专利名称：聚l-谷氨酸/壳聚糖复合物材料与三维多孔支架及其制备方法
技术领域：
本发明属生物材料和组织工程领域，特别涉及组织工程用聚L-谷氨酸/壳聚糖复 合物材料与三维多孔支架及其制备方法。
背景技术：
支架材料是组织工程的基础，目前用于支架的材料可分为天然高分子和合成高 分子两大类。天然高分子存在的主要问题是，来源有限，价格昂贵，物理机械性能较 差，不能根据组织工程需要对降解时间进行控制。合成高分子材料，如生物可降解聚 酯虽然适合批量生产，易于加工，结构和性能可以按需修饰和调控，但亲水性和细胞 相容性较差，临床发现，合成聚酯类材料因酸性降解产物引起非特异性无菌性炎症反 应，因此寻找合适的多孔支架材料成为现今组织工程研究的重要课题。
聚L-谷氨酸(poly-L-glutamic acid)是一种生物可降解的大分子多肽，在体内能 降解为谷氨酸单体，为人体所必需，生物相容性优良，低免疫原性，能促进组织修复 和细胞生长。
壳聚糖(Chitosan)是一种资源丰富性能优良的生物材料，大量研究表明它可以 作为细胞的三维载体，用于组织工程领域。
针对天然高分子和合成高分子所存在的问题，组织工程领域迫切需要一种新型支 架材料。本发明将提供一种全新的修复软骨用的聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物支架材料， 同时公布其制备方法。
发明内容
本发明目的之一是提供一种组织工程用聚L-谷氨酸/壳聚糖多孔支架材料。 本发明目的之二在于提供该多孔支架材料的制备方法。 本发明目的是通过下述技术方案实现的。
一种聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物材料，其特征在于该材料的组成按重量比计，聚 L-谷氨酸与壳聚糖比值为1: 5 5: 5。
所述的壳聚糖的分子量范围是500000 2100000;聚L-谷氨酸的分子量范围 3000 88000。
所述的聚L-谷氨酸经1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDOHC1)、
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后，与壳聚糖反应形成水凝胶。
一种由上述聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物材料制成的三维多孔支架，其特征在于该 支架的孔隙率大于90%，平均孔径为20 250um;该支架的材料组成按重量比计，聚 L-谷氨酸与壳聚糖比值为1: 5 5: 5。
本发明的聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物三维多孔支架的制备方法以聚L-谷氨酸和 壳聚糖为原料，采用活化交联法，再通过冷冻-冻干制得组织工程用多孔支架。该制
备方法包括以下步骤
a) 按聚L-谷氨酸与壳聚糖重量比为1: 5 5: 5分别配制这两种溶液，在酸性 条件下配制重量浓度为1. 0 2. 0%壳聚糖溶液，采用的溶剂为乙酸；在稀NaOH 溶液中配制重量浓度为1. 0 2. 0%聚L-谷氨酸溶液；
b) 在稀NaOH的聚L-谷氨酸溶液中加入交联活化剂，交联活化剂中l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDOHC1)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩 尔比为l: 1，交联活化剂用量为聚L-谷氨酸羧基摩尔数的1 1.5倍，常温 搅拌5 10小时；
c) 将上述活化之后的聚L-谷氨酸溶液通过恒压滴液漏斗缓慢滴加到壳聚糖溶 液中，滴加完毕后，搅拌混合液5 10小时；
d) 将反应完毕的上述混合液，转移至透析袋中，透析40 60小时；
e) 将透析完毕的溶液，注入模具中，采用冷冻一冻干法，在-20 -20(TC下冷冻 5 10小时后于冷冻干燥机中冻干，得聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物三维多孔支 架。
本发明通过活化聚L-谷氨酸侧链上的羧基，与壳聚糖的氨基反应，形成聚L-谷 氨酸/壳聚糖复合物组织工程支架，可通过调节预冻温度、浓度等来控制多孔支架孔 径尺寸，改变聚L-谷氨酸/壳聚糖质量比控制材料的力学和降解性能。细胞实验表明， 软骨细胞在支架中生长良好，无毒副作用。本发明制备的组织工程支架适于软骨修复。
图la冷冻温度为-20。C条件下制备的支架SEM照片；
图lb冷冻温度为-100'C条件下制备的支架SEM照片；
图lc冷冻温度为-196'C条件下制备的支架SEM照片；
图2a壳聚糖和聚L-谷氨酸浓度均为1%时，支架的SEM照片；
图2b壳聚糖和聚L-谷氨酸浓度均为2%时，支架的SEM照片； 图3a壳聚糖分子量为50万时，支架的SEM照片； 图3b壳聚糖分子量为120万时，支架的SEM照片； 图3c壳聚糖分子量为210万时，支架的SEM照片； 图4为聚L-谷氨酸含量对多孔支架降解性能影响；
图5a为聚L-谷氨酸含量对多孔支架压縮强度影响，a为聚L-谷氨酸壳聚糖=0:5， b 为聚L-谷氨酸:壳聚糖=2: 5， c为聚L-谷氨酸:壳聚糖=5:5;
图5b为聚L-谷氨酸含量对多孔支架压縮模量影P向，a为聚卜谷氨酸壳聚糖=0:5， b
为聚L-谷氨酸壳聚糖=2:5， c为聚L-谷氨酸壳聚糖=5:5;
图6a为软骨细胞经Dio标记后发出的绿色荧光图6b为多孔材料的自发蓝色荧光图6c为图6a和图6b的荧光合成具体实施例方式
现将本发明的具体实施叙述于后。
实施例1:冷冻温度对聚L-谷氨酸/壳聚糖多孔支架微结构的影响
用乙酸溶液配制重量浓度为1.0%壳聚糖溶液和用稀NaOH溶液配制重量浓度为 1. 0%聚L-谷氨酸溶液，在4mL聚L-谷氨酸溶液中加入60mg的1-乙基-(3-二甲基氨 基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDOHC1)和36mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌6小时； 将活化后的聚L-谷氨酸溶液通过恒压滴液漏斗缓慢滴加到10mL壳聚糖溶液中，继续 搅拌6小时；反应液透析48小时后，注入模具中，分别在-20°C、 -IO(TC、 -196。C下 冷冻6小时后冻干，得聚L-谷氨酸/壳聚糖三维多孔支架。图la、 lb、 lc分别为在 冷冻温度为-20°C、 -IO(TC、 -196。C条件下制备的支架SEM照片。 实施例2:壳聚糖和聚L-谷氨酸浓度对多孔支架微孔结构的影响
本实施例步骤与实施例一基本相同，所不同的是预冻温度为-IO(TC，壳聚糖溶液 和聚L-谷氨酸溶液浓度均分别为1%和2%。图2a和2b分别为壳聚糖和聚L-谷氨酸浓 度均为1%和2%时支架的SEM照片。
实施例3:壳聚糖和聚L-谷氨酸分子量对多孔支架微孔结构的影响
本实施例步骤与实施例一基本相同，所不同的是预冻温度为-10(TC，采用不同 分子量的壳聚糖和聚L-谷氨酸，其中壳聚糖分子量为50万，120万和210万；聚L-
谷氨酸分子量为0.3万，4.4万和8.8万。图3a、 3b、 3c分别为壳聚糖分子量为50
万、120万、210万时，支架的SEM照片。
实施例4:聚L-谷氨酸含量对多孔支架降解性能的影响
用乙酸溶液配制重量浓度为1. Oy。壳聚糖溶液和用稀NaOH溶液配制重量浓度为1% 聚L-谷氨酸溶液，在4mL、 10mL聚L-谷氨酸溶液中加入60mg、 150mg的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDOHC1)和36mg、 90mg的N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，搅拌6小时。活化后的聚L-谷氨酸溶液通过恒压滴液漏斗缓慢滴加到10mL 壳聚糖溶液中，其中一个样品中不加活化的聚L-谷氨酸溶液，控制聚L-谷氨酸与壳 聚糖质量比分别为0:5，2:5，5:5，继续搅拌6小时，反应液透析48小时后，注入模 具中，在-2(TC冷冻6小时后冻千得聚L-谷氨酸/壳聚糖三维多孔支架。取一定量多 孔支架，加入10ml的0. 5mg/mL pH 7. 4的溶菌酶溶液，于37'C恒温水槽中消化1、 2、 3、 4周后取出，在-2(TC冷冻3小时，然后冻干，恒重后称其重量。图4为不同聚卜 谷氨酸含量多孔支架的降解曲线，说明多孔支架的降解速率与聚L-谷氨酸含量有关。 实施例5:聚L-谷氨酸含量对多孔支架力学性能的影响
如实施例4中制备不同聚L-谷氨酸含量的多孔支架。将样品切成10X10X10mm 大小，采用美国INSTRON-5869型材料试验机测试支架材料的机械压縮性能，实验 速度为lmm/min，温度为18°C，湿度50%，测得压縮强度和压縮模量。图5a和5b 为聚L-谷氨酸含量不同时多孔支架的压縮强度和压縮模量，说明多孔支架的力学性 能和聚L-谷氨酸的含量有关。 实施例6:聚L-谷氨酸/壳聚糖多孔支架体外评价
用乙酸溶液配制重量浓度为1.0%壳聚糖溶液和用稀NaOH溶液配制重量浓度为 1. 0%聚L-谷氨酸溶液，在4mL聚L-谷氨酸溶液中加入60mg的1_乙基-(3-二甲基氨 基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDOHCl)和36mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌6小时； 将活化后的聚L-谷氨酸溶液通过恒压滴液漏斗缓慢滴加到10mL壳聚糖溶液中，继续 搅拌6小时；反应液透析48小时后，注入模具中，在-2CTC冷冻6小时后冻干得聚 L-谷氨酸/壳聚糖三维多孔支架。取该多孔支架剪成5mmX5mm大小样品，用75%酒精 浸泡半小时以上，换培养液匿EM (含10。/。FBS)浸泡l小时以上。取生长旺盛软骨细 胞消化收集，1000rpm离心5分钟，用lml无血清DMEM培养液重悬细胞，加入Dio 染料5 u 1， 37°C、 5。/。C02培养箱孵育15分钟，1000rpm离心5分钟，用培养液DMEM
(含10。/。FBS)重悬，配置成50X10、ells/ml细胞悬液。取准备好的材料，吸干后， 每块材料接种50 u 1细胞悬液，37°C、 5%<:02培养箱黏附4小时后，加培养液DMEM
(含10。/。FBS)培养；观察前，取细胞材料复合物，去离子水轻轻冲洗3遍后，置于 激光共聚焦显微镜观察细胞形态。图6a、 6b、 6c为软骨细胞在复合支架上培养2周 后的激光共聚焦照片。图6a为细胞经Dio标记后发出的绿色荧光图，图6b为材料的 自发蓝色荧光图，图6c为6a和6b的荧光合成图。结果表明，该聚L-谷氨酸/壳聚 糖多孔支架材料具有良好的生物相容性，细胞在多孔材料中能很好的生长。
上述对实例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明 方法。熟悉本领域的技术人员可以容易对这些实施实例做出各种修改，并把在此说明 的一般性原理应用在其他应用实例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于 这里的实施实例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对本发明做出的改进和修改都 应该在本发明的保护范围之内。
权利要求
1. 一种聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物材料，其特征在于该材料的组成按重量比计，聚L-谷氨酸与壳聚糖比值为15～55。
2. 根据权利要求1所述的聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物材料，其特征在于所述的壳聚 糖的分子量范围是500000 2100000;聚L-谷氨酸的分子量范围3000 88000。
3. 根据权利要求1所述的聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物材料，其特征在于所述的聚L-谷氨酸经l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDOHCl、N-羟基琥珀酰亚 胺NHS活化后，与壳聚糖反应形成水凝胶。
4. 一种由权利要求1所述的聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物材料制成的三维多孔支架， 其特征在于该支架的孔隙率大于90%，平均孔径为20 250ym;该支架的材料组 成按重量比计，聚L-谷氨酸与壳聚糖比值为1: 5 5: 5。
5. —种用于权利要求4所述的三维多孔支架的制备方法，其特征在于它包括下述步 骤a) 按聚L-谷氨酸与壳聚糖重量比为1: 5 5: 5分别配制这两种溶液，在酸性 条件下配制重量浓度为1. 0 2. 0%壳聚糖溶液，采用的溶剂为乙酸；在稀NaOH 溶液中配制重量浓度为1. 0 2. 0%聚L-谷氨酸溶液；b) 在稀NaOH的聚L-谷氨酸溶液中加入交联活化剂，交联活化剂中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDOHC1与N-羟基琥珀酰亚胺NHS的摩尔 比为l: 1，交联活化剂用量为聚L-谷氨酸羧基摩尔数的1 1.5倍，常温搅 拌5 10小时；c) 将上述活化之后的聚L-谷氨酸溶液通过恒压滴液漏斗缓慢滴加到壳聚糖溶液中，滴加完毕后，搅拌混合液5 10小时；d) 将反应完毕的上述混合液，转移至透析袋中，透析40 60小时；e) 将透析完毕的溶液，注入模具中，采用冷冻一冻干法，在-20 -20(TC下冷冻 5 10小时后于冷冻干燥机中冻干，得聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物三维多孔支 架。
全文摘要
本发明公开了一种聚L-谷氨酸/壳聚糖复合物材料，该材料的组成按聚L-谷氨酸与壳聚糖重量比为1∶5～5∶5。由该材料制成的三维多孔支架的孔隙率大于90％，平均孔径为20～250μm；这种支架的制备方法以聚L-谷氨酸和壳聚糖为原料，采用活化交联法，再通过冷冻-冻干制得组织工程用多孔支架。它具有良好生物相容性。通过改变聚L-谷氨酸和壳聚糖质量比可控制多孔材料的力学性能和降解性能，改变预冻温度和溶液浓度能调控三维多孔支架孔径。本发明提供的三维多孔支架材料适合于软骨修复。
文档编号A61L27/56GK101380485SQ200810201279
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月16日 优先权日2008年10月16日
发明者宋志江, 尹静波, 斌 曹, 琼 李, 艳 杨, 坤 罗 申请人:上海大学