘤中的表达存在显著的差异，即乳腺癌中VEGF呈显著的高表达，而且是乳腺癌生物学行为的重要判断指标，如VEGF表达与否及其表达程度与乳腺癌远处转移率及患者预后呈显著相关性，即VEGF高表达者，远处转移率高且预后差。
发明内容本发明的目的在于(1)提供一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)联结体；(2)提供Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)联结体制备方法；(3)提供Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)联结体应用。本发明的目的是通过以下技术方法来实现的将抗VEGF(血管内皮生长因子)单克隆抗体与二乙三胺五乙酸4L(Gd-DTPA)螯合成一种用于MR分子成像的特异性对比剂Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)，对荷人乳腺癌棵鼠模型进行此MR对比剂的在体分子成像实验，评价其显像效果，获得成功。本发明的技术方案如下一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)联结体，通过下列方法制得a、DTPA双酸酐的合成将二乙三胺五酸、乙酸肝和吡咬混合；b、DTPA-Polylysine制备将多聚赖氨酸溶解于NaH2C03/Na2HC(M￡冲液中，搅拌，并加入步骤a得到的DTPA双酸酐溶液中；c、Gd-DTPA-Polylysine制备将Gd203加入到HC1中,加热、溶解，蒸发多余的HC1即得到GdCl3的溶液，将GdCl3溶液加入到步骤b得到的DTPA-Polylysine溶液中；d、抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联结将抗VEGF单克隆抗体溶解NaH2C03/Na2HC(M爰沖液中，然后加入碳化二亚胺和步骤c得到的Gd-DTPA-Polylysine,搅拌反应，层析，收集抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联合体。在步骤b中还包括取出多聚赖氨酸、NaH2C03/Na2HC03.DTPA双酸酐混合溶液，用平衡透析法除去游离的DTPA,并转换到PH=5，0.2mlNaAc/HAc緩冲液。在步骤d中选用SephdroseCL-4B层析柱层析。一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb联结体的制备方法包括以下步骤a、DTPA双酸酐的合成将二乙三胺五酸、乙酸酐和吡咬混合；b、DTPA-Polylysine制备将多聚赖氨酸溶解于NaH2C03/Na2HC(Mi沖液中，搅拌，并加入步骤a得到的DTPA双酸酐溶液中c、Gd-DTPA-Polylysine制备将Gd203加入到HC1中,加热、溶解，蒸发多余的HC1即得到GdCh的溶液，将GdCl3溶液加入到步骤b得到的DTPA-Polylysine溶液中；d、抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联结将抗VEGF单克隆抗体溶解于NaH2C03/Na2HC03緩沖液中，然后加入碳化二亚胺和步骤c得到的Gd-DTPA-Polylysine,搅拌反应，层析，收集抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联合体。在步骤b中还包括取出多聚赖氨酸、NaH2C03/Na2HC03.DTPA双酸酐混合溶液，用平衡透析法除去游离的DTPA,并转换到PH=5，0.2mlNaAc/HAc緩冲液。在步骤d中选用SepharoseCL-4B层析柱层析。一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)联结体应用，该:眹结体作为对比剂在磁共振成像中应用。所述的磁共振成像是在体显示肿瘤内VEGF基因表达、VEGF介导的瘤内血管生成的特异性、靶向性磁共振成像。本发明所公开一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)联结体、制备方法及其应用，其优点表现在(l)本发明采用单克隆抗体与钆剂的螫合制备出新型对比剂，可借助于抗体的靶向性进行特异性成像，本发明采用血管内皮生长因子(VEGF)的单抗，因此，可对VEGF及其介导的血管生成进行成像。(2)早期的研究大多将单克隆抗体与Gd-DTPA直接共扼联结，这样直接联结一方面连接的Gd-DTPA量少，增强效果不理想；另一方面，由于DTPA环酐为双环结构，容易在双链或多个蛋白分子之间形成二聚体或多聚体，故随着Gd-DTPA连接数目的增加，DTPA-抗体复合物的免疫活性下降，对比剂的靶向效果不佳。在我们的发明中，我们采用Polylysine(多聚赖氨酸)放大系统取得了良好的扩增效果。我们利用大分子多聚体能与多个Gd-DTPA联结的技术，先制成Gd-DTPA标记的大分子多聚体，然后再把多个Gd-DTPA标记的大分子多聚体联结到VEGF单克隆抗体上，这样在一个抗体上可:f关结28~36个Gd-DTPA，而不降低抗体的免疫活性。用ELISA法测定Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)的免疫活性，结果得到与VEGF的抗体接近的结合情况。在体外的检测中显示Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)的纯度高，在醋酸纤维薄膜电泳图谱中具有单一斑点。总之，本发明借助于Polylysine(多聚赖氨酸)的扩增效应和抗体的,异性，此对比剂Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)具有免疫活性高、耙向性强、Gd"含量多等优点，可行在体肿瘤MR靶向成像研究，显示VEGF表达的情况，以及VEGF介导的肿瘤血管生成情况，为富于VEGF基因的恶性肺瘤如乳腺癌等的早期诊断、良恶性肿瘤的鉴别诊断提供一条崭新的途径，为抗血管生成治疗提高新的评价手段。图1:Gd-DTPA-Polylysine的高压液相(HPLC)色傳图。图2:Gd-DTPA-Polylysine的SDS-PAGE电泳图语。图3:Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)联结体的醋酸纤维薄膜电泳图语。图4:ELISA方法测定免疫联结体的免疫活性结果。图5:注入对比剂前及注入对比剂Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)后各时间扫描点MR图像。其中图中A:注入对比剂前。图中B:注入对比剂后5min,肿瘤组织未见强化，肝脏组织强化，肝内血管显示。图中C:注入对比剂后lh，肿瘤边缘开始强化，大血管显示清楚。图中D:注入对比剂后lh，肝脏组织明显强化，肝内血管显示清楚。图中E，F:注入对比剂后2h,肿瘤组织、肝脏组织普遍强化。图中G，H:注入对比剂后3h，肿瘤组织、肝脏组织强化4交2h时均勾。图中I,J:注入对比剂后4h,肺瘤强化达高峰，肝脏强化不明显。图中K:肿瘤持续强化，逐渐向中心弥散。图中L，M:注入对比剂后12h,肿瘤中心强化明显。图中N,0:注入对比剂后24h，肿瘤中心强化较12h时减弱。图6:肝脏组织、肿瘤组织和M^肉组织增强率比^^。图7:肿瘤大体及病理图。其中图中A:肿瘤剖面图，肿瘤组织鱼肉样。图中B:HE染色(40x10倍)，示肿瘤组织癌细胞大小形态不一，核分裂相多见，见坏死肺瘤细胞。图中C:VEGF免疫组化(40x10倍)，肿瘤细胞浆见椋色颗粒示VEGF染色阳性。图8:注入对比剂前及注入对比剂Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)后各时间点扫描MR图像。其中图中A:注入对比剂前。图中B:注入对比剂后5min，肿瘤组织未见强化。图中C:注入对比剂后lh，肺瘤边缘开始强化。图中D:注入对比剂后2h，肺瘤组织普遍强化。图中E,F，注入对比剂后3h，4h，肿瘤组织普遍强化。图中G:注入对比剂后8h,肿瘤持续强化，逐渐向中心弥散。图中H:注入对比剂后12h,肿瘤中心强化明显。图中I:注入对比剂后24h，肿瘤中心强化4交12h时减弱。图9:注入对比剂前及注入对比剂Gd-DTPA后各时间点扫描MR图像。其中图中A:注入对比剂前。图中B，C:注入对比剂后5min,肿瘤组织明显强化。图中D,E:注入对比剂后lh，胂瘤组织强化仍明显，^f旦4交5min时稍弱。图中F，G，H:注入对比剂后2h，3h,肿瘤组织强化程度随时间延长而减弱。图中H:注入对比剂后4h，肿瘤强化不明显，对比剂基本退出。图中I:注入对比剂后8h,对比剂完全退出。图10:实验组与对照组信号曲线图。图11:肿瘤大体图片及病理图片。其中图中A:乳腺癌棵鼠模型(MDA-MB-231细胞)。图中B:肺瘤剖面，肿瘤组织呈鱼肉状。图中C:HE染色(每标尺代表25um)，肿瘤细胞大小不一，分化差。图中D:VEGF免疫组化(40x10)，肿瘤细胞浆内见棕色颗粒示染色阳性。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步描述。实施例1一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)联结体制备I、DTPA双酸酐(CaDTPA)的合成10g二乙三胺五酸(DTPA)悬浮于30ml乙酸酐和15ml吡啶的混合液中，于60。C搅拌反应6h,冷却后加适量乙醇过滤，乙醚洗涤，干燥，得白色固体DTPA双酸酐(CaDTPA)粗品。重结晶后，测定产品熔点是178180。C(分解)，在红外光谱图中具有1845、1785cn^环状酸酐的00伸缩振动双峰。II、DTPA-Polylysine制备称Polylysine(多聚赖氨酸)10mg，溶解于3ml的0.2mol/LNaH2C03/化2^03緩沖液(PH=9.6)中，在冰浴中不停地搅拌并加入DTPA双酸酐(CaDTPA)溶液，室温下再搅拌反应16小时后结束反应。取出反应混合液，用平衡透析法除去游离的DTPA，并转换到PH=5,0.2mlNaAc/HAc緩沖液。取出透析袋中溶液，减压浓缩后置于4。C冰箱保存，用于下步反应试验。同时，取样0.5ml，并用S印hadex柱(1x25cm)，0.Olmol/LPBS,PH7.4緩沖液洗脱分析，可见仅一个大分子洗脱峰出现。III、Gd-DTPA-Polylysine制备:0(1203加人到0.lmol/LHC1中，加热至60°C，持续反应10min，完全溶解后，蒸发多余的HC1即得到GdC"的溶液。加入制备的GdCl3溶液到经过减压浓缩的DTPA-Polylysine溶液中，然后在室温下再搅拌反应24~30小时后，用平衡透析法除去游离的Gd,并转该溶液的PH体系。采用高频电感藕合等离子体发射光语法(ICP-AES)测量样品Gd含量，计算所得到的Gd-DTPA-Polylysine每分子含30~42个Gd离子。IV、抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联结由于聚赖氨酸还有胺基存在，把抗VEGF单克隆抗体溶解在0.lmol/LNaH2C03/Na2HC03緩沖液(PH=9.6)，然后加入碳化二亚胺(ECD)和Gd-DTPA-Polylysine,在室温下再搅拌反应24~30小时后，用S印haroseCL-4B层析柱(1x25cm)除去没联结上的抗体，收集抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联合体，冷冻浓缩，经0.22um除菌过滤后^L存。V、对比剂的鉴定(1)Gd含量测定采用高频电感藕合等离子体发射光谱法(ICP-AES)测量Gd含量，Gd-DTPA-Polylysine的Gd含量是3042个(n=7)。用于动物试验的每分子抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine联结体的Gd含量是28~36个Gd-DTPA。(2)、大分子的纯度测定使用高效液相色谱法(HPLC)、SDS电泳法、醋酸纤维薄膜电泳和分子筛S印haroseCL-4B柱层析证明经过纯化的大分子的纯度。(a)HPLC:使用高压液相色谱(HPLC)分析法测定Gd-DTPA-Polylysine的纯度，柱子为TSK3000(Bio-Rad)分子筛凝胶分析柱，用0.Olmol/L,PH=7.4的PBS液洗脱，淋洗速度为lml/min，测量走纸速度为2mm/min,每次进样2~5ul，以波长入=280nm处4全测出洗脱液。高压液相色谱(HPLC)分析标记样品的高压液相色谱图示，出现一个大峰(>95%),较小分子量峰<2%(图1)。(b)SDS-PAGE电泳:将20ul两倍体积的样品緩沖^i。到等体积的样品和标准溶液小试管中，在沸水中放置3-5min后，加到电泳样品槽中进行SDS-PAGE电泳，恒压100V到溴酚蓝指示剂接近前沿(大约4h)，取出固定后，用考马斯亮蓝R-25染色，再用7%乙酸脱色。Gd-DTPA-Polylysine的SDS-PAGE电泳图语示具有单一斑点(图2)。(c)醋酸纤维薄膜电泳把样品点在醋酸纤维薄膜上(4cm处作为原点)，然后放在盛有PH8.6巴比妥一巴比妥钠緩沖液中进行电泳40min，恒流电流，5mA/每条，取出薄膜，用考马斯亮蓝R-25染色，再用7%乙酸脱色。Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)联结体的醋酸纤维薄膜电泳图镨，结果表明Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)联结体具有单一斑点(图3)。(3)、免疫活性测定用ELISA法测定Gd-DTPA-Polylysine联结抗体的免疫活性，结果得到与VEGF的抗体接近的结合情况，而(Gd-DTPA)26-VEGF抗体的免疫活性下降很多(图4)。具体方法lug/100ulVEGF包被，包被液用0.Olmol/LPBS(PH=7.4)，4。C过夜放置，甩干。用1。/。BSA在37。C30min封闭后，200ul/孔洗涤液洗涤、甩干三次。100ng/ml为第一孔，以后5倍稀释不同量的VEGF的抗体或相应Gd-DTPA联结体进行免疫结合反应，37。C;改置lh。取出，200ul/孔洗涤液洗涤、甩干五次。加入70ul/孔经稀释过的羊抗鼠IgG-HRPO(1:2000)，37。C恒温下》文置60分钟后，用200ul/孔洗涤液洗涤、甩干六次。加入100ul/孔ABTS显色液，室温下发色20min或更长时间。使用波长入=414nm情况下，测量每孔的吸收系数A值。实施例2Gd-DTPA-po1y1ysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)在荷人乳腺癌棵鼠才莫型活体MR分子成像中的实验材料与方法1、动物冲莫型的制备本实验采用细胞悬液法原位接种人乳腺癌细胞抹MDA-MB-231制作乳腺癌棵小鼠模型。棵小鼠及乳腺癌MDA-MB-231细胞抹购自中国科学院肿瘤研究所。12只棵鼠均为雌性5周龄无特定病原体级(SPF)BALB/c棵小鼠，质量为1820g。乳腺癌MDA-MB-231细胞采用Leibovitz，sL-15medimu(GIBCO公司)加入15%胎牛血清(GIBCO公司)培养，待细胞至活细胞比率〉95%时按1x1070.2ml/只接种于棵鼠右侧第二对乳腺的脂肪垫内。接种后每周至少三次观察瘤体生长情况，2周后接种部位形成肉眼可见的肿瘤，4~5周后肺瘤直径达到1.5~2.Ocm,此时进^亍MRI成^f象研究。2、MRI扫描技术及图像分析采用GESignaAdvantage1.5TMR仪，使用3英寸表面线圈。每只荷瘤棵鼠均先平扫后增强，平扫采用横断位和冠状位SET1WI(TR/TE400/13ms)、FSET2WI(TR/TE.3000/84.3ms);增强扫描选用^黄断位、冠状位和矢状位SET1WI(TR/TE400/13ms)。层厚/间距1/0.5mm(横断位)；2/lmm(冠状位)，2/l腿(矢状位)，矩阵为256x256，FOV8cmx8cm。增强时釆用特异性MRI对比剂Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)，注射剂量均为O.2ml/只，经棵鼠尾静脉注射。注射对比剂后扫描时间为5min、lh、2h、3h、4h、8h、12h及24h。麻醉方法为2.5%戊巴比妥钠溶液O.05ml,腹腔注射。观察瘤体组织、肝脏组织、瘤体邻近前腿部肌肉组织增强表现，并测量信号强度。具体测量方法为分别于注入对比剂前后在冠状位上测量瘤体组织、肝脏组织、瘤体邻近前腿部肌肉组织的信号强度，并计算增强率，计算方法为(S增强-S平扫)/S平扫x100%。。测量时分别选择5个大小一致的感兴趣区(regionofinterest,R0I)，兴趣面积、不小于4mm2，尽量取强化明显且均匀的区域，取其平均值。3、病理检查实验结束后处死实验棵鼠，取肿瘤组织做病理检查，行常规组织病理检查和免疫组化检查。VEGF免疫组化所用I抗为鼠抗人单克隆抗体，II抗为羊抗鼠单克隆抗体。具体方法①脱水，切片，脱蜡如常。②PBS洗3次各5分钟。滴加3训202,室温静置20分钟，蒸馏水洗3次各3分钟。④柠檬酸緩冲液蒸煮20分钟，冷却后在PH7.2,0.01mlPBS中洗3次各5分钟。⑤滴加正常山羊血清封闭液，室温静置20分钟，甩去多余液体。滴力口1抗(l:40稀释)，4。C过夜。⑦0.01PBS洗3次，每次5分钟。⑧直接滴加II抗，37。C静置20分钟。0.01PBS洗3次，每次5分钟。⑩DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度。水洗，苏木精复染，水洗，封片。以胞浆内含有棕黄或棕褐色颗粒为VEGF阳性。4、统计学处理注射对比剂后各时间点的信号强度值与注射前分别进行配对t检验，统计软件为SPSS13.0,以户<0.05为显著性标准。结果1、强化表现肿瘤病灶在5min时强化不明显，lh后肿瘤边缘开始强化，强化程度较低，随着时间的延长强化逐渐明显，且由外周向中心弥散，至4h时强化达到高峰。观察至24h肺瘤仍有轻度强化。棵鼠肝脏组织在5min时即开始强化，2h时强化达高峰，随后随着时间的延长对比剂逐渐退出，至4h强化不明显。肌肉组织始终未见明显强化。主动脉等大血管于5min时即可见明显强化，持续约2h。(见图5)2、肿瘤组织、肝脏组织、肌肉组织各延迟扫描时间点信号结果及增强率比较。(1)肺瘤组织各扫描时间点信号值及增强率(见表l)。将注入对比剂后各扫描点的信号值逐个与注入对比剂前的信号值进行配对t检验，统计结果显示，注入对比剂后5min时瘤体组织的信号值与注入对比剂前没有显著差异(t=1.16,P=0.182),注入对比剂后lh至24h瘤体组织的信号强度与注入对比剂前有显著差异(P<0.05),即肿瘤呈显著强化表现。肿瘤强化的高峰出现在注射对比剂后4小时，最大强化率58.17%。表1:肺瘤组织各时间点信号强度及增强率信号值t值/值增强率%平扫643.88±24.64---5min664.39±27.141.610.1823.18lh825.84±37.146.950扁28.262h969.92±28.0467.65<0.00150.643h981.99±59.919.850扁52.514h1018.46±62.7716.77<0扁58.178h845.6±49.7414.41<0細31.3312h844.08±71.149.260.00131.0924h798.15±11.6111.93<0扁23.96(2)肝脏组织各扫描时间点信号强度及增强率(见表2)。将注入对比剂后各扫描点的信号值逐个与注入对比剂前的信号值进行配对t检验，统计结果显示，注入对比剂后5min,lh，2h，3h瘤体组织的信号值与注入对比剂前的信号值有显著差异(P〈0.05);注入对比剂4h后各时间点瘤体组织的信号值与注入对比剂前没有显著差异(P〉0.05)。胂瘤强化的高峰出现在2h,最大强化率56.33%。表2:肝脏组织各时间点信号值及增强率信号值t值/>值增强率%平扫713.53±19.09---5min1004.398±25.4318.35<0扁40.76lh1066.21±39.9834.44<0扁49.432h1115.43±25.8321.98<0扁56.333h1094.67±24.0228.47<0週53.424h762.51±42.252.680.0556.868h754.37±30.662.320.0815.7212h743.95±29.851.670.1714.2624h716.91±60.540.130.9060.47(3)肌肉组织各扫描时间点信号强度及增强率(见表3)，注入对比剂前后肌肉组织各扫描时间点信号值比较差异无统计学意义(,〉0.05)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(4)肿瘤组织、肝脏组织及肌肉组织各扫描时间点增强率比较(见图6)3、病理结果常规HE染色示肿瘤细胞杂乱排列，癌细胞大小形态不一，核分裂相多见。VEGF免疫组化肿瘤细胞浆内见椋色颗粒示染色阳性。(见图7)实施例3Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)与Gd-DTPA在乳腺癌棵鼠模型MR分子成像中的对照实验目前，国内外乳腺癌发病率均呈显著上升趋势，我国许多大城市的女性乳腺癌发病率已居妇女恶性肿瘤的首位，且发病年龄有提早的趋向。乳腺癌的诊断主要依赖影像学检查，包括X线、B超和MRI等，其中高场强MRI动态多期增强扫描的价值最大，其特异性及敏感性均4交高，但是，采用目前应用最广泛的Gd-DTPA时，乳Ai良、恶性胂瘤的^f兹共振表现有部分相互重叠、交叉。因此，无法做到特异性诊断，这既影响了乳腺癌与良性病变的鉴别，也影响早期乳腺癌的检出。如何特异性的、早期诊断乳腺癌是临床最关心的问题之一。本研究将VEGF靶向性MR对比剂Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)和常规对比剂Gd-DTPA在乳腺癌(MDA-MB-231细胞抹)棵鼠模型中进行对照研究，评价采用Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)进行乳腺癌MR分子成像的可能性，以及这种成像对乳腺癌的诊断作用。材料与方法1、动物模型的制备及实验动物分组本实验釆用细胞悬液法原位接种人乳腺癌细胞抹MDA-MB-231制作乳腺癌棵小鼠才莫型，共12只。制作方法同前。随机将12只已接种人乳腺癌细胞抹的棵鼠分成实验组和对照组。实验组注射对比剂Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)，对照组注射含相同Gd离子浓度的常规对比剂Gd-DTPA。Gd-DTPA用钆喷酸葡胺注射液(马根维显，含釓喷酸二葡胺469mg/ml，Schering广州)加生理盐水稀释而成。对比剂注射剂量均为O.2ml/只，经棵鼠尾静脉注射。2、MRI扫描技术及图j象分析采用GESignaAdvantage1.5TMR仪，使用3英寸表面线圏。每只棵鼠均先平扫后增强，平扫采用横断位和冠状位SET1WI(TR/TE400/13ms)、FSET2WI(TR/TE3000/84.3ms);增强扫描选用才黄断位和冠状位SET1WI(TR/TE400/13ms)。层厚/间距1/0.5mm(横断位)；2/lram(冠状位)，矩阵为256x256，FOV8cmx8cm。注射对比剂后的扫描时间为5min、lh、2h、3h、4h、8h、12h及24h。麻醉方法为2.5%戊巴比妥钠溶液O.05ml，腹腔注射。观察瘤体增强表现，并测量信号强度。体测量方法为分别于注入对比剂前后测量瘤体信号强度(SIt),棵鼠模型肿瘤同側邻近的前腿部肌肉组织信号强度(SlM),并计算其对比度噪声比(contrasttonoiseratio,CNR)。计算方法为CNR=(SIT-SIM)/SD噪声。毎只-寐鼠SIt及SL的测量分别选择5个大小一致的感兴趣区(ROI)，兴趣面积不小于4咖2,测量时尽量取强化明显且均匀的区域，取其平均值。3、病理;险查实验结束后处死实验荷瘤棵鼠，取肿瘤组织送病理检查，分别行常规组织病理学^r查和VEGF免疫组化。具体方法同前。4、统计学处理对实验组和对照组基线、注射对比剂后各时间测定点的信号强度值、CNR值与注射前分别进行统计分析，统计软件为SPSS13.0，以户<0.05为显著性标准。结果1、强化表现实验组注入对比剂Gd-DTPA-po1y1ysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)5min后扫描见小鼠血管明显强化，肿瘤强化不明显；lh后胂瘤边缘开始强化，强化程度较低，随着时间的延长强化逐渐明显，且由外周向中心弥散，至4h时强化达到高峰。观察至24h肺瘤仍有轻度强化(见图8)。对照组注入对比剂Gd-DTPA5min后扫描见肺块明显均勻强化，随着时间的延长强化程度逐渐减弱，于4h后对比剂基本退出(见图9)。2、基线比较分别测定实验组和对照组的平扫图像上瘤体信号强度(SIt)及同侧19前肢肌肉组织信号强度(SIm)值，计算CNR值，经两样本H企验比较瘤体与瘤体、肌肉与肌肉之间信号的差异，显示两组间差异无统计学意义SIT"=0.841,尸=0.303)、SISQ=0.262，0.199)及CNR值(f=0.713,,=0.285),i兌明两组基线无明显差异。3、各延迟时间点扫描结果比较实验组和对照组棵鼠分别注射不同的对比剂后在8个时间点进行扫描，在冠状位上分別測定SIt和SIm，并计算CNR值。进行实验组和对照组组间比较和实验组、对照组的组内比较。分别采用方差分析(总体方差不齐，先进行秩变换，再进行方差分析)和LSD分析。结果显示(1)实验组和对照组组间比较实-验组和对照组的SlT差异有统计学意义(F=31.348，P<0.001);实一验组和对照组的SlM差异有统计学意义(F=19.094，P<0.001);实'验组和对照组CNR差异有统计学意义(F=45.996，P<0.001),说明实—验组和对照组之间的增强效果有差异。(见图IO)(2)实验组组内比较实验组SIT值在注射对比剂前后有统计学差异(F=419.39，P<0.001),通过两两分析后示SIT在注射对比剂后5min时瘤体信号强度的升高与注射对比剂前比较其差异无统计学意义(P=0.301);延迟lh后至24h瘤体信号强度的升高与注射对比剂前比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。实验组SIM值在注射对比剂前后无统计学差异(F=1.371，P=0.209)。实一验组CNR在注射对比剂前后有统计学差异(F=138.742,P<0.001);两两分析显示在注射对比剂后5min时CNR与注射对比剂前比较其差异无统计学意义(P=0.677);延迟lh后至24hCNR值均有统计学意义(P<0.001)。(具体见表4)由此可见，注入对比剂Gd-DTPA-Po1y1ysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)后，瘤体在1至24h内均达到增强效果，而肌肉组织没有明显强化，这不仅表明了Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)对胂瘤的良好强化效果，亦显示了其靶向功能。表4:实验组注射对比剂后各时间点扫描结果SITSI固CNRXP值尸值尸值c-645息29.70-647.71±32.45--0.0552±1.01-C+5min654.95±32.400.301652.78±33.070.6450.0387±0.940.677C+lh740.15±31.490.000655.54±33.290.4761.2520±0.740.000C+2h977.60±37.230.000656.67±70.550.4153.6687±0.950細C+3h1014.41±56.010.000652.31±65.330.1594.5241±0.840扁C+4h1016.37±39.13o扁652.31±65.330.6764.9032±1.060扁C+8h843.37±30.520細643.94±26.400.7323.4152±0.710.000C+12h799.20±15.870扁634.71±33.800.2384.0365±0.860扁C+24h791.31±20.360.000638.81±30.810.4192.7024±0.670細注表示实验组注射对比剂(C+)后各时间点测定值或计算值分别与平扫结果(C-)比较。(3)对照组组内比较对照组SIT注射对比剂前后有统计学差异(F=152.037，P〈0.001);两两分才斤示在注射对比剂后5min、lh、2h、3h、4h瘤体信号强度的升高与注射对比剂前比较其差异有统计学意义(P5min，lH，2H,3H,4H〈0.001);延迟8h至24h后瘤体信号强度的升高与注射对比剂前比较差异无统计学意义(P>0.05)。对照组SIM值在注射对比剂前后有统计学差异(F-26.236，P<0.001);两两分析示在注射对比剂5min、lh、2h和3h与注射对比剂前信号改变有统计学差异(P5min，1H，2H<0.001，P3H=0.039);延迟4h至24h后对比剂注射前后信号改变无统计学差异(P>0.05)。对照组CNR在注射对比剂前后有统计学差异(F=59.596，P<0.001);两两分析示在注射对比剂5min、lh、2h、3h与注射对比剂前信号改变有统计学差异(P5min，lh，2h，3h〈0.001);延迟4h至24h后对比剂注射前后信号改变无统计学差异(P>0.05)。(具体见表5)结合SIT值和CNR值的分析结果，由于CNR值在4h时无统计学差异(P-0.155)，所以我们认为SIT值在4h时的信号改变无意义。综上所述，注入对比剂Gd口DTPA后5min、lh、2h、3h时瘤体与月几肉组织均有强化效果，4h后对比剂退出。表5:对照组注射对比剂前后各时间点扫描结果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注表示对照组注射对比剂(C+)后各时间点测定值或计算值分别与平扫结果(C-)比较。3、病理结果常规HE染色示肺瘤细胞大小形态不一，核分裂相多见。VEGF免疫组化肿瘤细胞浆内见棕色颗粒示染色阳性。(见图ll)。权利要求1、一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb联结体，其特征在于通过下列方法制得a、DTPA双酸酐的合成将二乙三胺五酸、乙酸酐和吡啶混合；b、DTPA-Polylysine制备将多聚赖氨酸溶解于NaH2CO3/Na2HCO3缓冲液中，搅拌，并加入步骤a得到的DTPA双酸酐溶液中；c、Gd-DTPA-Polylysine制备将Gd2O3加入到HCl中，加热、溶解，蒸发多余的HCl即得到GdCl3的溶液，将GdCl3溶液加入到步骤b得到的DTPA-Polylysine溶液中；d、抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联结将抗VEGF单克隆抗体溶解NaH2CO3/Na2HCO3缓冲液中，然后加入碳化二亚胺和步骤c得到的Gd-DTPA-Polylysine，搅拌反应，层析，收集抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联合体。2、根据权利要求1所述的联结体，其特征在于在步骤b中还包括取出多聚赖氨酸、NaH2C03/Na2HC03、DTPA双酸酐混合溶液，用平衡透析法除去游离的DTPA,并转换到PH-5，0.2mlNaAc/HAc緩冲液。3、根据权利要求1所述的联结体，其特征在于在步骤d中选用SepharoseCL-4B层析柱层析。4、一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb联结体的制备方法包括以下步骤a、DTPA双酸酐的合成将二乙三胺五酸、乙酸酐和吡咬混合；b、DTPA-Polylysine制备将多聚赖氨酸溶解于NaH2C03/Na2HC(M爰冲液中，搅拌，并加入步骤a得到的DTPA双酸酐溶液中；c、Gd-DTPA-Polylysine制备将Gd203加入到HC1中，加热、溶解，蒸发多余的HCl即得到GdCl3的溶液，将GdCl3溶液加入到步骤b得到的DTPA-Polylysine溶液中；d、抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联结将抗VEGF单克隆抗体溶解NaH2C03/Na2HC03緩沖液中，然后加入碳化二亚胺和步骤c得到的Gd-DTPA-Polylysine,搅拌反应，层析，收集抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联合体。5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于在步骤b中还包括取出多聚赖氨酸、NaH2C03/Na2HC03,DTPA双酸酐混合溶液，用平衡透析法除去游离的DTPA，并转换到PH-5，0.2mlNaAc/HAc緩沖液。6、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于在步骤d中选用SepharoseCL-4B层析柱层析。7、根据权利要求l-3任一所述的联结体应用，其特征在于该联结体作为对比剂在磁共振成像中应用。8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的i兹共振成^f象是在体显示肿瘤内VEGF基因表达、VEGF介导的瘤内血管生成的特异性、靶向性磁共振成像。全文摘要本发明涉及一种联结体，尤其是涉及一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)联结体、制备方法及其应用。本发明的技术方案如下一种Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)联结体(对比剂)，通过下列方法制得a.DTPA双酸酐的合成；b.DTPA-Polylysine制备；c.Gd-DTPA-Polylysine制备；d.抗VEGF单克隆抗体与Gd-DTPA-Polylysine的联结。本发明借助于Polylysine(多聚赖氨酸)的扩增效应和单克隆抗体的特异性，此对比剂Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF单克隆抗体)具有免疫活性高、靶向性强、Gd³⁺含量多等优点。文档编号A61K49/06GK101564540SQ20081003647公开日2009年10月28日申请日期2008年4月22日优先权日2008年4月22日发明者汪登斌,钟高仁,陈克敏,英龚申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院