用于生产型动物的改良dna疫苗的制作方法

专利名称：：用于生产型动物的改良dna疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于家畜(特别是牛和猪)的改良DNA疫苗，
背景技术：
：自从二十世纪九十年代初以来，已经了解了脱氧核糖核酸(DNA)分子在接种中的用途(Wolf等人，Science1990.247.1465-1468)。用编码有免疫活性的蛋白质的DNA或RNA分子体内转染将要接种的受体的细胞后，该接种技术诱发细胞和体液免疫。一种DNA疫苗由至少一种质粒和药学可接受的载体或赋形剂组成，这种质粒由将要接种的受体的细胞机器表达。该质粒的核苷酸序列尤其编码一种或多种免疫原，例如能够在将要接种的受体中诱发细胞免疫应答(T淋巴细胞的动员)和体液免疫应答(刺激产生针对免疫原的特异性抗体)的蛋白质或糖蛋白(DavisH丄CurrentOpinionBiotech.1997.8.635-640)。来自病原体的所有免疫原都不是在将要接种的动物中自然地十分有效地诱发最佳保护性免疫应答的抗原。因此必须增强免疫应答。已提出DNA疫苗的多种施用途径(腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、粘膜等)。也提出了多种施用工具，特别是DNA包被和发射的金颗粒一用以穿透到将要接种的受体的皮肤细胞内(Tang等人，Nature1992.356.152-154),和液体射流注射器一能转染皮肤细胞和下面的组织细胞(Furth等人，AnalyticalBioch.1992.205.365-368)。一些化学化合物已经用于DNA的体外转染A/-阳离子脂类。阳离子脂类本身分为4个亚类。l)含有季铵盐的阳离子脂，如D0TMA(二油酰-氧丙基三甲铵，Gibco生产，商品名为Lipofectine)、D0TAP(三甲基-2，3-(十八碳-9-烯酰氧基)-l-丙基铵；Gregoriadis等人，FEBSLetters1997.402.107-110)、DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四烷氧基)-1-丙基铵；WO-A-9634109)、DLRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2，3-双(十二烷氧基)-l-丙基铵；Feigner等人，Ann.NYAcad.Sci.1995.772.126-139)。这些含有季铵盐的阳离子脂可以与另一种中性脂组合，如DOPC(二油酰-磷脂酰胆碱)或DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)(J.P.Behr,BioconjugateChemistry1994，5.382-389)。2)月旨胺(lipoamine)，如D0GS(双十八烷基氨基甘氨酰精胺，Promega生产，商品名为Transfectam;Abdallah等人，Biol.Cell.1995.85.1-7)、DC-Choi(二甲基氨基乙烷-氨甲酰基-胆固醇；Gao和Huang,Biochem.Biophys.Res.Co鹏un.1991.179.280-285)、BGSC(双胍-亚精胺-胆固醇)、BGTC(双胍-三(氨乙基)胺-胆固醇)(Vigneron等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996.93.9682-9686)。3)含有季铵盐和脂铵的阳离子脂类，如D0SPA(N,N-二甲基-N-(2-(精胺羧基酰胺基)乙基)-2，3-双(二油酰氧基)-1-丙烷亚胺五氢-氯化物，Gibco销售，商品名为LipofectAmine⑤；Hawley-Nelson等人，Focus1993.15.73-79)、GAP-DLRIE(N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2，3-双(十二烷氧基)-l-丙烷铵；Wheeler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996.93.11454-11459;Norman等人，Vaccine1997.15.801-803),4)含有脒盐的脂类，如ADPDE、AD0DE(Ruysschaert等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1994.203.1622—1628)。B/-聚合物，如SuperFect(活化的dendrimer分子，Qiagen生产；Xu等人，Mol.Genet.Metab.1998.64.193-197)，和C/-生物化学剂，如毒素，特别是霍乱毒素。这些化合物中有一些已经用于配制效果减轻的DNA疫苗。体外转染领域的知识不适用于DNA接种，后者的最终目的在于确保保护性免疫反应。利用已知能促进体外转染的化合物观察到对诱发有效免疫保护的负面影响。一些制剂化学化合物在高剂量时对转染的细胞有毒性。在Etchart的工作中(Etchart等人，J.Gen.Virol.1997.78.81577-1580),在经鼻内途径施用DNA疫苗的过程中使用D0TAP没有佐剂作用，而经口途径有佐剂作用。D0TAP也已经用于编码流感病毒血凝素(HA)的DNA疫苗(用于小鼠模型)，经鼻内途径施用(Ban等人，Vaccine1997.15.811-813)，但是加入D0TAP抑制免疫应答。在通过肌内途径施用的编码乙肝病毒表面蛋白(S)的DNA疫苗(用于小鼠模型)中使用DC-Choi或D0TAP/D0PE，能提高抗体应答，而使用Lipofectine(或D0TMA)不能提高这种应答(Gregoriadis等人，FEBSLetters1997.402.107-110)。DC-Chol/DOPE也已经用于针对人类免疫缺陷病毒(HIV，Env蛋白)的DNA疫苗(用于小鼠模型)，经肌内途径施用诱发更有效的免疫应答，而经皮下或皮内途径施用不能提高这种应答(Ishii等人，AIDSRes.Hum.Retro.1997.13.1421-1428)。添加某些细胞因子，特别是白介素和干扰素，能提高特别是由DNA疫苗诱发的免疫应答。每种细胞因子引发一种特异性的反应，将免疫应答较高或较低程度地定向于细胞反应或体液反应(Pasquini等人，Immunol.Cell.Biol.1997.75.397-401;Kim等人，J.InterferonCytokineRes.1999.19.77-84)。如果免疫内容不同，特别是如果对另外的物种施用这种细胞因子，因此处于异源免疫系统中，从特定种获得的细胞因子的佐剂作用不一定相同。加入细胞因子也可能没有佐剂作用，或者甚至可能导致所研究的作用逆转，也就是说，免疫应答降低或者抑制。因此，编码与GM-CSF融合的单链免疫球蛋白的DNA疫苗不能增强免疫应答，而直接对小鼠施用这种融合蛋白是有效的，施用由Fv和细胞因子IL-1P组成的融合蛋白，或者施用编码后一种融合蛋白的DNA疫苗，具有相同的结果(Hakim等人，J.Immunol.1996.157.5503-5511)。使用以融合或非融合构象共表达细胞因子IL-2和乙型肝炎病毒包膜蛋白的质粒导致体液和细胞免疫应答均增强(Chow等人，J.Virol.1997.71.169-78)。然而，使用编码人类获得性免疫缺陷病毒(HIV-l)糖蛋白gpl20和细胞因子IL-2的双顺反子质粒，比使用只编码gp120的单顺反子质粒诱发更低的特异性抗-gpl20免疫应答(Barouch等人，J.Immunol.1998.161.1875-1882)。向小鼠中同时注射两种表达载体一一种编码狂犬病病毒G糖蛋白，另一种编码鼠GM-CSF—刺激B和T淋巴细胞的活性，而同时注射编码Y-干扰素(代替鼠GM-CSF)的质粒导致免疫应答降低(Xiang等人，Immunity1995.2.129-135)。抗原的某种修饰，如编码抗原的核苷酸序列部分的缺失，DNA片段插入编码抗原的核苷酸序列中或非翻译区上游或下游，也能提高DNA疫苗的效能，特別是通过提高抗原的表达水平或其递呈。然而实际上，对编码抗原的核苷酸序列操作可能导致最初的免疫活性降低或丧失。因此，编码狂犬病病毒G抗原的基因中跨膜域缺失，使得通过肌内途径施用编码这种修饰抗原的DNA疫苗后在小鼠模型中诱发的保护水平降低(Xiang等人，Virol.1995.209.569)。编码牛疱奢病毒(HBV)gD糖蛋白的基因中跨膜域缺失，在经肌内途径接种的牛中不能增强抗体应答，只能豫发部分保护(vanDrunenLittle-vandenHurk等人，J.Gen.Virol.1998.79.831-839)。在用编码埃博拉病毒GP糖蛋白的DNA疫苗或用编码分泌形式的此种GP糖蛋白的DNA疫苗免疫后攻击的豚鼠中，体液和细胞免疫应答及引起的保护相同(Xu等人，NatureMedicine1998.4.37-42)向编码疟疾Pf332抗原的基因中插入人组织纤溶酶原激活物(tPA)的信号序列，在经肌内途径接种的小鼠中不能增强抗体应答(Haddad等人，FEMS1997.18.193-202)。向编码鼠轮状病毒VP7抗原的基因中同时加入tPA序列，在经皮内途径接种的小鼠中也不能增强抗体应答，而由VP4抗原和tPA组成的融合蛋白则致使应答增强，但不诱发有效的保护(Choi等人，Virology1998.250.230-240)。对一种抗原的核苷酸序列进行的修饰通常不能直接用于另一种抗原，因为抗原不总是具有相同的结构排列。
发明内容本申请人有提高DNA接种效率的目的。其目的特别在于通过DNA接种在家畜(特别是牛和猪)中获得更好的免疫应答，特别是有效的保护。本申请人以生产如下改良DNA疫苗为目的，这些疫苗能在牛中诱发有效和保护性的免疫应答，对抗1型牛疱奢病毒(BHV-1),也称为牛传染性鼻气管炎(IBR)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，粘膜病病毒或l型或2型牛痕病毒(牛病毒性腹泻病毒或BVDV-1和BVDV-2)，3型副流感病毒(bPI-3)本申请人以生产如下改良DNA疫苗为目的，这些疫苗能在猪中诱发有效和保护性的免疫应答，包含至少一种针对选自下列的病毒的效价猪疱奢病毒或奥耶斯基病(假狂犬病病毒或PRV)、猪生殖道呼吸道综合征病毒(porcinereproductiverespiratorysyndromevirus)(或PRRSV)、猪流感病毒(或SIV)、普通猪霍乱病毒(或HCV)、细小病毒。本申请人也以生产如下改良DNA疫苗为目的，这些疫苗能在牛中获得有效和保护性的免疫保护，包含至少一种针对BHV-1、BRSV、BVDV、bPI-3和狂犬病病毒的效价。本发明的主题是改良的DNA疫苗，它们能获得针对至少一种感染家畜(特别是牛和猪)的病原体的有效保护。DNA疫苗的改良方法包括配制、添加GM-CSF、抗原的优化或这些办法的组合。优逸地，DNA疫苗的改良方法是配制，任选地添加GM-CSF或抗原优化，或者最后添加GM-CSF和优化抗原。根据定义，DNA疫苗含有编码并表达基因或基因片段(例如表位)的质粒作为活性成分。术语质粒包括DNA转录单元，它含有多核苷酸序列，该序列含有将要表达的基因序列和在体内表达所必需的元件。环状质粒形式、超螺旋形式等是优选的。线性形式也属于本发明的范围内。每个质粒含有启动子，它能确保插入的基因在其控制下在宿主细胞中表达.它们通常是强真核启动子，特别是巨细胞病毒早期启动子CMV-IE，是人或鼠来源的，或者任选地是其它来源的，如大鼠或豚鼠来源的。一般来说，启动子是病毒来源或细胞来源的。关于CMV-IE以外的病毒启动子，能够提到的有SV40病毒早期或晚期启动子，或劳斯肉瘤病毒LTR启动子。也可以是衍生基因的病毒的启动子，例如对该基因特异的启动子。至于细胞启动子，能够提到的有细胞骨架基因的启动子，如结蛋白启动子，或肌动蛋白启动子。当几个基因存在于同一质粒中时，它们可能在同一转录单元或几个不同的单元中。根据第一种模式，通过加入含有季铵盐的下式阳离子脂作为佐剂配制根据本发明的DNA疫苗R，-O-CH2-CH-CH2-N—R2-X0RiCH3其中仏是饱和或不饱和的线型脂族基团，含有12-18个碳原子，R2是另一脂族基团，含有2或3个碳原子，X是羟基或氨基.优选地，这是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-l-丙铵；WO-A-9634109),优选与中性脂，特别是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)组合，形成DMRIE-DOPE。因此，本发明的主题是一种针对至少一种侵袭家畜(特别是牛或猪)的病原体的DNA疫苗，它含有至少一种质粒一该质粒含有至少一种编码动物种病原体的免疫原的核苷酸序列(在允许该序列在体内表达的条件下)，和含有季铵盐的阳离子脂，特别是DMRIE，优选地与DOPE组合。优选地，在使用前即刻将重组载体与该佐剂混合，优选地在对动物施用之前使这样制备的混合物形成复合物，例如保持10-60分钟，特别是30分钟左右.当含有D0PE时，DMRIE:DOPE的摩尔比优选地是95:5至5:95,更特别地是l:L质粒DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂的重量比尤其可以为50:1至1:10，特别是10:1至1:5，优选地1:1至1:2。根据第二种模式，向根据本发明的疫苗中加入GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺教因子；ClarkS.C.等人,Science1987.230.1229;GrantS.M.等人，Drugs1992.53.516);其实现方法可以是直接向疫苗组合物中掺入GM-CSF蛋白，或者优选地在允许体内表达的条件下向表达载体中插入编码GM-CSF的核苷酸序列。对于表达载体，优选地使用质粒，例如含有编码目的抗原的核苷酸序列的质粒或另一质粒。优选地根据将要接种的动物种选择GM-CSF;因此，对于牛，使用牛GM-CSF;对于猪，使用猪GM-CSF。根据第三种模式，编码免疫原的核苷酸序列是一种优化的形式。优化是指核苷酸序列的任何修饰，特别是至少表现为该核苷酸序列的较高水平的表达，和/或编码该抗原的信使RNA的稳定性提高，和/或引发向胞外基质中分泌该抗原，直接或间接的结果是诱发的免疫应答增强。在本发明中，目的抗原的优化优选地在于编码目的抗原跨膜域的核苷酸序列片段的缺失(缺失是指完全缺失或足以使跨膜域不再或基本上不再有功能的部分缺失)，和/或在于编码tPA(Montgomery等人，Cell.Mol.Biol.1997.43.285-292;Harris等人,Mol.Biol.Med.1986.3.279-292)信号的核苷酸序列的框内添加，和/或在于稳定化内含子向将要表达的基因上游的插入。编码目的抗原跨膜域的DM片段的缺失促使截短的抗原向胞外基质中分泌，从而提高了它们与免疫系统的细胞接触的可能性。编码tPA信号的核苷酸序列的插入提高与tPA信号连接的信佳RNA的可翻译性，从而提高该信使RNA的表达水平，因此提高抗原的产生水平。tPA信号也在合成抗原的分泌中起作用。也可以使用其它编码信号肽的核苷酸序列，特别是从蜜蜂中获得的编码蜂毒肽的信号肽的序列(SiskW.P.等人，1994，J.Virol.68,766-775)。稳定化内含子插入编码目的抗原的基因中避免了其信使RNA的异常剪接，并且保持后者的物理完整性。优选地，tPA信号是人源的。人tPA信号的核苷酸序列可从GenBank数据库中获得，编号为NM—000930。优选地，内含子是兔P-珠蛋白基因的内含子II(vanOoyen等人，Science1979.206.337-344),其核苷酸序列可从GenBank数据库中获得，编号为V00882,在参考文献中命名为2号内含子。本发明的主题是一种改良DNA疫苗，它在牛中能诱发针对牛传染性鼻气管炎(IBR)的有效和保护性的免疫应答。引起牛传染性鼻气管炎的病毒是1型牛疱渗病毒(BHV-1)，它是甲13型疱渗病毒科(Aiphaherpesviridae)的成员(BabiukL.A,等人，1996，Vet.Microbiol"53，31-42)。编码糖蛋白gB、gC和gD的核苷酸序列已知，可从GenBank数据库中获得，编号为AJ004801。根据本发明，优选地通过用根据本发明的佐剂(特別是DMRIE，优选地是DMRIE-DOPE)配制，改进针对IBR的MA疫苗。任选地，可以同时加入牛GM-CSF(Maliszewski等人，Molec.Immunol.,1988，25,8"-850)，或者优化至少一种IBR抗原，或者最后加入牛GM-CSF和优化至少一种IBR抗原。编码牛GM-CSF的核苷酸序列可从GenBank数据库中获得，编号为U22385。牛GM-CSF的添加可以如下实现向疫苗组合物中掺入牛GM-CSF多肽，或者优选地向体内表达栽体(优选地质粒)中插入编码牛GM-CSF的核苷酸序列。优选地，编码牛GM-CSF的核苷酸序列插入第二表达质粒(例如pLF1032，实施例13)中，该质粒不同于插入编码IBR抗原的基因的质粒。来自IBR的抗原的优化如下进行将糖蛋白gB和/或糖蛋白gC和/或糖蛋白gD的信号肽序列替换为一种"信号"序列，特别是人源tPA信号的那些(GenBank编号NM—000930),和/或缺失编码gB和/或gC和/或gD跨膜域的DNA片段。编码这些糖蛋白之一的跨膜域的DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分(糖蛋白的胞质部分)缺失。根椐本发明的针对IBR的DNA疫苗因此能编码并表达一种优化的IBR抗原(gB、gC或gD)或其中两种或所有三种，即，优化的gB、优化的gC和优化的gD。能在本发明中应用的编码BHV-1抗原的核苷酸序列，和表达栽体的不同构建体，在附加实施例和FR-Al-2751229中，特别是在实施例7和8中给出。优选地，根据本发明，针对HBV-1的DM疫苗用服RIE-DOPE配制，包含编码BHV-1gB抗原的表达质粒(例如pPB281，实施例3.1.2)，通过缺失編码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化；编码BHV-1gC抗原的第二表达质粒(例如pPB292，实施例3.2.2)，通过缺失14编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化；编码朋V-1gD抗原的第三表达质粒(例如pPB284，实施例3.3.2)，通过缺失编码跨膜域的核苷M列片段和邻接的C端部分优化。通常，且不仅对于BHV-1，与编码跨膜域的序列邻接的C端部分可能是保守的。然而，与编码跨膜域的序列同时删除它通常比较容易。^^发明的目的也在于一种改良DNA疫苗，它在牛中能i秀发针对牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的有效和保护性的免疫应答。BRSV病毒是一种副粘病毒，也是副粘病毒科(Para迈yxoviridae)的成员(Baker等人，Vet.Clin.NorthAm.FoodAnim.Pract.，1997，13，425-454)。编码F蛋白和G糖蛋白的核苷,列已知，可从GenBank数据库中获得，编号分别为Y17970和U33539。针对BRSV的DNA疫苗优选地用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE，优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地，可以同时加入牛GM-CSF，或者优化至少一种BRSV抗原，或者最后加入牛GM-CSF和优化至少一种BRSV抗原。牛GM-CSF的添加可以如BHV-1所述进行。来自BRSV的抗原的优化如下进行将BRSV的F蛋白和/或BRSV的G包膜糖蛋白的信号序列替换为一种"信号"序列，特别是人源tPA信号序列，和/或缺失编码F和/或G的跨膜域的DNA片段。编码这些蛋白质之一的跨膜域的DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分缺失。根据本发明的针对BRSV的DM疫苗因此能编码并表达一种优化的BRSV抗原(F或G)或此两者(F和G)。能在本发明中应用的编码BRSV抗原的核苷酸序列，和不同表达栽体构建体，在附加实施例和FR-Al-2751229中，特別是在实施例9和10中给出。优选地，根据本发明，针对BRSV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含编码BRSVF抗原的表达质粒(例如pSB114,实施例4.1.3)，通过插入人tPA的信号序列代替F的信号序列、缺失编码跨膜域的F的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化；编码BRSVG抗原的第二表达质粒(例如pSB110，实施例4.2.2)，通过插入人tPA的信号序列代替G的信号序列、缺失编码G的跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化。本发明的主題也在于一种改良DNA疫苗，它在牛中能诱发针对BVDV病毒的有效和保护性的免疫应答.BVDV病毒是黄病毒科(Flaviviridae)的一种瘟病毒。它广泛分布于牛群中，表现为胚胎畸形、流产或临床呼吸道(粘膜病)和肠道(牛病毒性腹泻)症状。BVDV病毒可以根据临床指征的严重程度区分，分成两组1型BVDV(不明显的或轻度的临床指征)和2型BVDV(急性临床指征，出血，高发病率，高死亡率)(DeanH.J.和LeyhR.,1999,Vaccine,17，1117-1124)。当BVDV病毒类型不能清楚地指明时，该病毒被认为是1型或2型。BVDV病毒是一种包膜单链RNA病毒，由编码一种多蛋白的单基因组成，该多蛋白在裂解后产生几种明确区分的蛋白质，特别是EO蛋白(gP48)和E2蛋白(gp53)(VassilevV.B.等人，1997，J.Virol.，71,471-478)。编码E0-E2多蛋白的核普酸序列已知，可从GenBank数据库中获得，BVDV-1的保藏号为M96687,BVDV-2的为AF145967。针对BVDV的DNA疫苗优选地用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地，可以同时加入牛GM-CSF,或者优化至少一种BVDV抗原，或者最后加入牛GM-CSF和优化至少一种BVDV抗原。牛GM-CSF的添加可以如BHV-1所述进行。来自BVDV的抗原的优化如下进行在编码BVDV的E0蛋白和/或BVDV的E2蛋白的核苷酸序列上游添加一种"信号"序列，特别是人源tPA的信号序列，和/或缺失编码E2跨膜域的DNA片段，和/或在编码EO和/或E2的核苷酸序列上游插入内含子，特别是兔0-珠蛋白基因的内含子II。根据本发明的针对BVDV的DNA疫苗因此能编码并表达一种优化的BVDV抗原(EO或E2)或此两者(EO和E2)。能在本发明中应用的编码BVDV抗原的核苷酸序列，和表达栽体的不同构建体，在附加实施例和FR-A1-2751229中，特别是在实施例13中给出。优选地，根据本发明，针对BVDV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含编码BVDVE0抗原的表达质粒(例如pLF1029，实施例5.1.2，pLF1031，实施例6.2.2)，通过在E0上游插入人tPA的信号序列并且在EO上游插入兔p-珠蛋白基因的内含子II优化；编码BVDVE2抗原的第二表达质粒(例如pLF1021，实施例5.2.2，pLF1023，实施例6.1.2)，通过在B2上游插XAtPA的信号序列、缺失编码E2跨膜域的核苷,列片段和邻接的C端部分并且在E2上游插入兔p-珠蛋白基因的内含子II优化。能有利地生产一种质粒混合物。该混合物可含有至少两种表达质粒，每种均表达一种不同的免疫原(EO或E2)和/或从不同类型的BVDV(BVDV"-1或BVDV-2)获得。特别是，混合物由表达BVDV-1EO、BVDV-1E2、BVDV-2EO和BVDV-2E2的4种质粒组成。本发明的主题也在于一种改良的DNA疫苗，它能在牛中诱发针对3型副流感病毒(bPI-3)的有效和保护性的免疫应答。bPI-3病毒是一种副粘病毒，也是副粘病毒科的成员(Tsai等人，Infect.I咖un.，1975，11，783—803)。编码bPI-3的血凝素和神经氨酸酶蛋白(HN)和融合蛋白(F)的核苷酸序列已知，可从GenBank数据库中获得，保藏号为U31671。针对bPI-3的DM疫苗优选地用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE，优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地，可以同时加入牛GM-CSF，或者优化至少一种bPI-3抗原，或者最后加入牛GM-CSF和优化至少一种bPI-3抗原o牛GM-CSF的添加可以如BHV-1所述进行。来自bPI-3的抗原的优化如下进行将bPI-3的血凝素-神经氨酸酶(HN)的和/或bPI-3的融合蛋白(F)的信号序列替换为一种"信号"序列，特别;i人源tPA信号序列，和/或缺失编码HN和/或F的跨膜域的DM片段，和/或在编码HN和/或F的核苷*列上游插入一种内含子，特別是兔P-珠蛋白基因的内含子II。编码这些蛋白质之一的跨膜域的DM片段优选地伴随着邻接的C端部分缺失。根椐本发明的针对bPI-3的DNA疫苗因此能编码并表达一种优化的bPI-3抗原(HN或F)或此两者(HN和F)。能在本发明中应用的编码bPI-3抗原的核苷酸序列，和不同表达载体构建体，在附加实施例和FR-A1-2751229中，特别是在实施例14和15中给出。优选地，根据本发明，针对bPI-3的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含编码bPI-3HN抗原的表达质粒(例如pLF1025，实施例7.1.2)，通过插入人tPA的信号序列代替丽的信号序列、缺失编码跨膜域的HN的核苷酸序列片段和邻接的C端部分并且在HN上游插入兔p-珠蛋白基因的内含子II优化；编码bPI-3F抗原的第二表达质粒(例如pLF1027，实施例7.2.2)，通过插入人tPA的信号序列代替F的信号序列、缺失编码F的跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分并且在F上游插入兔P-珠蛋白基因的内含子II优化。本发明的主题也在于一种改良DNA疫苗，它在猪中能诱发针对疱渗病毒(PRV)的有效和保护性的免疫应答。PRV是甲型疱渗病毒科(Alphaherpesvirinae)的成员，该病毒引起奥耶斯基病(SawitzkyD.，Arch,Virol.S卿l.，1997,13，201-206)。编码糖蛋白gB、gC和gD的核苷酸序列已知，可从GenBarik数据库中获得，保藏号分别为M17321、AF15809t)、A兩6702。选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地，可以同时加入猪GM-CSF(InumaruS.和Taka迈atsuH.，Imnmnol.Cell.Biol.，1995，73，474—476)，或者优化至少一种PRV抗原，或者最后加入猪GM-CSF和优化至少一种PRV抗原。猪GM-CSF的添加可以如下进行向疫苗组合物中掺入猪GM-CSF多肽，或者向体内表达载体(优选地质粒)中插入编码猪GM-CSF的核苷酸序列(例如，可从GenBank数据库中获得，保藏号为D21074)。优选地，18编码猪GM-CSF的核苷酸序列插入第二表达质粒(例如pLF1033，实施例14)中，该质粒不同于插入编码PRV抗原的基因的质粒。来自PRV的抗原的优化如下进行将糖蛋白gB和/或糖蛋白gC和/或糖蛋白gD的信号肽序列替换为一种"信号"序列，特别是人源tPA信号序列(GenBank保藏号NM-000930),和/或缺失编码gB和/或gC和/或gD跨膜域的DNA片段。编码这些糖蛋白之一的跨膜域^DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分缺失。根据本发明的针对PRV的DNA疫苗因此可编码并表达一种优化的PRV抗原(gB、gC或gD)或其中两种或所有三种，即，优化的gB、优化的gC和优化的gD。能在本发明中应用的编码PRV抗原的核苷酸序列，和不同表达载体构建体，在附加实施例和FR-A1-2751224中，特别是在实施例8和9中给出。优选地，根据本发明，针对PRV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含编码PRVgB抗原的表达质粒(例如pSB102，实施例8.1.2)，通过缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化；编码PRVgC抗原的第二表达质粒(例如pSB104，实施例8.2.2)，通过缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化；编码PRVgD抗原的第三表达质粒(例如pSB106，实施例8.3.2)，通过缺失编码跨膜域的核苷^列片段和邻接的C端部分优化。本发明的目的也在于一种改良DNA疫苗，它在猪中能诱发针对猪生殖道呼吸道综合征病毒(PRRSV)的有效和保护性的免疫应答。PRRSV是一种动脉炎病毒(Arterivirus)，是动脉炎病毒科(Arteriviridae)的成员(Murtaugh等人，Arch.Virol.,1995，140，1451-1460)。编码由开放阅读框0RF3、0RF5和0RF6编码的蛋白质的核苷酸序列已知，可从GenBank数据库中获得，保藏号为U87392。针对PRRSV的DM疫苗优选地用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地，可以同时加入猪GM-CSF，或者优化至少一种PRRSV抗原，或者最后加入猪GM-CSF和优化至少一种PRRSV抗原。猪GM-CSF的添加可以如PRV所述进4亍。来自PRRSV的抗原的优化如下进行将开放阅读框3(0RF3，gp45或大包膜糖蛋白)和/或糖蛋白0RF5(gp25或包膜糖蛋白E)和/或糖蛋白0RF6(gpl8或膜蛋白)编码的蛋白质的信号肽序列替换为一种"信号"序列，特别是人源tPA信号序列(GenBank保藏号NM-000930)，和/或缺失编码0RF3和/或0RF5和/或0RF6跨膜域的DM片段。编码这些糖蛋白之一的跨膜域的DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分缺失。根据本发明的针对PRRSV的DNA疫苗因此可编码并表达一种优化的PRRSV抗原(0RF3、0RF5或0RF6)或其中两种或所有三种，即，优化的0RF3、优化的0RF5和优化的0RF6。能在本发明中应用的编码PRRSV抗原的核苷酸序列，和不同表达载体构建体，在附加实施例和FR-A1-2751224中，特别是在实施例14-17中给出。优选地，才艮据本发明，针对PRRSV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含编码PRRSV0RF3抗原的表达质粒(例如pLF1009，实施例9.1.1，pLF1015，实施例10.1.1);编码PRRSV0RF5抗原的笫二表达质粒(例如pLF1012，实施例9.2.2,pLF1018,实施例IO.2.2),通过将0RF5的信号序列替换为人tPA信号肽序列、缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化；编码PRRSV0RF6抗原的笫三种表达质粒(例如pLF1014，实施例9.3.2，pLF1016，实施例IO.3.2),通过将0RF6的信号序列替换为人tPA信号肽序列、缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化。可以有利地能生产一种质粒混合物。该混合物可含有至少两种表达质粒，每种均表达一种不同的免疫原(0RF3、0RF5或0RF6)和/或从不同的PRRSV林(例如欧洲林，如Lelystad，美国林ATCCVR-2332)获得。特别是，一种混合物由表达PRRSVLelystad0RF3、PRRSVLelystad0RF5、PRRSVLelystad0RF6、PRRSVVR-23320RF3、PRRSVVR-23320RF5和PRRSVVR-23320RF6的6种质粒组成。本发明的主题也在于一种改良的DNA疫苗，它能在猪中诱发针对猪流感病毒(SIV)的有效和保护性的免疫应答。SIV病毒是一种A族流感病毒，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员(MurphyB.R.和WebsterR.G.，《病毒学》，第二版，B.N.Fields,D.M.Knipe等人编写，RavenPressLtd.，纽约1990)。编码SIVH1N1林和H3N2林的血凝素(HA)和神经氨酸酶(M)蛋白的核苷酸序列已知，可从GenBank数据库中获得，保藏号分别为,992、U86145、U07146、AF153238。针对SIV的DNA疫苗优选地用才艮据本发明的佐剂(特别是DMRIE，优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地，可以同时加入猪GM-CSF,或者优化至少一种SIV抗原，或者最后加入猪GM-CSF和优化至少一种SIV抗原。猪GM-CSF的添加可以如PRV所述进4亍。来自SIV的抗原的优化如下进行将SIV血凝素(HA)和/或SIV神经氨酸酶(NA)蛋白的信号序列替换为一种"信号"序列，特别是人源tPA信号序列，和/或缺失编码HA和/或NA的跨膜域的DNA片段，和/或在编码HA和/或NA的核普酸序列上游插入一种内含子，特别是兔P-珠蛋白基因的内含子II。编码这些蛋白质之一的跨膜域的DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分缺失。根据本发明的针对SIV的DM疫苗因此可编码并表达一种优化的SIV抗原(HA或NA)或此两者(HA和NA)。能在本发明中应用的编码SIV抗原的核苷酸序列，和不同表达栽体构建体，在附加实施例和FR-A1-2751224中给出，对于SIVH1N1林，特别是在实施例10和11中给出，对于SIVH3N2林，在实施例12和13中给出。优选地，根据本发明，针对SIV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制，包含编码SIVHA抗原的表达质粒(例如pLF1002，实施例11.1.2，pLF腦，实施例12.1.2)，通过插入人tPA的信号序列代替HA的信号序列、缺失编码跨膜域的HA的核苷酸序列片段和邻接的C端部分并且在HA上游插入兔P-珠蛋白基因的内含子II优化；编码SIVNA抗原的第二表达质粒(例如pLF1004,实施例11.2.2，pLF1008，实施例12.2.2)，通过插入人tPA的信号序列代替NA的信号序列、缺失编码NA的跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分并且在NA上游插入兔P-珠蛋白基因的内含子II优化。可以有利地生产一种质粒混合物。该混合物可含有至少两种表达质粒，每种均表达一种不同的免疫原(HA或NA)和/或来自于不同的SIV林(例如H1N1或H3N2)。特别是，一种混合物由表达SIVH1N1HA、SIV阻lNA、SIVH3N2HA和SIVH3N2M的4种质粒组成。尽管本发明对特定DNA疫苗进行了描述，但是本发明特别是根据本出于同样^考虑，对于一个动:种，根据本JL明'的疫苗可以互相组合，和/或与针对同一种的其它病原体的DNA疫苗组合。其它病原体尤其可能是狂犬病病毒、猪霍乱病毒和猪细小病毒。针对狂犬病病毒的根据本发明的免疫原制剂或改良DNA疫苗尤其含有一种质粒，该质粒编码未修饰的狂犬病病毒的G糖蛋白和DMRIE-DOPE,任选地添加GM-CSF。针对猪细小病毒的根据本发明的改良免疫原制剂或DNA疫苗尤其含有一种质粒，该质粒编码来自细小病毒的抗原(例如VP2蛋白，FR-Al-2751224的实施例18)和DMRIE-DOPE,4壬选地添加猪GM-CSF(例如pLF1033，实施例14)。针对猪霍乱病毒(HCV)的根据本发明的改良克疫原制剂或DNA疫苗尤其含有一种质粒，该质粒编码来自HCV的抗原(例如E1蛋白，同一文献的实施例19,或E2蛋白，实施例20)和DMRIE-DOPE，任选地添加猪GM-CSF(例如PLF1033，实施例14)。因此，本发明的主题也在于改良的多价DNA疫苗，它能在牛中获得针对选自BHV-1、BRSV、BVDV、bPI-3和狂犬病病毒的至少两种牛病原体的有效保护。本发明的主题也在于改良的多价DNA疫苗，它能在猪中获得针对选自PRV病毒、PRRSV病毒、SIV病毒、猪霍乱病毒(或HCV)和猪细小病毒的至少两种猪病原体的有效保护。这些多价DNA疫苗可以通过用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制加以改进。任选地可以同时加入如前所述的GM-CSF，或者优化至少一种如前所述的目的抗原，或者最后加入GM-CSF和优化至少一种目的抗原.根据本发明的改良多价DNA疫苗由一种或多种表达质粒构成，以致这些疫苗在体内表达第一病原体的至少一种免疫原，和感染同一动物物种的至少一种其它病原体的至少一种免疫原。其中至少一种免疫原优选地选自下列组别的成员-对于牛，BRSV的F、BRSV的G、BHV-1的gB、BHV-1的gC、BHV-1的gD、BVDV-1的E0、BVDV-1的E2、BVDV-2的E0、BVDV-2的E2、bPI-3的F和bPI-3的丽，和-对于猪，PRV的gB、PRV的gC、PRV的gD、PRRSVLelystad抹的0RF3、PRRSVLelystad抹的0RF5、PRRSVLelystad抹的0RF6、PRRSVVR-2332抹的0RF3、PRRSVVR-2332抹的0RF5、PRRSVVR-2332抹的0RF6、SIVH1N1抹的HA、SIVH1N1抹的NA、SIVH3N2抹的HA和SIVH3N2抹的NA。也可以利用一种体内表达载体(例如痘病毒、腺病毒、疱渗病毒)，将根据本发明的改良单价或多价DNA疫苗与至少一种常规疫苗(灭活疫苗、減毒活疫苗、亚单位疫苗)或重组疫苗组合，对抗感染同一种的至少一种不同的病原体，或者用作这些疫苗的强化剂。关于构建具有这些牛效价的质粒的方法，本领域技术人员可参考FR-A1-2751229,对于具有猪效价的质粒的方法，参考FR-Al-2751224。本发明的目的也在于一种接种家畜(特别是牛或猪)的方法。这种接种方法包括施用如上所述的单价或多价改良DNA疫苗之一。这些接种方法涉及用于被动转移免疫性的妊娠雌畜或幼畜或成畜。该接种方法包括施用一次或多次改良DNA疫苗。在根据本发明的疫苗中使用的DNA的量，对于特定质粒，为约10yg至约1000Mg，优选地约50Mg至约500ng。本领域技术人员具有精确确定每一接种方案所用DNA的有效剂量所必需的能力。23优选地，剂量体积为0.2至5ml,优选地1至3ml。在该接种方法中，可以通过现有技术中用于多核普酸接种的多种施用途径，并利用已知的施用技术，施用根据本发明的改良DNA疫苗。根据本发明的一种优选模式，接种方法包括，通过肌内途径、皮下途径或者借助于无针注射器通过皮内途径施用根据本发明的改良DNA疫苗。现在将借助于被视为非限制性实施例的实施方案并参照附图更详细地描述本发明，其中图1:质粒pVR1012图2:质粒pAB110序列表SEQIDNO1寡核苷酸PB326SEQIDNO2寡核苷酸PB329SEQIDNO3寡核苷酸SB090SEQIDNO4寡核苷酸SB091SEQIDNO5寡核苷酸LFOOlSEQIDNO6寡核苷酸LF002SEQIDNO7寡核苷酸PB234SEQIDNO8寡核苷酸PB235SEQIDNO9寡核苷酸PB511SEQIDNO10寡核苷酸PB512SEQIDNO11寡核苷酸SB221SEQIDNO12:寡核苷酸SB222SEQIDNO13:寡核苷酸PB507SEQIDNO14:寡核苷酸PB508SEQIDNO15:寡核苷酸PB513SEQIDNO16寡核苷酸PB514SEQIDNO17寡核苷酸SB22324SEQIDNO18SEQIDNO19SEQIDNO20SEQIDNO21SEQIDNO22SEQIDNO23SEQIDNO24SEQIDNO25SEQIDNO26SEQIDNO27SEQIDNO28SEQIDNO29SEQIDNO30SEQIDNO31SEQIDNO32'SEQIDNO33SEQIDNO34SEQIDNO35SEQIDNO36:SEQIDNO37.SEQIDNO38SEQIDNO39SEQIDNO40SEQIDNO41.SEQIDNO42SEQIDNO43SEQIDNO44:SEQIDNO45:SEQIDNO46:寡核普酸SB224寡核苷酸PB497寡核苷酸PB498寡核苷酸SB225寡核苷酸SB226寡核苷酸SB210寡核苷酸SB211寡核苷酸SB212寡核苷酸SB220寡核苷酸SB213寡核苷酸SB214寡核苷酸SB215寡核苷酸SB216寡核苷酸LF050寡核苷酸LF051寡核苷酸LF052寡核苷酸LF053寡核苷酸LF039寡核苷酸LF040寡核苷酸LF041寡核苷酸LF042寡核苷酸LF043寡核苷酸LF044寡核苷酸LF045寡核苷酸LF046寡核苷酸LF064寡核苷酸LF065寡核苷酸LF066寡核苷酸LF067SEQIDNO47SEQIDNO48SEQIDNO49SEQIDNO50SEQIDNO51SEQIDNO52SEQIDNO53SEQIDNO54SEQIDNO55SEQIDNO56SEQIDNO57SEQIDNO58SEQIDNO59SEQIDNO60'SEQIDNO61'SEQIDNO62:SEQIDNO63:SEQIDNO64:SEQIDNO65:SEQIDNO66SEQIDNO67SEQIDNO68SEQIDNO69:SEQIDNO70.SEQIDNO71:SEQIDNO72:SEQIDNO73:SEQIDNO74:SEQIDNO75:寡核苷酸LF047寡核苷酸LF048寡核苷酸LF058寡核苷酸LF059寡核苷酸LF060寡核苷酸LF061寡核苷酸LF062寡核苷酸LF063寡核苷酸SB201寡核苷酸SB202寡核苷酸SB203寡核苷酸SB217寡核苷酸SB204寡核苷酸SB205寡核苷酸SB206寡核普酸SB218寡核苷酸SB207寡核苷酸SB208寡核苷酸SB209寡核苷酸SB219寡核苷酸LF027寡核苷酸LF028寡核苷酸LF019寡核苷酸LF020寡核苷酸LF021寡核苷酸LF022寡核苷酸LF023寡核苷酸LF024寡核苷酸LF025SEQIDNO76:SEQIDNO77:SEQIDNO78:SEQIDNO79:SEQIDNO80:SEQIDNO81:SEQIDNO82:SEQIDNO83:SEQIDNO84:SEQIDNO85:SEQIDNO86:SEQIDNO87:SEQIDNO88:SEQIDNO89:SEQIDNO90:SEQIDNO91:SEQIDNO92:SEQIDNO93:SEQIDNO94:SEQIDNO95:SEQIDNO96:SEQIDNO97:SEQIDNO98:SEQIDNO99:SEQIDNO100SEQIDNO101SEQIDNO102SEQIDNO103SEQIDNO104寡核苷酸LF026寡核苷酸LF037寡核苷酸LF038寡核苷酸LF029寡核苷酸LF030寡核苷酸LF031寡核苷酸LF032寡核苷酸LF033寡核苷酸LF034寡核苷酸LF035寡核苷酸LF036寡核苷酸LF003寡核苷酸LF004寡核苷酸LF005寡核苷酸LF006寡核苷酸LF007寡核普酸LF008寡核苷酸LF009寡核苷酸LF010寡核苷酸LFOll寡核苷酸LF012寡核苷酸LF013寡核苷酸LF014寡核苷酸LF015寡核普酸LF016寡核苷酸LF017寡核普酸LF018寡核普酸LF054寡核苷酸LF055SEQIDNO105:寡核苷酸LF056SEQIDNO106:寡核苷酸LF057实施例对于所考虑的每种病原体，编码主要抗原(原始形式和^"饰形式)的每种基因是在真核表达质粒中特定构建的主体。分泌形式的抗原通过缺失编码跨膜域和胞质域的基因片段获得。在所有情况中，根据相应蛋白质序列的亲水性图(在MacVector6.5上)确定蛋白质的跨膜域。实施例1:分子生物学方法1.1病毒基因组DNA的提取在十二烷基硫酸钠(SDS)(0.5%终浓度)存在下，用蛋白酶K(100mg/ml终浓度)在37'C下处理病毒悬液2小时。利用酚/氯仿混合液抽提病毒DNA，用两倍体积的纯乙醇在-20C下沉淀16小时，然后在4t:下以10OOOg离心15分钟。干燥DNA沉淀，溶解于最小体积的无菌超纯水中.1.2病毒基因组RNA的分离利用P.Chomczynski和N.Sacchi(Anal.Biochem.1987.162.156-159)所述的"硫氰酸胍/酚-氯仿"技术提取每种病毒的基因组RNA。1.3分子生物学技术所有质粒构建都用Sambrook等人(《分子克隆实验室手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的标准分子生物学技术进行。用于本发明的所有限制性片段都用"Geneclean"试剂盒(BIOIOIInc.，LaJolla,CA)分离。对于所有构建体，克隆的DNA片段以及与表达载体的连接体都用Sanger法(Sambrook等人，1989)测序。1.4PCR和RT-PCR合成对于克隆的基因或基因片段特异的寡核苷酸，其中一些有时在5'末端含有便于克隆扩增片段的限制位点。反转录(RT)反应和聚合酶链反应(PCR)按标准技术(Sambrook等人，1989)进行。1.5质粒的大量纯化以大约10mg的规模纯化加入疫苗组合物的质粒，用氯化铯-溴化乙锭梯度法(Sambrook等人，1989)进行。实施例2:基本质粒构建体由质粒pVR1020(图1,WO-A-9803199的图1和实施例7)衍生的真核表达质粒pVR102(XC.J.Luke等人，J.ofInfectiousDiseases,1997,175,95-97)含有人组织纤溶酶原激活物(tPA)信号序列的编码序列，通过BamHI-BglII消化并插入一种序列修饰质粒pVR1020,该插入序列含有几个克隆位点(BamHI、Notl、EcoRI、Xbal、PmII、Pstl、BglII),由下列寡核苷酸的配对产生PB326(40mer)(SEQIDNO1)5'GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC3'和PB329(40mer)(SEQIDNO2)5'GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT3'这样获得的栽体大小约为5105个碱基对(或bp),称为pABllO(图2)。用兔外周血细胞的基因组DNA作为模板，利用下列寡核苷酸通过PCR产生相应的DNA片段ISB090(20mer)(SEQIDNO3)'i5'TTG-GGGACCCTTGATTGTTC3'和1SB091(21mer)(SEQ工DNO4)5'CTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC3'之后，将兔P-珠蛋白基因的内含子II克隆到载体pCRII(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)中，产生的质粒命名为pNS050。表达质粒pABllO如下修饰向位于组织纤溶酶原激活物(tPA)信号肽ATG上游的Sail位点导入兔珠蛋白基因内含子II的序列。利用下列寡核苷酸对，通过聚合酶链反应(PCR),由质粒pNS050扩增兔珠蛋白基因内含子II的序列29!LFOOl(30mer)(SEQ工DNO5)5'CTCCATGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGT3'和LF002(30mer)(SEQIDNO6)5'CTCCATGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAA3'PCR产物(573个碱基对或bp)用Sail消化，克隆到预先用Sail线性化的质粒pABllO中，产生约5678bp的质粒pLF999。实施例3:编码不同形式的l型牛疱渗病毒(BHV-l)抗原的质粒含有BHV-1B901抹的gB、gC和gD基因的病毒DNA片段如下分离用不同限制酶消化病毒基因组，通过琼脂糖凝胶电泳分离，利用对应于BHV-lST抹gB、gC和gD基因片段的探针通过Southern印迹法分析(Leung-TackD.等人，Virology,1994，199，409-421)。也能使用BHV-l科罗拉多抹[cooper](ATCC号VR-864)。将这样鉴定的片段克隆到载体pBluescriptSK+(Stratagene，LaJolla,CA,USA)中，位于这三个基因向表达载体pVR1012克隆的起点。3.1编码不同形式的BHV-1gB的质粒3.1.1pPB280:克隆到载体pVR1012中的gB基因(原始形式)含有BHV-1gB基因的5'和3，部分的两种XhoI-XhoI片段通过Southern印迹法鉴定，克隆到预先用Xhol消化的栽体pBluescriptSK+(Stratagene,LaJolla，CA，USA)中。这样获得的质粒分别命名为pPB128和pPB117。用NotI和XhoI消化含有gB基因5，片段的质粒pPB128,产生1708bp的片段(片段A)。用Xhol和Stul消化含有gB基因3，部分的质粒pPB117,产生1345bp的片段。将后一片段克隆到预先用EcoRV和Xhol消化的载体pBluescriptKS+(Stratagene,LaJolla，CA，USA)中。产生的质粒称为pPB279。然后用Xhol和BamHI消化质粒pPB279,产生1413bp的DNA片段(片段B)。然后将片段A和B克隆到用Notl和BamHI消化的载体pBluescriptKS+中，产生质粒pPB278(约6063bp)，允许BHV-1gB基因的重构。载体pPB278然后在PCR反应中用作模板，该反应利用下列寡核苷酸进行,PB234(30mer)(SEQIDNO7)5'TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG3'!和PB235(21mer)(SEQIDNO8)5'GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG3'.PCR产物(146bp)用限制酶SalI和NheI消化。质粒pPB278用Nhel和BamHI消化。这样获得的2728bp片段和预先消化的PCR片段连接到预先用Sail和BamHI消化的栽体pVR1012(实施例2)中，产生大小约为7742bp的质粒pPB280。BHV-1gB基因编码一种有933个氨基酸的蛋白质。3.1.2pPB281:克隆到载体pVR1012中的gB基因(A[TM-Cter]形式)BHV-1gB基因的截短形式(其跨膜域(TM)和羧基端(Cter)域缺失)的获得方法是向Sail和BamHI预消化的质粒pVR1012(实施例2)中连接以Sall-PvuII消化质粒pPB28(X实施例3.1.1)获得的大小为2234bp的片段和由下列寡核普酸配对获得的56bp片段PB511(52mer)(SEQ工DNO9)5,3,!和PB512(57mer)(SEQIDNO10)GCAG3'..这样产生的质粒大小约为7154bp,称为pPB281。截短的BHV-1gB基因编码一种有759个氨基酸的蛋白质。3.1.3pSB115:克隆到栽体pAB110中的gB基因(tPAA[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pPB281(实施例3.1.2)PCR扩增BHV-lgB基因的tPAA[TM-Cter]形式SB221(39mer)(SEQ工DNO11)5'AAAATTTCGATATCCGCCGCGGGGCGACCGGCGACAACG3'和SB222(33mer)(SEQIDNO12)5'GGAAGATCTTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTC3'用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(2088bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中，产生大小约为7154bp的质粒pSB115。gB基因的tPAA[TM-Cter]形式编码一种有729个氨基酸的糖蛋白，含有BHV-1gB糖蛋白的胞外域，3.2编码不同形式的BHV-1gC的质粒3.2.1pPB264:克隆到栽体pVR1012中的gC基因(原始形式)含有完整BHV-1gC基因的3.5kb的BamHI-HindIII片段通过Southern印迹法鉴定，并克隆到载体pBluescriptSK+中。这样获得的质粒称为pPB287。然后用NcoI-BssSI消化质粒pPB287。获得大小为1492bp的消化片段。将它与通过下列寡核苷酸配对获得的合成DNA片段连接PB507(37mer)(SEQIDNO13)■5'TCGTGCCTGCGGCGCAAGGCCCGGGCGCGCCTGTAGT3'和PB508(37mer)(SEQIDNO14>5'CTAGAC'TACAGGCGCGCCCGGGCCTTGCGCCGCAGGC3',克隆到用Ncol和Xbal预消化的质粒pLitmus28(NewEnglandBiolabs，Inc.,Beverly,MA，USA)中，产生中间质粒pPB290。将Pstl和Xbal消化pPB290产生的1554bp片段克隆到预先用Pstl和XbaI消化的载体pVR1012(实施例2)中，从而产生大小约为6427bp的质粒pPB264。BHV-1gC基因编码一种有508个氨基酸的蛋白质。3.2.2pPB292:克隆到载体pVR1012中的gC基因(A[TM-Cter]形式)通过将下列三种DNA片段连接于预先用Pstl和Xbal消化的载体pVR1012(实施例2)中，获得BHV-1gC基因的截短形式。(a)用Pstl和Xhol消化pPB264(实施例3.2.1)产生的1035bp片段，(b)用Xhol和Banl消化pPB264产生的350bp片段，和(c)由寡核苷酸PB513和PB514配对产生的43bp合成片段。这些寡核香酸如下PB513(43mer)(SEQIDNO15)5'GCACCGCTGCCCGAGTTCTCCGCGACCGCCACGTACGACTAGT3'■和PB514(43mer)(SEQIDNO16)5'CTAGACTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGGAGAACTCGGGCAGCG3'.这样获得的大小约为6305bp的质粒称为pPB292。截短的BHV-lgC基因编码一种有466个氨基酸的蛋白质。3.2.3pSB116:克隆到载体pABllO中的gC基因(tPAA[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pPB292(实施例3.2.2)PCR扩增BHV-lgC基因的tPAA[TM-Cter]形式SB223(39mer)(SEQ工DNO17)5'AAAATTTCGATATCCCGGCGGGGGCTCGCCGAGGAGGCG3'和SB224(32mer)(SEQIDNO18)J5'GGAAGATCTCTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGG3'用EcoRV和BglII酶消化扩增产物(1362bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pABllO(实施例2)中，产生大小约为6404bp的质粒pSB116。gC基因的tPAA[TM-Cter]形式编码一种有479个氨基酸的糖蛋白，其含有BHV-1gC糖蛋白的胞外域。3.3编码不同形式的BHV-lgD的质粒3.3.1pPB148:克隆到载体pVR1012中的gD基因(原始形式)含有BHV-1gD基因的5kb的XhoI-XhoI片段通过Southern印迹法鉴定，克隆到预先用Xhol消化的载休pBluescriptSK+中，产生质粒pPB147。然后将Ndel和BsrBI消化pPB147产生的325bp片段与Ndel和Styl消化pPB147产生的943bp片段连接到用EcoRV和Xbal预消化的载体pVR1012(实施例2)中，从而产生大小约为6171bp的质粒pPB148。BHV-lgD基因编码一种有417个氨基酸的蛋白质。3.3.2pPB284:克隆到载体pVR1012中的gD基因(A[TM-Cter]形式)利用下列引物对33PB497(33mer)(SEQIDNO19)5'TTTCTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCGTG3'和PB498(31mer)(SEQ工DNO20)5''TTTCTAGATTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCG3'.对Pstl和Xbal预消化的BHV-1病毒B901抹的基因组DNA进行PCR扩增，由这样获得的片段获得截短的BHV-lgD基因。然后将该PCR片段克隆到用Pstl和Xbal预消化的质粒pVR1012(实施例2)中，产生大小约为5943bp的质粒pPB284。截短的BHV-lgD基因编码一种有355个氨基酸的蛋白质。3.3.3pSB117:克隆到载体pABllO中的gD基因(tPAA[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pPB284(实施例3.3.2)PCR扩增BHV-lgD基因的tPAA[TM-Cter]形式SB225(39mer)(SEQ工DNO21)5'AAAATTTCGATATCCCCCGCGCCGCGGGTGACGGTATAC3'和SB226(33mer)(SEQIDNO22)5'GGAAGATCTTTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCGG3'用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(1029bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中，产生大小约为6071bp的质粒pSB117。gD基因的tPAA[TM-Cter]形式编码一种有368个氨基酸的糖蛋白，含有BHV-lgD糖蛋白的胞外域。实施例4:编码不同形式的牛呼吸道合胞病毒(BRSV)抗原的质粒编码BRSV病毒F和G抗原的基因由Snook抹的病毒RNA通过RT-PCR获得(Thomas等人，ResearchinVet.Science,1982,33，170-182)。也可以使用BRSVA51908抹(ATCC号VR-794)。4.1编码不同形式的BRSV-F的质粒4.1.1pSB107:克隆到载体pVR1012中的F基因(原始形式)用病毒RNA作为模板，利用下列引物，经RT-PCR扩增BRSVSnook34抹的F基因SB210(34mer)(SEQIDNO23)5'AAATTTTCTGCAGATGGCGACAACAGCCATGAGG31;.和SB211(35mer)(SEQIDNO24)5'TTAAGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTGTTG3'.用酶Pstl和BamHI消化大小为1739bp的扩增产物，克隆到预先用Pstl和BamHI消化的栽体PVR1012(实施例2)中，从而产生大小约为6583bp的质粒pSB107.BRSV病毒的F基因编码一种有574个氨基酸的蛋白质。4.1.2pSB108:克隆到栽体pVR1012中的F基因(A[TM-Cter]形式)用病毒RNA作为模板，利用下列引物，经RT-PCR扩增BRSVSnook抹F基因的截短形式SB210(SEQ工DNO23)和SB212(39mer)(SEQIDNO25)5'AATTTTGGATCCTCATGTGGTGGATTTTCCTACATCTAC3'.用酶Pstl和BamHI消化扩增产物(1581bp),克隆到预先用Pstl和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中，产生大小约为6430bp的质粒pSB108。F基因的截短形式编码一种有523个氨基酸的糖蛋白，含有BRSVF糖蛋白的胞外域。4.1.3pSB114:克隆到栽体pAB110中的F基因(tPAA[TM-Cter]形式)用病毒RNA作为模板，利用下列引物，通过RT-PCR扩增BRSVSnook抹的F基因的tPAA[TM-Cter]形式SB212(SEQ工DNO25)和SB220(38mer)(SEQIDNO26)5'AAAATTCACGTGAACATAACAGAAGAATTTTATCAATC3'用酶Pmll和BglII消化扩增产物(1516bp),克隆到预先用Pmll和BglII消化的载体pABllO(实施例2)中，产生大小约为6572bp的质粒pSB114。F基因的tPAA[TM-Cter]形式编码一种有535个氨基酸的糖蛋白，含有BRSVF糖蛋白的胞外域。4.2编码不同形式的BRSV-G的质粒对于BRSVG蛋白(II型糖蛋白)，信号序列和跨膜序列无法区别，在跨膜域缺失过程中需要在对应于胞外域的序列上游添加一个信号序列'质粒pAB110(实施例2)用于构建含有编码BRSVG蛋白的基因的截短形式的质粒.4.2.1pSB109:克隆到载体pVR1012中的G基因(原始形式)用病毒RNA作为模板，利用下列引物，经RT-PCR扩增BRSVSnook抹的G基因SB213(32mer)(SEQ工DNO27)5'ACGCGTCGACATGTCCAACCATACCCATCATC3'和SB214(38mer)(SEQIDNO28)5'TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTG3'.用酶Sail和Xbal消化扩增产物(784bp),克隆到预先用Sail和Xbal消化的载体pVR1012(实施例2)中，产生大小约为5661bp的质粒pSB109。BRSVG基因编码一种有257个氨基酸的糖蛋白。4.2.2pSB110:克隆到栽体pVR1012中的G基因(tPAA[TM-Cter]形式)用病毒RNA作为模板，利用下列引物，通过RT-PCR扩增BRSVSnook抹的G基因的截短形式SB215(33mer)(SEQIDN〇29)5'TTTTAAGGATCCGCTAAAGCCAAGCCCACATCC.3'和SB216(33mer)(SEQIDNO30)5'TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTG3'.用酶BamHI和Xbal消化扩增产物(666bp),克隆到预先用BamHI和XbaI消化的载体pAB110(实施例2)中，产生大小约为5660bp的质粒pSBllO。36BRSV病毒G基因的tPAA[TM-Cter]形式编码一种有218个氨基酸的糖蛋白，含有G糖蛋白的胞外域，但在它之前为组织纤酶原激活物的信号序列。实施例5:编码不同形式的1型牛病毒性腹泻病毒(BVD-1)抗原的质粒编码1型BVDV病毒的E0(48kDa的糖蛋白或gP48)和E2(gp53)抗原的基因由0sloss抹的病毒RNA通过RT-PCR获得(L.DeMorelooze等人，J.Gen.Virol.1993，74,1433-1438;A.Renard等人,DNA,1985，4,439-438;A.Renard等人，Ann.Rech.Vet.,1987，18，121-125)。也可以使用NADL(ATCCVR-534)或纽约(ATCCVR-524)抹。5.1编码不同形式的l型BVDVOsloss抹E0的质粒5.1.1pLF1028:克隆到载体pVR1012中的E0基因(原始形式)利用引物LF051,由相应的病毒RNA合成Osloss抹EO基因的互补DNA(cDNA)，并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF050(36mer)(SEQIDNO31)5'CATACCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG3'和LF051(40mer)(SEQIDNO32)5'CATACCGGATCCTCAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC3'Sail和BamHI消化PCR产物获得的约765bp的DNA片段与Sail和BamHI消化pVR1012(实施例2)产生的4866bp片段连接，产生质粒pLF1028(约5636bp)。BVDV-1Osloss抹的EO基因编码一种有252个氨基酸的蛋白质。向寡核苷酸LF050序列中引入一个ATG密码子，以允许相应重组EO多肽翻译的起始。5.1.2pLF1029:克隆到载体pLF999中的EO基因(P-珠蛋白tPA-E0形式)利用下列寡核苷酸对，通过PCR反应由pLF1028模板(实施例5.1.1)合成EO基因37LF052(39mer)(SEQIDNO33)5'CATGACGCGGCCGCTATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG3'和LF053(40mer)(SEQIDNO34)5'CATGACAGATCTTTAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC3'.Notl和Bglll消化PCR产物获得的约770bp的DNA片段与Notl和Bglll消化pLF999(实施例2)产生的5642bp片段连接,产生质粒pLF1029(约6417bp),这样修饰的BVDV-10sloss抹的E0基因(P-珠蛋白tPA-EO)编码一种有283个氨基酸的蛋白质。5.2编码不同形式的1型BVDV0sloss抹E2的质粒5.2.1pLF1020:克隆到载体pVR1012中的E2基因(原始形式)利用引物LF040,由相应的病毒RNA合成0sloss抹E2基因的cDNA,并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF039(33mer)(SEQIDNO35)5'CATGACGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTG3'和LF040(36mer)(SEQ工DNO36)5'CATGACAGATCTTCAACGTCCCGAGGTCATTTGTTC3'.Sail和Bglll消化PCR产物获得的约1235bp的DNA片段与Sail和Bglll消化pVR1012(实施例2)产生的4860bp片段连接，产生质粒pLF1020(约6100bp)。BVDV-1Osloss抹的E2基因编码一种有409个氨基酸的蛋白质。向寡核苷酸LF039序列中引入一个ATG密码子，以允许相应重组E2多肽翻译的起始。5.2.2pLF1021:克隆到载体pLF999中的E2基因(P-珠蛋白tPA-E2A[TM+Cter]形式)利用下列寡核苷酸对，通过PCR反应由pLF1020模板(实施例5.2.1)合成跨膜域和羧基端域缺失的E2基因LF041(36mer)(SEQIDNO37)5'CATGACGCGGCCGCTATGACGACTACTGCATTCCTG3'和LF042(35mer)(SEQIDNO38)5'CATGACAGATCTCAAGCGAAGTAATCCCGGTGGTG3.Notl和Bglll消化PCR产物获得的1132bp的DNA片段与Notl和Bglll消化pLF999(实施例2)产生的5642bp片段连接，产生质粒pLF1021(约6779bp)。这样修饰的BVDV-10sloss抹的E2基因(P-珠蛋白tPA-E2A[TM+Cter])编码一种有404个氨基酸的蛋白质。实施例6:编码不同形式的2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV-2)抗原的质粒编码2型BVDV病毒E2抗原(gp53)的基因由890抹的病毒RNA通过RT-PCR获得(J.F.Ridpath和S.R.Bolin,Virology,1995，212，36-46)。也能使用Q140抹，它可以获自QuebecMinistryofAgriculture,FisheriesandFood,Armand-FrappierInstitute(P.Tijssen等人，Virology,1996,217,356-361)。也可以使用1373抹和296抹(J.F.Ridpath,BVDV研究计划，国家动物疾病中心，2300DaytonAvenue,Ames,USA)。6.1编码不同形式的2型890抹E2的质粒6.1.1pLF1022:克隆到载体pVR1012中的E2基因(原始形式)利用引物LF044，由相应的病毒RNA合成890抹E2基因的cDNA,并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF043(36mer)(SEQ工DNO39)5'ACTGTATCTAGAATGACCACCACAGCTTTCCTAATC3'和LF044(39mer)(SEQIDNO40)5'ACTGTAAGATCTTTAAGTATTCACTCCAGCACCCATAGC3'.Xbal和Bglll消化PCR产物获得的约1240bp的DNA片段与Xbal和Bglll消化pVR1012(实施例2)产生的4891bp片段连接，产生质粒pLF1022(约6136bp)。BVDV-2890抹的E2基因编码一种有410个氨基酸的蛋白质。向寡核苷酸LF043序列中引入一个ATG密码子，以允许相应重组E2多肽翻译的起始。6.1.2pLF1023:克隆到载体pLF999中的E2基因(P-珠蛋白tPA-E2A[TM+Cter]形式)利用下列寡核苷酸对，通过PCR反应由pLF1022模板(实施例6.2.1)合成跨膜域和羧基端域缺失的E2基因LF045(41mer)(SEQIDNO41)5'CATGACGCGGCCGCCCTATGACCACCACAGCTTTCCTAATC3'和LF046(36mer)(SEQIDNO42)!5'CATGACAGATCTTTATATGAACTCTGAGAAGTAGTC3'.Notl和BglII消化PCR产物获得的1140bp的DNA片段与Notl和BglII消化pLF999(实施例2)产生的5642bp片段连接,产生质粒pLF1023(约6787bp)。这样修饰的BVDV-2890抹的E2基因(珠蛋白tPA-E2A[TM+Cter])编码一种有405个氨基酸的蛋白质。6.2编码不同形式的2型890抹E0的质粒6.2.1pLF1030:克隆到栽体pVR1012中的E0基因(原始形式)利用引物LF065,由相应的病毒RNA合成890抹E0基因的cDNA，并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增KF064(39mer)'(SEQIDNO43)51CATACCGTCGACATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG3'■和L'F065(39mer)(SEQIDN〇44)51CATACCGGATCCTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC3'.Sail和BamHI消化PCR产物获得的约768bp的DNA片段与Sail和BamHI消化pVR1012(实施例2)产生的4866bp片段连接，产生质粒pLF1030(约5639bp)。BVDV-2890抹的EO基因编码一种有253个氨基酸的蛋白质。向寡核苷酸LF064的序列中引入一个ATG密码子，以允许相应重组EO多肽翻译的起始。6.2.2pLF1031:克隆到栽体pLF999中的EO基因(P-珠蛋白tPA-EO形式)利用下列寡核苷酸对，通过PCR反应由pLF1030模;fei实施例6.2.1)合成EO基因LF066(42mer)(SEQ工DNO45)5'CATGACGCGGCCGCTATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG3'!和LF067(39mer)(SEQIDNO46)5'CATACCAGATCTTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC3'.Notl和BglII消化PCR产物获得的约770bp的DNA片段与Notl和BglII消化pLF999(实施例2)产生的5642bp片段连接，产生质粒pLF1031(约6417bp)'这样修饰的BVDV-2890抹的EO基因(P-珠蛋白tPA-EO)编码一种有283个氨基酸的蛋白质。实施例7:编码不同形式的3型牛副流感病毒(bPI-3)抗原的质粒编码bPI-3病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)抗原的基因由RinsingerSF-4抹(可从ATCC获得，ATCC号为VR-281)的病毒RNA通过RT-PCR获得。7.1编码不同形式的bPI-3SF-4抹HN的质粒7.1.1pLF1024:克隆到载体pVR1012中的HN基因(原始形式)利用引物LF048，由相应的病毒RNA合成SF-4抹的丽基因的cDNA，并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF047(39mer)(SEQIDNO47)5'CATATCGTCGACATGGAATATTGGAAACACACAAACAGC3'和LF048(38mer)(SEQIDNO48)5'CATGACGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTCTGT3'.Sail和EcoRV消化PCR产物获得的约1726bp的DNA片段与Sail和EcoRV消化pVR1012(实施例2)产生的4896bp片段连接，产生质粒pLF1024(约6619bp)。bPI-3HN基因编码一种有572个氨基酸的蛋白质。7.1.2pLF1025:克隆到载体pLF999中的HN基因(P-珠蛋白tPA-E2A[TM]形式)利用下列寡核苷酸对，通过PCR反应，由pLF1024模板(实施例7.1.1)合成跨膜域缺失的HN基因LF058(33mer)(SEQIDNO49)5'CATACTGCGGCCGCTTTAATTCAAGAGAACAAT3'和KF059(35mer)(SEQIDNO50)5'CATATCGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTC3'.Notl和EcoRV消化PCR产物获得的1566bp的DNA片段与Notl和EcoRV消化pLF999(实施例2)产生的5663bp片段连接，产生质粒pLF1025(约7229bp)。这样修饰的bPI-3HN基因(P-珠蛋白tPA-E2A[TM])编码一种有548个氨基酸的蛋白质。7.2编码不同形式的bPI-3SF-4抹F的质粒7.2.1pLF1026:克隆到载体pVR1012中的F基因(原始形式)利用引物LF061，由相应的病毒RNA合成SF-4抹的F基因的cDNA，并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF060(36mer)(SEQIDNO51)5'CATATCGTCGACATGATCATCACAAACACAATCATA3'和LF061(36mer)(SEQIDNO52)5'CATGACCAGATCTTATTGTCTATTTGTCAGTATATA3'.Sail和BglII消化PCR产物获得的1628bp的DNA片段与Sail和BglII消化pVR1012(实施例2)产生的4860bp片段连接，产生质粒pLF1026(约6488bp)。bPI-3F基因编码一种有550个氨基酸的蛋白质。7.2.2pLF1027:克隆到载体pLF999中的F基因(0-珠蛋白tPA-FA[TM+Cter]形式)利用下列寡核普酸对，通过PCR反应由PLF1026模板(实施例7.2.1)合成跨膜域和C端域缺失的F基因42LF062(42raer)(SEQIDNO53)5'CATACTGCGGCCGCTCAAATAGACATAACAAAACTGCAACGT3'i和LF063(41mer)(SSQIDNO54)5'CATATCGATATCTATGCACTAGATTGATACCAACTTCCAAC3'.Notl和EcoRV消化PCR产物获得的1434bp的DNA片段与Notl和EcoRV消化pLF999(实施例2)产生的5663bp片段连接，产生质粒pLF1027(约7097bp)'这样修饰的bPI-3F基因(P-珠蛋白tPA-FA[TM+Cter)编码一种有504个氨基酸的蛋白质。实施例8:编码不同形式的假狂犬病病毒(PRV)抗原的质粒编码PRV糖蛋白gB、gC和gD的基因由NIA3抹的病毒DNA经PCR获得(M.Riviere等人，J.Virol.66，3424-3434;A.Baskerville等人，TheVeterinaryBulletin,1973，43，第9号)。也可以使用PRVNIA3抹的突变体，在US-A-4，680176中有描述，保藏于国立微生物保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes)(CNCM)，InstitutPasteur,巴黎，法国，编号为1-351和1-352。8.1编码不同形式的PRV-gB的质粒8.1.1pSB101:克隆到载体pVR1012中的gB基因(原始形式)用病毒DNA作为模板，利用下列引物，PCR扩增PRVNIA3抹的gB基因SB201(36mer)(SEQIDNO55)5'TTTTAAGATATCATGCCCGCTGGT.GGCGGTCTTTGG3'和SB202(39mer)(SEQIDNO5S)5'TTTTAAGGATCCCTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTC3'.用酶EcoRV和BamHI消化扩增产物(2766bp),克隆到预先用EcoRV和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中，产生大小约为7631bp的质粒pSB101。PRVgB基因编码一种有913个氨基酸的糖蛋白。8.1.2pSB102:克隆到载体pVR1012中的gB基因(A[TM-Cter]形式)用病毒DNA作为模板，利用下列引物，PCR扩增PRVNIA3抹的gB基因的截短形式SB201(SEQIDNO55)和SB203(39mer)(SEQIDNO57)5'TTTTAAGGATCCCTAGTGGTCCACCTTGACCACGCGGTC3'.用酶EcoRV和BamHI消化扩增产物(2262bp)，克隆到预先用EcoRV和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中，产生大小约为7142bp的质粒pSB102.gB基因的截短形式(A[TM-Cter])编码一种有750个氨基酸的糖蛋白，含有PRVgB糖蛋白的胞外域。8.1.3pNS009:克隆到载体pAB110中的gB基因(tPAA[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pSBlOl(实施例8.1.1)PCR扩增PRVNIA3抹的gB基因的tPAA[TM-Cter]形式SB203(SEQIDNO57);和SB217(39mer)(SEQIDNO58)5'AAAATTTCGATATCCACCTCGGCCTCGCCGACGCCCGGG■3'.用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(2088bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中，产生大小约为7127bp的质粒pNS009.gB基因的tPAA[TM-Cter]形式编码一种有720个氨基酸的糖蛋白，含有PRVgB糖蛋白的胞外域。8.2编码不同形式的PRV-gC的质粒8.2.1pSB103:克隆到载体pVR1012中的gC基因(原始形式)用病毒DNA作为模板，利用下列引物，PCR扩增PRVNIA3抹的gC基因SB204(36mer)(SEQ工DNO59)5'TTTTAAGATATCATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATG3'和SB205(37mer)(SEQ工DNO60)5'TTTTAAAGATCTTTAAGGCCCCGCCTGGCGGTAGTAG3'.用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(1452bp)，克隆到预先用EcoRV和BglII消化的栽体pVR1012(实施例2)中，产生大小约为6323bp的质粒pSB103。PRVgC基因编码一种有479个氨基酸的糖蛋白。8.2.2pSB104:克隆到载体pVR1012中的gC基因(A[TM-Cter]形式)用病毒DNA作为模板，利用下列引物，PCR扩增PRVNIA3抹的gC基因的截短形式SB204(SEQ工DNO59)和:SB206(36mer)(SEQIDNO61)J5'TTTTAAAGATCTTTAGGGGGAGGCGTCGTAGCGCTG3'.用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(1332bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pVR1012(实施例2)中，产生大小约为6206bp的质粒pSB104。gC基因的截短形式(A[TM-Cter])编码一种有440个氨基酸的糖蛋白，含有PRVgC糖蛋白的胞外域。8.2.3pNS012:克隆到载体pAB110中的gC基因(tPAA[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pSB103(实施例8.2.1)PCR扩增PRVNIA3抹的gC基因的tPAA[TM-Cter]形式SB206(SEQIDNO61)和SB218(39mer)(SEQIDNO62)5'AAAATTTCGATATCCACGGCGCTCGGCACGACGCCCAAC3'.用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(1270bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中，产生大小约为6311bp的质粒pNS012。gC基因的tPAA[TM-Cter]形式编码一种有448个氨基酸的糖蛋白，含有PRVgC糖蛋白的胞外域。8.3编码不同形式的PRV-gD的质粒8.3.1pSB105:克隆到载体PVR1012中的gD基因(原始形式)用病毒DNA作为模板，利用下列引物，PCR扩增PRVNIA3抹的gD45基因SB207(36mer)(SEQIDNO63)5'AATTTTGATATCATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGCG3'和SB208(36mer)(SEQ工DNO64)5'AATTTTGGATCCCTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG3'.用酶EcoRV和BamHI消化扩增产物(1227bp)，克隆到预先用EcoRV和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中，产生大小约为6104bp的质粒pSB105。PRVgD基因编码一种有404个氨基酸的糖蛋白。8.3.2pSB106:克隆到载体pVR1012中的gD基因(A[TM-Cter]形式)用病毒DNA作为模板，利用下列引物，PCR扩增PRVNIA3抹的gD基因的截短形式SB207(SEQ工DNO63)和SB209(40mer)(SEQIDNO65)5'AAATTTTGGATCCCTAGCGGTGGCGCGAGACGCCCGGCGC.31.用酶EcoRV和BamHI消化扩增产物(1077bp)，克隆到预先用EcoRV和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中，产生大小约为5957bp的质粒pSB106。gD基因的截短形式(A[TM-Cter])编码一种有355个氨基酸的糖蛋白，含有PRVgD糖蛋白的胞外域。8.3.3pPB238:克隆到载体pABllO中的gD基因(tPAA[TM-Cter]形式)利用下列引物，由模板pSB105(实施例8.3.1)PCR扩增PRVNIA3抹的gD基因的tPAA[TM-Cter]形式SB209(SEQ工DNO65)和S3219(39mer)(SEQIDNO66)5'AAAATTTCGATATCCACCTTCCCCCCGCCCGCGTACCCG3'.用酶EcoRV和BamHI消化扩增产物(1015bp)，克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pABllO(实施例2)中，产生大小约为6056bp的质粒pPB238。gD基因的tPAA[TM-Cter]形式编码一种有363个氨基酸的糖蛋白，含有PRVgD糖蛋白的胞外域。实施例9:编码不同形式的猪生殖道呼吸道综合征病毒(PRRSV)Lelystad抹抗原的质粒编码PRRSV0RF3、0RF5和0RF6蛋白的基因由Lelystad抹的病毒RNA经RT-PCR获得(J.Meulenberg等人，Virology,1993,19,62-72;W0-A-92-21375)，于1991年6月5日保藏于国立微生物保藏中心(CNCM),InstitutPasteur,巴黎，法国，编号为1-1102。9.1编码不同形式的PRRSVLelystad抹0RF3的质粒9.1.1pLF1009:克隆到载体pVR1012中的0RF3基因(原始形式)利用引物LF028,由相应的病毒RNA合成Lelystad抹的0RF3基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF027(30mer)(SEQIDNO67)5'CACTACGATATCATGGCTCATGAGTGTGCA3'i和.LF028(30mer)(SEQ工DNO68)5'CACTACAGATCTTTATCGTGATGTACTGGG3'.■EcoRV和Bgllll消化PCR产物获得的802bp的DM片段与EcoRV和Bgllll消化pVR1012(实施例2)产生的4879bp片段连接，产生大小约为5681bp的质粒pLF1009。PRRSVLelystad0RF3基因编码一种有265个氨基酸的蛋白质。9.2编码不同形式的PRRSVLelystad抹0RF5的质粒9.2.1pLF1011:克隆到载体PVR1012中的0RF5基因(原始形式)利用引物LF020,由相应的病毒RNA合成Lelystad抹的0RF5基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF019(30mer)(SEQIDNO69)5'CTCACCGTCGACATGAGATGTTCTCACAAA3'和LF020(30mer)(SEQIDNO70)5'CTCACCTCTAGACTAGGCCTCCCATTGCTC3'.Sail和Xbal消化PCR产物获得的802bp的DNA片段与Sail和Xbal消化pVR1012(实施例2)产生的4879bp片段连接，产生大小约为5681bp的质粒pLF101LPRRSVLelystad0RF5基因编码一种有201个氨基酸的蛋白质.9.2.2pLF1012:克隆到载体pAB110中的0RF5基因(截短形式)利用下列寡核苷酸对，由模板pLF1011(实施例9.2.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的ORF5基因LF021(30mer)('SEQ工DNO71)5"CACCTCGGATCCTTTGCCGATGGCAACGGC3',和LF022(33mer)(SEQIDNO72)5'CACCTCGGATCCTTAGACTTCGGCTTTGCCCAA3'.BamHI消化PCR产物获得的432bp的DNA片段与BamHI消化pABllO(实施例2)产生的5105bp片段连接，产生大小约为5537bp的质粒pLF1012。这样修饰的PRRSVLelystad0RF5基因(tPAA[TM+Cter])编码一种有168个氨基酸的蛋白质。9.3编码不同形式的PRRSVLelystad抹0RF6的质粒9.3.1pLF1013:克隆到载体pVR1012中的ORF6基因(原始形式)利用引物LF024,由相应的病毒RNA合成Lelystad抹的ORF6基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增(30mer)(SEQIDMO73)5'CACTCAGTCGACATGGGAGGCCTAGACGAT3'和LF024(30mer)(SEQIDNO74)5'CACTCATCTAGATTACCGGCCATACTTGAC3'.Sail和Xbal消化PCR产物获得的528bp的DNA片段与Sail和Xbal消化pVR1012(实施例2)产生的4881bp片段连接，产生大小约为5409bp的质粒pLF1013。PRRSVLelystad0RF6基因编码一种有173个氨基酸的蛋白质。9.3.2pLF1014:克隆到栽体pABllO中的ORF6基因(截短形式)利用下列寡核苷酸对，由模板pLF1013(实施例9.3.1)通过PCR反48应合成跨膜域和羧基端域缺失的0RF6基因LF025(30mer)(SEQIDNO75)5'CACTACGGATCCGTGTCACGCGGCCGACTC3'和■LF026(33mer)(SEQIDNO76)5'CACTACGGATCCTTAAACAGCTCGTTTGCCGCC3'.BamHI消化PCR产物获得的390bp的DM片段与BamHI消化pABllO(实施例2)产生的5105bp片段连接，产生大小约为5495bp的质粒pLF1014。这样修饰的PRRSVLelystad0RF6基因(tPAA[TM+Cter])编码一种有154个氨基酸的蛋白质。实施例10:编码不同形式的猪生殖道呼吸道錄合征病毒(PRRSV)美国抹ATCCVR-2332抗原的质粒编码PRRSV病毒0RF3、0RF5和0RF6蛋白的基因由保藏为ATCC号VR-2332的美国抹的病毒RNA经RT-PCR获得(M.Murtaugh等人，Arch.Virol.，1995，140，1451-1460)。10.1编码不同形式的PRRSVVR-2332抹0RF3的质粒10.1.1pLF1015:克隆到载体pVR1012中的ORF3基因(原始形式)利用引物LF038,由相应的病毒RNA合成VR-2332抹的0RF3基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF037(30mer)(SEQ工DNO77)5'CACTACGATATCATGGTTAATAGCTGTACA3'和LF038(30mer)(SEQIDNO78)5''CACTACTCTAGACTATCGCCGTACGGCACT3'.EcoRV和Xbal消化PCR产物获得的769bp的DNA片段与EcoRV和Bgllll消化pVR1012(实施例2)产生的4900bp片段连接，产生大小约为5669bp的质粒pLF1015。PRRSVVR-2332抹0RF3基因编码一种有254个氨基酸的蛋白质。10.2编码不同形式的PRRSVVR-2332抹0RF5的质粒10.2.1pLF1017:克隆到载体pVR1012中的0RF5基因(原始形式)利用引物LF030，由相应的病毒RNA合成VR-2332抹的0RF5基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF029(30mer)(SEQIDNO79)5'CACTACGATATCATGTTGGAGAAATGCTTG3'和.LF030(30mer)(SEQIDNO80)5'CACTACAGATCTCTAAGGACGACCCCATTG3'.EcoRV和Bglll消化PCR产物获得的607bp的DM片段与EcoRV和Bglll消化pVR1012(实施例2)产生的4879bp片段连接，产生大小约为5486bp的质粒pLF1017。PRRSVVR-2332抹0RF5基因编码一种有200个氨基酸的蛋白质.10.2.2pLF1018:克隆到载体pABllO中的0RF5基因(截短形式)利用下列寡核苷酸对，由模板pLF1017(实施例10.2.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的0RF5基因LF031(33mer)(SEQIDNO81)5'CACTACGGATCCGCCAGCAACGACAGCAGCTCC3'和'LF032(33mer)(SEQIDN〇82)5'CACTACGGATCCTTAGACCTCAACTTTGCCCCT3'.BamHI消化PCR产物获得的426bp的DNA片段与BamHI消化pABllO(实施例2)产生的5105bp片段连接，产生大小约为5531bp的质粒pLF1018。这样修饰的PRRSVVR-2332抹0RF5基因(tPAA[TM+Cter])编码一种有166个氨基酸的蛋白质。10.3编码不同形式的PRRSVVR-2332抹0RF6的质粒10.3.1pLF1019:克隆到载体pVR1012中的0RF6基因(原始形式)利用引物LF034，由相应的病毒RNA合成VR-2332抹的0RF6基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF033(33mer)(SEQIDNO83)5'CACATCCTGCAGATGGGGTCGTCCTTAGATGAC31和LF034(30mer)(SEQIDNO84)5'CACATCTCTAGATTMTTGGCATATTTGAC3'.Pstl和Xbal消化PCR产物获得的527bp的DNA片段与Pstl和Xbal消化pVR1012(实施例2)产生的4871bp片段连接，产生大小约为5398bp的质粒pLF1019.PRRSVVR-2332抹0RF6基因编码一种有174个氨基酸的蛋白质.10.3.2pLF1016:克隆到载体pAB110中的0RF6基因(截短形式)利用下列寡核苷酸对，由模板pLF1019(实施例10.3.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的0RF6基因LF035(30mer)(SEQIDNO85)5'CACTACGGATCCGTGAGTCGCGGCCGACTG3'|和LF036(33mer)(SEQIDNO86)5'CACTACGGATCCTTAAACAGCTTTTCTGCCACC3'BamHI消化PCR产物获得的390bp的DNA片段与BamHI消化pABllO(实施例2)产生的5105bp片段连接，产生大小约为5459bp的质粒pLF1016。这样修饰的PRRSVVR-2332抹0RF6基因(tPAA[TM+Cter])编码一种有154个氨基酸的蛋白质。实施例11:编码不同形式的猪流感病毒(SIV)HlNl抹抗原的质粒编码猪流感病毒H1N1型的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原的基因由"SW"HlNl抹的病毒RNA经RT-PCR获得.这些抹可从位于加拿大Laval的魁北克大学Armand-Frappier研究所的病毒学研究中心获得(D.S.Arora等人，VirusGenes,1997，14，251-254)。参见G.W.Both等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1983，80，6996-7000。11.1编码不同形式的SIVHlNl抹HA的质粒11.1.1pLF1001:克隆到栽体pVR1012中的HA基因(原始形式)利用引物LF004，由相应的病毒RNA合成H1N1抹的HA基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF003(30mer)(SEQIDNO87)5'CTCCATGATATCATGGAAGCAAAACTATTC3'和LF004(30mer)(SEQ工DNO88)5'CTCCATCAGATCTTAAATGCATATTCTGCA3'.EcoRV和Bgllll消化PCR产物获得的1705bp的DM片段与EcoRV和Bgllll消化pVR1012(实施例2)产生的4879bp片段连接，产生大小约为6584bp的质粒pLF1001.SIVH1N1HA基因编码一种有566个氨基酸的蛋白质。11.1.2pLF1002:克隆到载体pLF999中的HA基因(修饰形式)利用下列寡核苷酸对，由模板pLF1001(实施例11.1.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的HA基因LF005(30mer)(SEQ工DNO89)5'TCCGCGGCCGCACATGCTAACAATTCCACA3'和LF006(32mer)(SEQIDNO90)5'TCCGCGGCCGCTTACATTGATTCTAGTTTCAC3'.Notl消化PCR产物获得的1515bp的DNA片段与Notl消化pLF999(实施例2)产生的5678bp片段连接，产生大小约为7193bp的质粒pLF1002'这样修饰的SIVH1N1HA基因(兔P-珠蛋白基因的内含子II,tPA，A[TM+Cter])编码一种有530个氨基酸的蛋白质。11.2编码不同形式的SIVHlNl抹NA的质粒11.2.1pLF1003:克隆到载体pVR1012中的NA基因(原始形式)利用引物LF008,由相应的病毒RNA合成H1N1抹的NA基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF007(30mer)(SEQIDNO91)5'CACCTGGTCGACATGAATCCAAATCAGAAG3'和LF008(30mer)(SEQ工D恥92)5'CACCTGTCTAGACTACTTGTCAATGGTGAA31.Sail和Xbal消化PCR产物获得的1416bp的DNA片段与Sail和Xbal消化pVR1012(实施例2)产生的4881bp片段连接，产生大小约为6297bp的质粒pLF1003。SIVH1N1NA基因编码一种有469个氨基酸的蛋白质。11.2.2pLF1004:克隆到载体pLF999中的NA基因(修饰形式)52利用下列寡核苷酸对，由模板pLF1003通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的NA基因LF009(31mer)(SEQIDNO93)5'CACTACGAATTCACAAATTGGGAATCAAAAT3':和LF010(30mer)(SEQ工DNO94)J.5'AATTTGTGAATTCGCGGCCGCGGATCCGGT3'.EcoRI消化PCR产物获得的1207bp的DNA片段与EcoRI消化pLF999(实施例2)产生的5678bp片段连接，产生大小约为6885bp的质粒pLF1004。这样修饰的SIVH1N1NA基因(兔P-珠蛋白基因的内含子II，tPA，A[TM+Cter])编码一种有431个氨基酸的蛋白质。实施例12:编码不同形式的猪流感病毒(SIV)H3N2抹抗原的质粒编码H3N2型猪流感病毒的HA和NA抗原的基因由"CotesduNord1987"(cdn87)抹的病毒RNA经RT-PCR获得，该毒抹由世界卫生组织(WHO)引用，可获自国家流感参考中心，病毒学实验室，8avenueRockfeller,69008里昂，法国。12.1编码不同形式的SIVH3N2抹HA的质粒12.1.1pLF1005:克隆到栽体pVR1012中的HA基因(原始形式)利用引物LF012，由相应的病毒RNA合成H3N2抹的HA基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF011(30mer)(SEQIDN〇95)5'CTGCACGTCGACATGAAGACTGTCATTGCC3'和LF012(24mer)(SEQIDNO9S)5'GATATCTCAGATGCAAATGTTGCA3'.EcoRV和Sail消化PCR产物获得的1709bp的DNA片段与EcoRV和Sail消化pVR1012(实施例2)产生的4893bp片段连接，产生大小约为6602bp的质粒pLF1005。SIVH3N2HA基因编码一种有566个氨基酸的蛋白质。12.1.2pLF1006:克隆到载体PLF999中的HA基因(修饰形式)利用下列寡核苷酸对，由模板pLF1005(实施例12.1.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的HA基因LF013(33mer)(SEQIDNO97)5'CACCGCGGATCCCTTCCAGAAAATGGCAGCACA3'和LF014(33mer)(SEQ工DNO98)5'CACCGCGGATCCTTAGT(JTTTGTATCCCGACTT3'.BamHI消化PCR产物获得的1542bp的DM片段与BamHI消化pLF999(实施例2)产生的5678bp片段连接，产生大小约为7220bp的质粒pLF1006。这样修饰的SIVH3N2HA基因(兔P-珠蛋白基因的内含子II，tPA，△[TM+Cter])编码一种有538个氨基酸的蛋白质。12.2编码不同形式的SIVH3N2抹NA的质粒12.2.1pLF1007:克隆到载体pVR1012中的NA基因(原始形式)利用引物LF016,由相应的病毒RNA合成H3N2抹的NA基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF015(30mer)(SEQIDNO99).5'CACTCAGATATCATGAATCCAAAGCAAAAG3':和LF016(30mer)(SEQIDNO100)5'CACTCATCTAGATTATATAGGCATGAGATC3'.EcoRV和Xbal消化PCR产物获得的1414bp的DM片段与EcoRV和Xbal消化pVR1012(实施例2)产生的4900bp片段连接，产生大小约为6314bp的质粒pLF1007。SIVH3N2NA基因编码一种有469个氨基酸的蛋白质。12.2.2pLF1008:克隆到载体pLF999中的NA基因(修饰形式)利用下列寡核苷酸对，由模板pLF1005(实施例12.2.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的NA基因LF017(33mer)(SEQ工DNO101)51CACTACGGATCCTTCAAC-CAATATGAGTGCGAC3'■和LF018(33mer)(SEQIDNO102)5'CACTACGGATCCTTATGAAGTCCACCATACTCT3'.BajnHI消化PCR产物获得的1221bp的DNA片段与BamHI消化pLF999(实施例2)产生的5678bp片段连接，产生大小约为6899bp的质粒pLF1008.这样修饰的SIVH3N2NA基因(兔P-珠蛋白基因的内含子II,tPA，A[TM+Cter])编码一种有431个氨基酸的蛋白质。实施例13:编码牛GM-CSF的质粒利用引物LF065,由牛血单核细胞的细胞RNA合成牛GM-CSF基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF054(36mer)(SEQIDNO103)5'CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC3':和LF055.(34mer)(SEQ工DNO104)5'CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCA.3'.Sail和BglII消化PCR产物获得的437bp的DNA片段与Sail和BglII消化pVR1012(实施例2)产生的4860bp片段连接，产生质粒pLF1032(约5297bp)。牛GM-CSF基因编码一种有143个氨基酸的蛋白质。实施例14:编码猪GM-CSF的质粒利用引物LF067,由猪血单核细胞的细胞RNA合成猪GM-CSF基因的cDNA，并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增LF056(36mer)(SEQIDNO105)5'CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC3';和；LF057(37mer)(SEQIDNO106)5'CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCAGCA3'.SalI和BglII消化PCR产物获得的440bp的DNA片段与SalI和Bgl11消化pVR1012(实施例2)产生的4860bp片段连接，产生质粒pLF1033(约5300bp)。猪GM-CSF基因编码一种有144个氨基酸的蛋白质。实施例15:疫苗质粒的配制含有一种或多种根据实施例3-14的质粒的DNA溶液如Sambrook等人(1989)所述通过乙醇沉淀浓缩。DNA沉淀溶解于0.9%NaCl溶液中，获得1mg/ml的浓度。用适当体积的无菌水溶解DMRIE-DOPE的冻干物制备0.75mMDMRIE-DOPE溶液。通过溶于0.9%NaCl溶液的1mg/mlDM溶液与0.75mMDMRIE-DOPE溶液等份稀释，实现质粒DNA-脂复合物的形成。利用26G针头，沿瓶壁逐渐加入该DNA溶液，瓶中含有阳离子脂溶液，以避免形成泡沫。两种溶液一混合就轻轻摇动。最终获得含有0.375mMDMRIE-DOPE和500Mg/ml质粒的组合物。对于上述所有搡作，在室温下使用所有溶液是所希望的。在免疫动物之前，DNA/DMRIE-DOPE复合物的形成在室温下进行30分钟，实施例16:牛针对BHV-1的免疫12头牛随机分配到3组中，每组4头。第1组为对照动物组。对第2组的动物施用疫苗质粒pPB281(编码A[TM-Cter]形式的BHV-1gB,实施例3.1.2)、pPB292(编码A[TM-Cter]形式的BHV-1gC,实施例3.2.2)和pPB284(编码A[TM-Cter]形式的BHV-1gD,实施例3.3.2)的混合物。对第3组的动物施用与第2组相同的混合物，但是该混合物如实施例15所述用DMRIE-DOPE配制。利用针头注射器经肌内途径对每头牛进行10ml的注射，21天后重复一次。每次免疫中使用的每种质粒的总量为1500ng。本领域的技术人员有根据所需的质粒剂量调节体积或浓度的必要能力。在第一次接种后的35天的时间内，监测由两种表达BHV-1gB、gC和gD抗原的疫苗质粒混合物诱发的血清学反应。结果示于下表中56<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>实施例17:猪针对PRV的免疫15只大约7周龄的猪随机分配到3组中，每组5只。第1组为对照动物组。对第2组的动物施用疫苗质粒pNS009(编码tPAA[TM-Cter]形式的PRVgB，实施例8.1.3)、pNS012(编码tPAA[TM-Cter]形式的PRVgC，实施例8.2.3)和pPB238(编码tPAA[TM-Cter]形式的PRVgD,实施例8.3.3)的混合物。对第4组的动物施用与第3组相同的混合物，但是该混合物如实施例15所述用DMRIE-DOPE配制，获得0.0535mM的终DMRIE-DOPE浓度。这些接种方案所需的质粒，每种350pg混合于14ml终体积中。利用针头注射器经肌内途径对每只猪进行2ml的注射，21天后重复一次。在第35天时，经鼻施用2mlPRVNIA3抹攻击病毒溶液攻击这些猪，每只鼻孔1ml,效价为10776CCID5。/ml。在第一次接种后的42天的时间内，监测每只动物的体重(kg)。在攻击后的7天内计算每只动物的相对体重增加(G7)。它是第7天(D7)的体重减去攻击曰(DO)的体重，除以攻击日的体重，每曰表示为百分数(D7的体积-DO的体重)100/(DO.7的体重)AG7是接种动物与对照动物的相对体重增加平均值的差。结果示于下表中:<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>应当清楚地理解，附加权利要求书所确定的本发明不限于以上说明书所述的具体实施方案，而包括既不超出本发明的范围又不违反其精神的变化。序列表〈110〉MERIAL<120>用于生产型动物的改良DNA疫苗〈130〉DNAbpF<140><141〉〈歸106<170〉PatentlnVer.2.1<210〉1<211〉40<212〉鹏〈213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列说明寡核苷酸<400〉1gatctgcagcacgtgtctagaggatatcgaattcgcggcc40<210〉2<211>40<212〉醒<213>人工序列<220><223〉人工序列说明寡核苷酸〈400〉2ggitccgcggccgcgaattcgatatcctctagacacgtgct40〈210〉3<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸〈400〉3ttggggacccttgattgttc20〈210>4<211>21〈212〉DNA〈213>人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400>4ctgtaggaaa幼gaagaaggc21〈210〉5<211>30〈212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉人工序列说明寡核苷酸<400>5ctccatgtcgacttggggacccttgattgt30<210>6〈211〉30<212>腿<213>人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400>6ctccatgtcgacctgtaggaaaaagaagaa30<210〉7<211〉30〈212〉DNA<213〉人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400>7ttgtcgacatggccgctcgcggcggtgctc30<210>860<211>21<212〉腿<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸〈400〉8gcagggcagcggctagcgcgg21<210〉9<211>52<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉人工序列说明寡核苷酸〈400〉9ctgcacgagctccggttct3cgacattgaccgcgtggtca3gacgg3ctgag52〈210>10<211〉56<212〉廳<213>人工序列<220><223〉人工序列说明寡核苷酸<400〉10gatcctcagtccgtcttgaccacgcggtcaatgtcgtagaaccggagctcgtgcag56<210>11<211>39<212>醒<213>人工序列<220><223〉人工序列说明寡核苷酸<400>11a肪atttcgatatccgccgcggggcgaccggcgacaacg39<210>12〈211〉33<212>醒61<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸〈400〉12ggaagatcttcagtccgtcttgaccacgcggtc<210>13<211>37<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸<400>13tcgtgcctgcggcgcaaggcccgggcgcgcctgtagt<210>14<211>37<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉入工序列说明寡核苷酸<400>14ctagactacaggcgcgcccgggccttgcgccgcaggc<210>15<211>43<212>飄<213>人工序列<220〉〈223〉人工序列说明寡核苷酸<400>15gcaccgctgcccgagttctccgcgaccgccacgtacgactagt<210>16<211〉43<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉人工序列说明寡核苷酸<400>16ctagactagtcgtacgtggcggtcgcggagaactcgggcagcg〈210>17〈211>39<212〉腿<213>人工序列<220〉〈223〉人工序列说明寡核苷酸〈400>17aaaatttcg3tatcccggcgggggctcgccgaggaggcg〈210〉18<211〉32<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉人工序列说明寡核苷酸<400>18ggaagatctctagtcgtacgtggcggtcgcgg<210〉19<211〉33〈212〉腿<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸<400〉19tttctgc卿tgcaagggccgacattggccgtg<210>20<211〉31<212>腿<213>人工序列<220><223〉人工序列说明寡核苦酸<400>20tttctagattagggcgtagcgggggcgggcg31<210>21<211>39〈212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223>人工序列说明寡核苷酸〈400〉21aaaatttcgatatcccccgcgccgcgggtgacggtatac39<210>22<211〉33<212〉DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400〉22ggaagatctttagggcgtagcgggggcgggegg33<210〉23<211〉34<212>■〈213〉人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸〈400>23aaattttctgcagatggcgacaacagccatgagg34<210>24<211〉35〈212〉腿<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸〈400〉24ttaaggatcctcatttactaaaggaaagattgttg35<210>25<211>39<212>腿<213>人工序列<220><223>人工序列description:oligonucleotide〈400>25aattttggatcctcatgtggtggattttcctacatctac39<210>26<211>38<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>人工序列说明寡核苷酸<400〉263asattC3cgtg犯c3t犯cagaagasttttatc肪tc38<210>27<211〉32<212>腿<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸<400〉27acgcgtcgacatgtccaaccatacccatcatc32<210>28<211>38<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>人工序列说明寡核苷酸〈400〉28ttaaaatctagattagatctgtgtagttgattgatttg38<210>29<211>33<212>DM<213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸<400>29tttt犯ggatccgctaaagcc肪gcccacatcc33<210>30<211>33<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>人工序列说明寡核苷酸<400>30ttaaaatctagattagatctgtgtagttgattg33<210〉31<211〉36〈212〉脆<213〉人工序列<220〉<223>人工序列说明寡核苷酸<400〉31cataccgtcgacstgaagaaactagag站agccctg36<210>32<211>40<212>匪<213>人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400>32cataccggatcctcaggctgcatatgccccaaaccatgtc4066<210〉33<211>39〈212>腿<213>人工序列〈220><223〉人工序列说明寡核苷酸<400>33catgacgcggccgctatgaagaaactagagaaagccctg<210>34<211>40<212>腿<213>人工序列〈220><223>人工序列说明寡核苷酸<400>34catgacagatctttaggctgcatatgccccaaaccatgtc<210>35<211>33<212〉DNA<213>人工序列<220〉〈223〉人工序列说明寡核苷酸<400〉35■catgacgtcgacatgacgactactgcattcctg<210>36<211>36<212>DNA<213〉人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400〉36catgacagatcttcaacgtcccgaggtcatttgttc<210〉37<211〉36<212>DNA〈213>人工序列<220>〈223>人工序列说明寡核苷酸<400>37catgacgcggccgctatgacgactactgcattcctg〈210>38〈211〉35<212〉腿<213〉人工序列<220>〈223〉人工序列说明寡核苷酸〈400〉38catgacagatctcaagcgaagtaatcccggtggtg<210>39<211>36<212〉腿<213>人工序列<220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸<400>39actgtatctagaatgaccaccacagctttcctaatc<210>40<211>39〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>人工序列说明寡核苷酸<400>40actgtaagatctttaagtattcactccagcacccatagc<210>41<211〉41<212〉腿<213〉人工序列<223>|人工序列说明寡核苦酸<柳>41catgacgcggccgccctatgaccaccacagctttcctaatc41<210>42<211>36〈212〉隨<213〉人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400〉42catgacagatctttatatgaactctgagaagtagtc36<210〉43<211〉39<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>人工序列说明寡核苷酸<400>43cat3ccgtcg3catg卿a3g肌attggagaaggcactg39<210>44<211〉39〈212〉腿<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸<400>44cataccggatcctcatgctgcatgagcaccaaaccatgc39<210>45<211>42<212>DNA<213〉人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸〈400〉45catgacgcggccgct3tgagaaagaaattggag犯ggcactg<210>46<211>39<212>腿<213>人工序列<220〉<223>人工序列说明寡核苷酸<400>46cataccagatcttcatgctgcatgagcaccaaaccatgc<210>47<211>39<212>腿<213>人工序列<220〉<223〉人工序列说明寡核苷酸<400>47catatcgtcgacatggaatattggaaacacacaaacagc<210>48<211〉38<212〉腿<213〉人工序列<220〉<223>人工序列说明寡核苷酸<400>48catgacgatatctagctgcagtttttcggaacttctgt<210〉49<211>33<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400>49catactgcggccgctttaattcaagagaacaat33<210>50<211〉35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400>50catatcgatatctagctgcagtttttcggaacttc35<210〉51<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400>51catatcgtcgacatgatcatcacaaacacaatcata36<210>52<211>36<212>醒<213〉人工序列<220><223>人工序列说明寡核苦酸<400>52catgaccagatcttattgtctatttgtcagtatata36<210〉53<211>42<212〉腿<213>人工序列<220><223〉人工序列说明寡核苦酸<400〉53catactgcggccgctcaaatagacataacaaaactgcaacgt42〈210〉54<211〉41<212>腿.<213〉人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400>54catatcgatatctatgcactagattgataccaacttccaac41<210>55<211〉36<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>人工序列说明寡核苷酸<400>55ttttaagatatcatgcccgctggtggcggtctttgg36<210>56<211>39<212〉DNA<213>人工序列<220〉〈223〉人工序列说明寡核苷酸<400〉56ttttaaggatccctacagggcgtcggggtcctcgctctc39<210〉57<211>39<212>腿<213〉人工序列<220><223>人工序列说明寡核苷酸<400〉57ttttaaggat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子是兔P-珠蛋白基因的内含子II。10.根据权利要求l-5之一的疫苗，其特征在于含有BHV-1的核苷酸序列。11.根据权利要求10的疫苗，其特征在于含有经如下优化的gB基因序列用信号序列，特别是人源tPA信号的那些，替换糖蛋白gB的信号狀序列，和/或缺失编码gB跨膜域的DNA片段。12.根据权利要求IO的疫苗，其特征在于含有经如下优化的gC基因序列用信号序列，特别是人源tPA信号的那些，替换糖蛋白gC的信号肽序列，和/或缺失编码gC跨膜域的DNA片段，13.根据权利要求10的疫苗，其特征在于含有经如下优化的gD基因序列用信号序列，特别是人源tPA信号的那些，替换糖蛋白gD的信号肽序列，和/或缺失编码gD跨膜域的DNA片段。14.根据权利要求IO的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列质粒编码BHV-1gB抗原的表达质粒，通过缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段优化；编码BHV-1gC抗原的第二表达质粒，通过缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核普酸序列片段优化；和编码BHV-1gD抗原的第三表达质粒，通过缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核苷^列片段优化。15.根据权利要求1-5之一的疫苗，其特征在于含有BRSV的核苷酸序列。16.根据权利要求15的疫苗，其特征在于含有经如下优化的BRSVF基因的序列将BRSVF蛋白的信号序列替换为一种信号序列，特别是人源tPA的信号序列，和/或缺失编码F的跨膜域的DNA片段。17.根据权利要求15的疫苗，其特征在于含有经如下优化的BRSVG基因的序列将BRSVG糖蛋白的信号序列替换为一种信号序列，特别是人源tPA的信号序列，和/或缺失编码G的跨膜域的DNA片段。18.根据权利要求15的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列质粒编码BRSVF抗原的表达质粒，通过插入人tPA的信号序列代替F的信号序列、缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的F的核苷酸序列片段优化；和编码BRSVG抗原的第二表达质粒，通过插入人tPA的信号序列代替G的信号序列、缺失编码G的跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段优化。19.根据权利要求1-5之一的疫苗，其特征在于含有BVDV的核苷酸序列.20.根据权利要求19的疫苗，其特征在于含有经如下优化的BVDVEO基因的序列在编码EO蛋白的核苷酸序列上游添加信号序列，特别是人源tPA的信号序列，和/或在编码E0的核苷酸序列上游插入内含子，特别是兔P-珠蛋白基因的内含子II。21.根据权利要求19的疫苗，其特征在于含有经如下优化的E2基因的序列在编码E2蛋白的核苷酸序列上游添加信号序列，特别是人源tPA的信号序列，和/或缺失编码E2的跨膜域的DNA片段，和/或在编码E2的核苷^列上游插入内含子，特别是兔P-珠蛋白基因的内含子II。22.根据权利要求19的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列质粒编码BVDVEO批原的表达质粒，通过在E0上游插入人tPA的信号序列并且在E0上游插入兔P-珠蛋白基因的内含子II优化；和编码BVDVE2抗原的第二质粒，通过在E2上游插入人tPA的信号序列、缺失编码E2跨膜域的核苷酸序列片段并且在E2上游插入兔P-珠蛋白基因的内含子II优化。23.根据权利要求l-5之一的疫苗，其特征在于含有bPI-3的核苷酸序列。24.根据权利要求23的疫苗，其特征在于含有经如下优化的bPI-3HN基因的序列将HN的信号序列替换为一种信号序列，特别是人源tPA的信号序列，和/或缺失编码HN跨膜域的DNA片段，和/或在编码HN的核苷^列上游插入内含子，特别是兔珠蛋白基因的内含子II。25.根据权利要求23的疫苗，其特征在于含有经如下优化的bPI-3F基因的序列将F的信号序列替换为一种信号序列，特别是人源tPA的信号序列，和/或缺失编码F跨膜域的DNA片段，和/或在编码F的核苷^列上游插入内含子，特别是兔P-珠蛋白基因的内含子II。26.根据权利要求23的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列质粒编码bPI-3HN抗原的表达质粒，通过插入人tPA的信号序列代替HN的信号序列、缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的HN的核苷酸序列片段并且在HN上游插入兔P-珠蛋白基因的内含子II优化；和编码bPI-3F抗原的第二表达质粒，通过插入人tPA的信号序列代替F的信号序列、缺失编码F的跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段并且在F上游插入兔P-珠蛋白基因的内含子II优化。27.根据权利要求1-5中任一项的疫苗，其特征在于含有PRV的核苷財列。28.根据权利要求27的疫苗，其特征在于含有经如下优化的gB基因的序列将gB糖蛋白的信号肽序列替换为一种信号序列，特别是人源tPA信号的那些，和/或缺失编码gB跨膜域的DNA片段。29.根据权利要求27的疫苗，其特征在于含有经如下优化的gC基因的序列将gC糖蛋白的信号肽序列替换为一种信号序列，特别是人源tPA信号的那些，和/或缺失编码gC跨膜域的DNA片段。30.根据权利要求27的疫苗，其特征在于含有经如下优化的gD基因的序列将gD糖蛋白的信号肽序列替换为一种信号序列，特别是人源tPA信号的那些，和/或缺失编码gD跨膜域的DNA片段。31.根据权利要求27的疫苗，其特征在于含有DMRIE-D0PE和下列质粒编码PRVgB抗原的表达质粒，通过缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段优化；编码PRVgC抗原的第二表达质粒，通过缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段优化；编码PRVgD抗原的第三表达质粒，通过缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段优化。32.根据权利要求l-5之一的疫苗，其特征在于含有PRRSV的核苷酸序列。33.根据权利要求32的疫苗，其特征在于含有经如下优化的0RF3基因的核苷酸序列将0RF3编码的蛋白质的信号肽序列替换为信号序列，特别是人源tPA信号的那些，和/或缺失编码0RF3跨膜域的DNA片段。34.根据权利要求32的疫苗，其特征在于含有经如下优化的0RF5基因的核苷酸序列将0RF5编码的蛋白质的信号肽序列替换为信号序列，特别是人源tPA信号的那些，和/或缺失编码0RF5跨膜域的DNA片段。35.根据权利要求32的疫苗，其特征在于含有经如下优化的0RF6基因的核苷酸序列将0RF6编码的蛋白质的信号肽序列替换为信号序列，特别是人源tPA信号的那些，和/或缺失编码0RF6跨膜域的DNA片段。36.根据权利要求32的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列质粒编码PRRSV0RF3抗原的表达质粒；编码PRRSV0RF5抗原的第二表达质粒，通过将0RF5的信号序列替换为人tPA信号肽序列、缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段优化；和编码PRRSV0RF6抗原的第三表达质粒，通过将0RF6的信号序列替换为人tPA信号欣序列、缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段优化。37.根据权利要求1-5之一的疫苗，其特征在于含有SIV的核苷酸序列。38.根据权利要求37的疫苗，其特征在于含有经如下优化的HA基因的核苷酸序列将HA的信号序列替换为一种信号序列，特别是人源tPA的信号序列，和/或缺失编码HA的跨膜域的DNA片段，和/或在编码HA的核苷酸序列上游插入内含子，特别是兔P-珠蛋白基因的内含子II。39.根据权利要求37的疫苗，其特征在于含有经如下优化的NA基因的核苷酸序列将NA的信号序列替换为一种信号序列，特别是人源tPA的信号序列，和/或缺失编码NA的跨膜域的DNA片段，和/或在编码NA的核苷*列上游插入内含子，特别是兔P-珠蛋白基因的内含子IL40.根据权利要求37的疫苗，其特征在于含有DMRIE-DOPE和下列质粒编码SIVHA抗原的表达质粒，通过插入人tPA的信号序列代替HA的信号序列、缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的HA的核苷酸序列片段并且在HA上游插入兔P-珠蛋白基因的内含子II优化；和编码SIVNA抗原的第二表达质粒，通过插入人tPA的信号序列代替NA的信号序列、缺失编码NA的跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段并且在NA上游插入兔P-珠蛋白基因的内含子II优化。全文摘要本发明涉及一种针对感染生产型动物(特别是牛或猪)的病原体的DNA疫苗，它含有质粒—该质粒含有编码所述动物种的病原体免疫原的核苷酸序列(在使该序列能在体内表达的条件下)，和含有季铵盐的阳离子脂，这种脂具有通式(I)，其中R₁是饱和或不饱和的线型脂族基团，含有12-18个碳原子；R₂是另一个脂族基团，含有2或3个碳原子；X是羟基或氨基，该脂优选地是DMRIE。文档编号A61K47/24GK101554480SQ20081016678公开日2009年10月14日申请日期2001年1月19日优先权日2000年1月21日发明者J-C·F·奥多奈特,L·B·费希尔,S·巴祖-勒-鲁申请人:梅瑞尔公司