专利名称：双基因活化的骨-软骨复合移植体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于组织工程和基因输送技术领域，具体涉及双基因活化的骨-软骨复合
移植体的制备方法及其应用。
二背景技术：
将组织工程方法运用于成骨和软骨修复是近年来整形医学研究的热点之一。相比 较于传统的关节形成术、微骨折、自体成骨或软骨细胞的移植等手段，组织工程化的方法可 以得到更加具有生物学和力学功能的成骨和软骨组织，操作简便，可控性强，可以在体外培 养得到足够的细胞和细胞外基质之后再移植到体内缺损部位。 将基因治疗方法引入组织工程化的骨和软骨的构建中，在近两年得到越来越多研 究者的关注。与细胞因子类蛋白药物相比较，基因治疗具有能持续地在缺损局部表达生物 活性蛋白的能力，能够在缺损部位的修复过程中保持治疗浓度的活性蛋白，能使修复组织 更符合人体生理需求，较好地避免了蛋白药物半衰期短、需要重复注射、可操作性差、容易 导致边缘效应等缺点。 近年来，随着干细胞技术的飞速发展，成体干细胞特别是骨髓间充质干细胞
(MSC)，越来越多地被用作软骨和成骨组织工程的种子细胞。理论上，干细胞是可以在体外
进行无限分化的，那么只要将它们进一步向成骨和软骨细胞诱导，就可以满足骨组织工程
的需求。因此，骨髓间充质干细胞作为种子细胞已经成为组织工程研究的热点。 目前，间充质干细胞修复关节缺损的绝大多数研究只注重了软骨缺损的修复，而
对关节软骨下成骨的缺损修复未进行细致的研究。虽然成骨和软骨组织都来源于骨髓间
充质干细胞，但由于它们在个体发育过程中所处的阶段不同，在骨关节处所处的微环境不
同，因而成骨和软骨组织具有不同的生理结构和生物学特性，对关节缺损的修复必须而且
应该实现对成骨和软骨的同时修复。此外，在单纯的软骨修复中存在一个主要问题无论
天然软骨还是组织工程软骨的移植，移植体稳定性(stability)以及与宿主组织的整合性
(integration)都比较差。 针对以上问题，近年来，由一个表层的软骨层(对应于关节软骨)和一个深层 的钙化组织(对应于软骨下骨)组成的骨-软骨移植复合体(osteochondral grafting composite)代表了一种新颖、有前途的方法，用以重建关节的生物和力学功能。目前，有一 些研究小组利用两种不同组成成分的组织工程材料，进行干细胞双向分化的研究，他们通 常是利用细胞因子诱导间充质干细胞向成骨和软骨方向分化，然后植入体内进行成骨和软 骨的缺损修复。而我们结合基因传输技术，将软骨细胞分化诱导基因和成骨细胞分化诱导 基因复合在支架的上下两层，制备基因活化的双支架来持续、稳定地表达治疗浓度的生物 活性因子，诱导骨髓间充质干细胞进行骨和软骨的双向分化，在体外构建骨-软骨移植复 合体并用于体内缺损的修复。
发明内容
本发明需要解决的问题是针对临床上关节处骨、软骨联合损伤修复的方法有限，且传统的治疗效果均不甚理想的现状，提供一种组织工程化骨_软骨复合移植物，该移植物可用于异位构建组织工程化骨_软骨复合组织，以更好地修复关节处的骨、软骨联合缺损。
本发明结合应用骨_软骨组织工程和原位基因治疗原理，通过将骨髓间充质干细胞体外扩增后种植在两种不同基因活化的双层多孔壳聚糖/明胶支架上制备得到组织工程化骨_软骨复合移植物，壳聚糖/明胶支架与关节组织的细胞外基质成分相似，有利于细胞生长，被不同基因活化的支架材料能将基因转染进入种子细胞并持续表达相应的蛋白因子，使材料具有定向诱导分化能力。
本发明的技术方案为将种子细胞分别种植在两种不同基因活化过的主要成分相
同的双层支架材料中，利用原位基因转染原理，同时诱导了上下两层种子细胞分别向软骨
细胞和成骨细胞分化，从而在体外形成组织工程化的骨-软骨复合移植物；所用的种子细
胞为骨髓间充质干细胞；所述支架材料主要成分为壳聚糖和明胶，所述的两种基因，一种是
任何已知的诱导干细胞向软骨细胞分化的基因，有转化生长因子(TGF-P)、成纤维细胞生
长因子(FGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)，另一种是任何已知
的诱导干细胞向成骨细胞分化的基因，有骨形态发生蛋白(BMP)，血管内皮细胞生长因子
(VEGF)，降f丐素基因相关肽(calcitonin gene-related p印tide)，核心结合因子a 1 (Core
bindingfactor al，Cbfal)。被软骨细胞分化诱导基因活化的支架材料能诱导骨髓间充
质干细胞分化为软骨细胞，形成软骨层，被成骨细胞分化诱导基因活化的支架材料能诱导
骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，形成成骨层。 为了更好地实现本发明，发明人提供以下优选方案 所述的两种不同基因是以质粒DNA的形式分别复合在两层支架材料上，复合过程
包括将质粒溶液滴加在支架材料上，在4t:条件下，让质粒和支架材料复合12小时，质粒
和支架材料的复合的最佳质量比为2y g/mg。 所述的原位转染软骨细胞诱导基因为任何已知的诱导干细胞向软骨细胞分化的基因，优选转化生长因子1基因。 所述的原位转染成骨细胞诱导基因为任何已知的诱导干细胞向成骨细胞分化的基因，优选骨形态发生蛋白2基因。 当优选使用TGF-13 1和BMP-2这两个基因的条件下，所述的包含了种子细胞的双层支架体系制备过程包括将质粒TGF-P 1溶液滴加在支架材料上，在fC条件下，让质粒和支架材料复合12小时，制得成软骨层支架材料；将质粒BMP-2溶液滴加在另一个支架材料上，在4t:条件下，让质粒和支架材料复合12小时，制得成成骨层支架材料，然后分别将种子细胞种植在软骨层支架材料和成骨层支架材料，用2%琼脂糖溶液将软骨层支架材料和成骨层支架材料上下粘结，形成带有种子细胞的双层支架体系。
所述种子细胞优选骨髓间充质干细胞。 所述支架材料为组织工程学领域常用的可降解的壳聚糖/明胶混合物。
相对于现有技术，本发明具有如下的有益效果 壳聚糖/明胶不仅作为支架为细胞生长提供了合适的环境，而且阳离子壳聚糖起到了基因载体的作用，能有效地将基因转染进入种子细胞，并在细胞内持续、稳定表达相应的蛋白因子，诱导和实现骨髓间充质干细胞的双向分化。在双层体系种子细胞的培养分化 过程中，软骨层和成骨层复合体的环境与体内关节处的微环境相似，不同分化的细胞间能 够进行营养交换，并相互作用和相互影响，有利于体内移植的成功。 这样的复合体有如下优点①从植入体内时就可以提供很好的力学稳定性；②将 移植体的死亡率降到最低；③移植体的成骨层能够帮助固定软骨层移植体，因为骨-骨之 间的整合比软骨_软骨之间的整合要好，而且更快。
四
图1双基因活化的双层支架的扫描电镜图 图2ELISA测定双层支架体系中TGF-P 1和BMP-2原位转染骨髓间充质干细胞的 蛋白表达效率 图3Q-PCR测定双层体系中软骨和成骨相关标志基因的mRNA表达量 在BMP-2基因诱导的成骨层，选取两个成骨分化标志性基因0CN和0PN，在
TGF-P 1基因诱导的软骨层，选取两个最具代表性的软骨分化标志性基因AGGRECAN和COL
II 图4骨_软骨复合移植体在体外培养四周后的实物图
图5骨_软骨的免疫组织化学复合染色图 用于成骨层染色的是O. 1%茜素红溶液，用于软骨层染色的是II型胶原免疫组化 染色。 图A是携带了双质粒的双层支架实验组，图B是不携带任何一种质粒的DNA-FREE 组。
五具体实施例方式
本发明具体涉及将种子细胞分别种植在两种不同基因活化过的主要成分相同的
双层支架材料上，利用原位基因转染原理，同时诱导了上下两层种子细胞分别向软骨细胞
和成骨细胞分化，从而在体外形成组织工程化的骨-软骨复合移植体，在具体实施过程中，
主要涉及壳聚糖_明胶支架的制作，基因活化的壳聚糖_明胶支架的构建，骨髓间充质干细
胞的接种和培养以及双基因活化的双层支架的构建。
1.壳聚糖-明胶支架的制作 ①于预热的50mL 1%乙酸溶液中，分别加入lg的壳聚糖和lg的B型明胶。
②6(TC搅拌12小时，制备成2%浓度的壳聚糖_明胶混合溶液。
③在5mL和20mL的注射器内倒入lmL壳聚糖-明胶混合溶液后，将注射器正立放 置12小时至混合溶液消泡且溶液变成胶体状。
在-20 °C冷冻1小时，-80 °C冷冻2小时，随后在冷冻干燥机内冷冻干燥48小时。
⑤将材料浸入pH9. 4的NaHC03-Na2C03缓冲溶液中置换出材料表面残留酸性成分。
⑥双蒸水浸洗数次，浸泡在无水乙醇中脱水12小时，取出，在空气中吹干，然后浸 泡在EDC/NHS/MES交联液中交联4小时。 ⑦双蒸水浸洗数次，再次冻干，浸泡在75%的医用酒精中消毒12小时。 ⑧将消毒后的壳聚糖_明胶三维支架材料置入超净台中吹干，手提式紫外灯照射杀菌2小时后，获得干燥、无菌的复合支架。 ⑨保存在4 °C冰箱内备用。 2.基因活化的壳聚糖_明胶支架的构建 ①将处理好的壳聚糖_明胶支架分为三个实验组TGF-13 1基因活化组、BMP-2基 因活化组和无基因组，按1个支架/孔，放入24孔板中。 ②在TGF-P 1基因活化组中的每个支架上小心地滴加20ii L TGF-P 1溶液(含 4 ii g DNA)。 ③在BMP-2基因活化组中的每个支架上小心地滴加20 ii L BMP-2溶液(含4 ii g DNA)。 ④无基因组的支架不滴加任何质粒，仅用双蒸水稍微浸润。
⑤三组支架均放在4。C复合12小时以上。 3.骨髓间充质干细胞的接种和双基因活化的双层支架的构建 ①用0. 25 %的胰蛋白酶和0. 02 %的EDTA混合消化液消化第2-3代的BM-SCs。 ②1200rpm离心20分钟，弃上清。 ③用DMEM培养液悬浮并制备浓度为2. 5X 109/L细胞悬浮，分别在两个实验组的 每个支架上接种20yL(5X104)细胞悬浮液。 ④待培养液完全浸入支架后，立即补充20 ii L培养液，重复3-4次。
⑤37C培养2小时后，用2%的agarose小心将不同基因活化的两个支架粘在一 起，作为实验组。未携带质粒的两个支架组合在一起，作为对照组(DNA-FREE组)。每个双 层支架在静置60秒后，每个孔里补加500 ii L完全培养基，37t:培养箱中继续培养2-4周。
⑥应用于兔3. 2mm X 5. Omm骨和软骨联合损伤模型的修复。
权利要求
一种双基因活化的骨-软骨复合移植体，其特征是将种子细胞种植在两种不同基因活化过的主要成分相同的双层支架材料中，利用原位基因转染原理，同时诱导了上下两层种子细胞分别向软骨细胞和成骨细胞分化，从而在体外形成组织工程化的骨-软骨复合移植体；所用种子细胞为骨髓间充质干细胞；所述支架材料主要成分为壳聚糖和明胶，所述两种基因，一种是任何已知的诱导干细胞向软骨细胞分化的基因，即转化生长因子或成纤维细胞生长因子或类胰岛素生长因子或血小板衍生生长因子，另一种是任何已知的诱导干细胞向成骨细胞分化的基因，即骨形态发生蛋白或血管内皮细胞生长因子或降钙素基因相关肽或核心结合因子α1。
2. 根据权利要求l所述的双基因活化的骨-软骨复合移植体的制备方法，其特征在于 所述支架材料的制备过程是将能诱导干细胞向软骨细胞分化的质粒DNA的溶液滴加在支 架材料中，在4t:条件下，让质粒和支架材料复合12小时，制成软骨层支架材料，将能诱导 干细胞向成骨细胞分化的质粒DNA溶液滴加在另一个支架材料上，在fC条件下，让质粒和 支架材料复合12小时，制成成骨层支架材料。
3. 根据权利要求2所述的双基因活化的骨-软骨复合移植体的制备方法，其特征在于 所述的质粒和支架材料复合过程中，质粒和支架材料的质量比为1 P g/mg 100 g/mg。
4. 根据权利要求2所述的双基因活化的骨_软骨复合移植体的制备方法，其特征在于所述含有种子细胞的双层支架制备方法为首先将种子细胞分别种植在软骨层支架材料和成骨层支架材料中，然后将软骨层支架材料和成骨层支架材料上下粘结，形成带有种子细胞的双层支架体系；所述的软骨层和成骨层粘结的方法包括用一定浓度的琼脂糖溶液 (0. 5% -5% )将两层支架连在一起；用一定浓度的壳聚糖明胶混合溶液将两层支架连在一 起；用一定浓度的海藻酸钠和Ca2+溶液将两层支架连在一起。
5. 根据权利要求4所述的双基因活化的骨_软骨复合移植体的制备方法，其特征是所 述种子细胞为骨髓间充质干细胞。
6. 根据权利要求2所述的双基因活化的骨_软骨复合移植体的制备方法，其特征是所 述的支架材料主要成分是壳聚糖和明胶。
7. 权利要求l所述的双基因活化的骨-软骨复合移植体在关节处骨和软骨联合损伤修 复中的应用。
全文摘要
本发明属于组织工程和基因输送技术领域，具体涉及一种双基因活化的骨-软骨复合移植体及其制备方法和应用。该方法通过将种子细胞分别种植在两种不同基因活化过的主要成分相同的双层支架材料上，利用原位基因转染原理，同时诱导上下两层种子细胞分别向软骨细胞和成骨细胞分化，从而在体外形成组织工程化的骨-软骨复合移植体；所用的种子细胞为骨髓间充质干细胞；所述支架材料主要成分为壳聚糖和明胶，所述的两种不同的基因，一种是任何已知的诱导干细胞向软骨细胞分化的基因，另一种是任何已知的诱导干细胞向成骨细胞分化的基因。利用上述方法，在体外制备了骨-软骨复合移植体，并进一步在体内用于骨-软骨的修复。
文档编号A61L27/22GK101721748SQ20091023461
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者刁华佳, 张峻峰, 李沛, 陈欢, 陈江宁 申请人:南京大学