创伤后应激障碍的治疗的制作方法

专利名称：创伤后应激障碍的治疗的制作方法
技术领域：
本文一般性地涉及治疗创伤后应激障碍的方法，并且更特别地涉及使用化合物A 治疗创伤后应激障碍的方法、抑制多巴胺羟化酶的方法。还提供了通过施用治疗有效 量的化合物A改善患者恢复力的方法。还提供了通过给患者施用治疗有效量的化合物A诊 断患者创伤后应激障碍的方法，以及评价创伤后应激障碍的体征、症状或征候群中的至少 一种的方法；以及如果化合物A降低了创伤后应激障碍的体征、症状和征候群中的至少一 种则诊断患者创伤后应激障碍的方法。
背景技术：
焦虑障碍是最常出现的具有极大经济负担的精神疾病的障碍。除泛发性的焦虑障 碍外，它们还包括创伤后应激障碍、惊恐性障碍、强制性障碍和社交障碍以及其它恐怖症。创伤后应激障碍可能是严重的并且是慢性的，一些研究表明在一般性人群中一生 的发病率为1. 3%至7. 8%。创伤后应激障碍通常随之而来的是心理上使人痛苦的创伤性 事件。这些事件可例如包括好斗、恐怖事件、身体攻击、性攻击、机动车事故和自然灾害。对 该事件的反应可包括强烈畏惧、无助或恐惧。大多数人随着时间过去而从创伤性事件中恢 复并且恢复到正常生活。相反，在创伤后应激障碍患者中，症状会持续并且可能随着时间而 恶化，妨碍了恢复到正常生活。心理疗法是目前创伤后障碍治疗的支柱。方法包括认知行为疗法、暴露疗法和 眼运动脱敏和重复处理。药物疗法可增加心理疗法的效果。选择性血清素再吸收抑制剂 (SSRI)，例如舍曲林(Zoloft )和帕罗西汀(Paxil ),是由美国食品药品监督管理局批准 用于治疗PTSD的唯一药物。许多不希望的副作用和特征与SSRI应用有关。这些包括对下 列情况的考虑药物相互作用、胃肠道副作用、性欲副作用、自杀观念、急性抗焦虑药作用和 作用缓慢起效。一些三环抗抑郁药(TCA)和单胺氧化酶抑制剂(MAOI)显示具有一定的效 果，但是患者耐受性低，原因是副作用发生率高。MAOI具有饮食限制要求，并且与高血压事 件有关。TCA具有抗胆碱能和心血管副作用。拉莫三嗪，一种钠通道阻滞剂，在对照研究的 小规模安慰剂治疗创伤后应激障碍中具有一定的效果。使用拉莫三嗪的困难在于需要有调 整(titration)，以及发展为Steven Johnson综合征、生活恐吓疹的风险，使之在治疗应用 中是一种差的候选品。需要开发安全有效的创伤后应激障碍的治疗法。多巴胺是一种儿茶酚胺神经递质，其连同特异性多巴胺能受体一起主要发现于中 枢神经系统中。去甲肾上腺素是一种循环儿茶酚胺，其在中枢和外周系统中作用于肾上腺 素能受体。多巴胺羟化酶(DBH)催化多巴胺向去甲肾上腺素的转化，并且在中枢和外周交感神经元中均有发现。DBH的抑制作用同时地通过阻断其代谢提高多巴胺水平并通过 阻断其合成降低去甲肾上腺素水平。内匹司他((S)-5-氨基甲基-l-(5，7-二氟_1，2，3， 4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐)是一种DBH抑制剂。发明概述本文提供了通过给患者施用治疗有效量的化合物A治疗诊断有创伤后应激障碍 的患者的方法。还提供了通过施用治疗有效量的化合物A改善患者恢复力的方法。还提供了通过给患者施用治疗有效量的化合物A诊断患者创伤后应激障碍的方 法，和评价创伤后应激障碍的体征、症状或征候群中的至少一种的方法；以及如果化合物A 降低了创伤后应激障碍的体征、症状和征候群中的至少一种则诊断患者创伤后应激障碍的 方法。


图1显示了个别酶分析法的细节。图2显示了内匹司他对SHR的肠系膜动脉(a)、左心室(b)和大脑皮层(C)中的组 织去甲肾上腺素和多巴胺含量的作用。图3显示了内匹司他对SHR的肠系膜动脉(a)、左心室(b)和大脑皮层(C)中的组 织多巴胺/去甲肾上腺素比率的作用。图4显示了内匹司他对比格狗的肾动脉、左心室和大脑皮层中的组织去甲肾上腺 素和多巴胺含量的作用。图5显示了内匹司他对比格狗的肾动脉、左心室和大脑皮层中的组织多巴胺/去 甲肾上腺素比率的作用。图6显示了内匹司他对比格狗的去甲肾上腺素(a)的血浆浓度、多巴胺(b)血浆 浓度的以及多巴胺/去甲肾上腺素比率(c)的作用。图7显示了内匹司他以及(R) -5-氨基甲基-1- (5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐以30mg. kg—1 ；po对SHR的肠系膜动脉、左心 室和大脑皮层中的去甲肾上腺素含量、多巴胺含量和多巴胺/去甲肾上腺素比率的作用。图8显示了 l、2a(内匹司他)和2b ((R) _5_氨基甲基(5，7_ 二氟_1，2，3，4_四 氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐)的结构。图9显示了化学反应流程。图10显示了一个表，其描述了内匹司他对DBH和选择的一系列酶和受体的内匹司 他相互作用。图11显示了内匹司他对SHR㈧和正常比格狗⑶的组织DA/NE比率的作用。图12显示了长期施用内匹司他对正常比格狗中血浆DA/NE比率的作用。图13显示了 口服施用内匹司他对SHR的平均动脉压的作用。图14显示了从仰卧CHF患者的外周静脉采集的血浆样品中的去甲肾上腺素和多 巴胺的游离碱的浓度(pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用安慰剂达3个月获得的。图15显示了从仰卧CHF患者的外周静脉采集的血浆样品中的去甲肾上腺素和多 巴胺的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用20mg的内匹司他游离碱达3个月获得的。图16显示了从仰卧CHF患者的外周静脉采集的血浆样品中的去甲肾上腺素和多 巴胺的游离碱的浓度(pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用40mg的内匹司他游离碱达 3个月获得的。图17显示了从仰卧CHF患者的外周静脉采集的血浆样品中的去甲肾上腺素和多 巴胺的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用60mg的内匹司他游离碱达 3个月获得的。图18显示了从仰卧CHF患者的外周静脉采集的血浆样品中的去甲肾上腺素和多 巴胺的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用80mg的内匹司他游离碱达 3个月获得的。图19显示了从仰卧CHF患者的外周静脉采集的血浆样品中的去甲肾上腺素和多 巴胺的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用120mg的内匹司他游离碱 达3个月获得的。图20显示了从插入导管的CHF患者动脉性静脉和冠状窦采集的血浆样品中的去 甲肾上腺素的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用安慰剂达3个月获 得的。图21显示了从插入导管的CHF患者动脉性静脉和冠状窦采集的血浆样品中的多 巴胺的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用安慰剂达3个月获得的。图22显示了从插入导管的CHF患者动脉性静脉和冠状窦采集的血浆样品中的去 甲肾上腺素的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用20mg的内匹司他游 离碱达3个月获得的。图23显示了从插入导管的CHF患者动脉性静脉和冠状窦采集的血浆样品中的多 巴胺的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用20mg的内匹司他游离碱达 3个月获得的。图24显示了从插入导管的CHF患者动脉性静脉和冠状窦采集的血浆样品中的去 甲肾上腺素的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用40mg的内匹司他游 离碱达3个月获得的。图25显示了从插入导管的CHF患者动脉性静脉和冠状窦采集的血浆样品中的多 巴胺的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用40mg的内匹司他游离碱达 3个月获得的。图26显示了从插入导管的CHF患者动脉性静脉和冠状窦采集的血浆样品中的去 甲肾上腺素的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用60mg的内匹司他游 离碱达3个月获得的。图27显示了从插入导管的CHF患者动脉性静脉和冠状窦采集的血浆样品中的多 巴胺的游离碱的浓度(Pg/ml)，该浓度是在该患者每天口服施用60mg的内匹司他游离碱达 3个月获得的。图28说明了应当从进一步的统计分析以及此作用的原因中扣除的数据。图29显示了大鼠内匹司他的药物代谢动力学参数。图30显示了在单次10mg/kg内匹司他口服剂量后雄性大鼠血浆内匹司他的浓度。
图31显示了在单次30mg/kg内匹司他口服剂量后雄性大鼠血浆内匹司他的浓度。图32显示了在单次100mg/kg内匹司他口服剂量后雄性大鼠血浆内匹司他的浓度。图33显示了在单次10、30或100mg/kg内匹司他口服剂量后大鼠血浆内匹司他的 平均浓度。数值是每个时间点三只大鼠的平均值。图34显示了剂量与血浆中内匹司他的AUC值之间的线性关系。图35显示了在单次30mg/kg内匹司他口服剂量后雌性大鼠血浆内匹司他的浓度。图36显示了在单次10mg/kg内匹司他口服剂量后雄性大鼠血浆和脑中内匹司他 的平均浓度。图37显示了在单次10mg/kg内匹司他口服剂量后雄性大鼠脑中内匹司他的浓度。图38显示了肠系膜动脉中的去甲肾上腺素浓度。图39显示了肠系膜动脉中的多巴胺浓度。图40显示了肠系膜动脉中的多巴胺/去甲肾上腺素浓度。图41显示了大鼠左心室中的去甲肾上腺素水平。图42显示了大鼠左心室中的多巴胺水平。图43显示了大鼠左心室中的多巴胺/去甲肾上腺素水平。图44显示了以剂量函数绘图的SHR的大脑皮层中的多巴胺浓度(μ g/g湿重)。 隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图45显示了以剂量函数绘图的SHR的大脑皮层中的去甲肾上腺素浓度(μ g/g湿 重)。隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图46显示了以剂量函数绘图的SHR的大脑皮层中的多巴胺/去甲肾上腺素浓度 (yg/yg湿重)。隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图47显示了以剂量函数绘图的SHR的左心室中的多巴胺浓度(μ g/g湿重)。隔 离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图48显示了显示了以剂量函数绘图的SHR的左心室中的去甲肾上腺素浓度(μ g/ g湿重)。隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图49显示了以剂量函数绘图的SHR的左心室中的多巴胺/去甲肾上腺素浓度 (yg/yg湿重)。隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图50显示了以剂量函数绘图的SHR的肠系膜动脉中的多巴胺浓度(μ g/g湿重)。 隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图51显示了以剂量函数绘图的SHR的肠系膜动脉中的去甲肾上腺素浓度(μ g/g 湿重)。隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图52显示了以剂量函数绘图的SHR的肠系膜动脉中的多巴胺/去甲肾上腺素浓 度(yg/yg湿重)。隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η =9)图53显示了施用内匹司他、(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐、或dH20载剂、或SKF102698或PEG400 dH20(l 1)载剂之后SHR的大脑皮层中的多巴胺浓度(μ g/g湿重)。隔离12小 时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图54显示了施用内匹司他、(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐、或dH20载剂、或SKF102698或PEG 400 dH20(l 1)载剂之后SHR的大脑皮层中的去甲肾上腺素(yg/g湿重)。隔离12 小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图55显示了施用内匹司他、(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐、或dH20载剂、或SKF102698或PEG 400 dH20(l 1)载剂之后SHR的大脑皮层中的多巴胺/去甲肾上腺素浓度(yg/yg湿 重)。隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)。图56显示了施用内匹司他、(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐、或dH20载剂、或SKF102698或PEG 400 dH20(l 1)载剂SHR的左心室中的多巴胺浓度(μ g/g湿重)。隔离12小时三次 口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图57显示了施用内匹司他、(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐、或dH20载剂、或SKF102698或PEG 400 dH20(l 1)载剂之后SHR的左心室中的去甲肾上腺素浓度(μ g/g湿重)。隔离12 小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)图58显示了施用内匹司他、(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐、或dH20载剂、或SKF102698或PEG 400 dH20(l 1)载剂之后SHR的左心室中的多巴胺/去甲肾上腺素浓度(μ g/yg湿 重)。隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)。图59显示了施用内匹司他、(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐、或dH20载剂、或SKF102698或PEG 400 dH20(l 1)载剂之后SHR的肠系膜动脉中的多巴胺浓度(μ g/g湿重)。隔离12 小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)。图60显示了施用内匹司他、(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐、或dH20载剂、或SKF102698或PEG 400 dH20(l 1)载剂SHR的肠系膜动脉中的去甲肾上腺素浓度(μ g/g湿重)。隔离12 小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)。图61显示了施用内匹司他、(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐、或dH20载剂、或SKF102698或PEG 400 dH20(l 1)载剂之后SHR的肠系膜动脉中的多巴胺/去甲肾上腺素浓度(μ g/μ g 湿重)。隔离12小时三次口服剂量施用的第三次之后的6小时采集组织。(η = 9)。图62显示了皮层、纹状体和肠系膜动脉中的儿茶酚胺水平。图63显示了血清中的三碘甲腺原氨酸水平。图64显示了血清中的甲状腺素水平。图65显示了狗肾髓质中多巴胺和去甲肾上腺素的浓度对内匹司他的应答。图66显示了狗肾皮质中多巴胺和去甲肾上腺素的浓度对内匹司他的应答。
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图67显示了安慰剂或内匹司他对正常比格狗中血浆DA水平(pg/ml)的作用。图68显示了安慰剂或内匹司他对正常比格狗中血浆NE水平(pg/ml)的作用。图69显示了安慰剂或内匹司他对正常比格狗中血浆DA/NE比率的作用。图70显示了安慰剂或内匹司他对正常比格狗中血浆EPI水平(pg/ml)的作用。图71显示了长期施用(14. 5天)内匹司他对正常比格狗中NE、DA和EPI的血浆 水平的作用。N = 8只/组。*< 0.05，与安慰剂比较。图72显示了给比格狗口服施用RS 25560-197 (2mg/kg ；bid)达14. 5天后收集的 血浆样品中的内匹司他的游离碱和RS 47831的有效浓度(ng/ml)。图73显示了狗的肾动脉中的多巴胺水平。图74显示了狗的肾动脉中的去甲肾上腺素水平。给狗口服施用0、5、15或30mg/ kg胶囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p < 0.01，与安慰剂比较 (均值士 SD)。图75显示了狗的肾动脉中的多巴胺水平。给狗口服施用0、5、15或30mg/kg胶 囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p< 0.01，与安慰剂比较(均值 士 SD)。图76显示了狗的大脑皮层中的多巴胺水平。给狗口服施用0、5、15或30mg/kg胶 囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p<0. 01 ；M 0. 05 < ρ < 0. 10， 与安慰剂比较(均值士 SD)。图77显示了狗的大脑皮层中的去甲肾上腺素水平。给狗口服施用0、5、15或30mg/ kg胶囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p < 0.01，与安慰剂比较 (均值士 SD)。 图78显示了狗的大脑皮层中的多巴胺/去甲肾上腺素比率水平。给狗口服施用 0、5、15或30mg/kg胶囊b. i. d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p < 0. 01， 与安慰剂比较(均值士 SD)。图79显示了狗的左心室中的多巴胺水平。给狗口服施用0、5、15或30mg/kg胶 囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p< 0.01，与安慰剂比较(均值 士 SD)。图80显示了狗的左心室中的去甲肾上腺素水平。给狗口服施用0、5、15或30mg/ kg胶囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p < 0.01，与安慰剂比较 (均值士 SD)。图81显示了狗的左心室中的多巴胺/去甲肾上腺素水平。给狗口服施用0、5、15 或30mg/kg胶囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p < 0. 01，与安慰 剂比较(均值士 SD)。图82显示了狗的肾皮质中的多巴胺水平。给狗口服施用0、5、15或30mg/kg胶 囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p< 0.01，与安慰剂比较(均值 士 SD)。图83显示了狗的肾皮质中的去甲肾上腺素水平。给狗口服施用0、5、15或30mg/ kg胶囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p < 0.01，与安慰剂比较 (均值士 SD)。
图84显示了狗的肾皮质中的多巴胺/去甲肾上腺素水平。给狗口服施用0、5、15 或30mg/kg胶囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p < 0. 01，与安慰 剂比较(均值士 SD)。图85显示了狗的肾髓质中的多巴胺水平。给狗口服施用0、5、15或30mg/kg胶囊 b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p<0. 01 ；Μ,Ο. 05 < ρ < 0. 10，与 安慰剂比较(均值士 SD)。图86显示了狗的肾髓质中的去甲肾上腺素水平。给狗口服施用0、5、15或30mg/ kg胶囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p < 0.01 ；Μ,Ο. 05 < ρ < 0. 10，与安慰剂比较(均值士 SD)。图87显示了狗的肾髓质中的多巴胺/去甲肾上腺素水平。给狗口服施用0、5、15 或30mg/kg胶囊b. i.d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8，*p < 0. 01，与安慰 剂比较(均值士 SD)。图88显示了内匹司他的组织浓度。给狗口服施用0、5、15或30mg/kg胶囊 b. i. d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8 (仅为均值)。图89显示了内匹司他第5天的血浆浓度。给狗口服施用0、5、15或30mg/kg胶囊 b. i. d.达4. 5天，最后施药后6小时采集组织。N = 8 (仅为均值)。图90显示了内匹司他第4天O-Shr血浆浓度的曲线下面积(AUC)。给狗口服施用 0、5、15 或 30mg/kg 胶囊 b. i.d.。N = 8(仅为均值)。图91显示了 β -肾上腺素能受体结合数据。图92显示了内匹司他对酶活性的抑制％的作用。图93显示了牛DBH的活性，以抑制百分数表示，以抑制剂浓度的对数的函数绘图。图94显示了人DBH的活性，以抑制百分数表示，以抑制剂浓度的对数的函数绘图。图95显示了三种DBH抑制剂对牛和人DBH活性的IC50 (均值士 SE)。图96显示了抑制数据对牛DBH的Lineweaver-Burk图(A)，以及表观KM对抑制剂 浓度的图(B)0图97显示了结合分析法中测定内匹司他亲和力的研究概要。图98显示了内匹司他的受体概况。图99显示了直肠温度概要(摄氏度)。图100显示了临床观察和行为学试验的概要，针对载剂治疗的动物。图101显示了临床观察和行为学试验的概要，针对30mg/kg内匹司他治疗的动物。图102显示了临床观察和行为学试验的概要，针对100mg/kg内匹司他治疗的动 物。图103显示了临床观察和行为学试验的概要，针对300mg/kg内匹司他治疗的动 物。图104显示了内匹司他运动活动试验0. 5和1小时的水平活动。图105显示了内匹司他运动活动试验1. 5和2小时的水平活动。图106显示了内匹司他运动活动试验2. 5和3小时的水平活动。图107显示了内匹司他运动活动试验3. 5和4小时的水平活动。图108显示了内匹司他运动活动试验0. 5和1小时的运动数。
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图109显示了内匹司他运动活动试验1. 5和2小时的运动数。图110显示了内匹司他运动活动试验2. 5和3小时的运动数。图111显示了内匹司他运动活动试验3. 5和4小时的运动数。图112显示了内匹司他运动活动试验0. 5和1小时的休息时间(秒)。图113显示了内匹司他运动活动试验1. 5和2小时的休息时间(秒)。图114显示了内匹司他运动活动试验2. 5和3小时的休息时间(秒)。图115显示了内匹司他运动活动试验3. 5和4小时的休息时间(秒)。图116显示了 DBHI运动活动试验水平活动。图117显示了 DBHI运动活动试验运动数。图118显示了 DBHI运动活动试验休息时间(秒)。图119显示了对最大惊恐反应的概要统计和显著性评价。图120显示了对最大惊恐反应的概要统计和显著性评价。图121显示了对最大惊恐反应的概要统计和显著性评价。图122显示了对最大惊恐反应的概要统计和显著性评价。图123显示了内匹司他和H20与关于St Max的时间的比较。图124显示了内匹司他和H20与关于St Avg的时间的比较。图125显示了 PEG和SKF与关于St Max的时间的比较。图126显示了 PEG和SKF与关于St Avg的时间的比较。图127显示了可乐定和H20与关于St Max的时间的比较。图128显示了可乐定和H20与关于St Avg的时间的比较。图129显示了对每只大鼠的预治疗听觉惊恐反应性和开始日期。图130显示了对每只大鼠的预治疗听觉惊恐反应性和开始日期。图131显示了 DBHIs内匹司他和SKF 102698对身体中心温度作用的缺乏。图132显示了基线和第1天的平均身体中心温度(摄氏度)。图133显示了第5天和第1天的平均身体中心温度(摄氏度)。图134显示了 SKF 102698自发运动活动的作用。图135显示了 0-15和15-30分钟的自发运动活动。图136显示了 30-45和45-60分钟的自发运动活动。图137显示了内匹司他对自发运动活动的作用缺乏。图138显示了 DBHI化合物SKF 102698和内匹司他对预脉冲抑制的作用缺乏。图139显示了针对大鼠预脉冲抑制百分数的概要统计和全部配对治疗比较的P值。图140显示了在针对大鼠预脉冲抑制百分数的时间内的概要统计和配对治疗比 较的P-值(对于惊恐1-15)。图141显示了在针对大鼠预脉冲抑制百分数的时间内的概要统计和配对治疗比 较的P-值(对于惊恐31-45)。图142显示了由DBHI SKF-102698但不是由内匹司他产生的听觉惊恐反应性的降 低。图143显示了针对大鼠听觉惊恐反应性的概要统计和全部配对治疗比较的P-值。
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图144显示了在针对大鼠听觉惊恐反应性的时间内的概要统计和配对治疗比较 的P-值(对于惊恐1-15)。图145显示了在针对大鼠听觉惊恐反应性的时间内的概要统计和配对治疗比较 的P-值(对于惊恐31-45)。图146显示了 SKF 102698对体重变化的作用。图147显示了内匹司他对体重变化的作用缺乏。图148显示了猴子口服投药的结果。图149显示了猴子口服投药的结果。图150显示了用于这些研究中的临床等级评分表。图151总结了在A、B、C和D组中动物的损伤一览表。图152总结了在A、B、C和D组中动物的损伤一览表。图153显示了安慰剂治疗的IRAM(A)和CRS(B)。图 154 显示了 B 组的 IRAM(A)和 CRS(B)。图 155 显示了 C 组的 IRAM(A)和 CRS(B)。图 156 显示了 D 组的 IRAM(A)和 CRS(B)。图157显示了安慰剂治疗对内匹司他的三个浓度的比较。图158显示了安慰剂治疗对内匹司他的三个浓度的比较。图159显示了 A组的MPTP-损伤后(预治疗)CRS对左旋多巴和安慰剂治疗的比较。图160显示了对A组的弗里德曼(Friedman)试验和描述统计。图161显示了 A组的Durmett检验因果分析。图162显示了 B组的MPTP-损伤后(预治疗)CRS对左旋多巴和内匹司他治疗的 比较。图163显示了 B组的弗里德曼试验和描述统计。图164显示了 B组的Durmett检验因果分析。图165显示了 C组的MPTP-损伤后(预治疗)CRS对左旋多巴和内匹司他治疗的 比较。图166显示了 C组的弗里德曼试验和描述统计。图167显示了 C组的Dunnett检验因果分析。图168显示了 D组的MPTP-损伤后(预治疗)CRS对左旋多巴和内匹司他治疗的 比较。图169显示了 D组的弗里德曼试验和描述统计。图170显示了 D组的Dunnett检验因果分析。图171显示了各组的亲和力计数测定。图172针对各组的描述统计。图173显示了基础心率和平均动脉压。图174显示了内匹司他在用SCH-23390或载剂预治疗的清醒SHR中对心率的作用。图175显示了内匹司他对用SCH-23390或载剂预治疗的SHR的平均动脉压的作
12用。图176显示了四组大鼠在药物治疗开始前当天的平均血压。图177显示了四组大鼠在药物治疗开始前当天的心率。图178显示了四组大鼠在药物治疗开始前当天的运动活动(任意单位)。图179显示了药物治疗第1天的四组大鼠的平均血压。图180显示了药物治疗第2天的四组大鼠的平均血压。图181显示了药物治疗第3天的四组大鼠的平均血压。图182显示了药物治疗第7天的四组大鼠的平均血压。图183显示了药物治疗第2天的四组大鼠的心率。图184显示了药物治疗第3天的四组大鼠的运动活动(任意单位)。图185显示了在首先的6天治疗期间四组大鼠的体重变化。图186显示了每个时间点时平均血压的显著水平。图187显示了每个时间点时平均血压的显著水平。详细描述如本文使用的，下列单词和短语通常将具有下述含义，除非它们使用的上下文显 示有另外的范围。如本文使用的，“化合物A”包括内匹司他(((S)-5_氨基甲基-l-(5，7-二氟-1， 2,3,4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐))、((R) _5_氨基甲基(5， 7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐)及其混合物和其 药学可接受的盐。“药学可接受的盐”包括但不限于无机酸的盐，例如盐酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐 (diphosphate)、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐(sulf inate)、硝酸盐等盐；以及有机酸的盐， 例如苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、枸橼酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺 酸盐、对甲苯磺酸盐、2-羟乙基磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐以及烷酸盐例如乙酸 盐、H00C-(CH2)n-C00H其中η为0-4的盐等盐。此外，如果化合物是以酸加成盐获得的，则可通过将该酸盐的溶液碱化而获得游 离碱。相反，如果该产物为游离碱，则加成盐特别是药学可接受的加成盐可根据用于从碱化 合物制备酸加成盐的常规操作程序，通过将该游离碱溶解于适宜的有机溶剂中再用酸处理 该溶液来制备。本领域技术人员理解各种可用于制备非毒性药学可接受的加成盐的合成方 法。如本文使用的，术语“治疗”是指疾病或障碍的至少一种体征、症状或征候群有益 地改变的任何方式，以便预防或延缓发病、降低发病率或频率、降低严重度和强度、延缓进 程、防止复发、或者改善症状或者与该疾病或障碍相关的症状。例如，在创伤后应激障碍中， 治疗该障碍可以在某些实施方案中引起创伤后应激障碍的体征、症状和征候群中的至少一 种的频率和强度中的至少一种降低。如本文使用的，短语“诊断有创伤后应激障碍(PTSD) ”是指具有创伤后应激障碍的 体征、症状或征候群表征，创伤性事件引发的精神病障碍。此创伤性事件的非限制性实例包 括好斗、恐怖事件、身体攻击、性攻击、机动车事故和自然灾害。精神障碍的诊断和统计手册-IV-修订本(DSM-IV-TR)，一本罗列了精神障碍的分类和标准的精神卫生职业手册，将创伤后应激障碍分类为焦虑障碍。根据DSM-IV-TR，PTSD 诊断可以构成，如果1.患者经历、目睹或者面临一种或多种与现实的或威迫的死亡或者严重损伤有 关的事件，或者对自身或其它的身体完整性的恐吓，以及与强烈畏惧、无助或恐惧有关的响 应；2.创伤性事件的结果是，患者经历至少1种再经历/侵扰症状，3种回避/麻木症 状，和2种觉醒过度症状，并且该症状的持续时间达1个月以上；以及3.该症状在社会、职业或者其它发挥功能的其它重要领域引起临床显著的痛苦或 者损伤。在某些实施方案中，如果患者的障碍达到DSM-IV-TR标准，则该患者被诊断有创 伤后应激障碍。在某些实施方案中，如果患者具有创伤后应激障碍的体征、症状或征候群中 的至少一种，则该患者被诊断有创伤后应激障碍。在某些实施方案中，评分表被用于测定创 伤后应激障碍的体征、症状或征候群，并且根据使用此评分表测定结果诊断为创伤后应激 障碍。在某些实施方案中，根据评分表的“得分”被用于诊断或评价创伤后应激障碍的体征、 症状或征候群。在某些实施方案中，“得分”可以度量创伤后应激障碍的体征、症状或征候群 的频率、强度或严重度中的至少一种。如本文使用的，术语“评分表”是指一种测定患者创伤后应激障碍的体征、症状或 征候群中的至少一种的方法。在某些实施方案中，评分表可以是访谈表或问卷表。评分 表的非限制性实例是临床-用药PTSD评分表(CAPS)、临床-用药PTSD评分表第2部分 (CAPS-2)、儿童和青少年的临床-用药PTSD评分表(CAPS-CA)、事件评分表的影响(IES)、 事件评分表的影响-修订本(IES-R)、临床综合印象评分表(CGI)、疾病的临床综合印象严 重度(CGI-S)、临床综合印象改进(CGI-I)、PTSD评分表的Duke综合等级(DGRP)、PTSD评 分表的Duke综合等级改进(DGRP-I)、汉密尔顿焦虑评分表(HAM-A) ,PTSD的结构性访谈表 (SI-PTSD)、PTSD访谈表(PTSD-I)、PTSD症状评分表(PSS-I)、小型国际神经精神医学访谈 表(MINI)、Montgomery-人Sberg抑郁等级评分表(MADRS)、Beck抑郁清单(BDI)、汉密尔顿 抑郁评分表(HAM-D)、修订的汉密尔顿抑郁等级评分表(RHRSD)、成年人抑郁清单(MDI)、老 年人抑郁清单(⑶S-30)和儿童抑郁指数(⑶I)。如本文使用的，术语“体征”和“体征”是指障碍的客观发现。在某些实施方案中， 体征是障碍的生理现象或者反应。在某些实施方案中，体征可以是指心率和节律、体温、呼 吸的模式和频率、血压。在某些实施方案中，体征可能与症状有关。在某些实施方案中，体 征可能是症状的表征。如本文使用的，术语”症状”和“症状”是指表征障碍的主观指征。创伤后应激障 碍的症状可以是指例如但不限于复发性和侵入性创伤记忆、创伤性事件的复发性和痛苦梦 想、创伤性事件复发时的行为或情感、与创伤提醒物接触时的痛苦、与创伤提醒物接触时的 生理反应、回避与创伤有关的思考或情感的努力、回避活动或情境的努力、无能力回忆创伤 或创伤局面、显著减少对重大活动的兴趣、与其它人分离或疏远的情感、受限制的爱好范 围、前途渺茫的感觉、社交性焦虑、对生疏环境的焦虑、入睡或睡眠困难、易激惹或怒气爆 发、集中精力困难、警觉过度、以及夸张的惊恐反应。在某些实施方案中，潜在的危险刺激可 引起觉醒过度或焦虑。在某些实施方案中，该生理反应显示下列的至少一种呼吸异常、心
14率节律异常、血压异常、特殊感觉的功能异常、以及感觉器官的功能异常。在某些实施方案 中，可能发生受限制的影响范围，其特征为减少或限制范围或者情感强度或情感展示，并且 前途渺茫的感觉可能在人们对将会没有职业、婚姻、子女或正常寿命的思考中显现。在某些 实施方案中，儿童和青少年可能具有创伤后应激障碍的症状例如，例如且不限于，分裂或激 动行为、表达创伤局面的重复演示、缺乏认可内容的可怕梦想、以及特殊创伤的再展示。在 某些实施方案中，症状可以是与记忆恢复有关的应激。如本文使用的，术语“征候群”是指一组体征、症状，或者是指一组体征和症状，它 们因其相互关系或因其同时发生而成集合。例如，在某些实施方案中，创伤后应激障碍特征 为三种征候群再经历/侵扰、回避/麻木、和觉醒过度。如本文使用的，术语“再经历/侵扰”是指下列的至少一种复发性和侵入性创伤 记忆、创伤性事件的复发性和痛苦梦想、创伤性事件复发时的行为或情感、与创伤提醒物接 触时的痛苦、以及与创伤提醒物接触时的生理反应。在某些实施方案中，该生理反应显示下 列的至少一种呼吸异常、心率节律异常、血压异常、特殊感觉的功能异常、以及感觉器官的 功能异常。如本文使用的，术语“回避/麻木”是指下列的至少一种回避与创伤有关的思考 或情感的努力、回避活动或情境的努力、无能力回忆创伤或创伤局面、显著减少对重大活动 的兴趣、与其它人分离或疏远的情感、受限制的爱好范围、和前途渺茫的感觉。可能发生限 制范围的影响，其特征为减少或限制范围或者情感强度或情感展示。前途渺茫的感觉可能 在人们对将会没有职业、婚姻、子女或正常寿命的思考中显现。回避/麻木亦可能在社交性 焦虑和对生疏环境的焦虑中显示出来。如本文使用的，术语“觉醒过度”是指下列的至少一种入睡或睡眠困难、易激惹或 怒气爆发、集中精力困难、警觉过度、以及夸张的惊恐反应。潜在的危险刺激可引起觉醒过 度或焦虑。如本文使用的，术语“显著地”是指一组观察或发现，它们有太过接近的相互关系 而不会因偶然而发生。例如，在某些实施方案中，“显著改变”、“显著减少”和“显著增加”是 指不会因偶然而发生的变化或效果。在某些实施方案中，统计学方法可被用于确定一种观 察是否可以是指“显著地”改变、减少、增加或变化。诊断有创伤后应激障碍的患者可感受“受保护”、不自在、和强烈的焦虑。抑郁、 焦虑、恐慌发作和双相性精神障碍经常与创伤后应激障碍有关。酒精和药物滥用也是常见 的。在某些实施方案中，与创伤后应激障碍有关(cormorbid)的障碍可包括例如但不限于 抑郁、酒精滥用和药物滥用。如本文使用的，术语“临床-用药PTSD评分表(CAPS) ”是指一种针对创伤后应激综 合征的诊断和评价的度量。该CAPS是一种30个项目结构的访谈，其与针对PTSD的DSM-IV 标准相符。此种度量法的不同版本已被开发。如本文使用的，术语“临床-用药PTSD评分表-第1部分(CAPS-I) ”是CAPS的一 种版本，其评价当前的和一生的PTSD，并且亦被称为CAPS-DX (对于诊断)。如本文使用的，术语“临床-用药PTSD评分表-第2部分(CAPS-2) ”是指CAPS的 一种版本，其用于评价创伤后应激障碍患者一周的症状情况，并且亦被称为CAPS-SX(对于 症状)。
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如本文使用的，术语“儿童和青少年的临床-用药PTSD评分表(CAPS-CA) ”是指针 对儿童和青少年开发的一种CAPS的版本。如本文使用的，术语“事件评分表的影响(IES) ”是指由MardiHorowitz、Nancy Wilner和William Alvarez开发的一种评分表，以度量与特定事件有关的主观应激。它是 一种自我报道的评价法，并且可用于进行经时监测患者的状态。如本文使用的，术语“事件评分表的影响_修订本(IES-R) ”是指由Daniel S. Weiss和Charles Marmar开发的一种IES版本，以评价PTSD的觉醒过度征候群。如本文使用的，术语“临床综合印象评分表(CGI) ”是指一种用于进行精神病学评 价的评分表。患者被受访，并且CGI被用于度量疾病的严重度(CGI-S)、总体改善(CGI-I) 和效能指数。患者当前症状的评价。通常，其与范围为得分1(正常)至7(极坏)的7-点评分 表相关。将患者疾病的严重度与其它患者疾病的严重度比较。例如，该CGI-S得分可用于 测定用化合物A治疗之后患者的病情，并且可以比较该治疗前和治疗后的得分。如本文使用的，术语“临床综合印象改进(CGI-I) ”是指患者当前病情与其基础病 情的比较。通常，其与范围为1 (非常大的改善)至7 (非常大的恶化)的7-点评分表相关。 该CGI-I得分可用于测定例如在对化合物A治疗的应答中创伤后应激障碍的改善。如本文使用的，术语“效能指数”是指由CGI得到的得分，并且用当前治疗益处与 副作用严重度的比率比较患者基础病情。通常，其与范围为1(无)至4(优于治疗效果) 的4-点评分表相关。在评价创伤后应激障碍中，该效能指数可以，例如，评价用例如化合物 A的治疗法治疗的风险-利益。如本文使用的，术语“PTSD评分表的Duke综合等级(DGRP) ”是指一种评分表，其 测定针对三种PTSD征候群再经历/侵扰、回避/麻木、和觉醒过度以及全部PTSD严重度 的每一个的严重度和改善。如本文使用的，术语“PTSD评分表的Duke综合等级改进(DGRP-I) ”是指一种评分 表，其在例如针对创伤后应激障碍的化合物A的治疗的应答中用于区别应答者(1 (非常大 的改善)和2(很大的改善)的DGRP-I)和无应答者(DGRP-I > 2)。如本文使用的，术语“汉密尔顿焦虑评分表(HAM-A) ”是指一种由Max Hamilton于 1959年开发的评分表，其用于诊断和定量焦虑和创伤后应激障碍的症状。其由14个项目 组成，各自由一系列症状定义。针对确定项目得分开发了非标准化的调查问题以从患者或 行为特别指南引出信息。每个项目与范围为0(不存在)至4(严重)的5-点评分表相关。 这些项目包括评价焦虑心境、恐惧、智力效果、身体不适例如肌肉、心血管症状、紧张、失眠、 情感低落、身体感觉不适、呼吸症状、胃肠症状、自律症状、泌尿生殖器症状以及评价当时的 行为。例如，HAM-A得分的减少表明例如创伤后应激障碍的障碍的改善。如本文使用的，术语“PTSD的结构性访谈表(SI-PTSD)、PTSD访谈表(PTSD-I)、 PTSD症状评分表(PSS-I)、小型国际神经精神医学访谈表(MINI) ,Montgomery- Asberg抑 郁等级评分表(MADRS)、Beck抑郁清单(BDI)、汉密尔顿抑郁评分表(HAM-D)、修订的汉密尔 顿抑郁等级评分表(RHRSD)、成年人抑郁清单(MDI)、老年人抑郁清单(GDS-30)和儿童抑郁 指数(CDI) ”是指诊断、评价、测定创伤后应激障碍、焦虑或抑郁的体征、症状、征候群的另外 的评分表。
如本文使用的，术语“得分”是指测定精神病症状、焦虑或创伤后应激障碍的至少 一种体征、症状或征候群的得分中测定的至少一个项目或参数的得分。在某些实施方案中， 得分测定体征、症状、征候群、相关症状或者对创伤后应激障碍的日常生活的影响的频率、 强度或严重度。在某些实施方案中，评价创伤后应激障碍的“得分”可以例如通过针对创伤 后应激障碍的治疗来显著改变。如本文使用的，术语“终点得分”是指评价治疗期间或治疗后取得的创伤后应激障 碍的文书中的得分。如本文使用的，术语“基础得分”是指治疗开始之前评价创伤后应激障碍的文书中 的得分。如本文使用的，术语“全部得分”是指评价创伤后应激障碍的文书中的得分总和。 在某些实施方案中，全部得分是症状、征候群、相关症状、对日常生活的影响、效果和改善的 至少一种的得分总和。如本文使用的，术语“复发”是指患者疾病或障碍的至少一种症状的重新出现或者
T^ ο如本文使用的，短语“治疗有效量”是指足以提供关于疾病、障碍或病情的至少一 种体征、症状或相关症状的治疗结果的量。例如，该疾病、障碍或病情是PTSD。如本文使用的，短语“改善恢复力”是指增加患者经历创伤性事件而不蒙受创伤后 应激障碍痛苦或者有较少事件后症状或者破坏正常正常的日常生活活动的能力。在某些实 施方案中，改善恢复力可在某些实施方案中降低创伤后应激障碍的体征、症状或征候群的 至少一种。如本文使用的，术语“共同施用”是指针对第一药剂的给药方案，其与第二药剂的 给药方案重叠；或者是指同时施用第一药剂和第二药剂。给药方案是由给药量、频率和持续 时间来表征的。如果在第一药剂的第一次施用开始与第二次施用开始期间两个给药方案重 叠，则施用第二药剂。如本文使用的，术语“药剂”是指一种物质，其包括但不限于化合物例如小分子或 者复合有机化合物，蛋白质例如抗体或抗体片段或者包含抗体片段的蛋白质，或者遗传构 造生物体中的DNA或mRNA水平起效的遗传构造。如本文使用的，术语“多巴胺羟化酶活性”是指由多巴胺β羟化酶介导的多 巴胺到去甲肾上腺素的转化。多巴胺羟化酶的活性可通过测定多巴胺或去甲肾上腺素 水平来评价。如本文使用的，术语“调节”是指改变或变更活性、功能或性能。例如，一种药剂可 以通过使因子水平升高或降低而调节因子的水平。如本文使用的，术语儿茶酚胺是指一种化合物，其含有与儿茶酚部分连接的胺基 团，并且其可用作激素或神经递质。示例而非限制性的，多巴胺和去甲肾上腺素是儿茶酚 胺。本文提供了治疗诊断有创伤后应激障碍的患者的方法。该方法包括给患者施用治 疗有效量的化合物Α。在某些实施方案中，该方法进一步包括共同施用治疗有效量的至少一种其它药 剂，该其它药剂选自苯并二氮$类、选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)、血清素-去甲肾上腺素再吸收抑制剂(SNRI)、去甲肾上腺素再吸收抑制剂(NRI)、血清素5-羟色胺1A(5HT1A) 拮抗剂、多巴胺羟化酶抑制剂、腺苷A2A受体拮抗剂、单胺氧化酶抑制剂(ΜΑ0Ι)、钠 (Na)通道阻滞剂、钙通道阻滞剂、中枢和外周α肾上腺素受体拮抗剂、中枢α肾上腺素激 动剂、中枢或外周β肾上腺素受体拮抗剂、NK-I受体拮抗剂、促肾上腺皮质激素释放因子 (CRF)拮抗剂、非典型性抗抑郁药/抗精神病药、三环类、抗惊厥剂、谷氨酸拮抗剂、Y-氨基 丁酸(GABA)激动剂和部分D2激动剂。 在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是SSRI，其选自帕罗西汀、舍曲林、西酞 普兰、依他普仑和氟西汀。 在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是SNRI，其选自度洛西汀、米氮平和文拉法辛。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是NRI，其选自丁氨苯丙酮和阿托西汀。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是双硫仑。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是腺苷Α2Α受体拮抗剂伊曲茶碱 (istradefylline)。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是钠通道阻滞剂，其选自拉莫三嗪、卡马 西平、奥卡西平和丙戊酸盐。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是钙通道阻滞剂，其选自拉莫三嗪和卡 马西平。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是中枢和外周α肾上腺素受体拮抗剂 哌唑嗪。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是中枢α肾上腺素激动剂可乐定。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是中枢或外周β肾上腺素受体拮抗剂 普萘洛尔。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是非典型抗抑郁药/抗精神病药，其选 自奥氮平(olanz印ine)、利培酮和喹硫平。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是三环类，其选自阿米替林、阿莫沙平、 地昔帕明、多塞平、丙米嗪、去甲替林、普罗瑞林和曲米帕明。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是抗惊厥剂，其选自拉莫三嗪、卡马西 平、奥卡西平、丙戊酸盐、托吡酯和左乙拉西坦。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是谷氨酸盐拮抗剂托吡酯。在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是GABA激动剂，其选自丙戊酸盐和托吡在某些实施方案中，该至少一种其它药剂是部分D2激动剂阿立哌唑。在某些实施方案中，该患者具有至少一种儿茶酚胺的异常脑水平。在某些实施方案中，该化合物A降低患者脑中多巴胺β羟化酶活性。在某些实施方案中，该化合物A调节患者至少一种儿茶酚胺的脑水平。在某些实施方案中，该至少一种儿茶酚胺是去甲肾上腺素，并且该化合物A降低 患者去甲肾上腺素脑水平。在某些实施方案中，该至少一种儿茶酚胺是多巴胺，并且该化合物A升高患者多
18巴胺脑水平。在某些实施方案中，该化合物A降低患者与记忆恢复有关的应激。在某些实施方案中，该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种体征的频率 和强度中的至少一种。在某些实施方案中，该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种症状的频率 和强度中的至少一种。在某些实施方案中，该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种征候群的频 率和强度中的至少一种，其中该征候群选自再经历/侵扰、回避/麻木、和觉醒过度。在某些实施方案中，该再经历/侵扰包括下列的至少一种复发性和侵入性创伤 记忆、创伤性事件的复发性和痛苦梦想、创伤性事件复发时的行为或情感、与创伤提醒物接 触时的痛苦、以及与创伤提醒物接触时的生理反应。在某些实施方案中，该生理反应包括下列的至少一种呼吸异常、心率节律异常、 血压异常、至少一种特殊感觉的功能异常、以及至少一种感觉器官的功能异常。在某些实施方案中，该至少一种特殊感觉选自视觉、听觉、触觉、嗅觉、味觉和感觉。在某些实施方案中，该至少一种感觉器官选自眼、耳、皮肤、鼻、舌和咽。在某些实施方案中，该回避/麻木包括下列的至少一种回避与创伤有关的思考 或情感的努力、回避活动或情境的努力、无能力回忆创伤或创伤局面、显著减少对重大活动 的兴趣、与其它人分离或疏远的情感、受限制的爱好范围、前途渺茫的感觉、社交性焦虑、以 及与生疏环境有关的焦虑。在某些实施方案中，该觉醒过度包括下列的至少一种入睡或睡眠困难、易激惹或 怒气爆发、集中精力困难、警觉过度、夸张的惊恐反应、以及来自潜在的危险刺激的焦虑。在某些实施方案中，该化合物A不会降低患者对潜在的危险刺激适当和迅速应答 的身体能力。在某些实施方案中，该化合物A通过降低与记忆恢复有关的应激降低保持睡眠的 困难。在某些实施方案中，该患者是儿童或青少年。在某些实施方案中，该化合物A降低患者创伤后应激障碍的至少一种体征或症状 的频率和强度中的至少一种，其中该体征或症状选自分裂或激动行为、表达创伤局面的重 复演示、缺乏认可内容的可怕梦想、以及特殊创伤的再展示。在某些实施方案中，该化合物A降低患者与选自药物滥用、酒精滥用和抑郁的创 伤后应激障碍同时发生的至少一种障碍的发生率。在某些实施方案中，该化合物A被一天一次或两次施用于患者。在某些实施方案中，该化合物A不会引起下列的至少一种困倦、疲倦、或者精神 和身体能力的改变。在某些实施方案中，该化合物A在创伤性事件之前或者创伤性事件之后立即被施 用于患者。在某些实施方案中，创伤后应激综合征的至少一种体征、症状或征候群用下列的 至少一种来诊断或评价临床-用药PTSD评分表(CAPS)、临床-用药PTSD评分表第2部分(CAPS-2)、儿童和青少年的临床-用药PTSD评分表(CAPS-CA)、事件评分表的影响(IES)、 事件评分表的影响-修订本(IES-R)、临床综合印象评分表(CGI)、疾病的临床综合印象严 重度(CGI-S)、临床综合印象改进(CGI-I)、PTSD评分表的Duke综合等级(DGRP)、PTSD评 分表的Duke综合等级改进(DGRP-I)、汉密尔顿焦虑评分表(HAM-A) ,PTSD的结构性访谈表 (SI-PTSD)、PTSD访谈表(PTSD-I)、PTSD症状评分表(PSS-I)、小型国际神经精神医学访谈 表(MINI) ,Montgomery-人Sberg抑郁等级评分表(MADRS)、Beck抑郁清单(BDI)、汉密尔顿 抑郁评分表(HAM-D)、修订的汉密尔顿抑郁等级评分表(RHRSD)、成年人抑郁清单(MDI)、老 年人抑郁清单(⑶S-30)和儿童抑郁指数(⑶I)。在某些实施方案中，该化合物A显著改变下列至少一种的得分CAPS、CAPS-2、 CAPS-CA, IES、IES-R、CGI、CGI-S、CGI-I、DGRP, DGRP-I, HAM-A、SI-PTSD, PTSD-I, PSS-I, MADRS、BDI、HAM-D、RHRSD、MDI、⑶S-30 和 CDI。在某些实施方案中，该化合物A与基础得分比较显著降低了下列至少一种的终点 得分CAPS、CAPS-2、IES、IES-R 禾口 HAMA。在某些实施方案中，该化合物A显著增加了对CGI-I响应的比率，该CGI-I具有 CGI-I得分为1(非常大的改善)和2(很大的改善)中的至少一个。在某些实施方案中，该化合物A增加在具有1 (非常大的改善)或2 (很大的改善) 的至少一个的DGRP-I得分的DGRP-I中应答者的比率。在某些实施方案中，CAPS和CAP-2的至少一种的至少65的全部得分是创伤后应 激障碍的表征。在某些实施方案中，HAM-A的至少18的全部得分是焦虑障碍的表征。在某些实施方案中，CGI-I和DGRP-I的至少一种的至少3的得分是创伤后应激障 碍的表征。还提供了治疗患者创伤后应激障碍的方法。该方法包括对有创伤后应激障碍的患 者进行诊断；给患者施用治疗有效量的化合物A ；对创伤后应激障碍的体征、症状和征候群 中的至少一种进行评价；以及如果化合物A降低了创伤后应激障碍的体征、症状和征候群 中的至少一种则确定该创伤后应激综合征被改善。在某些实施方案中，该方法包括共同施用治疗有效量的至少一种其它药剂，该其 它药剂选自苯并二氮革类、选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)、血清素-去甲肾上腺素再 吸收抑制剂(SNRI)、去甲肾上腺素再吸收抑制剂(NRI)、血清素5-羟色胺1A(5HT1A)拮抗 剂、多巴胺羟化酶抑制剂、腺苷A2A受体拮抗剂、单胺氧化酶抑制剂(ΜΑ0Ι)、钠(Na)通 道阻滞剂、钙通道阻滞剂、中枢和外周α肾上腺素受体拮抗剂、中枢α肾上腺素激动剂、 中枢或外周β肾上腺素受体拮抗剂、NK-I受体拮抗剂、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF) 拮抗剂、非典型性抗抑郁药/抗精神病药、三环类、抗惊厥剂、谷氨酸拮抗剂、Y “氨基丁酸 (GABA)激动剂和部分D2激动剂。在某些实施方案中，该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种体征的频率 和强度中的至少一种。在某些实施方案中，该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种症状的频率 和强度中的至少一种。在某些实施方案中，该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种征候群的频率和强度中的至少一种，其中该征候群选自再经历/侵扰、回避/麻木、和觉醒过度。在某些实施方案中，创伤后应激综合征的至少一种体征、症状或征候群用下列的 至少一种来诊断或评价临床-用药PTSD评分表(CAPS)、临床-用药PTSD评分表第2部分 (CAPS-2)、儿童和青少年的临床-用药PTSD评分表(CAPS-CA)、事件评分表的影响(IES)、 事件评分表的影响-修订本(IES-R)、临床综合印象评分表(CGI)、疾病的临床综合印象严 重度(CGI-S)、临床综合印象改进(CGI-I)、PTSD评分表的Duke综合等级(DGRP)、PTSD评 分表的Duke综合等级改进(DGRP-I)、汉密尔顿焦虑评分表(HAM-A) ,PTSD的结构性访谈表 (SI-PTSD)、PTSD访谈表(PTSD-I)、PTSD症状评分表(PSS-I)、小型国际神经精神医学访谈 表(MINI) ,Montgomery-人Sberg抑郁等级评分表(MADRS)、Beck抑郁清单(BDI)、汉密尔顿 抑郁评分表(HAM-D)、修订的汉密尔顿抑郁等级评分表(RHRSD)、成年人抑郁清单(MDI)、老 年人抑郁清单(⑶S-30)和儿童抑郁指数(⑶I)。还提供了改善患者恢复力的方法。该方法包括施用治疗有效量的化合物A。在某些实施方案中，该方法包括共同施用治疗有效量的至少一种其它药剂，该其 它药剂选自苯并二氮革类、选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)、血清素-去甲肾上腺素再 吸收抑制剂(SNRI)、去甲肾上腺素再吸收抑制剂(NRI)、血清素5-羟色胺1Α(5ΗΤ1Α)拮抗 剂、多巴胺羟化酶抑制剂、腺苷Α2Α受体拮抗剂、单胺氧化酶抑制剂(ΜΑ0Ι)、钠(Na)通 道阻滞剂、钙通道阻滞剂、中枢和外周α肾上腺素受体拮抗剂、中枢α肾上腺素激动剂、 中枢或外周β肾上腺素受体拮抗剂、NK-I受体拮抗剂、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF) 拮抗剂、非典型性抗抑郁药/抗精神病药、三环类、抗惊厥剂、谷氨酸拮抗剂、Y “氨基丁酸 (GABA)激动剂和部分D2激动剂。在某些实施方案中，该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种体征的频率 和强度中的至少一种。在某些实施方案中，该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种症状的频率 和强度中的至少一种。在某些实施方案中，该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种征候群的频 率和强度中的至少一种，其中该征候群选自再经历/侵扰、回避/麻木、和觉醒过度。在某些实施方案中，创伤后应激综合征的至少一种体征、症状或征候群用下列的 至少一种来诊断或评价临床-用药PTSD评分表(CAPS)、临床-用药PTSD评分表第2部分 (CAPS-2)、儿童和青少年的临床-用药PTSD评分表(CAPS-CA)、事件评分表的影响(IES)、 事件评分表的影响-修订本(IES-R)、临床综合印象评分表(CGI)、疾病的临床综合印象严 重度(CGI-S)、临床综合印象改进(CGI-I)、PTSD评分表的Duke综合等级(DGRP)、PTSD评 分表的Duke综合等级改进(DGRP-I)、汉密尔顿焦虑评分表(HAM-A) ,PTSD的结构性访谈表 (SI-PTSD)、PTSD访谈表(PTSD-I)、PTSD症状评分表(PSS-I)、小型国际神经精神医学访谈 表(MINI) ,Montgomery-人Sberg抑郁等级评分表(MADRS)、Beck抑郁清单(BDI)、汉密尔顿 抑郁评分表(HAM-D)、修订的汉密尔顿抑郁等级评分表(RHRSD)、成年人抑郁清单(MDI)、老 年人抑郁清单(⑶S-30)和儿童抑郁指数(⑶I)。还提供了诊断患者创伤后应激障碍的方法。该方法包括给患者施用治疗有效量的 化合物A和评价创伤后应激障碍的体征、症状或征候群中的至少一种；以及如果化合物A降低了创伤后应激障碍的体征、症状和征候群中的至少一种则诊断患者创伤后应激障碍。在某些实施方案中，该患者是儿童、青少年或成人。多种评分表可以评价创伤后应激障碍(PTSD)以及卢非酰胺(rufinamde)和其它 治疗法对该障碍的治疗和预防的作用。它们是，例如但不限于，临床-用药PTSD评分表 (CAPS)、临床-用药PTSD评分表第2部分(CAPS-2)、儿童和青少年的临床-用药PTSD评分 表(CAPS-CA)、事件评分表的影响(IES)、事件评分表的影响-修订本(IES-R)、临床综合印 象评分表(CGI)、疾病的临床综合印象严重度(CGI-S)、临床综合印象改进(CGI-I)、PTSD评 分表的Duke综合等级(DGRP) ,PTSD评分表的Duke综合等级改进(DGRP-I)、汉密尔顿焦虑 评分表(HAM-A)、PTSD的结构性访谈表(SI-PTSD)、PTSD访谈表(PTSD-I)、PTSD症状评分 表(PSS-I)、小型国际神经精神医学访谈表(MINI)、Montgomery-人Sberg抑郁等级评分表 (MADRS) ,Beck抑郁清单(BDI)、汉密尔顿抑郁评分表(HAM-D)、修订的汉密尔顿抑郁等级评 分表(RHRSD)、成年人抑郁清单(MDI)、老年人抑郁清单(⑶S-30)和儿童抑郁指数(⑶I)。 这些方法通常通过访谈表或问卷表来评价的。在某些实施方案中，并非使用评分表的所有 部分。在某些实施方案中，该评分表被用于诊断和评价体征、症状、相关症状、或对PTSD的 日常生活的影响。在某些实施方案中，一个或多个评分表被用于诊断、评价或确认患者的创 伤后应激障碍。在某些实施方案中，评分表将通过对体征、症状或征候群的频率和强度中的 至少一种进行打分来测定体征、症状、征候群。用于创伤后应激障碍评价的评分表的实例是各种版本的CAPS，包括CAPS、CAPS-I 和CAPS-2，其得分为17种下列项目的核心PTSD症状1.复发性和侵入性创伤记忆2.与创伤提醒物接触时的痛苦3.事件复发时的行为或情感4.事件的复发性和痛苦梦想5.避免思考或情感的努力6.避免活动或情境的努力7.无能力回忆创伤或创伤局面8.显著减少对重大活动的兴趣9.与其它人分离或疏远的情感10.受限制的爱好范围11.前途渺茫的感觉12.入睡或睡眠困难13.易激惹或怒气爆发14.集中精力困难15.警觉过度16.夸张的惊恐反应17.生理反应性问题还针对于症状对社会和职业功能或者日常生活的影响、自从以前施用CAPS 以来症状的改善、全部应答有效性、全部PTSD严重性、以及相关症状的频率和强度。这些项 目是
18.对社会功能的影响19.对职业功能的影响20.总体改善(从早期测定时期以后)21.等级有效性22.总体改善23.因忠实或疏忽产生的内疚24.幸存者内疚25.杀人倾向(Homicidality)26.权威的幻灭27.绝望的感觉28.记忆缺陷29.悲伤和抑郁30.挫败的感觉为了评价症状的频率，交谈者遵循标准问题，必要时澄清或重述。示例而非限制 性的标准问题是你曾经有创伤性事件的不希望的回忆吗？它们例如是什么？你记起了什 么？如果问题需要重述，则该交谈者可以问例如以下的问题它们曾是在你觉醒或者仅是 在睡梦中时发生吗？或者在过去的一个月(周)你多久会有一次这些记忆？得分0表示频 率为从无，1表示1或2次，2表示一周1或2次，3表示一周若干次，4表示几乎每天都有。为了评价症状的强度，交谈者可以提出下列示例而非限制性的标准问题这些记 忆引起你多大的痛苦或不适？你是否能够将它们置于你的精神之外或者思考一些其它问 题？你尝试过多大努力？它们多大程度干扰你的生活？得分0表示为无，1表示轻的、最小 的痛苦或者活动中断，2表示中度的、痛苦清楚地存在但仍然能够控制的，一些活动中断，3 表示严重的、相当大的痛苦，难以消除记忆，活动明显中断，4表示极度的、使人无能力的痛 苦，不能消除记忆，不能连续活动。在某些实施方案中，如果具有至少1的频率以及至少2的强度时根据存在的症状 使用的该评分规则计数。在某些实施方案中，严重度得分是通过对每种症状总计频率和强 度等级来计算。在某些实施方案中，根据CAPS版本计算所有项目的总体或全部得分。在某些实施 方案中，针对每一征候群计算总得分。在某些实施方案中，针对PTSD的核心症状计算总得 分。在某些实施方案中，将终点得分与基础得分进行比较以确定创伤后应激障碍的严重度 的变化。在某些实施方案中，终点得分与基础得分比较显著降低被认为是PTSD的改善。在 某些实施方案中，CAPS、CAPS-1、CAPS-2或CAPS-CA的全部得分大于65是PTSD的表征。另一实例是IES，其评价15个项目7个项目测定干扰症状，8个项目测定回避症 状。自我评价的项目提问下列注释的每一个正确的频率有多少当我不想要时我考虑它，当 我考虑它或者想起它时我避免使我自己不安，我试图从记忆中除去它，由于有关进入我心 中的图像或者思想使我难以入睡或者保持睡眠，我有有关它的强烈情感的波动，我已梦到 了它，我远离它的提醒物，它觉得它未发生或者不是真的，我试图不谈起它，关于它的图像 进入我的脑海中，其它事情使我想起它，我注意到我仍然有许多关于它的情感但我不处理 它们，我试图不想它，任何提醒物使得回忆起它们的情感，以及我的情感有些麻本木。这些
23项目通常与四点评分表有关0 ( 一点也不)、1 (很少)、3 (有时)和5 (经常)。得分总数提 供了症状严重度或者全部主观应激的全面评价。已经提议，从0至8的得分处于亚临床的 范围，9-25为轻度的范围，26-43为中等范围，以及大于44为应激的严重范围。在某些实施方案中，计算IES中的全部项目的总体或全部得分。在某些实施方案 中，对于每一征候群计算总得分。在某些实施方案中，将终点得分与基础得分进行比较以确 定PTSD严重度的改变。在某些实施方案中，与基础得分比较终点得分减少30%被认为PTSD 改善。IES-R，IES的一种版本，通过分解原始IES项目来改变IES，我难以入睡或者保持 睡眠分解成以下两项我难以入睡以及我难以保持睡眠，并添加6个项目到该IES项目中。 这些添加的项目是我感到易怒和生气，我神经质并且容易震惊，我发现我自己的行为或 情感虽然那时我恢复了，我集中精力困难，它的提醒物使得我有身体反应例如出汗、呼吸困 难、恶心或心跳加剧，以及我感到警醒或者警戒。该评分系统亦变为0 ( —点也不)、1 (有一 些)、2(适度的)、3(完全有一点)和4(极度地)。在某些实施方案中，计算IES-R中的全部项目的总体或全部得分。在某些实施方 案中，对于每一征候群计算总得分。在某些实施方案中，将终点得分与基础得分进行比较以 确定创伤后应激障碍严重度的改变。在某些实施方案中，在IES-R中与基础得分比较终点 得分显著减少被认为是创伤后应激障碍的改善。在DGRP-I评分表中，化合物A在治疗创伤后应激障碍中的效果可通过测定在具有 1(非常大的改善)或2(很大的改善)的DGRP-I的DGRP-I中应答者的比率增加来评价。 在某些实施方案中，在DGRP-I中至少3的得分是创伤后应激的表征。在CGI中，化合物A治疗创伤后应激障碍的效果可通过CGI-S、CGI-I和效能指数 来评价。例如，在某些实施方案中，治疗之后具有1(非常大的改善)或2(很大的改善)的 CGI-I的CGI-I中应答者的比率增加表明该治疗是有效的。在某些实施方案中，在CGI-I中 至少3的得分是创伤后应激障碍的表征。在某些实施方案中，在CGI中该效能指数可测定 化合物A用于治疗创伤后应激障碍的效能。在HAMA-A中，为了评价焦虑或创伤后应激障碍，通常计算HAM-A中全部项目的总 体或全部得分。在某些实施方案中，HAM-A中将终点得分与基础得分比较以确定焦虑和创 伤后应激障碍的严重度的改变。在某些实施方案中，HAM-A中与基础得分比较终点得分显 著减少被认为是焦虑和创伤后应激障碍的改善。在某些实施方案中，HAM-A中至少18的全 部得分是焦虑和创伤后应激障碍的表征。通常，化合物A或药学可接受的衍生物将以治疗有效量被施用，可以单独或者与 另一治疗剂组合施用。药物组合物将是有用的，例如用于治疗创伤后应激障碍。药学可接受的衍生物包括酸、碱、烯醇醚和酯、酯、水合物、溶剂合物、和前药形式。 选择该衍生物以使得其药动学性质在至少一个性质方面与相应中性药剂相比更优。该化合 物A可在形成之前被衍生化。化合物A或药学可接受的衍生物的治疗有效量可以广泛地改变，这取决于创伤后 应激障碍的严重度、受试者的年龄和相对健康、使用的化合物的效能以及其它因素。在某些 实施方案中，治疗有效量为约0. 1毫克/kg(mg/kg)体重/天至约50mg/kg体重/天。在其 它实施方案中，该量为约1.0至约10mg/kg/天。因此，在某些实施方案中，对于70kg人的
24治疗有效量为约7. 0至约3500mg/天，而在其它实施方案中，其为约70至约700mg/天。不需要过多的试验并依赖个人知识以及本申请的公开内容，治疗此类疾病的领域 的技术人员将能够确定化合物A用于创伤后应激障碍的治疗有效量。通常，示例而非限制 性的，化合物A将以药物组合物通过下列途径之一施用口服、全身(例如，经皮、鼻内或通 过栓剂)或胃肠外(例如，肌内、静脉内或皮下)。组合物可以示例而非限制性的采用下列 形式片剂、丸剂、胶囊剂、半固体、粉末、缓释制剂、溶液、混悬液、酏剂、气雾剂或任何其它 适宜的组合物，并且通常包含化合物A以及至少一种药学可接受的赋形剂。可接受的赋形 剂示例而非限制性的是无毒性的、辅助施用、并且不会不利地影响化合物的治疗益处。此 类赋形剂可以是，例如，任何固体、液体、半固体，或者在气雾剂组合物的情况下的气体赋形 剂，该气体赋形剂通常是本领域技术人员可得到的。固体药物赋形剂示例而非限制性地包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、 明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉 等等。液体和半固体赋形剂可选自例如但不限于水、乙醇、甘油、丙二醇以及各种油类，包括 石油、动物、植物或合成来源的那些(例如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。优选的液 体载体，特别是对于注射用溶液，示例而非限制性地包括水、盐水、葡萄糖水溶液和乙二醇 类。可以将压缩气体用于分散化合物呈气雾形式。适用于此目的的惰性气体示例而非限制 性的是氮气、二氧化碳、氧化亚氮等。此外，药学制剂可以示例而非限制性的含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化 剂、增甜剂、着色剂、调味剂、用于改变渗透压的盐类、缓冲剂、掩蔽剂或抗氧剂。在某些实施 方案中，它们还可以含有其它治疗上有用的物质，其它适宜的药学载体以及它们的配方描 述于A. R. Alfonso Remington' s Pharmaceutical Sciences 1985，17th ed. Easton，Pa. Mack Publishing Company。化合物A在组合物中的量可以广泛的改变，这取决于例如制剂类型、单位剂量大 小、赋形剂种类以及药物科学领域技术人员已知的其它因素。通常，最终组合物将包含10% w至90% w的化合物，优选25% w至75% w，其余为一种或多种赋形剂。优选地，该药物组 合物以单位剂量形式施用以用于连续治疗，或者当特别需要症状的缓解时以单位剂量形式 任意施用。化合物A或其药学可接受的衍生物是与一种或多种上述药剂同时、之前或之后施用。本发明通过以下非限制性实施例作进一步说明。 实施例实施例1进行临床研究以证实化合物A在治疗创伤后应激障碍(PTSD)中的效能和耐受性。该研究设计包括化合物A的8-周随机、双盲、安慰剂对照治疗试验以用于治疗 PTSD。在签署知情同意书并符合入组/排除标准之后，患者随机接受化合物A或安慰剂 达8-周时间。研究期间，药师保留随机化记录并确证安慰剂或化合物A(二者是外观相似 的片剂)的顺序。患者的症状、副作用和顺应性每两周评价一次。
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根据症状和副作用的出现，研究者可以以20_40mg增量增加药物，只要能够耐受， 直到达到最大治疗益处。给药为每天一次，除非每天两次有较好耐受。顺应性是在第4周 和第8周通过药丸计数来评价的。在临床就诊期间给予患者支持性临床治疗。在紧急情况下一天24小时可通过电 话联系到研究者。如果需要则可以更加经常地探视患者。通过下列评价评分表测定效能功能总体评价(GAF)临床医生给药的PTSD评分表(CAPS)疾病的临床综合印象严重度(CGI-S)临床综合印象改善(CGI-I)Davidson 创伤评分表(DTS)。汉密尔顿焦虑评分表(Ham-A)Montgomery-Asberg 抑郁等级评分表(MADRS)治疗结果PTSD等级评分表(T0P-8)受试者入组标准是通过小型国际神经精神医学访谈表(MINI)和CAPS确认的PTSD的诊断年龄13岁或更大前4周无物质滥用或依赖性(尼古丁和咖啡因除外)2周未用精神药物(除外的是，氟西汀为4周)临床正常的身体和实验室检查(允许将肝功能检查(LFT)增加到正常限度的2. 5 倍。)可能怀孕(childbearing)的妇女必需使用医学认可的节育方法，例如避孕套、节 育药丸、D印o-Provera、或有杀精子剂的隔膜签署知情同意书男性或女性，任何人种或伦理起源受试者排除标准为双向性情感I型障碍、精神病或认知障碍的生活史活跃的自杀、杀人或精神病药敏史，针对化合物A不稳定的一般医学条件关于自杀观念的MADRS的#10号问题的得分彡6怀孕妇女、研究期间计划怀孕或哺乳的妇女满足仅一项退出标准即要求退出该研究。退出标准为该研究完成对化合物A或安慰剂治疗的严重和不能耐受的副作用自杀观念、杀人观念或精神病症状的急性发展通过CGI-I中的得分7(非常多的恶化)测定的症状恶化参与者明确要求退出该研究需要额外的、除该研究方案中的特定的研究药物或辅助药物外的精神药物，以用
26于控制受试者的精神病症状受试者在该研究过程中怀孕研究者判断患者继续在该研究中不再有最佳益处实施例2进行临床研究以证实化合物A在预防PTSD中的效能和耐受性。该研究设计包括化合物A预防PTSD的开放-终结的(open-ended)随机、双盲、安 慰剂对照治疗试验。在签署知情同意书并符合入组/排除标准之后，患者随机接受化合物A 对安慰剂达8-周时间。研究期间，药师保留随机化记录并确证安慰剂或化合物A( 二者是 外观相似的片剂)的顺序。患者的症状、副作用和顺应性每两周评价一次。根据症状和副作用的出现，研究者可以以20_40mg增量增加药物，只要能够耐受， 直到达到最大治疗益处。给药为每天一次，除非每天两次有较好耐受。顺应性是在第4周 和第8周通过药丸计数来评价的。在临床就诊期间对患者给予支持性的临床处理。在紧急情况下一天24小时可通 过电话联系到研究者。如果需要则可以更加经常地探视患者。通过下列评价评分表测定效能功能总体评价(GAF) 临床医生给药的PTSD评分表(CAPS)疾病的临床综合印象严重度(CGI-S)临床综合印象改善(CGI-I)Davidson 创伤评分表(DTS)。汉密尔顿焦虑评分表(Ham-A)Montgomery-Asberg 抑郁等级评分表(MADRS)治疗结果PTSD等级评分表(T0P-8)诊断和统计手册IV(DSM-IV)受试者入组标准是PTSD的缺乏，通过MINI和CAPS确认年龄13岁或更大前4周无物质滥用/依赖性(尼古丁和咖啡因除外)2周未用精神药物(除外的是，氟西汀为4周)临床正常的身体和实验室检查(允许将LFT增加到正常限度的2. 5倍。)可能怀孕的妇女必需使用医学认可的节育方法(例如避孕套、节育药丸、 D印o-Provera、或有杀精子剂的隔膜)签署知情同意书男性或女性，任何人种或伦理起源排除标准是PTSD 的病史双向性情感I型障碍、精神病或认知障碍的生活史活跃的自杀、杀人或精神病药敏史，针对化合物A
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不稳定的一般医学条件关于自杀观念的MADRS的#10号问题的得分彡6怀孕妇女、研究期间计划怀孕或哺乳的妇女满足仅一项退出标准即要求退出该研究。退出标准为该研究完成对化合物A或安慰剂治疗的严重和不能耐受的副作用自杀观念、杀人观念或精神病症状的急性发展体征或症状的出现与PTSD的诊断相一致。参与者明确要求退出该研究需要额外的、除该研究方案中的特定的研究药物或辅助药物外的精神药物，以用 于控制受试者的精神病症状。受试者在该研究过程中怀孕。研究者判断患者继续在该研究中不再有最佳益处。实施例3执行临床研究以证实化合物A组合治疗法在PTSD治疗中的效能和耐受性。该研究设计包括化合物A用于PTSD治疗的8_周随机、双盲、安慰剂对照治疗试 验。在签署知情同意书并符合入组/排除标准之后，患者随机接受化合物A或安慰剂达 8-周时间。患者亦可接受治疗有效剂量的哌唑嗪、丙戊酸盐、卡马西平或托吡酯并联用化合 物A或安慰剂。研究期间，药师保留随机化记录并确证安慰剂或化合物A( 二者是外观相似的片 剂)的顺序。患者的症状、副作用和顺应性每两周评价一次。根据症状和副作用的出现，研 究者以20_40mg增量增加药物，只要能够耐受，直到达到最大治疗益处。给药为每天一次， 除非每天两次有较好耐受。顺应性是在第4周和第8周通过药丸计数来评价的。在临床就诊期间对患者给予支持性的临床处理。在紧急情况下一天24小时可通 过电话联系到研究者。如果需要则可以更加经常地探视患者。通过下列评价评分表测定效能功能总体评价(GAF)临床医生给药的PTSD评分表(CAPS)疾病的临床综合印象严重度(CGI-S)临床综合印象改善(CGI-I)Davidson 创伤评分表(DTS)。汉密尔顿焦虑评分表(Ham-A)Montgomery-Asberg 抑郁等级评分表(MADRS)治疗结果PTSD等级评分表(T0P-8)受试者入组标准是PTSD的诊断，通过MINI和CAPS确认年龄13岁或更大前4周无物质滥用/依赖性(尼古丁和咖啡因除外)2周未用精神药物(除外的是，氟西汀为4周)
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临床正常的身体和实验室检查(允许将LFT增加到正常限度的2. 5倍。)可能怀孕的妇女必需使用医学认可的节育方法(例如避孕套、节育药丸、 D印o-Provera、或有杀精子剂的隔膜)签署知情同意书男性或女性，任何人种或伦理起源受试者排除标准为双向性情感I型障碍、精神病或认知障碍的生活史活跃的自杀、杀人或精神病药敏史，针对化合物A不稳定的一般医学条件关于自杀观念的MADRS的#10号问题的得分彡6怀孕妇女、研究期间计划怀孕或哺乳的妇女满足仅一项退出标准即要求退出该研究。退出标准为该研究完成对化合物A或安慰剂治疗的严重和不能耐受的副作用自杀观念、杀人观念或精神病症状的急性发展通过CGI-I中的得分7(非常多的恶化)测定的症状恶化参与者明确要求退出该研究需要额外的、除该研究方案中的特定的研究药物或辅助药物外的精神药物，以用 于控制受试者的精神病症状受试者在该研究过程中怀孕研究者判断患者继续在该研究中不再有最佳益处实旋例4进行临床研究以证实化合物A在治疗儿童PTSD中的效能和耐受性。该研究设计包括化合物A用于治疗PTSD的8_周随机、双盲、安慰剂对照治疗试验。在签署知情同意书并符合入组/排除标准之后，患者随机接受化合物A或安慰剂 达8-周时间。研究期间，药师保留随机化记录并确证安慰剂或化合物A(二者是外观相似 的片剂)的顺序。患者的症状、副作用和顺应性每两周评价一次。根据症状和副作用的出现，研究者可以以20_40mg增量增加药物，只要能够耐受， 直到达到最大治疗益处。给药为每天一次，除非每天两次有较好耐受。顺应性是在第4周 和第8周通过药丸计数来评价的。在临床就诊期间对患者给予支持性的临床处理。在紧急情况下一天24小时可通 过电话联系到研究者。如果需要则可以更加经常地探视患者。通过下列评价评分表测定效能功能总体评价(GAF)临床医生给药的PTSD评分表(CAPS)临床医生给药的PTSD评分表(CAPS-CA)疾病的临床综合印象严重度(CGI-S)
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临床综合印象改善(CGI-I)Davidson 创伤评分表(DTS)。汉密尔顿焦虑评分表(Ham-A)Montgomery-Asberg 抑郁等级评分表(MADRS)治疗结果PTSD等级评分表(T0P-8)受试者入组标准是PTSD的诊断，通过MINI和CAPS确认12岁或更小前4周无物质滥用/依赖性(尼古丁和咖啡因除外)2周未用精神药物(除外的是，氟西汀为4周)临床正常的身体和实验室检查(允许将LFT增加到正常限度的2. 5倍。)可能怀孕的妇女必需使用医学认可的节育方法(例如避孕套、节育药丸、 D印o-Provera、或有杀精子剂的隔膜)签署知情同意书男性或女性，任何人种或伦理起源受试者排除标准为双向性情感I型障碍、精神病或认知障碍的生活史活跃的自杀、杀人或精神病药敏史，针对化合物A不稳定的一般医学条件关于自杀观念的MADRS的#10号问题的得分彡6怀孕妇女、研究期间计划怀孕或哺乳的妇女满足仅一项退出标准即要求退出该研究。退出标准为该研究完成对化合物A或安慰剂治疗的严重和不能耐受的副作用自杀观念、杀人观念或精神病症状的急性发展通过CGI-I中的得分7(非常多的恶化)测定的症状恶化。参与者明确要求退出该研究需要额外的、除该研究方案中的特定的研究药物或辅助药物外的精神药物，以用 于控制受试者的精神病症状受试者在该研究过程中怀孕研究者判断患者继续在该研究中不再有最佳益处实施例5牛和人多巴胺-β _羟化酶活性是通过酪胺到酚乙醇胺的转化来分析的。牛肾上 腺多巴胺-β-羟化酶得自Sigma Chemicals (St Louis，M0，USA)，而人多巴胺-β -羟化酶 是从成神经细胞瘤细胞系SK-N-SH的培养基中纯化的。该分析是在ρΗ 5. 2和32°C下在介质 中进行的，该介质含有0. 125M NaAcUOmM富马酸盐、0. 5-2 μ M CuS04、0. Img. πιΓ1过氧化氢 酶、0. ImM酪胺和4mM抗坏血酸。在典型的分析中，0. 5-1毫单位的酶被加至反应混合物中， 接着加入含有过氧化氢酶、酪胺和抗坏血酸的底物混合物以引发反应(终体积为200 μ 1)。
30使样品与或不与适宜浓度的内匹司他(S-对映体)或(R)_5-氨基甲基-l-(5，7-二氟-1， 2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3-二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐(R-对映体)在37°C下孵育 30-40分钟。通过终止溶液将反应猝灭，该终止溶液含有25mM EDTA和240 μ M 3-羟酪胺 (内标)。通过反相高压液相色谱法(HPLC)使用280ηΜ处的紫外检测针对酚乙醇胺进行样 品分析。进行HPLC色谱运行，流速为1ml. mirT1，使用LiChroCART 125-4RP-18柱，等度洗 脱使用IOmM酸性酸、IOmM 1-庚烷磺酸、12mM磷酸四丁基铵和10%甲醇。根据对照计算剩 余百分活性，使用内标校正并拟合成非线性四参数浓度-应答曲线。内匹司他对12种选择的酶和受体的活性使用建立的分析法测定。个别受体放射 配体结合试验的细节可见于Wong et al(1993)。每种酶分析法的根本原理的简要说明给 于图1。通过迭代曲线拟合成四参数逻辑方程来分析结合数据。使用Cheng-Prusoff方程 从IC5tl值计算Ki值。酶抑制活性表示为IC5tl(产生50%酶活性的抑制所需的浓度)。雄 性 SHR(15-16 周龄，Charles River, Wilmington, MA, USA)被用于该研究。在研究当天， 动物称重，并随机分为在间隔12小时的三个连续时间给予载剂(对照)或适宜剂量的内 匹司他(3，10，30 或 IOOmg. kg、po)或(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3-二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐(SOmg.kg^po)。在第三次给药之后6小 时，大鼠用氟烷处死，断头并迅速收集组织(大脑皮层、肠系膜动脉和左心室)，称重，冰冷 的高氯酸中(0.4M)，在液氮中冷冻，并保存于-70°C，直至后续分析。为了定量去甲肾上腺 素和多巴胺浓度，在4°C下，通过短暂的声处理将组织勻浆，再在13，OOOrpm下离心30分钟。 使用电化学检测经HPLC针对去甲肾上腺素和多巴胺分析掺入3，4- 二羟基苄胺(内标)的 上清。雄性比格狗(10_16kg，MarshallFarms USA Inc，North Rose, NY, USA)被用于该 研究。在研究当天，对狗称重并随机分派口服给予空胶囊(对照)或适宜剂量的内匹司他 (0. 05，0. 5，1. 5或5mg. kg—1 ；po,b. i. d.)达5天。在第5天第一次给药之后6小时，将狗用 戊巴比妥处以安乐死，并迅速收集组织(大脑皮层、肾动脉、左心室)。随后并如上文所述处 理组织，并对去甲肾上腺素和多巴胺进行分析。雄性比格狗被随机分派口服给予空胶囊(对照)或内匹司他Omg.kg—1，po, b. i. d.)达15天。第一次给药后6小时，每天抽取静脉血样品，用于测定多巴胺和去甲肾上 腺素的血浆浓度。将样品收集到含有肝素和谷胱甘肽的试管中，在_4°C下离心，再将分离的 血浆保存于-70°C，直到分析。合成内匹司他((S)-5_氨基甲基-l-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢萘_2_基)_1， 3-二氢咪唑-2-硫酮盐酸盐)和相应的R-对映体((R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2， 3,4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐)。在涉及SHR的研究中，将药 物溶解于蒸馏水中，并用灌食针口服给予。在狗研究中，将药物填充到胶囊中，并口服给药。 所有剂量均以游离碱当量表示。所有数据表示为均值士 s. e. m。组织和血浆儿茶酚胺数据分析分别使用非参数单 因素方差分析(ANOVA)或双因素AN0VA，接着使用FisherLSD检验进行配对比较。P < 0. 05 被认为是统计学显著的。内匹司他(S-对映体)和(R)-5_氨基甲基-l-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐(R-对映体)产生牛和人多巴胺_ β _羟
31化酶活性的浓度_依赖性抑制。针对内匹司他计算的IC5tl，牛和人酶分别为8. 5士0. SnM和 9. 0士0. 8nM。(R) -5-氨基甲基 (5，7- 二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基)_2，3- 二氢-2-硫 代-IH-咪唑盐酸盐此之于内匹司他效能稍低(牛和人酶的IC5tl分别为25. 1 士0.6nM和 18. 3 士 0. 6nM)。对于一系列其它酶(酪氨酸羟化酶、乙酰CoA合成酶、酰基CoA-胆固醇乙基转移 酶、Ca2+/钙调蛋白激酶II、环氧酶-I、HMG-CoA还原酶、中性肽链内切酶、氧化氮合成酶、磷 酸二酯酶III、磷脂酶A2和蛋白激酶C)和神经递质受体(α 1Α、α 1Β、α 2Α、α 2Β、β i和β 2肾 上腺素受体、M1蕈毒碱受体、D1和D2多巴胺受体、μ阿片受体、5-Η \Α、5-ΗΤ2Α和5_HT2e血清 素受体)，内匹司他具有可忽略不计的亲和力(IC5tl或Ki > 10 μ M)。对照动物中的基础组织儿茶酚胺含量(μ g. g-1湿重)如下肠系膜动脉(去甲肾 上腺素，10. 40士 1.03 ；多巴胺，0. 25士0. 02)，左心室(去甲肾上腺素，1. 30士0. 06 ；多巴胺， 0.02士0.00)以及大脑皮层(去甲肾上腺素，0.76士0.03 ；多巴胺，0. 14士0. 01)。在三种被 研究的组织中，内匹司他产生剂量依赖性的去甲肾上腺素含量降低以及多巴胺含量和多巴 胺/去甲肾上腺素比率升高(图2和3)。图2显示了内匹司他在SHR中的肠系膜动脉(A)、 左心室(B)和大脑皮层(C)中对组织去甲肾上腺素(0)和多巴胺(口)含量的作用。数据 表示为均值士s. e.m;n = 7-9只/组。*p < 0. 05，与对照(0)比较。图3显示了内匹司他 在SHR中的肠系膜动脉(0)、左心室(口 )和大脑皮层(Δ )中对组织多巴胺/去甲肾上腺 素比率的作用。数据表示为均值士 s. e.m，η = 7-9只/组。*ρ<0.05，与对照(0)比较。在肠系膜动脉和左心室中的剂量为彡3mg. kg—1时，但在大脑皮层中的剂量仅为30 和IOOmg. kg—1时，这些变化达到了统计学显著性(ρ < 0. 05)。在研究的最高剂量时(IOOmg. kg_\ po)，在肠系膜动脉、左心室和大脑皮层中，去甲肾上腺素降低分别为47%、35%、42%， 多巴胺增加分别为820%、800%和86%。当在30mg. kg—1，po试验时，与R-对映体((R) -5-氨 基甲基-1-(5，7- 二氟-1，2，3,4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐) 相比，S-对映体(内匹司他)在肠系膜动脉和左心室中，在儿茶酚胺含量上得到显著更大 的改变(图7)。图7显示了内匹司他和(R)-5-氨基甲基-l-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐在30mg. kg—1 ；po时在SHR的肠系膜动脉、 左心室和大脑皮层中，对去甲肾上腺素含量、多巴胺含量和多巴胺/去甲肾上腺素比率的 作用。数据表示为平均值+/-sem。η = 9只/组。*ρ < 0. 05，与对照比较 ’#ρ < 0. 05，与 内匹司他比较。在对照动物中基础组织儿茶酚胺含量(yg.g—1湿重)如下肾动脉(去甲肾上 腺素，10. 7 士 1.05 ；多巴胺，0. 22 士 0.01)、左心室(去甲肾上腺素，2. 11 士 0. 18 ；多巴胺， 0.07士0.03)和大脑皮层(去甲肾上腺素，0.26士0.02 ；多巴胺，0.03士0.00)。当与对照动 物比较时，在被研究的三种组织中，内匹司他产生了剂量依赖性的去甲肾上腺素含量降低 以及多巴胺含量和多巴胺/去甲肾上腺素比率升高(图4和5)。图4显示了在比格狗的肾 动脉(A)、左心室(B)和大脑皮层(C)中，内匹司他对组织去甲肾上腺素(0)和多巴胺(口) 含量的作用。数据表示为均值士 s.e.m;n = 8只/组。*p< 0.05，与对照(0)比较。图5 显示了在比格狗的肾动脉(0)、左心室(口)和大脑皮层(Δ )中，内匹司他对组织多巴胺 /去甲肾上腺素比率的作用。数据表示为均值士s.e.m，n = 8只/组。*p<0.05，与对照 (0)比较。
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在三种组织中在> 0. lmg. kg—1.天―1的剂量下，这些变化达到了统计学显著性(ρ < 0. 05)。在肾动脉、左心室和大脑皮层中，在研究的最高剂量时(5mg. kg-1，b. i. d.，po)， 去甲肾上腺素降低分别为88%、91%和96%，多巴胺增加分别为627%,700%^P 166%。 在两组动物中儿茶酚胺的基线浓度相互间无显著性差异血浆去甲肾上腺素和多巴胺浓 度，在对照组中分别为460. 3 士 59. 6和34. 4 士 11. 9pg. ml—1，在内匹司他-治疗中分别为 401. 9士25. 5 和 41. 1 士8. Spg.mr1。当与对照组比较时，内匹司他(2mg. kg^b. i.d，po)产 生了显著的去甲肾上腺素血浆浓度降低以及多巴胺和多巴胺/去甲肾上腺素比率血浆浓 度升高(图6)。图6显示了在比格狗中内匹司他对去甲肾上腺素(A)、多巴胺⑶和多巴 胺/去甲肾上腺素比率(C)的血浆浓度的作用。对照狗(0)；内匹司他治疗狗(·)。数据 表示为均值士 s.e.m;n = 8只/组。*p < 0.05，与对照比较。在给药第6天观察到去甲 肾上腺素的血浆浓度峰值降低(52% )，而在给药第7天观察到多巴胺的血浆浓度峰值增加 (646% )。通过药理学方式交感神经功能的抑制调节作用对于充血性心力衰竭的治疗是 引人注目的治疗靶标，原因是此系统被提高的活性与该疾病的进行性恶化有关。本研究 的目的是药理学表征内匹司他的作用，该内匹司他是一种在交感神经中通过抑制多巴 胺_ β _羟化酶调节去甲肾上腺素合成的化合物。内匹司他显示是体外人和牛多巴胺_羟化酶的有效抑制剂。该化合物的抑制 作用是立体特异性的，因为S-对映体(内匹司他)比R-对映体((R)_5-氨基甲基-1-(5， 7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐)勉强但显著地更 有效。内匹司他对多巴胺_羟化酶显示出高度的选择性，因为该化合物对12种其它酶 和13种神经递质受体具有可以忽略的亲和力。在收到去甲肾上腺素能神经感应的组织中，多巴胺羟化酶的体内抑制作用 期望产生高水平的底物(多巴胺)和低水平的产物(去甲肾上腺素)。这种期望已在试验 中证实，所述试验研究了内匹司他对在体内的中枢和外周组织中儿茶酚胺水平的作用。在 SHR和比格狗中，内匹司他在外周(肠系膜或肾动脉，左心室)和中枢(大脑皮层)组织中 产生剂量依赖性的去甲肾上腺素含量降低以及多巴胺含量升高。在此方面，(R)_5-氨基甲 基-1- (5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐比内匹 司他的效能低，这与前面的对映体对该酶的较低IC5tl相一致。尽管多巴胺/去甲肾上腺素 比率亦有升高，但并未显示出化学计量的用多巴胺替代去甲肾上腺素。此发现最有可能的 解释是，多巴胺的组织水平已被低估，原因是多巴胺的神经元内代谢。内匹司他改变大脑皮层中儿茶酚胺水平的能力表明，药物确实穿透了血脑屏障。 在狗中，大脑皮层中的儿茶酚胺改变量显示出与外周组织相似。然而，在SHR中，内匹司他 在低剂量下(彡IOmg. kg—1)在外周组织中产生去甲肾上腺素和多巴胺含量的显著改变，但 未影响大脑皮层中的儿茶酚胺。这表明，至少在SHR中，该药物确实具有适度的外周选择 性。我们还显示，内匹司他减弱了交感神经介导的心血管反应并降低了 SHR中的血压，但不 影响运动活动(Hegde et al. , 1996 a & b)；这些发现将在另外的文稿中报道。血浆去甲肾上腺素浓度提供全面的交感神经活性的有用度量法，尽管此参数可能 受儿茶酚胺的神经元摄取和代谢清除改变的影响。血浆中去甲肾上腺素的基线浓度在狗中 令人惊奇地升高了，并且有可能是一种由放血取血操作诱导的初始应激的反射。然而，与对照组相比，内匹司他产生了血浆去甲肾上腺素浓度的显著降低，这与减少递质合成和释放 相一致，尽管不会扣减间接作用，该间接作用继发于神经元摄取或代谢清除的促进作用。由 于释放的去甲肾上腺素代表小部分的总神经元去甲肾上腺素贮藏，仅在现有贮藏的儿茶酚 胺充分耗尽之后，去甲肾上腺素生物合成的抑制剂才会影响去甲肾上腺素释放。相应地，在 给予内匹司他4天以前血浆去甲肾上腺素浓度降低不会达到统计学显著性，这表明交感神 经系统逐渐调节作用。应当理解，单独的血浆去甲肾上腺素浓度的测定不能用来解释去甲 肾上腺素释放的区别性差异(Esler et al.，1984)，这强调了在将来的研究中，进行器官特 异性去甲肾上腺素外流速率测定的需要。身体成长的证据表明，充血性心力衰竭中的交感神经系统长期激活是一种适应不 良行为反应。此争论由显示卡地洛尔在充血性心力衰竭患者关于长期发病率和死亡率中的 有益效果的临床试验所支持。然而，应当指出，大多数患者确实需要某种水平的交感神经驱 动，以支持心血管内环境稳定。确实，β-阻滞剂包括卡地洛尔的治疗价值可以受它们趋向 于引起血液动力学恶化特别是在治疗开始期间的限制。这种不希望的作用，它们是由交感 神经支持的突然停药所引起，需要小心剂量调整。多巴胺羟化酶的抑制剂例如内匹司 他可能由于下列原因而缺乏这种不需要的作用。首先，此类药物可能会减弱但不会消除去 甲肾上腺素释放；其次，它们产生该系统的逐渐调整从而消除对剂量调整的需求。内匹司他 超出β _阻滞剂的其它优点在于，它提高多巴胺水平，该多巴胺水平通过多巴胺受体的激 动作用可能对肾功能例如肾血管舒张、利尿和尿钠排泄有有益的作用。总之，内匹司他是一种有效的、选择性的并且口服有效的多巴胺羟化酶抑制 剂，其可能在与交感神经系统过度活化有关的心血管障碍的治疗中有价值。实施例6内匹司他(2a)的合成(图8和图9)。给自发性高血压大鼠(SHR)和正常狗口服 施用2a会产生有效的并且剂量依赖性的增加在外周动脉(肾或肠系膜)、左心室和大脑皮 层中的组织多巴胺(DA)/去甲肾上腺素(NE)比率。给正常狗长期口服施用2a还会产生了 血浆DA/NE比率的持续增加。在清醒SHR中，急性口服施用2a产生剂量依赖性的和长效的 (> 4h)抗高血压作用，并且还减弱了节前交感神经刺激的加压应答。血清T3和T4水平不 受剂量(6.2mg/kg，po，b. i.d.达10天)影响，该剂量升高了肠系膜动脉中的多巴胺/去甲 肾上腺素比率。根据其有效调节交感神经驱动心血管组织的能力，2a目前用于治疗充血性 心力衰竭临床评价法。充血性心力衰竭(CHF)在美国是死亡率的首要因素。CHF的特征是交感神经系统 (SNS)和肾素-血管紧张素系统(RAS)的显著激活。这两种神经激素系统的同时激活越来 越与CHF的永存(perpetuation)和发展(progression)有关。阻断这些神经激素系统的 作用的治疗干涉有可能有利地改变CHF的自然历史。事实上，阻断血管紧张素II形成的血 管紧张素转化酶(ACE)抑制剂显示出降低CHF患者的发病率和死亡率。然而，ACE抑制剂 具有有限的间接的减弱该SNS的能力。用肾上腺素受体拮抗剂抑制SNS是一种目前在 临床评价中的有希望的方法。直接调节SNS的选择性策略是通过多巴胺β-羟化酶(DBH) 的抑制来抑制去甲肾上腺素(NE)生物合成，该酶发挥从NE到多巴胺(DA)的转化的作用。 DBH的抑制作用将有望降低NE的组织水平并升高DA的组织水平，从而增加组织DA/NE比 率。此方法具有超过肾上腺素受体拮抗剂的潜在益处，例如降低α-肾上腺素受体的
34刺激以及提高DA水平，这可以产生肾脏血管舒张、尿钠排泄和降低醛固酮释放。以前的DBH 抑制剂例如镰胞菌酸和SKF 102698具有例如低效价和特异性的缺点，这排除了它们在心 力衰竭方面的临床开发。本实施例显示2a (内匹司他)相对于SKF 10269是一种有效的和选择性的DBH抑 制剂。2a的制备(流程I)是在Terashima7描述的条件下基于四氢萘酮3(得自3，5_ 二氟 苯基乙酰氯与乙烯在CH2Cl2中在-65°C下的AlCl3-催化的Friedel-Crafts反应)的手性还 原(LAH，(-) -1R，2S-N-甲基麻黄碱，2-乙基氨基吡啶)，得到R- (+) _四氢萘酚4a (92-95 % ee)。4a到R- (+)-甲磺酸酯5a的转化，接着与叠氮化钠反应，得到叠氮化物6a和二氢化萘 7的混合物(9 1)。将该叠氮化物氢化，产物用无水HCl处理，得到S-(-)-胺盐酸盐8a， 通过Strecker反应(甲醛亚硫酸氢盐复合物和KCN)转化成S_(_)_氨基腈9a。杂环IOa 的形成是通过氨基腈9a的相继二甲酰化接着后续用硫氰酸处理而实现的。腈完全水解得 到相似量的伯胺11a。腈IOa到胺2a的还原(93-96% ee)是使用LAH/THF实现的。该对 映体2b(91. 6% ee)通过同样的上述途径使用(+)_1S，2R_N_甲基麻黄碱作为手性助剂在酮 3的Terashima还原中得到。在4a，b以及由此2a，b中的手性中心的绝对构型基于以前描 述的S-(-)-2-四氢萘酚的先前文献。四氢萘2a 被证实是牛(IC50 = 8. 5 士0. 8nM)和人(IC50 = 9. 0 士0. 8nM)DBH 的竞争 性抑制剂。R-对映体 2b (IC50S = 25. 1 士0. 6ηΜ ;18· 3 士0. 6nM)和 1 (IC50S = 67. 0 士4. 2nM ； 85.0士3.7nM)分别是牛和人酶较低的有效抑制剂。化合物2a对一系列其它酶和神经递质 受体显示出弱的亲和力(图10)。这些数据表明，2a在体外是一种有效的和高度选择性的 DBH的抑制剂。此外，S-对映体比R-对映体效价高约2-3倍，这表明具有立体选择性。2a、2b和1的体内生物化学作用是在自发性高血压大鼠(SHR)和正常比格狗中评 价的。口服施用2a在SHR(图11A)和狗(图11B)中的动脉(肠系膜或肾)、左心室和大 脑皮层中产生剂量依赖性的DA/NE比率增加。在试验的最大剂量下(在SHR中为IOOmg/ kg，在狗中为5mg/kg)，在动脉、左心室和大脑皮层中，DA/NE比率的最大增加分别为14、11 和3. 2倍(在SHR中)以及95、151和80倍(在狗中)。当在SHR中以30mg/kg试验时，在 肠系膜动脉、左心室和大脑皮层中，SKF 102698(1)增加DA/NE比率分别为5. 5-倍、3. 5-倍 和2. 7-倍，而2a在相同剂量时增加比率分别为8. 3,7. 5和1. 5倍。在SHR中，在肠系膜动 脉、左心室和大脑皮层中，30mg/kg的R-对映体2b在DA/NE比率方面分别仅产生2. 6,3. 5 和1. 1倍增加。这些数据表明，2a在SHR和狗中均产生了期望的生物化学作用，但是在后一 种物种中更为有效。此外，在SHR中，2a比其R-对映体2b和SKF 102698 (1)在SHR中更有 效。2a(14. 5天治疗)对血浆DA/NE比率的长期作用在正常狗中进行研究。口服施用 2a(2mg/kg ；b. i. d)产生DA/NE比率的显著增加，在约6_7天时达到其峰效应，然后在7_14 天平台延至新的稳态(图12)。2a的体内血液动力学活性在清醒的、束缚的SHR中进行进一步评价，该SHR是一 种对心血管组织具有高度交感神经驱动的模型。口服给予2a导致剂量依赖性的抗高血压 作用(图13)。平均血压53士4mmHg的最大降低(33%降低，相对于载剂对照)在10mg/kg 剂量下观察到。该应答出现缓慢，在3-4h达到其平台。在最高剂量(30mg/kg)下抗高血压 效能丧失的确切理由目前尚不清楚。除了在10和30mg/kg下仍然稍有显著降低(分别为
359.8和10.5%)外，心率未受明显影响。根据本研究，将大鼠脑脊髓刺毁，2a对脊髓的节前 神经刺激(PNS)的加压应答的作用是在给药后5小时评价的。频率-加压应答曲线以剂量 依赖性方式显著向右偏移(P < 0. 05)(在频率-应答曲线中最大偏移 5倍)。对PNS的 心率应答无显著影响。这些数据表明，2a抑制对脉管系统的交感神经驱动，并且是其在SHR 中的抗高血压作用的可能机制。由于2a的杂环部分在结构上与甲巯咪唑相似，该甲巯咪唑是一种已知有 效的哺乳动物甲状腺功能的抑制剂，以2.0和6. 2mg/kg, po, b. i.d的剂量在碘缺乏 Sprague-Dawley大鼠(η = 9-12)中评价2a对甲状腺功能的作用达10天。甲巯咪唑(lmg/ kg, po, b. i.d.)，用作阳性对照，在给药后4小时造成显著减少T3的血清水平(第3天， 31 %，ρ < 0. 05 ；第7和9天，42%和44%，ρ < 0. 01)和T4的血清水平(第3和7天，46% 和58%，ρ < 0.01)，而2a显示在整个研究中无显著作用(第3、7和9天)。2a的两个剂 量显著升高肠系膜动脉中的DA/NE比率(ρ < 0. 01，相对于载剂对照)，但在第10天在最终 给药后4小时在皮质中未显示升高。本研究发现表明，2a(内匹司他)是一种有效的、选择性的并且口服有效的DBH的 抑制剂。该化合物在动物模型中还没有显著的行为作用，并且这些发现将是未来发表的论 题。由于化合物2a(内匹司他)有效调节对心血管组织的交感神经驱动，它是目前进行针 对CHF治疗的开发。图 9 显示了 a(a)i =SOCl2 ；ii =AlCl3, CH2Cl2,乙烯，-65°C ； (b) (-)_1R，2S-N-甲基 麻黄碱，2-乙基氨基吡啶，IM LAH/Et20, < -60°C用于R-对映体或(+)_1S，2R_N-甲基麻黄 碱,2-乙基氨基吡啶，IM LAH/Et20, < _60°C用于 S-对映体；(c)MsCl,Et2O,Et3N,-15°C ； (d) NaN3, DMS0，50°C ； (e) i =H2,10% Pd/C, Et0Ac，60psi ；ii :1M HCl/Et20 ； (f)NaOH,甲醛-亚 硫酸氢钠复合物，KCN, H2O, 50-80 0C ； (g) i 甲酸正丁酯，120°C ；ii :t_BuOK，甲酸乙酯， THF, -15°C ；iii :1M HCl, EtOH, KSCN ； (h) i :1M LAH/THF, 20°C ；ii :HC1/Et20, MeOH0图10显示了描述内匹司他对DBH和一系列选择的酶和受体的相互作用的表格。图11 :(A)_在自发性高血压大鼠中2a对组织DA/NE比率的作用。动物口服给药， 间隔12小时，第三次给药后6小时收集组织。*p<0.05，与安慰剂(载剂)比较。(B)-在正常比格狗中2a对组织DA/NE比率的作用。动物口服给药，一天2次，达 4. 5天，在第5天第一次给药后6小时收集组织。*p< 0.05，与安慰剂(空胶囊)比较。DA和NE浓度是通过HPLC用电化学检测分析的。所有数据表示为均值士平均标 准误。η = 9/组。图12 在正常比格狗中长期施用2a对血浆DA/NE比率的作用。动物口服给药， b. i.d.，达14. 5天。在每一天第一次给药后6小时采集血样。与安慰剂组相比，在所有时 间点2a产生DA/NE比率的显著(ρ < 0. 05)增加。血浆中的DA和NE浓度是通过HPLC用 电化学检测分析的。所有数据表示为均值士平均标准误。η = 8/组。图13 口服施用2a对清醒的、束缚的自发性高血压大鼠(SHR)的平均动脉压的作 用。SHR轻轻用醚麻醉，再用仪器测定动脉压并施用药物。将动物置于固定器上并使之恢 复30-40分钟。获得基线测定后，用载剂或适宜剂量的2a 口服治疗动物，持续记录血液动 力学参数达 4h。除了 0. 3mg/kg(180、210 和 240min)和 lmg/kg (30、210 和 240min)以外，在 全部剂量和时间点，2a产生平均动脉血压的显著降低.(ρ <0.05)。所有数据表示为均值士平均标准误。η = 6-8/组。在Uni-MeltThomas Hoover毛细管熔点仪或带有Mettler FP90 处理器的Mettler FB 81HT池上测定熔点，未作校正。质谱用Firmigan MAT8230 (对于电子冲击或化学电离) 或Finnigan MAT TSQ70 (对于 LSIMS)光谱仪获得。1H NMR光谱是在Bruker ACF300, AM300, AMX300或EM390光谱仪上记录的，化学位移以根据四甲基甲硅烷作为内标的ρρπι(δ)给出。 IR光谱是在Nicolet SPC FT-IR光谱仪记录的。UV光谱是在Varian Cary 3 UV-可见光 谱仪，Leeman Labs Inc.上记录的。在Perkin-Elmer Model 141旋光计上测定旋光度。手 性 HPLC 测定是在 RegisChiral AGP 柱(4. 6x1 OOmm)上使用 2% 乙腈-98% 20mM KH2PO4(pH 4. 7)以lmL/min在20°C下洗脱进行的。5，7_ 二氟-2-四氢萘酮(3)。将SOCl2 (IOOmL)以一份加至3，5_ 二氟苯基乙 酸(100g，0.58mol)中，搅拌15h之后，在减压下蒸发挥发性物质。将所得油状酰氯溶解 于CH2Cl2 (200mL)，再滴加至机械搅拌的AlCl3 (154g，l. 16mol)在CH2Cl2 (1.0L)中的混悬 液中。在干冰/丙酮浴中将该搅拌的混悬液冷却至_65°C的内部温度，再将该酰氯溶液以 保持内部温度< -60°C的速度添加。添加完毕后，在_65°C下快速使乙烯气体鼓泡通过该 反应混合物达lOmin。使反应混合物在搅拌下温热至0°C经2h，然后冷却至-10°C，再用 H20(500mL)处理，处理方式是先滴加，接着快速添加。分离有机层，用盐水(IOOmL)洗涤， 用MgSO4干燥。减压蒸发得到黑色油状残余物，使其在Kugelrohr上在真空下蒸馏，收集沸 点在90-110°C (1.0至0.7mm Hg)之间的物质。将蒸馏物在100_105°C (0. 3mm Hg)下重蒸 溜，得到 3 为白色固体，(73. 6g,0. 40mol ；70% ) :mp 46°C ;IR(KBr) 1705cm-1 ；1H NMR(CDCl3) δ 2. 55(t, J = 7· 5Hz，2H)，3· 10(t，J = 7. 5Hz，2H)，3· 58 (s，2H)，6· 70 (m，2H) ；MS m/z 182 (M+)。针对下式的分析计算值 C10H8F2O :C，65. 93 ；H, 4. 42。实测值=C, 65. 54 ；H, 4. 42。(R)-(+)_2-羟基-5，7-二氟-1，2，3，4-四氢化萘(4a)。将㈠_1R，2S-N-甲基 麻黄碱(81.3g,0. 454mol)在无水Et2O(LlL)中的溶液滴加(45min)至1. OM在Et2O中 的氢化铝锂(416mL，0.416mol)中，滴加速度为充分保持轻微回流。添加完毕后，使反应混 合物在回流下加热达lh，然后使之冷却至室温。加入2-乙基氨基吡啶(lllg，0.98mole) 在无水Et2O(IOOmL)中的溶液(45min)，加入速度为使得保持轻微回流。使反应混合物在 回流下加热另外lh，在此期间出现微黄绿色混悬物。使用干冰-丙酮浴将该混合物冷却 至-65°C的内部温度，再滴加5，7-二氟-2-四氢萘酮(23. 0g, 126mmol)在Et20(125mL)中 的溶液，滴加速度为保持内部温度低于_60°C。添加完毕后，将该混合物在_65°C至_68°C 下搅拌3h，再保持内部温度低于-60°C下通过添加MeOH(IOOmL)猝灭。在_65°C下将反应 搅拌另外lOmin，再使之温热至约-20°C。然后以限制温度< 35°C的速度加入3N HCl溶液 (2L)。在以增加的速度搅拌以达到全部溶解之后，将各层分离，再将醚层用盐水(200mL) 洗涤，干燥(MgS04)。将该醚溶液在减压下蒸发，再将残余物溶解于温热的Et2O(20mL)中， 接着添加己烷(200mL)。将该种子溶液在冰浴中冷却，并维持在0°C下达lh，此时收集所 得沉积的结晶，再在真空下干燥，得到醇4a(10.9g，47%) :mp 85°C ； [ α ] 25D+38. 1° (c = 1.83，CHCl3) ；93. 4% ee，通过手性 HPLC =1H NMR(CDCl3) δ 1. 70 (br s，1H)，1. 76-1. 88 (m， 2H)，1. 99-2. 06(m，2H)，2· 63-3. 08(m，3H)，4· 15 (m, 1Η)，6· 60 (m, 2Η)。针对下式的分析计算 值 CiqHiqF2O :C，65. 21 ；H，5. 47。实测值C，65. 38 :H，5. 42。(S)-对映体 4b 的光谱是相同的 mp 84-85 0C ；[a ]25D_37. 8° (c = 1. 24，CHCl3) ；92. 4% ee，通过手性 HPLC。针对下式的分析计算值 CiqHiqF2O :C，65. 21 ；H, 5. 47.实测值=C, 65. 47 ；H, 5. 39。(R)-⑴-2-甲磺酰氧基-5，7_ 二氟-1，2，3，4-四氢化萘(5a)。使用冰-MeOH浴 将 R-(+)_5，7- 二氟-2-四氢萘酚 4a(59. 0g,320mmol)和 Et3N(74. 2mL，53. 9g,530mmol) 在无水Et20(l. 78L)中的溶液冷却(_15°C )，再在氩气和搅拌下用MsCl(37.2mL，55.3g， 480mmol)处理5-lOmin。5h后反应完全(通过TLC测定)，加入水以溶解该固体。加入少 量的EtOAc以帮助完全溶解该固体。分离有机相，接着用IN HCl、NaHCO3水溶液、盐水洗 涤，用MgSO4干燥。蒸发溶剂，得到灰-白色固体5a(87. lg，332mmol)，其直接用于下一步 骤。将少许样品与i-Pr2O研磨，得到分析样品:mp 78. 8-80. 5°C; [ α ]25D+16. 8° (c = 1. 86， CHCl3) ；1H 匪R δ 2. 13-2. 28 (m, 2H)，2. 78-2. 96 (m, 2H)，3. 07 (s, 3H)，3. 09 (dd, J = 17. IHz, 4. 7，1H)，3. 20 (dd, J = 17. 2，4. 7Hz，1H)，5. 20 (m，1H)，6. 67 (m，2H)。针对下式的分析计算值 C11H12F2O3S :C，50.37 ;H，4. 61。实测值C，50. 41 ；H，4.64。(S)-对映体 5b 的光谱是相同的 mp 79. 9-80. 9°C; [ α ]25D-16. 6° (c = 2. 23，CHCl3)。针对下式的分析计算值 C11H12F2O3S =C, 50. 37 ；H, 4. 61.实测值C，50. 41 ；H, 4. 65。(S)-㈠-2-氨基-5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢化萘盐酸盐(8a)。在搅拌下将叠氮化 钠(40. Og, 0. 62mol)加至DMSO(IL)中，直到获得澄清溶液。将甲磺酸酯5a(138g，0. 53mol) 以一份加入，再将该混合物在501和N2气氛下加热16h。将反应混合物用H2O(LSL)稀释， 再用戊烷(4x250mL)萃取，接着相继用H2O(2xl00mL)、盐水(IOOmL)洗涤该合并的戊烷萃 取物，用MgSO4干燥。减压下蒸发溶剂，得到挥发性油，将其迅速在硅胶上使用戊烷作为洗 脱液进行色谱层析，得到二氢化萘7(8.50g，51.2mmOl)为挥发性油状物。进一步用戊烷/ CH2Cl2 (9 1)洗脱，得到叠氮化物 6a(101g，483mmol)为无色油状物=IR(CHCl3) 2103CHT1 ； m/z 171 (M+)。使该叠氮化物 6a 溶解于 EtOAc (1200mL)，再用 10% Pd/C(6g)在 2. 5LParr 瓶 中(60psi)氢化6h。每一个小时以后，将瓶子抽空，再重新装填氢气以除去形成的N2。将 所得混合物通过硅藻土过滤，与醚制HCl (IN, 500mL)搅拌，滤出细沉淀，再用EtOAc洗涤，然 后用无水醚洗涤。(过滤进行约4h)。将该潮湿的固体转移到圆底烧瓶中，再在真空中除 去剩余溶剂，得到白色固体 3(90. 4g，412mmol ；77. 9% ) :mp > 280°C ； [ α ]25D-60. 2° (c =
2.68，MeOH) ；1H NMR(d6-DMS0) δ 1. 79 (m, 1H)，2. 33 (m, 1H)，2. 63 (m, 1H)，2. 83-2. 92 (m. 2H)，
3.14 (dd, J = 16. 7,5. OHz, 1H)，3. 46 (m, 1H) ,6. 93 (d, J = 9. 4Hz, 1H)，7. 00 (dt, J = 9. 4， 2. 5Ηζ，1Η)。针对下式的分析计算值 CltlH12ClF2N :C，54. 68 ；H, 5. 51 ；N，6. 37。实测值=C, 54.31 ；H, 5. 52 ；N，6. 44。(R)-对映体 8b 的光谱是相同的:mp > 280°C ； [ α ]25D+58. 5° (c =1. 63，Me0H)。针对下式的分析计算值 C10H12ClF2N =C, 54. 68 ；H, 5. 51 ；N, 6. 37.实测值=C, 54. 64 ；H, 5. 51 ；N, 6. 40。(S)-(-)_(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)(氰基甲基)胺(9a)。将胺盐 酸盐 8a(50. 27g，229mmol) ffi NaOH(10. 0g. 250mmol)在水(150mL)中的溶液处理，接着用 足以获得溶液的少许额外的NaOH小球处理。加入另外的水(300mL)，再将该混合物置于 50°C浴中，再用甲醛亚硫酸氢钠复合物(30.8g，230mmol)处理。在将该混合物搅拌30min 后，加入KCN(15.0g，230mmOl)。在80°C下将反应混合物搅拌另外lh，冷却至室温，再用 EtOAc萃取，得到油(51. 3g)，其固化。TLC(5% MeOH-CH2Cl2)显示约10-15 %的起始胺剩 余。硅胶色谱层析，得到9a(39. 4g)和起始游离胺(7. 12g)，其在空气中迅速形成盐。使此 胺循环，得到另外 5. 35g 的产物。合并产率(44. 8g,202mmol ；87. 5% ) :mp 73. 1-76. 5°C ；
38[a]25D-58.0° (c = 1. 63，CHCl3)；力匪 R (CDCl3) δ 1. 50 (br s，1H)，1. 70 (m，1H)，2. 05 (m， 1H)，2. 55-3. 04 (m, 4H)，3. 22 (m, 1H)，3. 70 (s, 2H)，6. 62 (m, 2H) ；MSm/z 222 (M+)。针对下式 的分析计算值 C12H12F2N2 :C,64. 85 ；H, 5. 44 ；N，12. 60.实测值=C, 65. 07 ；H, 5. 47 ；N，12. 44。 (R)-对映体 9b 的光谱是相同的:mp 64. 4-73. 6°C ； [ a ]25D+52. 3° (c = 2. 12，CHCl3)。针 对下式的分析计算值 C12H12F2N2 :C，64. 85 ；H, 5. 44 ；N, 12. 60.实测值=C, 65. 14 ；H, 5. 54 ；N,
12.53。(S) _ (_) -1- (5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-5-氰基-2，3- 二氢 _2_ 硫 代-IH-咪唑(IOa) ο将在甲酸丁酯(240mL)中的腈9a (44. 7g，201mmol)在回流(120 °C 浴)和N2加热19h，然后在减压下除去溶剂。加入甲苯，蒸发以除去最终残余的溶剂，再在 高真空下将该残余物干燥，得到油状物(53. 2g)。将在无水THF(935mL)中的所得甲酰胺和 甲酸乙酯(48. 7mL，44. 7g，604mmol)在冰/Me0H(_15°C )中冷却，搅拌同时经20min加入 t-BuOK(lM，在THF中，302mL，302mmol)。在反应搅拌18h后，蒸发溶剂，将残余物溶解于IN HCl (990mL)和乙醇(497mL)中，再用KSCN(78. lg,804mmol)处理。在85°C下将该混合物搅 拌135min，然后置于冰浴中，得到沉淀物。将该过滤的固体以在10% MeOH/CH2Cl2中的浆液 加载到充满己烷的硅胶(Ikg)柱中。用10%丙酮/CH2Cl2洗脱，得到10a(18. 05g，62. Immol ； 30. 8 % ) :m. ρ· 240. 7-249. 2 "C ； [￥]25D -69.1° (c = 1· 18，DMS0) ；1H NMR(d6-DMS0) δ 2. 18 (br m, 1H)，2. 47 (m, 1H)，2. 75 (m, 1H)，3. 03-3. 35 (m, 3H)，5. 19 (m, 1H)，6. 94 (d, J = 9. 3Hz, 1H) ,7. 03 (dt, J = 9. 3,2. 4Hz, 1H) ,8. 29 (s, 1H), 13. 3(br s, 1H) ；MS m/z 291 (M+)。 针对下式的分析计算值 C14H11F2N3S :C, 57. 72 ；H, 3. 80 ；N, 14. 42.实测值C，57. 82 ；H, 3. 92 ； Ν，14·37·(用 1 1 MeOH/CH2Cl2 进一步洗脱柱子，得到伯胺 Ila :mp 261. 9-262. 7 °C ； [VJ25D -90.5° (c = 0. 398) ； IR (KBr) 1593，1630cm-1 ；1H NMR (d6-DMS0) δ 2. 14 (m, 1H)， 2. 15-2. 28 (m, 1H)，2. 74-3. 05 (m, 4H)，5. 64 (m, 1H)，6. 90 (d, J = 9. 2Hz, 1H)，7. 05 (dt. J = 9. 5,2. 4Hz, 1H) ,8. 73 (s, 1H) ,9. 70 (br s, 1H), 13. 7(br s, 1H) ；MS m/z 309 (if)。针对下式的 分析计算值C14H13F2N3OS ·0. 25H20 :C，53. 57 ；Η，4· 33 ；N, 13. 39。实测值-.C, 53. 32 ；H, 3. 96 :Ν，
13.24。(R)-对映体 IOb 的光谱是相同的mp243. 1-244. 7V ；[Vj250 +74.9。(c = 2. 14， DMS0)。针对下式的分析计算值 C14H11F2N3S =C, 57. 72 ；H, 3. 80 ；N, 14. 42。实测值=C, 57. 85 ； H, 3. 85 ；N, 14. 45。(S) -1- (5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-5-氨基甲基-2，3- 二氢 _2_ 硫 代-IH-咪唑。将在THF(75mL)中的上述腈(5. 00g，17. 2mmol)在氩气下在冰浴中搅拌，直 到获得均勻溶液。历经IOmin滴加LAH/THF的溶液(1M，34. 3mL, 34. 3mmol)，然后将该溶液 在0°C下搅拌30min，再使其恢复到室温达1. 5h。使反应再次冷却至0°C，再用饱和酒石酸 钾钠处理，直到该混合物变得可自由搅拌。加入另外的酒石酸溶液(30mL)，接着加入10% Me0H/CH2Cl2(200mL)，再将该混合物搅拌15min，再用水(100-150mL)处理。分离有机层，水 相用10% Me0H/CH2Cl2(2X125mL)萃取。将合并的萃取物洗涤，干燥(MgSO4)，再蒸发。使 残余物(5. 2g)在硅胶上用5% MeOH/CH2Cl2洗脱进行色谱层析，得到2a为游离胺(2. 92g，
9. 89讓ol ；58% ) :mp 170°C ；[V]25D -11.0° (c = 1. 59，DMSO)。针对下式的分析计算值
C14H15F2N3S · 0. 25H20 :C，56. 07 ；H, 5. 21 ；N, 14. 01。实测值:C，56. 11 ；H, 5. 10 ；N, 14. 14。(S)-1-(5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘 _2_ 基)_5_ 氨基甲基 _2，3_ 二氢-39
2-硫代-IH-咪唑盐酸盐(2a)。通过添加醚制HCl (1M，20mL，20mmol)至游离胺 2a(3. 12g,10. 6mmol)中来制备该盐酸盐，该游离胺2a已通过温热溶解在Me0H(250mL)中。 在减压下部分除去溶剂，再通过与EtOAc共同蒸发若干次而不蒸干来置换。将所得沉淀物 用Et0Ac(150mL)和醚(150mL)处理，滤出，用醚洗涤，再在氮气下然后在高真空和78°C下 干燥 20h，得到该盐酸盐(3. 87g) :mp 245°C (dec) ； [a]25D+9. 65° (c = 1. 70，DMS0) ； (93% ee，通过手性 HPLC) ；1H NMR (Τ = 320° K, DMS0) δ 2. 07 (m，1H)，2. 68-3. 08 (m，4H)，4. 09 (m， 3H)，4. 77 (m, 1H)，6. 84 (m, 2H)，7. 05 (s, 1H)，8. 57 (br s，3H)，12. 4(br s, 1H)。针对下式的分 析计算值 C14H16ClF2N3S · 0. 5H20 :C，49. 33 ；Η，5· 03 ；N, 12. 33。实测值:C，49. 44 ；H, 4. 96 ；N, 12. I8。(R)-对映体沘的光谱是相同的；mp 261-263°C;[V]25d_10.8o (c = L 43,DMS0)， 91. 6% ee，通过手性 HPLC。针对下式的分析计算值 C14H16ClF2N3S · 0. 35H20 :C，49. 73 ；H, 4. 98 ；N, 12. 42。实测值C，49. 80 ；H, 4. 93 ；N, 12. 39。DBH活性的体外分析。DBH活性是通过测定酪胺到酚乙醇胺的转化进行分析的。来 自肾上腺的牛DBH得自Sigma Chemical Co (St Louis，M0)。人分泌的DBH是从成神经细胞 瘤细胞系SK-N-SH的培养基中纯化的。该分析在pH 5. 2和32°C下，在0. 125M NaOAcUOmM 富马酸盐、0. 5-2 μ M CUS04、0. lmg/mL过氧化氢酶、0. ImM酪胺和4mM抗坏血酸中进行。在典 型的分析中，0. 5-1毫单位的酶被加至反应混合物中，然后加入含有过氧化氢酶、酪胺和抗 坏血酸的底物混合物以引发反应(终体积为200 μ L)。使样品与或不与适宜浓度的抑制剂 在37°C下孵育30-40min。通过终止溶液将反应猝灭，该终止溶液含有25mM EDTA和240 μ M 3-羟酪胺(内标)。通过反相HPLC使用UV检测于280ηΜ处针对酚乙醇胺进行样品分析。 剩余百分活性基于对照(无抑制剂)计算，使用内标校正并拟合成非线性4-参数浓度-应 答曲线，获得IC5tl值。选择的酶和神经递质受体的体外分析。2a对11种不同酶的活性是使用建立的分 析法(PanLabs Inc, Foster City, CA)测定的。2a对13种选择的受体的亲和力是通过放 射配体结合试验使用标准过滤技术和膜制备来测定的。结合数据是通过迭代曲线拟合成四 参数逻辑方程来分析的。使用Cheng-Prusoff方程计算Ki值。在自发性高血压大鼠(SHR)和正常狗中的体内生物化学研究。雄性SHR(15_16周 龄，Charles River, Wilmington, ΜΑ)被用于该研究。在研究当天，动物称重并随机分组为 接受安慰剂(载剂)或适宜剂量的2a，2b或1。每只大鼠口服给药三次，间隔12h，在早晨 开始。在第三次给药后6h，使大鼠用氟烷麻醉，断头，迅速采集组织(大脑皮层、肠系膜动 脉和左心室)，称重，置于冰冷的0. 4M高氯酸中，在液氮中冷冻，并保存于-70°C，直到分析。 使用电化学检测经HPLC分析组织NE和DA浓度。雄性比格狗(10-16kg，MarshallFarms USA Inc,North Rose，NY)被用于该研究。 在研究当天，狗被随机分组为接受安慰剂(空胶囊)或适宜剂量的2a。每只狗一天两次给 药达4.5天。在第5天第一次给药后6h，将狗用戊巴比妥处以安乐死，采集组织(大脑皮 层、肾动脉、左心室)，称重，置于冰冷的0. 4M高氯酸中，在液氮中冷冻，并保存于-70°C，直 到分析。使用电化学检测经HPLC分析组织NE和DA浓度。在狗中进行单独研究以测定长期施用2a对血浆DA/NE比率的作用。动物被随机分 组为接受口服安慰剂(空胶囊)或2a(2mg/kg，b. i. d)达14. 5天。每天抽取血样，第一次 给药后6h，测定DA和NE的血浆浓度。将样品收集到含有肝素和谷胱甘肽试管中，在_4°C
40下离心，再在-70°C保存，直到分析。在SHR中的血液动力学研究。雄性SHR(I5_16周龄)被用于该研究。使动物用醚 轻轻麻醉，再对左侧股动脉和静脉插入导管以分别用于测定血压和施用药物。将动物置于 固定器上并使之恢复30-40min。获得基线测定之后，使动物口服给予载剂或适宜剂量的2a 治疗，并连续记录血液动力学参数达4h。然后使动物用戊巴比妥麻醉，置于加热垫(37°C) 上，再用Harvard啮齿动物通风装置通风。施用阿托品(lmg/kg，iv)和筒箭毒碱(lmg/kg， iv)之后，用不锈钢杆通过眼的眼眶使动物脑脊髓刺毁。该脑脊髓刺毁杆用80V的Ims脉冲 以不同频率(0. 15，0. 45，1.5，5，15Hz)进行电刺激，获得频率-加压应答曲线。实施例7多巴胺和去甲肾上腺素的浓度在从充血性心力衰竭(CHF)患者采集的942个血浆 样品中进行测定。研究目的是1.评价不同剂量的内匹司他在4周之后对跨心肌(transmyocardial)(动脉-冠 状窦)和冠状窦儿茶酚胺水平的作用，以及评价内匹司他经12周的安全性和耐受性。2.评价内匹司他对下列基线变化的作用a) 4周和12周之后的血浆(静脉)儿茶酚胺水平b) 4周和12周之后的生命质量(QoL)、CHF症状、整体评价和NYHA分类c)4周之后的血液动力学参数，包括心输出量、全身血管阻力、MVO2、肺动脉压、和 肺动脉楔压d)住院治疗以及经12周CHF治疗的药物剂量变化e)4周和12周时的血压和心率f) 4周和12周之后的6分钟步行试验g) 12周时的左心室射血分数、左心室收缩末期压和左心室舒张末期容积。在第4和12周期间给药后2小时，从患者外周血管采集血样，同时让他们仰卧。来 自仰卧患者的其它样品在第0天(即给药开始之前的那天)在与给药后2小时相应的时间 采集。此外，一组患者在第4周期间在给药后2小时以及在第0天(即给药开始之前的那 天)在与给药后2小时相应的时间进行右侧心脏和冠状窦导管插入术。从这些患者的动脉 血管和冠状窦采集三份血液样品。多巴胺和去甲肾上腺素的游离碱的浓度是通过放射酶促法测定的。该方法包括使 血浆样品与儿茶酚-0-甲基转移酶和氚化S-腺苷基蛋氨酸孵育。孵育完毕后，将0-甲基化 儿茶酚胺类从血浆中通过液/液萃取法萃取，然后通过薄层色谱法分离。标记各种儿茶酚 胺的相关谱带，然后刮入到闪烁瓶中用于计数。该方法的定量限为Ipg多巴胺或去甲肾上 腺素/mL血浆。使用0.045mL至ImL的整份，线性范围为1至333000pg多巴胺或去甲肾上 腺素/mL血浆。该方法的完整描述可见于Benedict等人的出版物"同时估计血浆、尿和组 织中的多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的放射酶促微量分析法"(Clinical Chemistry, Vol. 31，No. 11，1985，pp. 1861-1864)。将采集的人血浆样品用作质量控制样品(QC)，并在该方法常规使用期间的每一天 单次(singlicate)分析，以监测该方法的性能。分析结果已被非随机化，并提供于图14-27。样品分析完成后，回顾结果。图28显 示了一个表，该表说明了应当从进一步的统计分析以及此作用的原因中扣除的数据。
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实施例8用内匹司他进行临床前体外和体内药理学研究。该体外研究评价了该化合物抑制 DBH活性的能力以及其对选择的受体的结合亲和力。该体内研究分为四类1)生物化学作 用(即降低组织去甲肾上腺素水平和增加多巴胺水平的能力)、2)对甲状腺功能的作用、3) 心血管作用、和4)行为作用。内匹司他是牛和人DBH的有效抑制剂。内匹司他对人DBH的IC5tl为9nM(CL 6960)， 显著低于DBH抑制剂SKF102698 (85nM)的IC50 0 RS-内匹司他的S对映体(表示为RS-内 匹司他-197)比表示为(R)-5-氨基甲基-l-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3_二 氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐的R对映体(18nM)更有效。以选择的受体筛选内匹司他的结合亲和力。内匹司他显示出对M1、D1和D2、以及 5HT1A,2A和2C的结合亲和力低于5. 0。内匹司他在大鼠和猴中的N-乙酰基代谢物显示出相 似缺乏对这些受体的结合亲和力。因此内匹司他及其主要代谢物RS-47831-007对上文所 列受体不是有效抑制剂。相对血压正常的Wistar-Kyoto大鼠而言，体外对苯肾上腺素的主动脉收缩反应 在自发性高血压大鼠(SHR)中被减弱。在SHR中用内匹司他(10mg/kg，p.o.)每日治疗21 天会使苯肾上腺素应答恢复至与该Wistar-Kyoto大鼠相似的值。总的来说，内匹司他在大鼠和狗中是一种有效的DBH的抑制剂。在两种物种的心 脏、肠系膜或肾动脉以及大脑皮层中，口服或静脉施用会造成显著的(P < 0. 05)组织去甲 肾上腺素减少、多巴胺增加、和多巴胺/去甲肾上腺素水平增加。在用雄性自发性高血压大鼠(SHR)的研究中，在以6. 2mg/kg 口服或i. v.施用后 从0. 5至4小时，在肠系膜动脉中，内匹司他显著减少去甲肾上腺素并增加多巴胺以及多巴 胺/去甲肾上腺素比率。这些参数的显著变化亦间隔12小时给予两次i. ν注射(15mg/kg) 的第2次之后6小时，在雄性Sprague-Dawley大鼠的左心室中观察到。组织儿茶酚胺的24 小时过程是在雄性SHR中在分别口服施用10或30mg/kg之后进行了研究。多巴胺/去甲 肾上腺素比率的增加在1小时时是显著的，并且长期持续(12小时，10mg/kg，肠系膜动脉； 以及24小时，30mg/kg，左心室)。肠系膜动脉多巴胺和去甲肾上腺素水平的显著变化在10 天给予雄性Sprague-Dawley大鼠2. O和6. 2mg/kg p. ο. b. i. d.之后观察到。在大脑皮层 中观察到无显著作用。以1或10mg/kg/d p. ο.给药SHR达7或25天已显著增加在肠系膜 动脉和大脑皮层中的多巴胺和多巴胺/去甲肾上腺素比率。总的来说，在急性或慢性(多 达25天)给药大鼠的肠系膜动脉中，内匹司他造成显著的去甲肾上腺素减少以及多巴胺和 多巴胺/去甲肾上腺素比率的升高。当在单次口服给药0. 3、1、3、10、30和100mg/kg之后6小时评价时，发现内匹司他 对雄性SHR和Sprague-Dawley大鼠的作用呈剂量响应性。在SHR中，0. 3mg/kg的剂量在肠 系膜动脉中、3. Omg/kg的剂量在左心室中、以及10mg/kg的剂量在大脑皮层中，多巴胺/去 甲肾上腺素比率有显著变化。在Sprague-Dawley大鼠，3. Omg/kg在肠系膜动脉中、1. Omg/ kg在左心室中、以及100mg/kg在大脑皮层中，多巴胺/去甲肾上腺素比率有显著增加。在 SHR的第二个剂量应答研究中，以3. 0,10,30或100mg/kg间隔12小时给药三次，第三次给 药后6小时收集组织。内匹司他在左心室和肠系膜动脉中引起显著的剂量依赖性的去甲肾 上腺素(10mg/kg)减少以及多巴胺(3. Omg/kg)和多巴胺/去甲肾上腺素比率(3. Omg/kg)
42增加。内匹司他在大脑皮层中对多巴胺和去甲肾上腺素浓度以及多巴胺/去甲肾上腺素比 率的作用仅在30和100mg/kg时是显著的。在通过饮用水(0. 3,0. 6和1. Omg/ml)给予内 匹司他达7天的雌性Wistar大鼠中见到有在左心室中的类似显著的剂量-应答作用。总 之，内匹司他在大鼠大脑皮层(60-100mg/kg/d)中比在左心室和肠系膜动脉(l-6mg/kg/d) 中抑制DBH的效能低。在间隔12小时给药(30mg/kg p. ο.)三次之后，在SHR的左心室和肠系膜动脉中， 内匹司他(S对映体)比R对映体显著更有效。在以30mg/kg单次给药或三次给药之后，在 SHR的左心室和肠系膜动脉中，在减少去甲肾上腺素以及增加多巴胺和多巴胺/去甲肾上 腺素比率方面，内匹司他比DBH抑制剂SKF102698显著更有效。从这些体内研究中产生的左 心室和肠系膜动脉中的效能关系与使用纯化的DBH(参见上文)从体外研究获得的效能关 系强烈的平行。然而，在大脑皮层中，在减少去甲肾上腺素水平以及增加多巴胺水平方面， 内匹司他比SKF 102698具有显著更低的作用。去甲肾上腺素显示出刺激肾素释放以及增 加血浆肾素活性。因此，评价用内匹司他减少去甲肾上腺素水平是否会导致血浆肾素活性 的减少是令人感兴趣的。然而，内匹司他(30和100mg/kg/d p. ο.达5天)在雄性SHR中 不会改变血浆肾素活性。因此，当以降低组织去甲肾上腺素水平的剂量给予时，内匹司他不 会改变SHR中的血浆肾素活性。雄性比格狗十二指肠内施用30mg/kg 5小时之后，在肠系膜动脉中，内匹司他造 成显著的减少去甲肾上腺素水平以及增加多巴胺/去甲肾上腺素比率，但是不会改变多巴 胺水平。当内匹司他给予雄性比格狗达4. 5天(5、15和30mg/kg b. i. d.，或10、30和60mg/ kg/d)时，在肾动脉、肾皮质和肾髓质中，显著地减少去甲肾上腺素以及增加多巴胺和多巴 胺/去甲肾上腺素比率，在10mg/kg/d应答开始时到延长至60mg/kg/d有一平台。在左心 室中观察到类似结果，不同的是多巴胺无显著增加。在大脑皮层中，在30和60mg/kg/d下 去甲肾上腺素显著减少，在全部剂量下多巴胺和多巴胺/去甲肾上腺素比率显著增加。总 之，在狗中在至少10mg/kg/d的剂量下，内匹司他是一种有效的口服有活性的DBH抑制剂。内匹司他具有与甲巯咪唑类似的结构，该甲巯咪唑是一种体内甲状腺过氧化酶的 有效抑制剂。在4或12.4mg/kg/d，p.o.的内匹司他剂量在用低碘饮食喂养并给药10天的 雄性Sprague-Dawley大鼠中对三碘甲腺原氨酸(三碘甲腺原氨酸)或甲状腺素的血清水 平无作用，而甲巯咪唑(2mg/kg/d)显著降低了三碘甲腺原氨酸或甲状腺素的血清水平。因 此，与甲巯咪唑不同，内匹司他不会影响三碘甲腺原氨酸或甲状腺素的血清水平。内匹司他在清醒的、束缚的SHR中诱发显著的抗高血压作用达至多4小时 (1. 0-30mg/kg, p. ο.)，并且显著降低了心率(10和30mg/kg)。内匹司他在清醒的、束缚的 SHR中的抗高血压作用(10mg/kg，p. ο.)未能通过用多巴胺受体(DA-I)拮抗剂SCH-23390 预治疗来减弱。内匹司他(10mg/kg)还在清醒的、束缚的血压正常的Wistar-Kyoto大鼠中 在给药后4小时降低了血压；然而压力减少比之于用SHR(-46mmHg)更少(-13mmHg)。概括 地讲，内匹司他在SHR和血压正常的大鼠引起血压减少，尽管该抗高血压作用在SHR中更显 著。在SHR中的抗高血压作用未显示出通过DA-I受体介导。在脑脊髓刺毁的SHR中在给药(3mg/kg p. ο.)后5小时，内匹司他还对节前神经 刺激的高血压和节前神经刺激显著减弱。因此，内匹司他在对交感神经刺激的反应中减少 了血压的上升。
麻醉的SHR用内匹司他(3. Omg/kg, i. v.)急性静脉治疗在3小时时间减少了平均 动脉压，但未降低肾血流量或者改变钠或钾的尿生成或尿排泄。给药后计算的肾血管阻力 减少。试图使用DA-I拮抗剂SCH-23390来评价内匹司他的肾脏舒血管作用是否是由DA-I 受体介导。然而此化合物在单独给药时降低了血压，这使得结果不可解释。总的来说，内匹 司他在麻醉SHR中不会损伤肾功能，并且不会减少肾血流量，尽管它会引起动脉血压降低。用内匹司他(1和10mg/kg，p.o.)每日治疗SHR达21天不会像由尾缚带方法测定 的那样改变心率或收缩压。然而，当大鼠被束缚并且它们的血压直接通过动脉套管测定时， 内匹司他(10mg/kg，p. ο.)诱发显著的抗高血压作用。在有无线电遥测血压换能器的SHR工具中用30和100mg/kg/d的剂量达30天，内 匹司他显著降低血压，但在3和10mg/kg/d时观察到未产生显著作用。在单次给药后，30和 100mg/kg/d的作用持续经历24-小时时间，并且在30天的作用未降低。心率未增加，运动 活动未受影响。未能降低血压的血管紧张素转化酶抑制剂依那普利的剂量(lmg/kg，p.o.) 与内匹司他(30mg/kg)的组合在给药30天引起内匹司他抗高血压作用的增强，并导致左心 室质量显著减少。左心室质量的减少在单独用依那普利时未发生。因此，用内匹司他30和 100mg/kg/d治疗SHR 30天导致血压减少，并且当与依那普利组合时，在左心室质量减少的 同时有另外的血压减少。在有无线电遥测血压换能器的血压正常的Wistar大鼠工具中，以30和100mg/kg/ d给药7天，内匹司他的血压降低作用低于在SHR中观察到的作用。在30mg/kg/d时，血压峰 值减少为-IOmmHg,与此相比在SHR中为-20。在100mg/kg/d时，血压峰值减少为_17mmHg， 与此相比在SHR中为-42。因此，在SHR中比在血压正常的大鼠中内匹司他具有更大的血压 降低作用。正常麻醉狗研究显示在急性静脉给药(l-10mg/kg i. v.)后没有内匹司他的心血 管作用，在给药后至多达5小时，动脉血压、左心室压(包括峰dp/dt)、心率、心输出量或肾 血流量无变化。单次给药(3-30mg/kg i. v.)后，在慢性工具化、清醒狗研究中观察到类似 的作用缺乏达12小时。在给予麻醉雄性比格狗长达5小时之后，内匹司他(30mg/kg，十二指肠内)未显著 抑制对直接肾神经刺激反应的肾血流量减少，也未显著抑制对颈动脉闭塞反应的动脉血压 增加。然而，在肠系膜动脉中在给药后5小时，内匹司他引起显著的去甲肾上腺素水平降低 以及多巴胺/去甲肾上腺素比率增加，但未引起多巴胺水平增加。因此，尽管组织去甲肾上 腺素水平显著降低，但是未显著抑制交感神经-诱发的功能反应。当内匹司他以10mg/kg/d给予雄性比格狗4. 5天时，无统计学显著的减少血压和 心率，增加对麻醉动物颈动脉闭塞应答增加。内匹司他治疗显著降低了对i. v.酪胺攻击应 答的心率增加，但仅产生轻微的和非显著的血压增加的抑制作用。因此，以显示导致组织去 甲肾上腺素水平最大减少的剂量长期给予内匹司他对交感神经诱发的功能应答没有较大 的抑制剂作用。小鼠急性给予1. 0-30mg/kg, p. ο.后内匹司他未引起对总的运动行为的显著作 用，并且不会影响小鼠活动能力(10-100mg/kg i.p·)。大鼠急性施用不会影响活动能力或 听觉惊恐反应性(3-100mg/kg i.p.)。以10、30和100mg/kg/d，p. ο. (AT 6867)给药10天在大鼠中观察到没有行为影响。直肠温度也未受影响。通过用DBH抑制剂SKF102698(100mg/kg/d，p.o.)治疗，以及通 过中枢作用a-肾上腺素激动剂可乐定(20mg/kg，b. i. d.，p. ο.)，显著降低了运动活动和听 觉惊跳反射。在给予SHR(3-100mg/kg/d，p.o.) (AT 6829)达30天后运动活动也未受影响。 因此，内匹司他不会引起大鼠中枢神经系统介导的行为影响的可检测的变化。内匹司他是人DBH体外以及大鼠和狗体内的有效竞争性抑制剂。在大鼠中，以 6mg/kg/d的剂量用内匹司他口服治疗产生了心脏和肠系膜动脉中DBH抑制作用的显著证 据。与另一DBH抑制剂SKF 102698相反，相对于大脑皮层而言，内匹司他显示出对左心室和 肠系膜动脉的一定选择性。在大鼠中用内匹司他观察到无行为影响。在狗中，在心脏、肾动 脉和肾脏中，10mg/kg/d出现DBH抑制的平台作用；未鉴别到显著作用的最小剂量。在SHR 中，内匹司他显著减少对交感神经刺激的高血压反应(3mg/kg p.o.)，并且其每天一次给药 (30mg/kg/d p. ο.)达30天时自始至终显著降低了血压。总之，内匹司他是调节交感神经系 统作用的有效DBH抑制剂。实施例9这里描述的本研究设计来评价内匹司他较高口服剂量的药物代谢动力学，以比较 雄性和雌性大鼠中的药物代谢动力学，以及通过对脑中内匹司他的水平定量来测定内匹司 他进入CNS中的渗透作用。使重量为180_220g的雄性大鼠(Crl ⑶BR Vaf+)在给药之前禁食过夜，直到给 药后4小时。使剂量配制在含有2% 1-羟丙基甲基纤维素(50厘泊粘度)、1%苯甲醇和 0. 6% Tween 80 (均得自 Sigma ChemicalCompany)的水中。对于 10、30 和 100mg/kg 剂量， 药物在该剂量溶液中的浓度分别为5、15和50mg/ml，并且通过液相色谱法(LC)确认。5mg/ ml剂量为澄清溶液，更高浓度为半透明混悬液。给药体积为2. OmlAg0在给药后的各时间， 用肝素化注射器通过心脏穿刺获得血液样品，通过离心制备血浆。外科手术切断大鼠的脑， 并将全部样品冷冻于-20°C，直到分析。使等份样品(0.05或0.5ml)与内标(50 μ 1甲醇，其中含有5 μ g/ml内匹司他 的单氟类似物以及5mg/ml 二硫苏糖醇)混合。将样品与200mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0， (0. 5ml)混合，再用3ml乙酸乙酯/己烷(1/1，ν/ν)萃取。含有分析物的有机相用250 μ 1的 250mM乙酸反萃取，再通过LC分析100 μ 1等份的水相。该LC系统在室温下使用Keystone HypersilBDS 15cm C8柱。流动相A为含有5mM十二烷基磺酸的12. 5mM磷酸钾，pH 3.0，流 动相B为乙腈。溶剂组成为40% B，并以lml/min的流速泵入。在261nm处通过UV吸收检 测。分析物浓度是根据由增加已知浓度分析物的未治疗大鼠血浆的分析生成的标准曲线测 得的。血浆浓度数据表示为yg(游离碱)/ml。使脑用盐水短暂地清洗，在纸毛巾上吸干，然后称重(1.5_2.0g)。加入内标 (50 μ 1甲醇，其中含有20μ g/ml内匹司他的单氟类似物)，使脑在含有0. 5mg/ml 二硫苏糖 醇的5ml的200mM磷酸钠，pH 7. 0中勻浆。将等份勻浆物(2ml)用IOml的乙酸乙酯/己 烷(1/1，ν/ν)萃取。使该有机相用150 μ 1的250mM乙酸轻轻反萃取。向水相添加100 μ 1甲醇之后(分析任何乳液)，如针对血浆所述通过LC分析 ιοομ 等份。脑中水平表示为yg(游离碱)/g脑组织。药物代谢动力学参数由平均血浆浓度计算。血浆半衰期(Tv2)计算为0. 693/ β， 其中β是通过log血浆浓度对在该数据末端直线部分之内的时间数据的线性回归测得的消除速率常数。从0至最终可定量血浆浓度的时间的血浆浓度对时间曲线下面积(AUC)是 通过梯形法计算的。从0至无穷的AUC(AUCg)计算为AUC总=AUC(0-C最后)+C最后/β，其中C最后是最后可定量的血浆浓度。图29显示了大鼠血浆和脑中内匹司他的药物代谢动力学参数。给予10、30或100mg/kg单次口服剂量的雄性大鼠血浆中内匹司他的浓度显示于 图30-32，并绘制于图33中。血浆中内匹司他浓度随剂量增加而增加，并且AUC总与剂量之 间的关系呈线性(图34)。消除半衰期在较高剂量下显示稍微增加(10、30和100mg/kg 口 服剂量给予雄性大鼠之后分别为1. 70,2. 09和3. 88hr)。30mg/kg内匹司他口服给予雌性大 鼠之后，内匹司他的血浆AUC@在雌性大鼠中比在给予等效剂量内匹司他的雄性大鼠中高 77% (图33和35)。脑中内匹司他水平(表示为yg/g)起初低于血浆中的水平(表示为 yg/ml)。然而，从给药后向前2小时，脑中内匹司他浓度超过血浆中的浓度(图36-37)。雄性大鼠内匹司他的血浆水平随10至100mg/kg之间剂量增加而线性增力口，基于 AUC貞的值。30mg/kg 口服剂量后，内匹司他的血浆水平在雌性大鼠中比在雄性大鼠中高。给雄性大鼠施用10mg/kg内匹司他口服剂量后，脑中内匹司他水平在最初低于血 浆中的水平，但是向前2小时起脑中内匹司他水平高于血浆中的。实施例10本项研究的目的是测定单次口服给予自发性高血压大鼠后，内匹司他(10mg/kg) 对肠系膜动脉中多巴胺和去甲肾上腺素水平作用的24小时时间过程。单次口服施用内匹 司他(10mg/kg)或载剂(dH20;10ml/kg)后，在1、2、4、6、8、12、16和24小时测定儿茶酚胺 水平。16-17周龄，体重300-400克的雄性自发性高血压大鼠(SHR)不限制食物和水。对 动物称重并随机分配，研究之前的下午，给以下治疗组(η = 9/组)之一在1，2，4，6，8， 12，16或24小时单次口服施用内匹司他10mg/kg或单次口服施用载剂(10ml/kg)，直到被 处死° 内匹司^也是由 the Instituteof Organic Chemistry, Syntex Discovery Research 以盐酸盐合成的，并且得自Syntex Central Compound Inventory。将内匹司他溶解于载 剂(dH20)中，得到可以10ml/kg重复体积施用口服剂量。内匹司他的全部剂量是以游离碱 当量施用的，并且在施用的早晨配制。处死的早晨，动物每分钟给药。在施用后1，2，4，6，8， 12，16和24小时，9只治疗动物和9只载剂动物用氟烷麻醉，断头，再迅速采集左心室和肠 系膜动脉并称重。将该肠系膜动脉置于在离心管中的0. 5ml的0.4M高氯酸中，将左心室置 于空冷管(cryotube)中。立即使两种组织在液氮中冷冻，并保存于_70°C。使用HPLC以电 化学检测测定肠系膜动脉儿茶酚胺水平。在断头时，通过将血从尸体引流到含有肝素的管 中来取血浆样品，再在4°C下离心。在每个时间点使每一治疗组与载剂比较。进行结果TRT、HARVEST及其相互作用的 双因素方差分析(ANOVA)。因子TRT的单因素ANOVA是针对每一采集时间进行的。在每一 时间点治疗动物与载剂动物之间的配对分析是使用Fisher' s LSD策略进行的，以控制试 验-方法错误率。仅在4小时时间点去甲肾上腺素值显著(p<0.05)低于载剂。在6小 时时间点水平勉强的(0.05 <p<0. 1)低(图38)。在2和6hr采集时间多巴胺水平显著 (P < 0. 05)高于载剂的多巴胺水平(图39)。在1、2、4、6和12小时时间点，多巴胺/去甲
46肾上腺素比率显著(P < 0. 05)高于载剂治疗的动物的比率(图40)。通常，在自发性高血压大鼠单次口服施用10mg/kg之后，在给药后1、2、4、6、8、12、 16或24小时，内匹司他对肠系膜动脉去甲肾上腺素或多巴胺水平具有很少统计学显著作 用。然而，在治疗的第一个12小时几乎全部观察到多巴胺/去甲肾上腺素比率连贯的增加。 在16和24采集时间，观察到在这三个参数中任一个都没变化。实施例11本项研究的目的是测定静脉内施用内匹司他(下文称为内匹司他)对 Sprague-Dawley大鼠左心室中多巴胺和去甲肾上腺素水平的作用。使动物接受静脉(iv) 施用(间隔12小时)载剂(75%丙二醇+25% DMSO ；1. 0ml/kg)或15mg/kg的内匹司他。 在最后化合物施用之后6小时测定组织去甲肾上腺素和多巴胺水平。16-17周龄，体重300-400克的雄性Sprague-Dawley大鼠不限制食物和水。对动物 称重并随机分配，研究之前的下午，给以下治疗组(η = 10/组)之一载剂(1. 0ml/kg)或内 匹司他 15mg/kg。内匹司他是由 thelnstitute of Organic Chemistry, Syntex Discovery Research合成的，并且得自Syntex Central Compound Inventory。将内匹司他溶解于适 量载剂(75%丙二醇+25% DMS0)中，获得1. 0ml/kg的给药体积。内匹司他是以游离碱当 量施用的，并且在首次施用之前的下午配制。采集之前的下午每只大鼠iv尾静脉给药。下一早晨之后12小时重复给药。最后 施用之后6小时，大鼠用氟烷麻醉，断头，再迅速采集左心室并称重。将该心室置于1. Oml 冰冷的0.4M高氯酸中。使组织立即在液氮中冷冻，并保存于-70°C。通过高效液相色谱法 使用电化学检测分析组织多巴胺和去甲肾上腺素浓度。对去甲肾上腺素以治疗的主要作用进行单因素方差分析(ANOVA)。针对多巴胺以 及它们主要由于各治疗组之间异质性方差的比率进行Kruskal-Wallis。接着在内匹司他治 疗大鼠和载剂治疗大鼠之间使用Fisher' s LSD检验进行配对比较。在所有P-值上进行 Bonferroni调节，以确保5%的全部试验-方法1型错误率。与载剂治疗的动物相比，以15mg/kg施用内匹司他显著(ρ < 0.01)减小去甲肾 上腺素水平51% (图41)，显著(ρ<0.01)增加多巴胺水平472% (图42)，并且显著(ρ <0.01)增加多巴胺/去甲肾上腺素比1117% (图43)。总之，静脉内施用内匹司他造成Sprague-Dawley大鼠左心室中DBH的显著抑制作用。实施例12本项研究评价内匹司他在改变雄性自发性高血压大鼠(SHR)皮层、左心室和肠系 膜动脉中的多巴胺和去甲肾上腺素水平的作用。动物以3、10、30或100mg/kg p. ο.给药三 次，间隔12小时。本项研究还比较了 S对映体(内匹司他)与R对映体((R)-5-氨基甲基-1-(5， 7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐)给药三次(30mg/ kg)以后的效果。本项研究还比较了内匹司他与SKF102698( —种先前显示在大鼠中口服有效的 DBH抑制剂)的作用。制备化合物并以游离碱等当量施用。内匹司他，(R)-5_氨基甲基-l-(5，7-二
47氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐以及SKF 102698得自 Syntex Central Compound Inventory。将内匹司他溶解于适量载剂(内匹司他用dH20， SKF102698 用 PEG 400 dH20, 50 50(体积体积))中。将 3、10、30 和 100mg/kg 的内 匹司他以及30mg/kg SKF 102698的剂量制备于10. 0ml/kg给药体积中。15-16周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR) (Charles River Labs)不限制食物和水。 动物称重并随机分派到下列治疗组之一 1)蒸馏水载剂(dH20)，或3、10、30的100mg/kg的 内匹司他，2)在蒸馏水中的30mg/kg的(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3-二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐，或3) PEG 400 dH20载剂或30mg/kg的 RS-2643 1-000。每只大鼠口服给药(p. ο.，使用灌食针)三次，间隔12小时，在早晨开始。 第三次给药后6小时，将大鼠用氟烷麻醉，断头，再迅速采集皮层、肠系膜动脉和左心室，称 重，置于冰冷的0. 4Μ高氯酸中，在液氮中冷冻，并保存于-70°C。通过高效液相色谱法和电 化学检测分析组织多巴胺和去甲肾上腺素浓度。进行四轮统计分析。第一轮比较用不同剂量的内匹司他和30mg/kg的(R)_5_氨 基甲基-1- (5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐治 疗的大鼠与载剂对照动物。用因子剂量和封闭因子天对每种组织和物种分别进行非参数 单因素方差分析(ANOVA)。报告总结果。每种剂量的治疗和对照之间的配对分析是使用 Durmett’ s检验进行的，以控制试验-方法错误率。使用非参数t_检验，第二统计学检验比 较SKF102698与PEG-ClH2O载剂治疗的组。使用非参数t-检验，第三统计学检验比较30mg/kg 的(R) -5-氨基甲基-1- (5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪 唑盐酸盐与内匹司他。第四统计分析比较30mg/kg的RS25560-197与SKF 102698。由于使 用两种不同载剂，开发线性对比法，其计算以下差值的差值变化=(30mg/kg-载剂)内匹司他_(30mg/kg-载剂)SKF102698通过SAS程序普通线性模型对均勻至零来检验此新变量。图中的全部数据是出现的士标准差。 在30和100mg/kg的内匹司他的剂量下，与载剂相比，大脑皮层中的多巴胺浓度显 著(P < 0. 05)更高(图44)，去甲肾上腺素浓度显著(ρ < 0. 05)更低(图45)，并且多巴 胺/去甲肾上腺素比率显著(P < 0. 05)更高(图46)。在3、10、30和100mg/kg的剂量下，与载剂相比，左心室中的多巴胺浓度显著(ρ <0. 05)更高(图47)。在10、30和100mg/kg的剂量下，与载剂相比，去甲肾上腺素浓度显 著(ρ <0.05)更低(图48)。在3、10、30和100mg/kg内匹司他的剂量下，与载剂相比，左 心室中的多巴胺/去甲肾上腺素比率显著(ρ <0.05)更高(图49)。在3、10、30和100mg/kg的剂量下，与载剂相比，SHR的肠系膜动脉中的多巴胺浓 度显著(P < 0. 05)更高(图50)。在10、30和100mg/kg，去甲肾上腺素浓度不显著(ρ > 0.05)低于载剂(图51)。在内匹司他的所有剂量下，与载剂相比，肠系膜动脉中的多巴胺 /去甲肾上腺素比率显著(P < 0. 05)更高(图52)。在大脑皮层中，与用载剂治疗相比，(R)-5-氨基甲基-1-(5，7-二氟-1，2，3，4-四 氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐造成多巴胺(图53)和去甲肾上腺素 (图54)均显著增加(ρ <0.01)，并且对多巴胺/去甲肾上腺素比率无作用(图55)。与 (R) -5-氨基甲基-1- (5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐相比，用内匹司他显著降低去甲肾上腺素水平(P < 0.01)(图54)。在左心室中，与用载剂治疗相比，(R) -5-氨基甲基-1- (5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐造成多巴胺(图56)和多巴胺/去甲肾上 腺素比率(图58)显著增加(ρ < 0.01)，但未显著降低去甲肾上腺素水平(图57)。在降 低去甲肾上腺素水平(图57)以及增加多巴胺和多巴胺/去甲肾上腺素比率(图56和58) 中，内匹司他比(R) -5-氨基甲基-1- (5，7-二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫 代-IH-咪唑盐酸盐显著更有效(ρ < 0. 01)。在肠系膜动脉中，与用载剂治疗相比，(R)-5_氨基甲基-l-(5，7-二氟_1，2，3， 4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐造成多巴胺(图59)以及多巴胺 /去甲肾上腺素比率(图61)显著增加(ρ <0.01)，但未显著降低去甲肾上腺素水平(图 60)。在降低去甲肾上腺素水平(图60)以及增加多巴胺和多巴胺/去甲肾上腺素比率(图 59和61)中，内匹司他比(R)-5-氨基甲基-l-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢萘_2_基)_2， 3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐显著更有效(ρ < 0. 01)。在大脑皮层中比较30mg/kg的内匹司他与SKF102698，对于30mg/kg剂量的SKF 102698，与载剂相比，皮层中的多巴胺浓度显著更高(ρ <0.01)(图53)。对于SKF102698 而言比之于对内匹司他而言，增加以上载剂更多(P < 0. 01)。对于SKF102698而言比之于 载剂，去甲肾上腺素浓度显著更低；并且对于SKF102698而言比之于对内匹司他而言，该减 少更大(P < 0. 01)(图44)。对于SKF102698而言比之于载剂，皮层中的多巴胺/去甲肾 上腺素比率显著(P < 0. 01)更大(图55)；并且对于SKF102698而言比之于对内匹司他而 言，增加以上载剂更多(P <0.01)。对于SKF102698而言比之于载剂，左心室中的多巴胺浓度显著更大(ρ < 0. 01) (图56)；并且对于内匹司他而言比之于对SKF 102698而言，增加以上载剂更多(ρ <0.01)。去甲肾上腺素浓度用SKF 102698治疗时与载剂没有差异；然而，相对于载剂，用 内匹司他比SKF 102698治疗显著降低去甲肾上腺素(ρ < 0. 01)(图57)。对于SKF102698 而言比之于载剂，左心室中的多巴胺/去甲肾上腺素比率显著(ρ <0.05)更高(图58)； 并且对于内匹司他而言比之于对SKF 102698而言，增加以上载剂更多(ρ < 0. 05)。对于SKF102698而言比之于载剂，肠系膜动脉中的多巴胺浓度显著更高(图59)； 并且对于内匹司他而言比之于对SKF 102698而言，增加以上载剂更多。去甲肾上腺素浓度 用SKF 102698治疗时比用载剂显著更低；并且相对于载剂，用内匹司他比SKF 102698治疗 显著降低去甲肾上腺素(图60)。对于SKF102698而言比之于载剂，左心室中的多巴胺/去 甲肾上腺素比率显著更高(图61)；并且对于内匹司他而言比之于对SKF 102698而言，增 加以上载剂更多。总之，该数据显示，在12小时间隔三次口服剂量施用的第三次施用之后6小时，在 SHR的肠系膜动脉、左心室和大脑皮层中，内匹司他是DBH体内的有效抑制剂。在所有三种 组织中，30mg/kg，S对映体内匹司他比R对映体((R) -5-氨基甲基(5，7- 二氟-1，2，3， 4_四氢萘-2-基)-2，3-二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐)更有效。此外，以30mg/kg三次 剂量施用经24小时之后，在肠系膜动脉和左心室中，内匹司他比SKF 102698更有效，但在 大脑皮层中效果更低。实施例13
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制备内匹司他，并以游离碱等当量施用。将内匹司他和甲巯咪唑溶解于载剂 (66. 7%丙二醇33.3% dH20)中，得到适宜浓度的给药溶液，使得全部剂量可以以1.0ml/ kg体积施用。在治疗之前，给重量为180-200克的雄性Sprague-Dawley大鼠用缺碘饮食 (Purina，5891C，Lot 1478,0. 066士0. 042mg碘/kg样品)不限制喂养14天。动物称重并 随机分派到以下治疗组之一(η = 12/组)内匹司他2. Omg/kg，内匹司他6. 2mg/kg, R，甲 巯咪唑lmg/kg，或载剂lml/kg。每组大鼠在晚上接着在早上口服给药，约12小时间隔，连 续10天。在第10天，在第二次给药后4小时，大鼠用氟烷麻醉，断头，采集皮层、纹状体和肠 系膜动脉，称重。甲巯咪唑组未采集组织样品，因为它们仅用作测定甲状腺功能的阳性对 照。将肠系膜动脉、皮层和纹状体立即置于0. 4M冰冷的高氯酸中，并在同一天使用HPLC分 析去甲肾上腺素和多巴胺水平。在第_3、0、3、7和9天(第0天是给药的第一天)取眼眶血样。使用放射免疫法 针对T3和T4水平分析血清样品。为了统计学评估T3和T4水平的变化，从第_3天时间点根据基线计算变化。进行受 试者中非参数双因素方差分析(ANOVA)。还进行单因素AN0VA，以检测与对照出现的是否有 显著差异。使用Fisher' s LSD策略进行对照和各治疗组之间的配对分析，以控制试验-方 法错误率。对于儿茶酚胺水平的统计分析，进行具有因子DOSE的单因素AN0VA。在每一给 药时的治疗和对照之间的配对分析是使用Fisher' s LSD策略进行的，以控制试验-方法 错误率。内匹司他以2. 0和6. 2mg/kg的剂量治疗的动物中，与载剂对照相比，皮层中的去 甲肾上腺素水平无显著(P > 0. 05)差异。与载剂对照相比，在2. 0和6. 2mg/kg给药组肠 系膜动脉中的去甲肾上腺素水平显著(P < 0. 05)更低，在2. 0和6. 2mg/kg两个给药组纹 状体中的去甲肾上腺素水平勉强(P < 0. 10)更低(图62)。在2. 0或6. 2mg/kg剂量组的内匹司他中，全部三种组织中的多巴胺水平与载剂对 照无显著(P > 0. 05)差异(图62)。在2. 0和6. 2mg/kg RS_25560_197的皮层和纹状体中的多巴胺/去甲肾上腺素比 率与载剂对照无显著(P > 0. 05)差异，而在2. 0和6. 2mg/kg内匹司他的肠系膜动脉中的 该比率显著(P < 0. 05)高于载剂对照(图62)。2. 0或6. 2mg/kg内匹司他均未通过改变大鼠血清中的游离T3或总T4水平影响甲 状腺功能。与载剂对照相比，阳性对照1. Omg/kg的甲巯咪唑的剂量显著地(ρ < 0. 05)降 低所有治疗日的T3水平(图63)以及第3天和第7天的T4水平(图64)。甲巯咪唑治疗 动物的T4水平仅在第9天勉强(ρ < 0. 10)更低。与载剂相比，内匹司他(2. 0或6. 2mg/kg)未引起多巴胺或去甲肾上腺素水平或 多巴胺/去甲肾上腺素比率的任何显著(p>0.05)改变。在纹状体中，去甲肾上腺素水 平勉强显著(P < 0. 10)减少在6. 2mg/kg剂量组中观察到，但未观察到其它显著变化。与 载剂相比，在肠系膜动脉中，2. 0和6. 2mg/kg的内匹司他均产生显著(ρ < 0. 05)更低的去 甲肾上腺素水平以及显著(P<0. 05)更高的多巴胺/去甲肾上腺素比率，未观察到多巴胺 水平的显著变化。因此，内匹司他显示在体内是一种有效的多巴胺羟化酶的抑制剂，
50Sprague-Dawley大鼠10天给药之后在肠系膜动脉中比在大脑皮层或纹状体中更为有效。实施例14进行本项研究以测定给予内匹司他狗的肾髓质和肾皮质中的多巴胺和去甲肾上 腺素浓度。成年雄性比格狗被随机分派到8只狗/组的四个组，并通过口服施用给予内匹 司他。以置于单个胶囊中的内匹司他5、15和30mg/kg的剂量投药。载剂为空胶囊。每只 狗每天早晨和下午接受2次给药(间隔8-10小时)达4天。在第5天，每只狗在早晨接受 单次给药，最后一次给药6小时后使狗安乐死。迅速采集肾髓质和肾皮质的样品，称重，置 于冰冷的0. 4M高氯酸中，在液氮中冷冻，并保存于-70°C。为了定量去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(D)的浓度，通过0.4M高氯酸中短暂声处 理将组织勻浆。声处理后，在4°C下使该勻浆物以13，OOOrpm在微量离心管(microfuge)中 离心30分钟。移取等份的每个上清液，再掺入3，4-二羟基苄胺(DHBA)作为内标。使来自 每个样品的萃取物使用电化学检测进行HPLC分离。方法的定量限为2. Ong/mL，对于各分析 物的线性范围为2. Ong/mL至400ng/mL。分析结果提供于图65和66。将每个分析物测定标准化为组织样品的重量，并且表 示为每克组织的分析物yg数。该表包含从每只狗获得的多巴胺、去甲肾上腺素的浓度以 及多巴胺浓度比去甲肾上腺素浓度的比率(D/NE)。此外，对于各治疗组提供每一分析物计 算的平均和标准差以及D/NE比率。实施例15重量为9-16kg的雄性比格狗(Marshall farms, North Rose, NY)被用于该研究。 使动物不限制饮水，并且每天一次在 10. 00ΑΜ进食。动物被随机分派到下列治疗组之一 (η = 8只/组)安慰剂(空胶囊)或2mg/kgb. i. d(4mg/kg/天)的内匹司他。每只动物 每天在早晨和下午(间隔8-10小时)接受2次给药。在AM给药后6小时抽取每天的血样 (IOml)，以供内匹司他和儿茶酚胺的血浆水平的测定。将样品收集到含有肝素和谷胱甘肽 的试管中，在收集的1小时以内在_4°C下离心。分离血浆，分成两个样品，一个用于测定血 W L茶酚胺，另一个用于分析内匹司他。在稍后的点上认为有必要分析组织儿茶酚胺时，在研究结束时还从狗中取组织样 品。在第15天，AM给药后6小时，取最终血液样品(10ml)。将狗用戊巴比妥钠(40mg/kg， iv)麻醉，置于尸体剖检台上，再第二次注射戊巴比妥(80mg/kg，iv)实施安乐死。进行快速 两侧穿胸廓切开术以及剖腹术。活组织检查取自肾动脉和左心室。打开颅骨以暴露大脑皮 层的额叶，进行活组织检查。将组织样品称重，置于冰冷的0.4M高氯酸中，在液氮中冷冻， 并保存于-70°C，直到分析。使用电化学检测经HPLC分析血浆NE、DA和EPI。使用电化学检测经HPLC测定内 匹司他的血浆浓度。Box-Cox变换法表明，该对数是一种适宜的变量稳定变换法；因此所有分析对 log-值进行。在第10天第1只狗的DA浓度的BQL(定量限以下)定义为0;1η(0)设定为 没有。使用混合模型(使用PROC MIXED)进行分析，固定天数和治疗分类变量，治疗中的狗 为随机因子。对于该固定效应，包括了天数和治疗之间的相互作用，因为药物与安慰剂组之 间的差异是天天在变化的。使用CONTRAST声明计算对比度，其恰当地考虑到每一特定对比 度误差项目。特别地，包括治疗组比药物组的该对比度使用狗对于其误差项的方差，而用于
51建立稳态的比较均在狗比较之中并且要求该误差方差。使用Helmert变换法(cf. SAS PROC GLM手册)计算稳态时期。这些变换比较各 治疗均值与以下时间点治疗均值的平均值。该稳态时期定义为在Hehnert对比为统计学显 著的最大时间之后的第一时间点开始。然而，由于此方法可能不能检测平滑变化过程，正如 可能在此情况下出现的，还计算了稳态期间的分析物浓度的斜率。对于每只狗分别计算稳 态期间的斜率，得到每只动物一个斜率。然后计算对于斜率的单变量统计，用标准理论置信 区间建立平均斜率，并检验斜率等于0的假设，并且计算其标准理论ρ-值。使用此斜率分 析，其基于测定稳态期间是否是改变浓度的时间。当与安慰剂组比较时，内匹司他(2mg/kg，bid)产生了显著减少血浆NE (2. 1倍) 和EPI (1.91倍)，以及显著增加血浆DA (7. 5倍)和DA/NE比率(13. 6倍)(参见图67-71)。 分别在第6天和第8天观察到血浆NE和EPI的峰减少，而分别在第7天和第6天观察到血 浆DA和DA/NE比率的峰增加。对血浆NE、DA和EPI的作用分别在给药后约4、8和6天达 到稳态。在给药后所有天中，血浆DA和DA/NE比率中的变化均显著不同于安慰剂的。在给 药后4-9天以及11-13天，血浆NE变化显著不同于安慰剂的。在给药后7-9天以及第12 天，血浆EPI变化显著不同于安慰剂的。施用内匹司他(2mg/kg，bid)在所有天中均产生显著的药物血浆水平(图72)。在 给药后2天观察到峰水平。在任一天均未检测到显著水平的内匹司他的N-乙酰基代谢产 物。长期(14. 5天)施用内匹司他(2mg/kg，bid, po)产生了血浆NE和EPI的显著减 少以及血浆DA和DA/NE比率的显著增加。这些变化反映了交感肾上腺系统通过抑制多巴 胺-β-羟化酶的抑制作用。实施例16对内匹司他称重，并置于胶囊(大小为13-Torpac ；East Hanover, NJ)中，得到每 粒胶囊5、15和30mg/kg的剂量(b. i. d.给予，得到10、30和60mg/kg/天的剂量)。初始狗 体重用于确定每只动物的剂量。接受Omg/kg/天的狗接受空胶囊(安慰剂)。内匹司他的 所有给药均以游离碱当量施用。体重为10_12kg的32只雄性比格狗被随机分派到以下4个治疗组之一(η = 8/ 组)Omg/kg/ 天(安慰剂)UOmg/kg/ 天(5mg/kg b. i. d.)、30mg/kg (15mg/kg b. i. d.)或 60mg/kg/天(30mg/kg b. i. d.)的内匹司他。狗编号为1-16的分派到给药组A，狗编号为 17-32的分派到给药组B。每天用16只研究动物经2天进行用于组织采集的最终手术。在 第一化合物施用之前2或3天对每只狗称重，剃光覆盖每只狗头静脉、隐静脉和颈静脉上的 皮肤区域。每二次给药8-lOhr后给药包括口服施用一粒胶囊。在第1-3天按时间表给狗 用药。在第4天，AM给药之前，3ml血得自颈静脉以用于测定基线血浆化合物水平。然后给 狗施用AM剂量，并在给药后1、2、4和8小时收集另外3ml血液样品以用于测定血浆化合物 水平。将血液样品置于含有肝素的试管中，在4°C下离心，再保存于-20°C，直到分析。然后 按时间表施用PM剂量。在手术当天按时间表施用AM剂量。AM剂量以后约6hr，从颈静脉 取最终3ml血液样品，以用于测定血浆化合物水平。然后在头或隐静脉中iv给予戊巴比妥 Na ( 40mg/kg)将狗麻醉，送到尸体剖检室，在这里给予另外剂量的戊巴比妥Na ( SOmg/ kg, iv)。然后迅速采集左心室、肾动脉、肾、肾髓质、肾皮质和大脑皮层，称重，置于2ml冰冷的0. 4M高氯酸中，在液氮中冷冻，并保存于-70°C，直到对儿茶酚胺使用电化学检测经HPLC 进行分析。将所有组织分成2份，将第二份立即在液氮中冷冻，并保存于-70°C以用于测定 组织化合物水平。将取自左心室的第三个透壁样品立即在液氮中冷冻，并保存于-70°C以用 于受体结合研究。将心室在50mM Tris_HCl、5mM Na2EDTA 缓冲溶液(pH 7. 4，4°C )中使用 Polytron P-IO组织破碎器(设定10，2x15秒破碎)勻浆。将勻浆以500xg离心10分钟，将上清液 保存在冰中。通过重新混悬将该片状沉淀物洗涤，以500xg离心，合并上清液。将该合并的 上清液以48，OOOxg离心20分钟。通过重新混悬将该片状沉淀物洗涤，在勻浆缓冲液中离 心1次，再在50mM Tris-HCl，0. 5mM EDTA缓冲溶液(pH 7. 4，4°C )中离心2次。将膜保存 于-70°C直至需要用。使用在含有50mM Tris_HCl、0. 5mM EDTA(pH 7. 4，32°C)的缓冲液中 的[3H]CGP-12177进行饱和试验。通过IOuM异丙肾上腺素确定非特异性结合。总结合、非 特异性结合和总计数管设置成8个浓度的[3H]CGP-12177，范围为0.016nM至2nM。将样品 在32°C下孵育60分钟。将样品经0. 1% PEI预处理的GF/B玻璃纤维滤器使用Brandel细 胞收集器过滤。用室温水洗涤样品三次达3秒。将水溶胶闪烁液加至每个小瓶中，再通过液 体闪烁计数测定放射活性。在首次将总配体浓度转换成游离配体浓度(总-结合=游离) 之后分析饱和结合等温线。对每种组织完成个别的饱和等温线。使用Bio-Rad蛋白结合法 并使用Y-球蛋白作为标准对蛋白分析膜。受体密度表示为，每mg蛋白，各治疗组的平均 值。通过比较内匹司他-治疗的组与安慰剂(对照)治疗的组来分析组织儿茶酚胺水平。 对各组织和各儿茶酚胺测量值分别进行具有因子DOSE的非参数单因素方差分析(ANOVA)。 在各剂量下治疗和对照之间的配对分析是使用Durmett' s检验进行的，以控制试验-方法 错误率。进行Student-Neuman-Kuels和Fisher' s LSD检验当作验证。以2种方式进行 组织和血浆化合物水平的分析。首先，进行个别t-检验，以比较各剂量水平与各参数配对 剂量的因素化水平。例如，在特定组织或血浆中以10mg/kg存在的化合物水平应与在30mg/ kg组中观察到的化合物水平比较3次。另外，在单因素ANOVA的情况下对全部三个剂量计 算线性正交比较。配对t-检验用于测定载剂治疗的组与10mg/kg/天内匹司他组之间结合 的任何差异。在肾动脉中，以10、30和60mg/kg/天的剂量施用内匹司他分别显著地(ρ < 0. 01) 使去甲肾上腺素水平减少86%、81%和85% (图73)。多巴胺水平在10、30和60mg/kg/天 的剂量下分别显著地(P < 0.01)增加180%、273%和268% (图74)。与安慰剂相比，10、 30和60mg/kg/天内匹司他的剂量分别显著地(p<0.01)使多巴胺/去甲肾上腺素比率增 加1711%、1767%和1944% (图75)。施用10和60mg/kg/天内匹司他之后，在大脑皮层 中，多巴胺水平分别显著地(P<0.01)增加632%和411% (图76)。多巴胺/去甲肾上腺 素比率显著地(ρ < 0.01)在10mg/kg/天内匹司他之后增加531%，并且在施用60mg/kg/ 天内匹司他之后增加612% (图78)。在这2个剂量下去甲肾上腺素水平未受显著(p> 0.01)影响(图77)。与安慰剂相比，在30mg/kg/天下，去甲肾上腺素显著(ρ < 0. 01)降低 63%,比率显著(ρ < 0.01)升高86%，而多巴胺水平勉强(0.05 < ρ < 0. 10)增加174% (图76-78)。在10、30和60mg/kg/天内匹司他之后，在左心室中，去甲肾上腺素水平分别 显著(ρ <0.01)减少85%、58%和79% (图80)。与安慰剂动物相比，多巴胺/去甲肾上 腺素比率分别显著(P < 0. 01)增加852%、279%禾口 607% (图81)。在10、30和60mg/kg/天内匹司他的剂量下未观察到多巴胺水平显著变化(图79)。在肾皮质中，与安慰剂相比，在10、30和60mg/kg/天内匹司他给药后，去甲肾上腺 素水平分别显著减少(ρ < 0.01)86%、66%和85% (图83)。在这些剂量下，多巴胺水平 分别显著(ρ < 0. 01)增加156%、502%和208% (图82)。在10，30和60mg/kg/天的剂 量下，多巴胺/去甲肾上腺素比率分别显著(ρ <0.01)增加1653%、1440%和1693% (图 84)。在肾髓质中，与安慰剂相比，在10、30和60mg/kg/天内匹司他的剂量下，多巴胺/去甲 肾上腺素比率分别显著(p<0.01)增加555%、636%和677% (图87)。在30mg/kg/天下 多巴胺水平显著(P < 0. 01)增加522%，并且在10和60mg/kg/天下分别勉强(0. 05 < ρ < 0. 10)增加150%和156% (图85)。与安慰剂相比，去甲肾上腺素水平在施用10mg/kg/ 天内匹司他后显著(ρ <0.01)减少72%，并且在60mg/kg/天之后勉强(0. 05 < ρ < 0. 10) 减少69% (图86)。统计分析显示，第4天获得的血浆中内匹司他浓度以及第5天获得的组织和血浆 中内匹司他浓度在每一剂量水平与其配对剂量的因素化水平之间是呈剂量比例的。因此， 剂量点确定为线性的，但以下是例外的(显著性结果表明此类数据是非线性的)肾髓质=3X10 < 30 (ρ < 0. 05)肾髓质6Χ10 < 60 (ρ = 0. 077)血菜(第4 天)=2X30 > 60 (ρ = 0. 076)在第5天，所有检测的组织中内匹司他的水平比血浆中的更高(图88-90)。该结果证明10mg/kg/天内匹司他治疗的组与载剂治疗的组之间的左心室样品无 差异(图91)。实施例17评价内匹司他对一系列酶的活性，所述的酶包括酪氨酸羟化酶、NO合成酶、磷酸二 酯酶III、磷脂酶A2、中性肽链内切酶、Ca2+/钙调蛋白激酶II、乙酰CoA合成酶、酰基CoA-胆 固醇乙基转移酶、HMG-CoA还原酶、蛋白激酶(非选择性的)和环氧酶-I。图92中所示，内 匹司他对全部研究的12种酶具有> 10 μ M的IC5tl，因此是一种高度选择性的(> 1000-倍) 多巴胺-β-羟化酶的抑制剂。实施例18来自肾上腺的牛DBH得自Sigma Chemicals (St. Louis, MO)。人分泌的DBH是从 成神经细胞瘤细胞系SK-N-SH的培养基纯化的，并且被用于获得抑制数据。制备含有25ml 凝胶的晶状体凝集素-琼脂糖柱，并用50mM KH2PO4, pH 6. 5,0. 5M NaCl平衡。用35ml的 在50mMKH2P04,pH 6. 5,0. 5M NaCl中的10%甲基α，D-甘露吡喃糖苷以0. 5ml/min洗脱该 柱子。收集含有最大酶活性的级分，再用超过滤器(Amicon)搅拌池使用YM30膜浓缩。通 过与50mM KH2PO4, pH 6. 5,0. IM NaCl进行缓冲溶液交换以除去甲基α，D-甘露吡喃糖苷。 将该浓缩的酶溶液分等份，并保存于_25°C。HPLC分析用于测定DBH活性，其中使用酪胺和抗坏血酸作为底物。该方法基 于通过反相HPLC色谱法分离和定量酪胺和酚乙醇胺(Feilchenfeld，N. B.，Richter, H. & Waddell, W. H. (1982).Anal. Biochem :A time-resolved assay of dopamine β -hydroxylase activity utilizatinghigh-pressure liquid chromatography.122 124-128)。在 pH 5. 2 和 37°C 下，在 0. 125M NaAc、IOmM 富马酸盐、0. 5 2. 0 μ M CuSO4,0. lmg/ml 过氧化氧醇(6, 500u,Boeringer Mannheim, Indianapolis, IN) >0. ImM酷胺禾口 4mM 抗坏血酸中进行该分析。在典型的分析中，0. 5-1. 0毫单位的酶被加至反应混合物中，然后 加入含有过氧化氢酶、酪胺和抗坏血酸的底物混合物以引发反应(最终体积200μ 1)。使样 品在37°C下孵育30 40分钟。通过含有25mM EDTA和240 μ M 3-羟酪胺(内标)的终止 溶液将反应猝灭。将样品(150 μ 1)加载到Gilson自动采样器上，并通过HPLC使用UV检 测于 280ηΜ 处分析。使用 PC-1000 软件(Thermo Separationsproducts, Fremont, CA)进行 积分和数据分析。进行HPLC运行，流速为lml/min，使用LiChroCART 125-4RP-18柱，等度 洗脱使用IOmM酸性酸、IOmM 1_庚烷磺酸、12mM磷酸四丁基铵和10%甲醇。基于无抑制剂 的对照计算剩余百分活性，使用内标校正并拟合成非线性4参数剂量应答曲线，以获得IC5tl 值。[14C]-酪胺的纯化。[14C]酪胺盐酸盐是通过C18轻负荷柱(两个柱合并成一个 柱)纯化，将该柱子用2ml的Me0H，2ml的5OmM KH2PO4, pH2. 3，30%乙腈，然后用4ml的5OmM KH2PO4, pH 2. 3 洗涤。使用多头抽真空装置(Speed Mate 30, from Applied Separations) 洗涤，并通过真空洗脱该柱子。加载[14C]酪胺之后，将柱子用6ml的50mM KH2PO4,pH2. 3洗 涤，再用含有30%乙腈的2ml的50mM KH2PO4洗脱。将洗脱物冷冻干燥以除去乙腈，重新混 悬于H2O,再保存于-20°C。通过放射活性方法的酶分析法。酶活性是使用[14C]酪胺作为底物进行分析的，并 且用C18柱分离该产物。该分析是在含有IOOmM NaAc,pH5. 2、IOmM富马酸、0. 5μΜ CuSO4, 4mM抗坏血酸、0. lmg/ml过氧化氢酶和不同浓度的酪胺的200ml体积中进行的。每一反应的 总计数为 150，OOOcpm。在37°C下，使牛DBH(每一反应为0. 18ng)与在反应缓冲溶液中的 酪胺和抑制剂混合。通过添加抗坏血酸/过氧化氢酶混合物引发反应，并在37°C下孵育30 分钟。通过添加100ml的25mM EDTA、50mM KH2PO4,pH 2. 3来终止反应。将全部混合物加载 到C18轻荷载柱(两个柱合并成一个柱)中，将该柱子预先用MeOH洗涤，再用50mMKH2P04， PH 2. 3平衡。用Iml的KH2PO4,pH 2. 3缓冲溶液两次，接着用2ml的相同缓冲溶液，洗脱到 闪烁瓶中。将ReadySafe闪烁液(16ml)加至闪烁瓶中，针对14C放射活性对样品计数。使用0、l、2、4、8nM的内匹司他浓度以研究以下酪胺浓度的抑制动力学0. 5、1、2、 3、4mM。该14C计数在如上文所述进行的各反应中是相同的。使用无酶的空白对照来获得背 景。对背景校正数据，转换为以nmol/min为单位的活性，并绘图(1/V vs 1/S)。Km'是由 斜率计算的，并且使用Y截距和线性回归来获得Ki值。SKF102698、内匹司他和(R) _5_ 氨基甲基-1_(5，7_ 二氟 _1，2，3，4-四氢 萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐抑制人和牛DBH的IC5tl值是在pH 5. 2和 37°C下，使用HPLC分析法以0. ImM酪胺、4mM抗坏血酸的底物浓度来获得的。全部三个化合 物对牛和人酶均产生DBH活性的剂量依赖性抑制作用(图93和94)。内匹司他、(R)-5-氨基甲基-l-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3_二 氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐和SKF102698的IC5tl值给于图95。S对映体(内匹司他)比 R对映体((R) -5-氨基甲基-1- (5，7- 二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3- 二氢-2-硫 代-IH-咪唑盐酸盐更有效，抑制牛DBH时效率为3-倍，抑制人酶时效率为2-倍。内匹司 他比SKF 102698更有效，抑制牛酶时效率为8-倍，抑制人DBH时效率为9-倍。图96显示了对牛DBH的抑制数据的Lineweaver-Burk图(上格)，以及表观Km对抑制剂浓度的图(下格)。从该图中确定Km为0.6mM。内匹司他(I-SnM)弓丨起Km的较大 偏移，这可能预示其为一种竞争性抑制剂。内匹司他对牛DBH的抑制作用显示与酪胺有竞 争性。4. 7士0. 4nM的Ki是通过线性回归计算的。内匹司他是人和牛DBH的有效抑制剂。其效能比SKF102698大8_9_倍。内匹司他 (S对映体)的效能比(R)-5-氨基甲基-l-(5，7-二氟-1，2，3，4-四氢萘-2-基)-2，3_ 二 氢-2-硫代-IH-咪唑盐酸盐(R对映体)大2-3倍。内匹司他对牛DBH的抑制作用显示与 酪胺有竞争性，Ki为4. 7 士 0. 4nM。实施例19内匹司他的亲和力是在图97中概述的结合分析法中测定的。使用标准放射配体 过滤结合法。通过迭代曲线拟合成四参数逻辑方程分析竞争结合数据。直接获得Hill系数和 IC50O竞争配体的pKi (Ki的-log)是从IC5tl值使用Cheng-Prusoff方程计算的。内匹司他具有对α工受体的中等亲和力(6. 9-6. 7的pKi)。对全部其它检测受体 的亲和力相对较低(PKi < 6. 2)(图98)。实施例20载剂和内匹司他一水合物粉末得自the Center for PharmaceuticalDevelopment, Syntex Preclinical Research and Development。在给药 时，60-mg/ml内匹司他制剂是通过将载剂与内匹司他粉末混合，接着振摇来制备的。6-和 20-mg/ml内匹司他制剂是通过将60-mg/ml制剂用载剂稀释来制备的。复溶的内匹司他制 剂在使用期间保持效价。含水载剂和内匹司他制剂含有羟丙基甲基纤维素、苯甲醇和聚山 梨酯80。根据急性毒性研究选择剂量，在该急性毒性研究中给小鼠施用250、1000或 2500mg/kg内匹司他的单次口服剂量。毒性和死亡的临床体征出现在1000和2500mg/kg。载剂或内匹司他制剂的单次口服剂量是通过强饲法给每只小鼠使用啮齿动物插 管器来施用的。选择该口服途径是由于它是一种计划的临床施用途径。给药体积是基于给 药前记录的个体体积来计算的(体重数据未在本报告中列表)。给药前2. 5至3. 5小时停 止给予小鼠食物和水，而不是试验方案中说明的1.5小时。此偏差不会影响该研究的完整 性。在给药之前记录临床观察。在给药后开始的60分钟，每一治疗组中的小鼠各自针 对临床观察和试验方案说明的行为学试验经约10分钟的间隔评价至多3组1O 30-mg/kg组 中的一只小鼠以及100-mg/kg组中的一只小鼠在给药后死亡，将它们从该研究中排除。使 存活小鼠安乐死，并在观察/试验期间结束时从该研究中排除。各组中的6只雄性小鼠各自通过强饲法施用单次口服剂量0(载剂)、30、100或 300mg/kg的内匹司他。临床观察和行为学试验是在施用试验制剂之后60分钟开始的。在 观察期间结束时，使全部存活小鼠安乐死，并从该研究中排除。与载剂对照组相比，较低体温出现在30-、100-和300-mg/kg组中。未出现治疗相 关的临床或严重的行为变化。直肠体温数据总结于图99 ；观察和行为学试验数据总结于图 100。未出现治疗相关的临床或严重的行为变化。(参见图101-103)异常群居成群(列为 其它反应)在100-mg/kg组的小鼠中出现，但在300-mg/kg组的小鼠中未出现；认为此发现是偶然的。在100-mg/kg组中有1只小鼠的临床/行为变化包括不活动、异常步态和姿势、 诱发的活动减少、异常被动性以及温和/持续发声；这些变化不归因于内匹司他。在30-和 100-mg/kg组中各有一只小鼠在给药后死亡；认为该死亡是偶然的，并且将该小鼠从该研 究中排除。实施例21本项研究的目的是确定DBHIs SKF-102698和内匹司他是否会产生活动能力或听 觉惊恐反应性的变化。这些行为的变化可以因此反映出这些化合物在中枢神经系统中的活性。成年雄性Sprague Dawley 大鼠(在研究日为 250_350g)得自 CharlesRivers Labs0使大鼠住宿于正常亮/暗循环中，亮光在0900Hrs至2100Hrs之间。使动物成对 住宿于标准金属网笼中，并且不限制食物和水。活动能力盒由Plexiglas 盒组成，测得 18〃 X18"，高 12〃。环绕该Plexiglas 盒的是 Omnitech Digiscan 监视器(型号 #RXXCM 16)，该监视器组成为1英寸照相光线(photobeam)的ban和每盒编号32的光敏器件。照 相光线中断的次数是通过Omnitech Digiscan分析仪(型号#DCM_8)进行分析的。使动物 在封闭的房间中进行试验，运行白噪声发生器以掩盖外来噪音。听觉惊恐反应性试验是在8 个 SR-Lab (San Diego Instruments, SanDiego, CA)自 动试验装置中进行的。将大鼠分别置于Plexiglas 圆筒(IOcm直径)中，该圆筒位于通风 减声区域中。听觉噪音爆发(具有ι毫秒上升时间和衰减时间的宽频带噪声)是通过在动 物之上30cm安装的扬声器提供的。压电加速计将受试者的运动转换成评分表中O至4095 的任意电压。药物施用之前，72只大鼠各自置于惊恐装置中，5分钟适应期之后，给它们提供每 隔20秒的听觉噪音爆发达15分钟(总计45次惊恐)。通过取惊恐次数11至45的平均 值对每只大鼠计算平均惊恐(前10次惊恐被忽视)。然后将这些大鼠中的64只置于8个 治疗组之一，使得每组具有相似的平均惊恐值。这8个治疗组如下SKF-102698 (100mg/kg) 及其载剂(50%水/50%聚乙二醇)，可乐定(40yg/kg)，内匹司他(3、10、30和100mg/kg)， 和它们的载剂dH20。以前的工作显示这种匹配操作最适合用于惊恐，因为在大鼠之间的惊 恐反应有显著差异性，但在大鼠中从一天到次日有高度的一致性。此试验操作后的每一天，给8只大鼠(来自8个治疗组中每一组的一只大鼠)注射 分派给它们的治疗药物，并立即分别置于运动活动盒中。对大鼠运动活动监测4小时。然 后，将大鼠置于转换笼达15分钟。在此15分钟开始时，将分派可乐定治疗的大鼠再接受一 次40yg/kg的注射。然后，将大鼠置于惊恐装置中，5分钟适应期后，每隔1分钟给它们提 供90dB噪音爆发达4小时。为评价运动活动，测定了水平活动(照相光线中断的次数)、运动次数以及休息时 间。分别分析各参数。在每一时间间隔(或称为样品)，使用分级数据进行双因素方差分 析(ANOVA)(非参数技术)，以测定白天封闭的治疗效果。4个RS-治疗的组与载剂对照的 配对比较亦使用Durmett ‘ st-检验进行。为评价惊恐反应性，对于200毫秒立即成功的惊恐，通过给每只惊恐大鼠经完整 的200毫秒施加平均力，并测定最大力。对每一试验(TRIALN)的每一治疗(TREAT)计算
57该平均的最大值和平均电压(MAXMEAN和AVGMEAN)，然后将这些值对各治疗的试验次数绘 图。将该图附加到报告中。试验1-60设定为时间=1，试验61-120设定为时间=2，试验 121-180设定为时间=3，试验181-240设定为时间=4。在每一时间中并对每一治疗计算 该平均的最大值和平均惊恐反应。然后将该平均值用于统计分析。使用协方差分析法来分 析惊恐反应。研究者对在时间内的治疗比较感兴趣，但对治疗中的时间作用不感兴趣。因 此，通过时间来分析惊恐反应。该模型包括大鼠试验当天(日期)的项目、基线惊恐反应和 治疗。日期为封闭因子，基线惊恐反应为协同变异。对于上述每一目的有三个分别的模型。 使用Durmett' s程序将变化剂量的内匹司他与载剂进行比较，以使控制多重比较。3个参数(水平活动、运动次数和休息时间)的分析结果提供于图104-115。治疗 组各参数对时间的图显示于图116-118。当四个内匹司他_治疗的组与载剂_治疗的对照组比较时，在这3个参数的任一 个中，在任意的检查时间，没有全部的非配对显著差异。当与载剂_治疗的对照比较时，可乐定_治疗的组在2和2. 5小时有显著更多的 水平活动，在2小时有显著更多的运动，并且在2小时有显著更少的休息时间(全部的ρ < 0. 05，分别参见图104-115)。表明在1小时时可乐定-治疗的组比载剂-治疗的对照组 有显著更多的休息时间(P < 0. 05)。当与载剂-治疗的对照比较时，SKF-102698-治疗的组在2. 5小时有显著更少 的水平活动和显著更少的运动(二者ρ < 0.05，参见图104-115)。表明1.5和4小时时 SKF-102698-治疗的组比载剂-治疗的对照组有显著更多的运动(二者ρ < 0. 05)。在 休息时间方面，在任何检查时间均检测到SKF-102698与载剂之间无显著差异(参见图 104-115)。通常，在最初2小时水平活动和运动次数减少，并在最后2小时保持为低点。类似 地，在最初2小时休息时间增加，并在最后2小时保持为升高的。在大鼠中，内匹司他对活动能力没有显著作用。在水平活动、运动次数或休息时间 方面，在任何检查时间，用3、10、30或100mg/kg的内匹司他治疗的动物与载剂-治疗的对 照动物无显著差异。在1小时时，用α 2-肾上腺素受体激动剂可乐定治疗的动物比载剂_治疗的对照 有显著更多的休息时间。然而在2小时时，用可乐定治疗的动物比载剂-治疗的对照有显 著更多的水平活动和运动，以及更少的休息时间。在2. 5小时时，用SKF-102698治疗的动物比载剂-治疗的对照有显著更少的水平 活动和运动。在1. 5和4小时时，与载剂-治疗的对照相比，用SKF-102698治疗的大鼠有 显著更多的运动。在休息时间方面，在检查的任意时间，检测到SKF-102698和对照之间无
显著差异。在惊恐反应方面，内匹司他和载剂的总治疗作用对任一种应答在任何时间均不 显著(ρ > 0. 05)。在时间2时平均惊恐反应的总治疗作用勉强显著(ρ = 0. 0703)，并且 Dunnett' s检验显示内匹司他30mg/kg比载剂组有显著更高的平均惊恐反应(ρ < 0. 05)。 基线平均惊恐反应在时间3和4时对两种应答是统计学显著的(ρ彡0.05)；在时间1和2时 对最大惊恐反应是勉强显著的，并且在时间2时对平均惊恐反应是勉强显著的(ρ ( 0. 10)。图123-124显示了这5个治疗组的每一组平均的最大和平均惊恐反应与时间比较。SKF-102698 (100mg/kg)在任意时间对于任一惊恐反应测定与载剂无统计学显著差异。图125和126显示了 SKF-102698和载剂的平均的最大和平均惊恐反应的时间过程。可乐定在时间1比载剂有统计学显著更低的最大和平均惊恐反应(P < 0. 01)，并 且在时间2仅对平均惊恐有统计学显著降低(ρ = 0. 0352)。对于可乐定组，时间2的最大 惊恐反应以及时间3的平均惊恐反应比水组勉强显著更低。图127-128显示对于可乐定和水，平均的最大和平均惊恐反应的时间过程。当与载剂相比时，在任意时间，以3、10、30或100mg/kg施用的内匹司他在大鼠中 未显示最大或平均惊恐反应的作用。在所有时间对于两种惊恐反应，SKF-102698行为类似 于载剂(PEG)。可乐定在较早时间成功地降低了最大和平均惊恐反应二者，并且在后面的时 间行为类似于载剂。图119-122显示了最大惊恐反应的概要统计和显著性评价。实施例22检查了内匹司他长期给药的作用。在第一给药日之前的3至13天之间，将大鼠置 于惊恐装置中，5分钟适应期之后，给它们提供平均每分钟一次的IlSdB噪音爆发(使用变 量试验间间隔范围为30至90秒)达20分钟。测定惊恐反应，并对每只大鼠计算最后20 次惊恐反应的均值。大鼠随机置于8个治疗组之一中(内匹司他5、15或50mg/kg，bid; SKF-102698, 50mg/kg, bid ；可乐定，20ug/kg，bid ；d_ 安非他明，2mg/kg，bid ；dH20 或环糊精 (SKF-102698的载剂)。通过口服强饲法以lOml/kg给药体积给大鼠给药。大鼠每天在早 晨和晚上给药达10天。在早晨和晚上给药之间的时间为6至10小时。先前研究显示，这 种匹配操作对于听觉惊恐反应性是最适宜的，因为大鼠之间在惊恐反应方面有显著的变异 性，但是在大鼠内从一天到次日有高度的一致性。由于在同一天不可能测试全部96只大鼠(8个治疗组，η = 12)，对给药时间表交 错使得每一天仅有8只大鼠进行测试。这8只大鼠的12个组各自由来自8个治疗组的每 一组的一只大鼠组成，使得该治疗组与日期平衡交叉。此外，全部治疗组与8个运动活动室 平衡交叉，然而，治疗组不与惊恐室平衡交叉。以下行为学试验在长期给药期间和之后施药；身体中心温度、运动活动、听觉惊恐 反应性和听觉惊恐的预脉冲抑制。使动物在有白噪声发生器运行的封闭室中试验。运动活动试验是在身体中心温度 读数之后立即进行的，该读数是在给药第10天进行(内匹司他和SKF-102698在早晨每日 给药之后约3小时又35分钟，以及在给药第10天每天施用可乐定和d-安非他明之前20 分钟)。运动活动试验进行1小时。在每一试验期之前对每一运动活动室运行诊断程序， 以确保照相光线和光敏器件操作适当。运动活动显示对中枢多巴胺水平变化敏感(Dietze and Kuschinsky, 1994)，其使得此行为学试验是一种体内DBHI作用的潜在的敏感分析法。 D-安非他明被用作此分析法的阳性对照。大鼠身体中心温度是通过将2cm直肠探条插入到每只大鼠的直肠中来获得的。 每只大鼠的身体中心温度测定三次，计算三次读数的平均值。身体中心温度计数的获得是在长期给药时间表第10天之前立即(获得基线)；在给药第1、5和10日，内匹司他和 SKF-102698的早晨每日给药之后3. 5小时，以及每日施用可乐定和d_安非他明之前15分 钟。身体中心温度显示对多巴胺和去甲肾上腺素水平均敏感，其使得此行为学试验是一种 体内DBHI作用的潜在的敏感分析法。可乐定(一种α 2激动剂)和d-安非他明(一种多 巴胺释放剂)被用作此分析法的阳性对照。听觉惊恐反应性(由迅速开始的强烈噪音爆发引起的一系列肌肉收缩)和预脉冲 抑制(通过分析任何惊恐反应性减少测定的感觉运动门控，其是在非惊恐刺激之前即刻惊 恐刺激时发生的)均在8个SR-Lab (SanDiego Instruments, San Diego, CA)试验装置中 进行测定。将大鼠分别置于Plexiglas圆筒(IOcm直径)中，该圆筒位于通风减声区域中。 听觉噪音爆发(具有1毫秒上升时间和衰减时间的宽频带噪声)是通过在动物之上30cm 安装的扬声器提供的。此外，在全部试验期间自始至终，这些扬声器产生68dB水平的背景 噪音。附着在plexiglas圆筒以下的压电加速计将受试者的运动转换成电压，然后将其检 波并通过装配SR-Lab软件和界面集成的PC计算机的数字化(在0至4095的评分表中)。 分贝计用于将8个试验装置中的每一个的扬声器标准化为平均的士 1%。此外，SR-Lab标 准化装置用于将8个惊恐检测装置中的每一个标准化为平均的士2%。进行惊恐反应性和 预脉冲抑制试验同时立即改变运动活动试验(在给药第10天，内匹司他和SKF-102698早 晨每日注射之后约4小时又40分钟，以及补充施用可乐定和d-安非他明之后10分钟)。 该惊恐反应性和预脉冲抑制试验包括将各大鼠分别置于SR-Lab试验装置中，5分钟适应期 之后，给大鼠以平均每分钟一次提供三种不同类型的噪音爆发之一(和惊恐反应测定)(使 用变量试验内间隔范围为30至90秒)达1小时(60次总噪音爆发和惊恐反应)。三种不 同类型的噪音爆发包括高声噪音爆发(118dB)，和相对完全(quite)的噪音爆发(77dB)，高 声噪音爆发之前100毫秒的完全爆发(预脉冲抑制试验)。这些试验是以假随机顺序提供 的。预脉冲抑制已显示对中脑边缘多巴胺水平的变化敏感。此外，听觉惊恐反应性亦显示 对多巴胺和去甲肾上腺素水平的变化敏感，这使得这些行为学试验是一种体内DBHI作用 的潜在的敏感分析法。可乐定和d-安非他明用作听觉惊恐反应性和听觉惊恐的预脉冲抑 制试验的阳性对照。每日行为学试验的时间表如下。在t = 0时，注射DBHI。在3. 5小时时，测定中 心体温。在3小时35分钟，评价运动活动。在4小时40分钟，评价惊恐反应性和预脉冲抑 制。从每个试验时间的每个受试者取三个温度读数。然后计算这三个读数的平均值。通过计算在试验期间受试者打断的照相光线的总次数来获得每只大鼠自发运动。针对刺激出现之后40毫秒窗口在每个试验期间测定受试者的反应。每个惊恐反 应是通过取每次噪音爆发之后立即开始的40个读数(每毫秒一次)的均值来计算的。听 觉惊恐反应性是通过测定针对每个受试者由IlSdB听觉爆发引发的惊恐的平均应答来计 算的。预脉冲抑制值是通过对每只大鼠将77dB脉冲-IlSdB脉冲配对的试验引发的平均惊 恐反应(上文所述预脉冲抑制)被IlSdB单独试验的相减，然后此值除以IlSdb单独试验 的值，即([IlSdB试验值-预脉冲抑制试验值]+IlSdb试验值)。具有治疗主作用的全部单因素ANOVA是在各时间针对每只动物基于基线的变化 来进行的。接着针对各重要性的比较进行t-检验。
60
针对每只动物每15min测定自发运动活动达1小时。分别分析每个时间间断(每 15min)。进行Kruskal-Wallis检验(非参数技术)，以检验治疗组之间的差异。如果未检 测到总体的显著性差异，则针对多重比较进行Bonferroni' s调整。在每一治疗中(TRIALN)，针对每一治疗(TREAT)和试验类型(TRIALT)计算平均的 平均电压(AVGMEAN)和平均百分预脉冲抑制(RATIO)。预脉冲抑制值是通过对每只大鼠将 77dB脉冲-IlSdB脉冲配对的试验引发的平均惊恐反应(上文所述预脉冲抑制)被IlSdB 单独试验的相减，然后此值除以IlSdb单独试验的值，S卩([IlSdB试验值-预脉冲抑制试验 值]+118db试验值)。将这些值对每一治疗的试验编号以及试验类型进行绘图，这些图附入报告中。注 意，该图上的y-轴改变。试验1-15相应于时间1，试验16-30相应于时间2，试验31-45相 应于时间3，试验46-60相应于时间4。对于每一治疗，显示动物的平均的百分预脉冲抑制 和平均的平均惊恐对TIME的图亦附上。平均惊恐反应和百分预脉冲抑制是使用方差分析进行分析的。该模型包括治疗期 限、入组治疗的动物、时间和经时相互作用的治疗。使用误差限对入组治疗的动物检验治疗 作用。研究了总治疗作用和经时治疗作用。Fisher' s最低显著性差异的方法用于调整 多重比较。如果该总治疗作用和经时治疗作用不显著(P-值> 0. 05)，则进行Bonferroni 调整。如果该总治疗作用不显著，则该调整施用于特定的配对比较。此外，如果该特定的 配对治疗作用不显著(P-值>0.05)，则还将该调整用于时间内的治疗作用。如果总治疗 和经时治疗作用二者均不显著(p-值〉0. 05)，则针对单个比较在时间内和经时平均进行 Bonferroni 调整。对每只动物为本分析计算给药前体重的变化。反复测定双因素ANOVA被用于治疗 总作用、时间和经时相互作用的治疗。然后进行单因素ANOVAS以检查每天的治疗作用。图129-130显示了对每只大鼠的预治疗听觉惊恐反应性和开始日期。图131显示，除了阳性对照(d-安非他明和可乐定)在长期给药的第一天显著增 加身体中心温度，无其它化合物在任何时间对身体中心温度有任何显著作用。图132-133 包含每一治疗在各时间的平均身体中心温度、中心体温根据基线的平均变化，和显著性结^ ο如图134所示，d-安非他明组在检查的所有时间均比载剂对照有显著更高的活动 能力。然而，可乐定组在检查的任何时间与载剂对照无显著性差异。在最初45分钟(即样 品1-3)，SKF 102698 50mg/kgb. i. d.组比其载剂对照有显著更低的活动能力，但在45分钟 之后无显著性(参见图135-136)。图137亦显示，内匹司他在检查的任何时间无总体显著治疗作用。配对比较显示， 在检查的任何时间，无内匹司他-治疗的组与载剂对照有显著性差异。此外，在检查的任何 时间，两个载剂对照之间无显著性差异((dH20和SKF的载剂)(参见图135和图136)。如图138所示，无治疗组在预脉冲抑制方面产生任何显著变化。对于SKF 102698 组和环糊精组，总体时间作用是统计学显著的(ρ = 0.0001)。对于环糊精对比dH20，经时 相互作用治疗是统计学显著的(P = 0.0283)，但其它无显著性。对于重要性的任何比较， 治疗作用无显著性。然而，与环糊精组相比，SKF组具有勉强更高的百分预脉冲抑制(ρ = 0. 0782)(参见图 139)。
在时间1和2中，可乐定组比载剂对照恰好有显著更高的百分预脉冲抑制，并且在 时间3和4期间与载剂无显著不同(参见图140-141)。在任何时间与它们本身的载剂相 比，d-安非他明和SKF 102698均无显著差异。在任何时间与dH20相比，没有内匹司他给药
组有显著差异。如图142所示，在听觉惊恐反应性方面仅SKF 102698治疗组产生显著变化。对于 重要性的全部比较，总体时间作用是统计学显著的(全部ρ = 0.0001)。对于安非他明与 dH20、可乐定与dH20以及环糊精与dH20的比较，经时相互作用治疗是统计学显著的(全部 P < 0. 05)，但其它无显著性。对于SKF 102698 50mg/kgb. i. d.对比环糊精(ρ = 0. 0007) 以及对于内匹司他 50mg/kg b. i. d.对比 SKF 102698 50mg/kg b. i. d. (ρ = 0. 0047)，治疗 作用是显著的，但其它无显著性(参见图143)。SKF 102698 50mg/kgb. i. d.组与环糊精相 比有显著更低的惊恐反应，并且与内匹司他50mg/kgb. i.d.组相比亦有显著更低的惊恐反 应。在任何时间SKF 102698 (50mg/kgb. i. d.)组比环糊精组有显著更低的惊恐反应 (参见表144-145)。在时间1和3期间，内匹司他(50mg/kgb. i.d.)组比SKF 102698 (50mg/ kg b. i.d.)组有显著更高的惊恐反应。未检测到有其它显著性差异。在给药前基线组之间体重方面无总体或配对显著性差异。如图146-147所示，d-安非他明组与载剂对照相比从给药前在体重方面有显著更 小的变化(p<0.01)。当在各个日内分析时，在4-10治疗日，载剂对照与安非他明组相比 从给药前在体重方面有显著更大的增加。然而，在检查的任何时间，可乐定组与载剂对照无 显著差异。如图146所示，SKF 102698 (50mg/kgb. i.d.)组与其载剂对照(SKF-载剂)相 比从给药前基线在体重方面显示显著更小的增加(ρ <0.01)。当在各个日内分析时，在第 2-10天治疗时，SKF-载剂对照与SKF 102698组相比从给药前在体重方面有显著更大的增 加，但第3天和第6天除外。重要的是，在任何日期，SKF-载剂与载剂对照组之间在体重方 面的变化无差异。如图147所示，在检查的任何时间，对于内匹司他任何剂量没有总体的显著治疗 作用。在检查的任何时间，配对比较显示没有内匹司他-治疗的组与载剂对照是显著不同 的。有趣的是，关于体重变化方面，在SKF 102698 (50mg/kg b. i. d.)组与内匹司他(50mg/ kg b. i.d.)组之间有显著的(ρ <0.05)总体差异。当在各个日内分析时，在第7-9天SKF 102698 (50mg/kg b. i. d.)组比内匹司他(50mg/kg b. i. d.)组有显著更低的体重。实施例231-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)购自 RBI，Inc，(Natick，MA)。为了 施药，以浓度2mg/ml (游离碱)将MPTP混悬于水中，再以等于各动物重量(kg)的体积皮下 注射。例如，950克动物接受2mg/ml的MPTP的0. 95ml注射，得到每一注射最终为2. Omg/
kg ο二十七(27)只成熟松鼠猴(Saimiri sciureus)用于本研究，其中16只雌性和11 只雄性。使这些猴子保持在13h/llh亮-暗循环中，不限制食物和水。用于本研究的所有 操作遵循NIH指南，并且经动物养护和使用学会委员会(IACUC)批准。动物分别居住并且 在开始行为研究之前容许有最低一个月适应成迁居者。这些研究中使用总计6只松鼠猴，3只未受伤害，3只受伤害(3个月前接受2mg/
62kg MPTP)。为了测定药物内匹司他的最佳施用途径，检查了三种不同的方法，它们包括(i) 插入物治疗法、(ii) 口服灌注法、和(ii) 口服强饲法。(i)RS溶液(5mg/ml)在药用蜀葵中 的插入物在3只未受伤害的猴子中试验，证明这是一种差的药物施用途径，原因是可能由 于不利的味道使动物不能摄入治疗物。(ii)药物(0. 5、2和5mg/kg)进入3只未受伤害的 和3只受伤害的猴子口中的口服灌注注射亦是不能接受的途径，因为在最高药物浓度下动 物容易吐出该溶液。(iii) 口服强饲法施用是在最高剂量(5mg/kg)下在3只MPTP-伤害的 猴子中进行，并且很好地被接受。这些结果(口服灌注和口服强饲法投药)总结于图148和图149。这些研究中使用总计6只松鼠猴，3只未受伤害，3只受伤害(3个月前接受2mg/kg MPTP)。动物每天2次接受0. 5，2. 0,或5. Omg/kg浓度的药物(IOam和2pm)，共计5天，在 不同剂量水平之间有2天的清洗期。药物施用是通过0. 5,2. 0和5. Omg/kg剂量口服灌注 法，以及5. Omg/kg剂量口服强饲法。在这两个较低剂量下药物耐受良好。一只未受伤害的 猴子接受5. Omg/kg，其在施药的最后两天有轻度的褐色稀粪，停药一天即消退。这些结果总 结于图148和149。本项研究中使用总计24只松鼠猴(Saimiri sciureus)，14只雌性，10只雄性。将 这24只动物随机分派到4个治疗组之一，6动物只/组。各组包括如下(I)A组安慰剂； (2) B 组lmg/kg/ 天；(3) C 组:4mg/kg/ 天；和(4) D 组1 Omg/kg/ 天。在 B 组中，在 MPTP-伤 害后1只动物急剧死亡，未予替换。伤害之前，使用红外活动监视(IRAM)笼使动物进行自发运动活动的定量评价。全 部记录期间长为60分钟，在2周时间历经10个期间。动物行为亦通过1至3个临床评定 者使用帕金森临床等级评分表(CRS)进行评价，每天一次(中午12点到下午1点)，达到连 续3至5天。正常动物在CRS中通常得分不大于3 (参见图150关于这些研究中使用的临 床等级评分表)。活动监视(IRAM)和临床等级评分二者确立了每只动物的平均基线活动。通过皮下注射施用浓度2. Omg/kg的MPTP(游离碱)使动物受伤害使之成为帕金 森状态(参见图151-156)。MPTP伤害后行为评价是在最后的MPTP-伤害之后2至4周进 行的。通过60-分钟期间的IRAM监视活动能力，达3至5天。在3至5天期间通过1至3 个个别的等级评价临床行为(CAS)。在某些情况下，动物需要另外剂量的MPTP(2mg/kg)来获得足够程度的伤害，以显 示帕金森症状，其定义为平均的总临床等级评价得分大于3。在开始该有效性研究的3周内，全部动物接受最终的MPTP后行为评价(IRAM和 CRS)。该最终的MPTP后评价被用于确立基线临床帕金森状态，并且用作用于统计分析的预 治疗值。动物测试对左旋多巴的应答和药物内匹司他的有效性。在最后MPTP给药之后4至 12周进行试验。24只松鼠猴被随机分派到4组:A组(6只动物)接受安慰剂(水)治疗； B组(5只动物)接受lmg/kg/天的药物内匹司(0. 5mg/kg,每天两次)；C组(6只动物)接 受4mg/kg/天(2mg/kg，每天两次)；以及D组(6只动物)接受10mg/kg/天(5mg/kg，每天 两次)。左旋多巴以2. 5、5或7. 5mg/kg的浓度通过口服强饲法每天两次施用(在IOam和 2pm)达连续7天。通过IRAM和CRS测定行为。在治疗最后4天早晨IOam给药后进行临床等级评价60至90分钟。评定者(1至3个个体)不清楚不同的治疗组。在药物治疗的最 后2至5天2pm施药后立即进行IRAM评价达90分钟。各个治疗剂量之间有最少2天的清 洗期。左旋多巴给药后，接着至少2天的清洗期，然后施用药物内匹司他或水(作为安慰 剂)达12天。通过口服强饲法在IOam和2pm每天两次施用药物。通过IRAM和CRS对行 为评分。在药物治疗的最后5天，在IOam内匹司他给药后60至90分钟，在早晨进行CRS。 评定者(1至3个个体)不清楚不同的治疗组。在药物治疗的最后5天2pm施药后立即进 行IRAM评价达90分钟。在松鼠猴中进行药物代谢动力学研究以测定内匹司他的血浆浓度。本项研究与安 全性和耐受性研究同时进行。使用3只MPTP-伤害的松鼠猴(#353、358和374)。收集Iml 血液(取自各动物的股静脉)用于分析。内匹司他以1、4和10mg/kg的浓度施用5天，各 药物浓度之间有2天的清洗期。在第一次给药之前1小时收集血液用于分析以建立基线， 并且在各不同药物水平的此第一次给药后6小时收集血液用于分析。进行第二个药物代谢动力学研究以确定内匹司他的稳态血浆水平。本项研究与有 效性研究同时进行，在该有效性研究中使动物在三个不同药物浓度的每个浓度下进行试验 达12天。从股静脉抽取血液1ml，取血时间是第1天第一次给药后6小时，然后是第7天第 一次给药后6小时，最后是第12天第一次给药后6小时。基线血浆水平是对给药之前的那 周收集的样品测定的。对各动物计算MPTP-伤害前和伤害后的平均活动能力。MPTP-伤害前基线是通过 将10个1小时监测期平均来确定的。MPTP后(预治疗)行为评价是在开始有效性研究的 3周内获得的。MPTP-伤害后活动能力是通过将3至5个1小时监测期(IRAMS)平均来确 定的。活动监测报告为“运动次/10分钟”。得分高的认为是更快的动物。Wilcoxon体征 秩和检验被用于比较每组动物(A组至D组)的MPTP-伤害前和伤害后活动。(b)临床等级 评价得分在该CRS中，MPTP-伤害前的动物没有得分大于3的。通过将1至3个单独评定 者根据连续3至5天的数据的总CRS平均，在开始有效性研究的3周内测定MPTP后临床等 级评价得分。评定每只动物的8种帕金森特征，总得分来自这8个特征的总和。对于每只动物， 获得每个给药的单个临床等级评价得分，其方式是将经连续多个给药(剂量相同)日进行 的全部评定者(1至3名)的临床等级评价得分平均。将该平均CRS用于统计分析。得分 低的认为帕金森行为状态较少。统计分析包括(1)使用Kruskal-Wallis (非参数方差分析)比较安慰剂与1、4和10mg/kg/天 的内匹司他的平均CRS。使用经各动物最终MPTP后评分校正的各试验药物浓度的平均CRS 来重复此比较。校正的临床得分是各浓度试验药物的临床得分，其为MPTP后临床得分的比率。(2)使用弗里德曼氏分析(非参数方差分析，重复测定)，MPTP伤害后(预治疗)对 于2. 5、5. 0和7. 5mg/kg左旋多巴和安慰剂治疗的平均CRS之间配对比较。对1、4和IOmg/ kg浓度的内匹司他进行相同分析。需要时进行非参数数据的Durmett氏因果分析。在每一药物水平之后，每隔10分钟监测IRAM活动能力最小90分钟。评分越高则认为动物更快(较少帕金森)。统计分析包括描述统计以及安慰剂和1、4和10mg/kg的试验药物的各个10分钟 数据组的平均值绘图。然后检查该图以鉴别任何趋势。未进行进一步的统计分析，因为根 据图分析测定到没有差异。比较MPTP伤害后(预治疗)对2. 5，5.0，and 7. 5mg/kg左旋多巴和内匹司他(1、 4、10mg/kg/天或安慰剂)的统计分析未予进行，原因是IRAM数据收集不足。在MPTP后仅 收集60分钟时间，相比之下内匹司他为90分钟。IRAM(活动监测)和CRS (临床等级评分表)二者均用于评价各松鼠猴的MPTP-伤 害的程度。下列部分将这些显示IRAM和CRS的A组至D组的结果列成表。总的来说，由 IRAM测定的活动能力在组内基线(MPTP-伤害前)与MPTP-伤害后之间无显著性差异，原因 是各动物的高度变异的RAM结果。该CBS结果显示了 MPTP伤害前和MPTP-伤害后状态之 间的差异。在CRS中MPTP-伤害前的动物得分不大于3。MPTP-损伤后动物均得分大于3。 所有组(A至D)具有的平均CRS范围为8至10，其超出24分的总计可能的CRS得分。图153A显示了 A组结果安慰剂治疗。伤害前和伤害后IRAM组之间没有显著性 差异，原因是每只动物每10分钟的运动是有高度差异的。Wilcoxon体征秩和检验W= 19， N = 6, P <0.06接受零假设。图153B显示了临床等级得分(GRS)。A组的平均GRS为8. 9，范围为4. 8至15. 4。 全部动物均显示MPTP伤害后的临床等级评价得分基本上增加。正常动物(未受伤害的) 通常具有低于3的得分。图154A和B显示B组的结果lmg/kg/天治疗。伤害前和伤害后IRAM组之间没 有显著性差异，原因是每只动物每10分钟的运动是有高度差异的。Wilcoxon体征秩和检 验W = 9，N = 5，P < 0. 06接受零假设临床等级得分(CRS)。B组的平均CRS为10. 32，范 围为4. 3至16. 1。全部动物均显示MPTP伤害后的临床等级评价得分基本上增加。正常动 物(未受伤害的)通常具有低于3的得分。图155显示了 C组的结果4mg/kg/天治疗。伤害前和伤害后IRAM组之间没有显 著性差异，原因是每只动物每10分钟的运动是有高度差异的。Wilcoxon体征秩和检验
=17，N = 6，P > 0.06接受零假设。C组的平均CRS为8. 97，范围为6. 5至17. 3。全部动 物均显示MPTP伤害后的临床等级评价得分基本上增加。正常动物(未受伤害的)通常具 有低于3的得分。图156显示了 D组的结果10mg/kg/天治疗。伤害前和伤害后IRAM组之间没有 显著性差异，原因是每只动物每10分钟的运动是有高度差异的。Wilcoxon体征秩和检验 W =21, N = 6, P >0.06接受零假设。全部动物均显示MPTP伤害后的临床等级评价得分 基本上增加。C组的平均CRS为8. 02，范围为4.0至15. 6。正常动物(未受伤害的)通常 具有低于3的得分。在MPTP-伤害的松鼠猴中，安慰剂治疗与三种不同浓度的内匹司他(l，4，10mg/ kg/天)之间没有可检测到的差异。4和10mg/kg/天的内匹司他与安慰剂均显示超出MPTP 后(预治疗)状态的显著改善。当与MPTP后(预治疗)比较时，所有组的动物用5mg/kg 和7. 6mg/kg左旋多巴均显示出显著改善，例外的是7. 5mg/kg剂量的C组和5mg/kg/剂量 的B组。当与MPTP后比较时，在2. 5mg/kg左旋多巴时没有动物组证明有显著改善。
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图157-170显示了治疗组与左旋多巴的比较、弗里德曼试验结果、描述统计和 Dunnett检验因果分析。图171-172显示了安慰剂治疗的活动监测与所有其它浓度内匹司他之间在给药 后时间点10至90分钟时的比较。对各个药物剂量水平绘制10分钟间隔。当与安慰剂比 较时，以4和10mg/kg/天剂量水平的药物(内匹司他)治疗无差异。lmg/kg/天动物比安 慰剂治疗缓慢。根据4个不同治疗组(1、4和10mg/kg的内匹司他和安慰剂)的非配对比 较分析，在PD的MPTP-伤害的非-人灵长类动物模型中，与安慰剂(水治疗)相比，内匹司 他对帕金森症状未产生显著作用。根据动物的配对比较分析，(治疗前和治疗后检查的相 同组动物)，与MPTP伤害后相比，4和10mg/kg/天浓度的内匹司他显示对帕金森症状的显 著作用(预治疗评价)。安慰剂具有边缘显著作用。使用相同的配对比较，与MPTP伤害后 状态相比，在全部组中5和7. 5mg/kg的左旋多巴证明有显著作用，但B组(5mg/kg左旋多 巴无作用)和C组(7.5mg/kg左旋多巴无作用)动物除外。然而，2.5mg/kg的左旋多巴证 明无显著作用。本项研究还证实，当使用少数动物时，与非配对研究设计相比，通过比较相同动物 治疗前和治疗后来减少动物与动物之间的差异性的配对分析更加适用于检测药物作用显著性。实施例24使雄性自发性高血压大鼠(280_345g;Charles River Labs, Kingston, NY)禁食 过夜，然后用醚麻醉。用PE50管对股动脉和股静脉插管，以分别用于记录血压和施用化合 物。然后将动物置于MAYO固定器并使它们的脚松松地绑在固定器上。肝素化盐水(50单 位肝素钠/ml)用于在整个试验中保持各插管的畅通。使用安装在IBM个人计算机上的 ModularInstruments MI2 BioR印ort 软件连续记录以下参数平均动脉压(MAP)、心率 (HR)、以及各参数在该试验中的特定时间点随基线的变化。在使用当天将全部化合物溶解。使内匹司他溶解于去离子水(载剂)中得到Img/ ml的游离碱浓度。内匹司他或载剂的口服给药体积为10ml/kg。使SCH-23390溶解于盐水 (载剂)中得到0.2mg/ml的游离碱浓度。内匹司他或盐水以1. 0ml/kg的体积静脉内推注， 接着用0. 2ml等渗盐水冲洗。手术操作之后，给予各动物最少1小时的恢复期。动物被随机分派到4个治疗 组载剂(iv)/载剂(Po)；载剂(iv)/内匹司他(po) ；SCH-23390(iv)/载剂(po)；或 SCH-23390 (iv) /内匹司他(po)。一旦动物安稳下来(最少1小时)，通过在15min期 间取各参数的平均值测定基线血压和心率。一旦基线血压和心率确定，动物静脉给予 SCH-23390 (200 μ g/kg)或载剂(盐水。lml/kg)。15分钟之后，动物口服给予内匹司他 (10mg/kg)或载剂(去离子水，10ml/kg)。在静脉给药之前对记录的参数测定15min，以确定基线血压和心率。然后将在静脉 内施用SCH-23390或载剂后5、10和15min测定记录的参数。口服施用内匹司他或载剂之 后，在 15、30、60、90、120、150、180、210和 240min 测定记录的参数。在试验结束时，使各动物用氟烷麻醉，并通过断头处以安乐死。切出皮层、左心室 (apex)和肠系膜动脉，称重，并固定在0.4M高氯酸中。然后使组织在液氮中冷冻，并保存 于-70°C。在随后日期将对这些组织进行生物化学分析，以测定儿茶酚胺水平(特别是，多巴胺和去甲肾上腺素)。分析结果将在随后日期报告。分别分析血压和心率。通过方差分 析(ANOVA)用治疗作用、时间及其相互作用分析血压和心率随基线的变化。对iv后时期以 及口服后时期均进行本项分析。通过ANOVA以对时间的主要作用在各时间进行进一步的分 析。当总治疗作用不显著时，在各ANOVA之后通过具有Bonferroni校正的Fisher’ s LSD 策略进行配对比较。通过具有主治疗作用的ANOVA和以后的配对比较进行另外的分析以比较各治疗 组的基线平均值。进行SCH-23390(iv)/载剂(po)对载剂(iv)/载剂(po)、载剂(iv)/内 匹司他(po)对载剂(iv)/载剂(po)、以及SCH-23390(iv)/内匹司他(po)对载剂(iv)/内 匹司他(Po)的比较。各治疗组之间的基础心率或平均动脉压无显著差异(图173)。与载剂对照相比，在口服后期间120min和240min，用SCH-23390静脉治疗导致心 率显著降低(P < 0. 05)(图174)。内匹司他没有像载剂治疗动物中观察到的那样多的降低 心率。这在给药后150和180min时是统计学显著的(ρ < 0. 05)(图174)。应当指出，此试 验过程中观察到心率方面的巨大的差异性。与接受载剂的动物相比，iv后期15min期间，静脉内施用SCH-23390使平均动脉 压产生小量(5 士 ImmHg)但显著的降低(ρ < 0. 05)(图175)。用内匹司他口服治疗到给 药后30min引起平均动脉压的显著降低(ρ <0.05)，这在该试验期间持续(图175)。用 SCH-23390预治疗未显著降低内匹司他单独施用观察到的抗高血压作用(图175)。实施例25使用15周龄的雄性Crl :C0BS(WI)BR大鼠。给24只大鼠长期植入遥测植入物 (TA11PA-C40, Data Sciences, Inc.，St. Paul, MN)以用于测定动脉血压、心率和运动活动。 使大鼠用戊巴比妥钠(60mg/kg，ip)麻醉，并剃光其腹部。在无菌状态下，在正中线作一切 口。暴露腹主动脉，插入遥测发射机设备的导管。在将该传感器缝合到该腹部肌肉中后，使 皮肤闭合。使每只大鼠恢复至少2周，然后进行药物施用。在开始试验前三天，将大鼠随机 分派到4个治疗组中载剂(ρ· ο.)、胼屈嗪(10mg/kg，p. ο.)、内匹司他(30mg/kg，p. ο.)、内 匹司他(100mg/kg, ρ. ο.)。监测收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均血压(MBP)、心率(HR)、和运动活动(MA)。确 定了这些参数的给药前值以后，各组大鼠接受7天的载剂、内匹司他或胼屈嗪的每日治疗。 关于MBP、HR和MA的典型的给药前数据提供于图176-178。内匹司他和胼屈嗪二者均制备于含有微量Tween 80的水中。全部剂量均是以 10ml/kg 口服给予大鼠，并且表示为游离碱当量。使用计算机数据采集系统以连续采集关于SBP、DBP、MBP、HR和MA的数据。每 隔5min采集每只大鼠的数据达10秒。然后将它们每小时取平均，并计算平均值的标准误 (SE)。在本报告中，仅提供MBP、HR和MA的数据。为清楚起见，图中略去了 SE棒和显著性 水平的标记(参见图186关于卢非酰胺治疗大鼠的MBP的各时间点的显著性水平，以及图 187关于胼屈嗪治疗大鼠的MBP的各时间点的显著性水平)。每日记录体重。全部值均表示为平均值士SEM。统计学显著定义为小于0. 05的ρ水平。分别分析MBP、HR和MA的数据。每个分析针对每天测定的26个时间点进行。使 用具有治疗主作用和时间及其相互作用的双因素AN0VA。如果检测到总治疗作用或显著相互作用，则将进行各时间点的一系列单因素AN0VA。在各时间点的配对比较是使用Durm氏 方法进行的。如果未检测到总治疗作用，则与对照的配对差异将通过使用Bonferroni调节 法调节临界值来进行。对于体重，将关于与给药前变化的双因素ANOVA用于分析治疗的总作用、天、和经 天相互作用的治疗。然后对每一天进行单因素AN0VA，使用Durm氏方法和Fisher’ s LSD 策略进行药物_治疗组与载剂对照的配对比较，以调节多重比较。口服施用30mg/kg的内匹司他(下文表示的所有给药均为po)在第1天倾向于缓 慢降低血压，但不会诱发连贯的低血压作用(图179)。随着该作用的发展，-IOmmHg的峰值 低血压作用在第2天第13小时观察到(图180)。在整个研究中还诱发类似程度的抗高血 压作用。在100mg/kg时，在第1天给药之后22hr，化合物诱发-IlmmHg的峰值抗高血压反 应(P < 0. 01 ；图179)。在第3天MBP连续降低并达到其约-17mmHg的最低点(ρ < 0. 01 ； 图181)。在整个研究中该MBP保持低点(参见图182，第7天)。10mg/kg的胼屈嗪引起立即的低血压作用，这在IOhr时消退(图179)。在第1天 给药后Ihr内，观察到在MBP方面有-24mmHg的最大降低(ρ < 0. 01)(图179)。在整个研 究中观察到了类似短暂的低血压作用(参见图179-182)。30和100mg/kg的内匹司他在第1天未连贯地影响HR。然而，在第2天，100mg/kg 的内匹司他在给药后3小时引起-100b/mm的心动过缓应答(图183)。在第3_7天观察到 显著的但较低断言性的心动过缓应答。相比之下，在整个研究中，10mg/kg的胼屈嗪诱发不同程度的心动过速(参见图 183)。在整个研究中，没有一种药物治疗显示出对MA的连贯的作用(例如，参见图184， 第3天)。与载剂治疗相比，没有一种药物治疗具有对体重的任何作用(ρ < 0. 05 ；图185)。 尽管用100mg/kg的内匹司他容易在第3天降低体重，但其无统计学显著性。对于相关领域技术人员而言显而易见的是，对本文描述的方法和应用的其它适当 修饰和改编是适宜的，并且可以实现而不会脱离本发明或其任何实施方案的范围。虽然本 发明已结合某些实施方案进行了描述，其并不欲意将本发明限制到所述的具体形式，相反， 其将涵盖此类替换物、修饰物和等价物，同样地，其可以包括在如以下权利要求所定义的本 发明精神和范围内。
权利要求
治疗诊断有创伤后应激障碍的患者的方法，其包括给患者施用治疗有效量的化合物A。
2.权利要求1的方法，其中该方法进一步包括共同施用治疗有效量的至少一种其它药 剂，该其它药剂选自苯并二氮$类、选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)、血清素-去甲肾上 腺素再吸收抑制剂(SNRI)、去甲肾上腺素再吸收抑制剂(NRI)、血清素5-羟色胺1A(5HT1A) 拮抗剂、多巴胺羟化酶抑制剂、腺苷A2A受体拮抗剂、单胺氧化酶抑制剂(MA0I)、钠 (Na)通道阻滞剂、钙通道阻滞剂、中枢和外周a肾上腺素受体拮抗剂、中枢a肾上腺素激 动剂、中枢或外周0肾上腺素受体拮抗剂、NK-1受体拮抗剂、促肾上腺皮质激素释放因子 (CRF)拮抗剂、非典型性抗抑郁药/抗精神病药、三环类、抗惊厥剂、谷氨酸拮抗剂、氨基 丁酸(GABA)激动剂和部分D2激动剂。
3.权利要求2的方法，其中该至少一种其它药剂是SSRI，其选自帕罗西汀、舍曲林、西 酞普兰、依他普仑和氟西汀。
4.权利要求2的方法，其中该至少一种其它药剂是SNRI，其选自度洛西汀、米氮平和文 拉法辛。
5.权利要求2的方法，其中该至少一种其它药剂是NRI，其选自丁氨苯丙酮和阿托西汀。
6.权利要求2的方法，其中该至少一种其它药剂是多巴胺羟化酶抑制剂双硫仑。
7.权利要求1的方法，其中该患者具有至少一种儿茶酚胺的异常脑水平。
8.权利要求1的方法，其中该化合物A降低患者脑中多巴胺0羟化酶活性。
9.权利要求1的方法，其中该化合物A调节患者至少一种儿茶酚胺的脑水平。
10.权利要求1的方法，其中该化合物A降低患者与记忆恢复有关的应激。
11.权利要求1的方法，其中该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种体征的频 率和强度中的至少一种。
12.权利要求1的方法，其中该患者是儿童或青少年。
13.权利要求12的方法，其中该化合物A降低患者创伤后应激障碍的至少一种体征或 症状的频率和强度中的至少一种，其中该体征或症状选自分裂或激动行为、表达创伤局面 的重复演示、缺乏认可内容的可怕梦想、以及特殊创伤的再展示。
14.权利要求1的方法，其中该化合物A降低患者与选自药物滥用、酒精滥用和抑郁的 创伤后应激障碍同时发生的至少一种障碍的发生率。
15.治疗患者的创伤后应激障碍的方法，其包括 对创伤后应激障碍患者进行诊断；给患者施用治疗有效量的化合物A ；对创伤后应激障碍的体征、症状和征候群中的至少一种进行评价；以及 如果该化合物A降低创伤后应激障碍的体征、症状和征候群中的至少一种，则确定该 创伤后应激综合征被改善。
16.权利要求15的方法，其中该方法进一步包括共同施用治疗有效量的至少一种其它药剂，该其它药剂选自苯并二氮罩类、选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)、血清素-去 甲肾上腺素再吸收抑制剂(SNRI)、去甲肾上腺素再吸收抑制剂(NRI)、血清素5-羟色胺1A(5HT1A)拮抗剂、多巴胺羟化酶抑制剂、腺苷A2A受体拮抗剂、单胺氧化酶抑制剂 (MA0I)、钠(Na)通道阻滞剂、钙通道阻滞剂、中枢和外周a肾上腺素受体拮抗剂、中枢a 肾上腺素激动剂、中枢或外周0肾上腺素受体拮抗剂、NK-1受体拮抗剂、促肾上腺皮质激 素释放因子(CRF)拮抗剂、非典型性抗抑郁药/抗精神病药、三环类、抗惊厥剂、谷氨酸拮抗 剂、氨基丁酸(GABA)激动剂和部分D2激动剂。
17.权利要求15的方法，其中该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种体征的 频率和强度中的至少一种。
18.权利要求15的方法，其中该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种症状的 频率和强度中的至少一种。
19.权利要求15的方法，其中该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种征候群 的频率和强度中的至少一种，其中该征候群选自再经历/侵扰、回避/麻木、和觉醒过度。
20.改善患者恢复力的方法，其包括施用治疗有效量的化合物A。
21.权利要求20的方法，其中该方法进一步包括共同施用治疗有效量的至少一种其它药剂，该其它药剂选自苯并二氮|类、选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)、血清素-去甲肾上腺素再吸收抑制剂(SNRI)、去甲肾上腺素再吸收抑制剂(NRI)、血清素5-羟色胺 1A(5HT1A)拮抗剂、多巴胺羟化酶抑制剂、腺苷A2A受体拮抗剂、单胺氧化酶抑制剂 (MA0I)、钠(Na)通道阻滞剂、钙通道阻滞剂、中枢和外周a肾上腺素受体拮抗剂、中枢a 肾上腺素激动剂、中枢或外周0肾上腺素受体拮抗剂、NK-1受体拮抗剂、促肾上腺皮质激 素释放因子(CRF)拮抗剂、非典型性抗抑郁药/抗精神病药、三环类、抗惊厥剂、谷氨酸拮抗 剂、氨基丁酸(GABA)激动剂和部分D2激动剂。
22.权利要求20的方法，其中该化合物A降低创伤后应激障碍患者的至少一种体征的 频率和强度中的至少一种。
23.诊断患者的创伤后应激障碍的方法，其包括 给患者施用治疗有效量的化合物A，和评价创伤后应激障碍的体征、症状或征候群中的至少一种；以及 如果化合物A降低了创伤后应激障碍的体征、症状和征候群中的至少一种则诊断患者 创伤后应激障碍。
24.权利要求23的方法，其中该患者是儿童、青少年或成人。
全文摘要
本文提供了通过给患者施用治疗有效量的化合物A治疗诊断有创伤后应激障碍的患者的方法。还提供了通过施用治疗有效量的化合物A改善患者恢复力的方法。还提供了通过给患者施用治疗有效量的化合物A诊断患者创伤后应激障碍，和评价创伤后应激障碍的体征、症状或征候群中的至少一种；以及如果化合物A降低了创伤后应激障碍的体征、症状和征候群中的至少一种则诊断患者创伤后应激障碍的方法。
文档编号A61K31/535GK101951912SQ200880108123
公开日2011年1月19日 申请日期2008年7月23日 优先权日2007年7月23日
发明者M·莫兰, T·沃伊沃德 申请人:辛诺西亚治疗公司