用于治疗勃起功能障碍的巴西漫游蜘蛛的毒素的制作方法

专利名称：用于治疗勃起功能障碍的巴西漫游蜘蛛的毒素的制作方法
用于治疗勃起功能障碍的巴西漫游蜘蛛的毒素本发明涉及通过使用来自巴西漫游蜘蛛(Phoneutria nigriventer)的毒素 Tx2-6的药物组合物来增强雄性阴茎勃起功能的方法。来自Τχ2-6毒素的药物组合物的用 途在本文中以用作恢复勃起功能障碍患者(例如高血压个体)的勃起功能的方法形式请求 保护。阴茎勃起是在受控调节下发生的复杂血液动力学功能。其通过激活副交感盆神 经(pelvic nerve)，从而导致动脉扩张，然后海绵体松弛而起始(ANDERSS0N K. E.，WAGNER G.Physiology of penileerection. Physiol Rev 75,191-236,1995)。存在以下科学共识一氧化氮(NO)是产生和维持增加的海绵体内压和阴茎勃起 的先决条件。NO合成是由一氧化氮合酶(NOS)来完成的。该酶的组成型形式-神经元型 NOS(nNOS)和内皮型 NOS(eNOS)-参与阴茎勃起的诱导(IGNAR0, L. J.，BUSH, P. Α.，BUGA,
G.M.，WOOD,K. S.，FUKUTO, J. M.，RAIFER, J. Nitric oxide and cyclicGMP formation upon electrical field stimulation cause relaxation ofcorpus cavernosum smooth muscle. Biochem Biophys Res Communl70,843-850,1990)。NO由阴茎动脉的小梁和神经元组织中的氮能神经释放(KIM，N.，AZADZ0I， K. Μ. , GOLDSTEIN, I. , SAENZ DE TEJADA, I. A nitricoxide-1ike factor mediates nonadrenergic-noncholinergic neurogenicrelaxation of penile corpus cavernosum smooth muscle. J Clin Invest88，112-118，1991)，其通过激活鸟苷酸环化酶(这增加了 cGMP (环鸟苷一磷酸)的细胞内浓度)而在海绵体动脉中发挥它们的松弛作用(MIZUSAWA，
H.，HEDLUND,P.，BRIONI，J. D.，SULLIVAN,J. P.，ANDERSON,K. Ε. nitric oxide independent activator ofguanylate cyclase by YC-I causes erectile responses in the rat. J Urol,167，2276-2281，2002).依赖于cGMP(cGKl或PKG)的环化酶I蛋白随后可改变细胞内钙通道并且 通过钙依赖性K+通道的开放导致平滑肌细胞的超极化(CHRIST，G.J.，WANG，H. Ζ.， VENKATESffARLU, K. ， ZHAO, W. ， DAY N. S. Ions channels and gap junctions their role in erectilephysiology, dysfunction, and future therapy. Mol Urol.，3，61—73，1999)。 PKG可将影响钙通道的其他蛋白质磷酸化或改变肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化状态，从 而导致由 NO 介导的海绵体肌肉松弛(MILLS, Τ. Μ.，CHITALEY, K.，WINGARD, C. J.，LEWIS, R. W. , WEBB, R. C. Effect of Rho—kinase inhibition on vasoconstriction in the penilecirculation. J Appl Physiol,91，1269—1273，2001).勃起功能障碍(ED)是由于海绵体内不平衡的收缩和松弛因子，尤其是通过NO系 统的阻碍而发生的，高血压是一种ED风险因子(ANDERSS0N K. E. Pharmacology of penile erection. Pharmacol Ver53, 417-450, 2001)。麻醉动物中海绵体神经的刺激会由于增加的 海绵体内压介导的NO而引发阴茎勃起(BURNETT，A. L.，CHANG, A. G.，CRONE, J. K.，HUANG, P. L. , SEZEN, S. F. Noncholinergicpenile erection in mice lacking the gene for endothelial nitric oxidesynthase. J Androl. ,23,92-97, 2002) ·巴西漫游蜘蛛的毒液是生物活性肽的丰富来源(Coedeieo, M. N.，Richaedson, M.，Gileoy, J.，Figueieedo, S. G. D.， BeirAo J P. S. L.，Diniz, C. R. Properties of the venom from the SouthAmerican armed spider Phoneutria nigriventer(Keyserling,1891). J. Toxicol-Toxin Rev.，14,309-326,1995 ；RICHARDSON, Μ.，PIMENTA, Α. Μ. C.，BEMQUERER, Μ. P.，SANTORO, Μ. Μ.，BEIRAO, P. S. L.，De LIMA, Μ. Ε.，FIGUEIREDO, S. G.，BLOCH, C. Jr.， VASCONCELOS, Ε.，CAMPOS, F. Α. P.，GOMES, P. C.，CORDEIRO, Μ. N. Comparison of the partial proteomes of the venomsof Brazilian spiders of the genus Phoneutria. Comp. Biochem. Physiol. C, Comp. Pharmacol. Toxicol. 142，173—187，2006)，并且该蜘蛛与 表现为不同症状的一些严重的人类意外事故有关(BUCARETCHI，F.，DEUS REINALD0, C. R.， HYSLOPjS.，MADUREIRA，P. R. ,De CAPITANI,E. M.，VIEIRA，R. J. A clinico-印idemiological studyof bites by spiders of the genus Phoneutria. Rev. Inst. Med. Trop, SaoPaulo 42，17-21，2000)，包括阴莲勃起(YONAMINE，C. Μ·，TRONCONE，L. R. P.，CAMILLO， Μ. Α. P. Blockade of neuronal nitricoxide synthase abolishes the toxic effects of Tx2-5, a lethal Phoneutrianigriventer spider toxin.Toxicon 44 169—172，2004)。巴西漫游蜘蛛的毒液含有产生不同生物学效应的数种神经毒素。离子通道通常 是此类效应的靶标，例如钠离子通道(ARAI^JO，D.A，CORDEIRO，M.N.，DINIZ，C. R.， BEIRAO 5 P· S. L. Effects of a toxicfraction，PhTx2，from the spider Phoneutria nigriventer on the sodiumcurrent. Naunyn-Schmiedeberg' s Arch Pharmacol，347， 205_208，1993 ；Martin-Moutot，N.，Mansuelle, P.，Alcaeaz G.，Dos SAntos？ R. G.，Cordeiro, M. N.， De Lima，Μ. E.，Seagar，M. & VanRenteeghem, C. Phoneutria nigriventer toxin 1 :a novel, state-dependent inhibitor of neuronal sodium channels that interactswith micro
conotoxin binding sites. Mol Pharmacol，69，1931-7，2006)、钙离子通道(LEAO， R. Μ. ,CRUZ, J. S.，DINIZ，C. R.，CORDEIRO，Μ. N. BEIRAO5P S.Inhibition of neuronal high-voltage activatedcalcium channels by the Phoneutria nigriventer Tx3~3 peptide toxin. Neuropharmacology, 39,1756-1767, 2000 ；Dos Santos, R. G.，VanRenteeghem,
C.，MAETIN_M0UT0T N.，Mansuelle, P.，Coedeieo Μ. N.，Diniz C. R.，M0RI，Y.，De Lima Μ. Ε. & Seagarj Μ. . Phoneutria nigriventer omega-phonetoxin IIA blocks the Cav2 famiIyof calcium channels and interacts with omega-conotoxin-binding sites. J Biol Chem，277， 13856-62，2002)和钾离子通道(KUSHMERICK C，KALAPOTHAKIS E，BEIRAO PS, PENAFORTE CL，PRADO VF, CRUZ JS，DINIZ CR，CORDEIRO MN，GOMEZ MV, ROMANO-SILVA MA, PRADO MA. Phoneutria nigriventer toxinTx3-l blocks A-type K+ currents controlling Ca2+ oscillation frequencyin GH3 cells. J. Neurochem. 72 (4) :1472_81，1999)。毒素Tx2_6(巴西漫游蜘蛛的毒素)是含有48个氨基酸残基的多肽，所述氨 基酸残基中的10个残基是半胱氨酸(CORDEIRO，M.N.，DINIZ, C. R.，VALENTIN, Α. C.， VON EICKSTEDT, V. R.，GILROY, J.，RICHARDSON, Μ. The purification and aminoacid sequences offour Tx2 neurotoxins from the venom of the Brazilian "armed，，spider Phoneutria nigriventer. FEBS Lett, 310 (2) : 153-156，1992)。减少电压依赖性钠离子通 道的快速失活是该毒素的主要作用(MATAVEL, A.，CRUZ, J. S.，PENAFORTE, C. L.，ARAUJO,
D.Α. M.，KALAPOTHAKIS, Ε.，PRAD0, V. F.，DINIZ, C. R.，CORDEIRO, Μ. N.，BEIRAO,P. S. L. Electrophysiological characterization andmolecular identification of the Phoneutria nigriventer peptide toxinPnTx2_6. FEBS Letters,532,219-223, 2002)，在该类型的毒素中该作用是由其在钠通道的位点3中的作用介导的(Cestele， S. &Catterall, W. A. Molecular mechanisms of neurotoxin action onvoltage-gated sodium channels. Biochimie,82,883-92,2000)。巴西漫游蜘蛛的粗制毒液诱导海绵体松弛，该作用可通过应用L-NAME来阻止 (ANTUNES，E. ,MARANG0NLR. A. ,GIGLI0, J. R. ,BRAIN, S. D.，de NUCCI，G. Activation of ti ssuekallikrein-kininogen-kinin system in rabbit skin by a fraction isolatedfrom Phoneutria nigriventer(armed spider) venom. Toxicon,31,1385-1391,1993)。专利US6365590描述了用于治疗勃起功能障碍和性无能的血管活性组合物。此类 组合物是能够引起勃起的带负电荷的成分(例如前列地尔)与带正电荷的成分(例如哌唑 嗪)或局部麻醉剂(例如利多卡因)的反应的产物。此类成分以酸和碱的形式组合形成有 机盐或具有离子配体的化合物。专利US7105571描述了用于治疗勃起功能障碍的方法和组合物。该方法为，在患 者的舟状窝(navicular pit)内插入含有能够引起勃起的血管活性前列腺素的有效半固体 组合物。该组合物包括血管活性前列腺素、促进组合物吸收的试剂、多糖、亲脂化合物和缓 冲剂系统。专利US6291471描述了阿扑吗啡(apomorfine)用于治疗勃起功能障碍(尤其是 在与血管变化相关的勃起功能障碍的情况下)的用途。还公开了由递送治疗量的阿扑吗啡 或该药物的前体药物组成的治疗方法。专利US5942545描述了用于治疗阴茎勃起功能障碍的组合物和方法。该发明通过 在阴茎上进行局部透皮给药法来施用包含前列腺素El的组合物。据称其在阴茎勃起功能 障碍的治疗中是无刺激性并且有效的。还可使用有效量的促进吸收的试剂例如对二氧戊环 (dioxalone)、二喊烷或基于乙醇溶液的载体组合物。还可将苯妥拉明或哌唑嗪与前列腺素 El结合使用。专利US6586391描述了通过递送内皮素拮抗剂以通过产生NO来促进血管扩张从 而减少勃起功能障碍的方法。专利US7223406描述了预防和治疗勃起功能障碍的方法和组合物。该发明基于递 送有效量的属于一组物质的一种或多种因子，在该组物质中有血管内皮生长因子、脑源性 神经营养因子、成纤维细胞生长因子、神经营养因子_3、神经营养因子-4或血管生成素-1。 使用的因子可以是整合蛋白或编码所述因子的核酸或所述蛋白质的功能性片段。还公开了 组合物、试剂盒和组合方法。专利US7022728描述了苯并咪唑的新型衍生物，其可用于治疗雄性或雌性性功能 障碍、阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症、焦虑症、情绪和行为病。可对药物进行化学修饰以使其性质例如其生物分布、药代动力学和溶解性发生改 变。几种方法已用于增加药物的溶解度和稳定性，其中使用有机溶剂、乳剂、脂质体、PH调 节剂、化学改变以及形成药物制剂与合适的封装剂例如环糊精的复合物。环糊精属于包括 六、七或八个吡喃葡糖单位的环状低聚糖家族。由于空间相互作用，环糊精(⑶)产生以具 有非极性内腔的截锥形式存在的环状结构。此类物质是化学上稳定的化合物，可进行区域选择性改性。环糊精(主体)与几种疏水性分子(客体)(包括全部或部分进入CD的腔内的 此类分子)一起形成复合物。CD已用于药物、香水和芳化剂的增溶和封装，如Szejtli， J.，Chemical Reviews, (1998)，98，1743—1753 ；Szejtli, J.，I. Mater. Chem.，(1997)，7， 575-587 中描述的。根据 Rajewski，R. A. ,Stella,V. ,J. Pharmaceutical Sciences, (1996)， 85,1142-1169中描述的对于它们的毒性、诱变性、致畸性和致癌性的详细研究，环糊精显 示低毒性，特别地显示了羟丙基-对-环糊精的低毒性，如Szejtli，J. Cyclodextrins Properties andapplications. Drug Investig. , (1990) 2 (suppl. 4) :11_21 中 艮导的。除 了会引发红细胞损害的一些高度浓缩的衍生物外，此类产物通常不会对健康造成危险。⑶在水、甲醇和乙醇中中度可溶，迅速溶于非质子极性溶剂，例如二甲基亚砜、二 甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和吡啶。可在文献中发现关于通过使用环糊精通过包合物(inclusioncompoimd)增加 溶解性低的客体在水中的溶解度的作用的许多工作以及关于包合配合物(i η c 1 u s i ο η complexes)的稳定性的论述，所述包合配合物的物理化学性质详尽地描述于Szejtli， J. ， Chemical Reviews, (1998),98,1743-1753.Szejtli, J. ， J. Mater. Chem. ， (1997),7, 575-587中。环糊精可与肽和/或蛋白质一起用于获得药物制剂以提高它们的稳定性和生 物利用度。这样，本发明使用在Tx2-6与环糊精之间形成超分子组合物作为用于血压正常和 高血压大鼠勃起功能障碍的测试中的药物组合物实例的策略。除了环糊精外之外，可生物降解聚合物、粘膜粘着聚合物和凝胶也可用作Τχ2-6 毒素控制释放的装置。在这样的系统中，将毒素包埋在基于微球型药物包囊的聚合物基质 中，所述基质在数天、数月或甚至数年内在生物体内以少量和受控的日剂量释放药物。至于 凝胶，可局部使用制剂。已就几种聚合物的物理性质在控释系统中对它们进行了检测，即聚(氨酯)(就 它们的弹性)、聚(硅氧烷)或硅酮(就它们良好的隔离度(isolation))、聚(甲基丙烯酸 甲酯)(就它们的物理强度)、聚(乙烯醇)(就它们的疏水性和抗性)、聚(乙烯)(就它 们的硬度禾口不渗透性)(Gilding,D. K. Biodegradable polymers. Biocompat. Clin. Implat. Mater. (1981)2 209-232)。然而，为了用于人，材料必须在化学上是惰性的并且不含杂质。用于释放系统的一 些材料是聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚丙烯酰胺、乳酸基质(base) (PLA)、乙醇酸基质 (PGA)中的聚合物和相应的共聚物(pLGA)和聚(酐)，例如癸二酸基质(PSA)的聚合物和 与多个疏水聚合物的共聚物。本发明的制剂的特征在于使用与包含在环糊精中的Tx2-6和其药学上可接受的 盐组合的药学上可接受的赋形剂与至少另一种药物活性化合物(其包含在或不包含在环 糊精、脂质体中和可生物降解聚合物例如PLA、PLGA和/或它们的混合物的微型胶囊中)的 混合物。可使用赋形剂或赋形剂的混合物制备制剂。赋形剂的实例如下水、盐溶液、磷酸盐 缓冲液、林格溶液、葡萄糖溶液、Hank溶液、含有或不含有聚乙二醇(glycol polyethylene) 的生物相容性盐溶液。还可使用非水性媒介物例如不挥发油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三 酯。其他有用的制剂包含能够增加粘度的试剂例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖以获得促进它们的递送的凝胶或粘膜粘着制剂。赋形剂可包含更少量的添加剂如增加物质或缓冲剂的化学等渗性和稳定性的 物质。下列是缓冲剂的实例磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、Tris缓冲剂；而硫柳汞 (timerosol)、间或邻-甲酚、福尔马林和苯甲醇是防腐剂的实例。标准制剂可以是液体或 固体。因此，对于非液体制剂，赋形剂可包括可在递送前向其中加入无菌盐溶液的葡萄糖、 人血清白蛋白、防腐剂等。本发明使用聚合物质环糊精、脂质体、乳剂，其全都用作Tx2-6毒素的载体。此类 制剂可通过肌内注射、静脉内注射、皮下注射、口服制剂、通过吸入或通过装置(包括直接 植入或注射入海绵体的装置)进行施用。在现有技术中还未发现要求保护Τχ2-6毒素、其药学上可接受的盐以及基于环糊 精、粘膜粘着制剂或凝胶的Τχ2-6药物组合物用于局部施用的用途的专利，所述局部施用 可用作增强勃起功能或用于恢复患有勃起功能障碍的个体(例如，高血压个体)的方法。本发明的一个特征是使用Τχ2-6作为通过NO释放引起阴茎勃起的诱导物。这已 通过在血压正常和高血压大鼠中使用NO的特异性标记(DAF-FM)和共聚焦显微镜分析进行 的体外和体内实验得到证明。此外，本发明还已验证非特异性NOS(L-NAME)抑制剂完全阻 断由该毒素引起的勃起的增强剂效应(通过ICP/MAP关系测量的)，这证明了 NO在毒素效 应中所起的关键作用。使用环糊精的本发明药物组合物的另一个有利方面是例如海绵组织中松弛效应 的延长作用、效应的起始以及通过基于羧甲基纤维素(作为非限定性实例)的粘膜粘着剂 制剂和凝胶递送Τχ2-6的更高便利性。有趣地，使用Τχ2-6作为具有功能受影响的高血压个体的勃起增强剂或甚至作为 勃起功能恢复剂(restorer)是由于该分子的作用机制，根据实验结果，其不同于现今使用 的主要药物(西地那非，Viagra )。柠檬酸西地那非(1朋々(学名为1-[4-乙氧基-3-(6， 7- 二氢-1-甲基-7-氧-3-丙基-IH-吡唑并[4，3-d]嘧啶-5-基)苯磺酰基]-4-甲基哌 嗪的柠檬酸盐)，商品名为Viagra ，是由辉瑞开发的用于治疗勃起功能障碍(雄性性无 能)和肺动脉高血压的药物。药物市场中用于治疗勃起功能障碍的其主要竞争者是他达拉 非(tadalafila) (Cialis )和伐地那非(vardenafila) (Levitra ，Vivanza )。另一个重要的方面是勃起的生理学过程部分涉及副交感神经系统，其导致阴茎海 绵体中一氧化氮(No)的释放。NO结合鸟苷酸环化酶，从而将其激活，这导致环鸟苷一磷酸 (cGMP)的水平增加。CGMP诱导海绵体平滑肌群的松弛(从而引起血管舒张)，这导致更多 的血液流入，从而导致勃起。西地那非(Viagra )对特异于cgmp的5-型磷酸二酯酶(PDE5)具有很强的选择 性，所述酶负责阴茎海绵体中CGMP降解。西地那非的分子结构与CGMP的分子结构相似，并 且其作为竞争剂与后者在海绵体中竞争与PDE5的结合，从而导致该酶的抑制，由此导致更 高的cGMP利用度。由于更高的cGMP利用度引起血管舒张增加，因而获得良好进行的勃起。 如果不存在性刺激，从而缺乏NO/cGMP系统的激活，那么西地那非不导致勃起。通过相同机 制起作用的其他药物包括他达拉非(Cialis )和伐地那非(Levitra )。至于τΧ2-6，已确 认其作用机制与一氧化氮的释放有关，这样，与西地那非作用的部位相比较而言，其干扰较前部的部位。因此，当其作用于氮能系统的电位依赖性钠离子通道时，毒素必定引起去极 化，从而导致一氧化氮的释放。一氧化氮触发如之前所述的整个过程，即，其激活鸟苷酸环 化酶，从而增加cGMP的产量，这反过来又导致决定勃起的海绵体的松弛。简而言之Tx2-6 释放一氧化氮(激活勃起的主要因子)。Viagra 抑制通过一氧化氮的首要作用形成并 且为该途径中的最后一个成份的CGMP，并且使得其能够被磷酸二酯酶5破坏。因此，我们提 出另一种类型的药物，其也可与其他现有药物结合，用于矫正阴茎勃起过程所涉及的系统 中可能的缺陷。可通过下列非限制性的实施例更好地理解本发明。实施例1 动物和药物所有进行的实验已由米纳斯联邦大学的动物实验伦理委员会(CETEA)批准 (no. 22/2006)。将来自巴西米纳斯州(MG)米纳斯联邦大学的Biot6rio do Instituto de Ciencias Biol0gicas (生命科学学院的动物房)的血压正常大鼠(12-14周龄，体重 220-250g)和高血压大鼠(CHITALEY，K.，WEBB，R. C.，D0RRANCE，A. Μ. ,MILLS,Τ. Μ. Decreased penile erection in DOCA-salt and strokeprone-spontaneously hypertensive rats. International Journal oflmpotence Research 13，16-20，2001)在实验中用作模型 DOCA-sal。血压正常大鼠自由地接触标准食物和水并且在12小时光照/12小时黑暗周期 中进行供养，从早上6点开始光照。通过在使用三溴乙醇麻醉的情况下进行单侧肾切除(unilateralnefrectomy)和 将去氧皮质酮(desoxicorticosterone) (D0CA，200mg/Kg体重)的醋酸酯“胶粘剂”置于颈 后部来使Wistar雄性大鼠(130-170g)产生高血压。DOCA大鼠在4周的时间内接受盐水 (1% NaCl, 0.2% KCl)。使“假手术”对照大鼠进行单侧肾切除术并饮用纯水。在4周的 (D0CA/假手术)处理后测量心脏收缩压。测量血压正常和高血压大鼠中不同剂量的Tx2-6 对勃起功能的效应。通过在用Τχ2_6(皮下注射的；48μ g/Kg)处理的正常血压大鼠中使用海绵体内注 射(200mg/Kg)的一氧化氮合酶非选择性抑制剂L-NAME(L-Ne-硝基-精氨酸甲酯)检测由 毒素对勃起的效应引起的一氧化氮的参与。实施例2 体内测量的海绵体内压/平均动脉压(PIC/PAM)。用氨基甲酸乙酯(140mg/Kg，腹膜内)麻醉大鼠，然后将其置于温暖的平台上。暴 露左股动脉，通过使用连接至充满肝素化盐水的管(PE10)的30G针将导管插入，从而允许 连续监控平均动脉压(medianarterial pressure，MAP)。利用中间切口暴露阴茎海绵体神 经和主体。移动相邻肌肉以便能够看见自同侧神经节显现并且位于前列腺的背部上的海绵 体神经。将连接至充满肝素化盐水的管(PE10)的针(30G)插入海绵体基部以测量海绵体 内压(ICP)。通过观察插管插入后海绵体内压的稍微增加和肝素化盐水流入后阴茎海绵体 的肿大反应来确认插管的正确放置。将动脉和海绵体插管连接至压力传感器。通过MAP/ICP监控器放大数值，并且以 mmHg表示。获得压力数据并且以12Hz进行数字化，显现并记录压力数据。在分离后，将海 绵体神经置于双极电极中。在皮下注射Tx2-6(12yg/Kg)之前和之后(15分钟)绘制对电 压(0.5，3. 0V，0.1ms.，每一个步骤进行30秒)的反应曲线。在所有实验中，在仪器校准后 获得MAP/ICP记录。
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实施例3 共焦显微镜检查通过腹膜内注射氨基甲酸乙酯(140mg/kg)麻醉大鼠，然后通过腹部动脉放血将 其杀死。用IOml盐水灌注血压正常大鼠的海绵体，然后切取阴茎。将海绵体条(大约 3-12mm 长)与不同浓度(0. 1-0. 01 μ g/ml)的毒素 Tx2~6 和 2· 5 μ molar DAF(DAF_FM 二乙 酸酯，4-氨基-5-甲氨基-2，，7，- 二氟荧光素二乙酸酯，Invitrogen Brasil Ltda) 一起 温育10分钟。然后，用PBS (5分钟/每次清洗)清洗制备物3次，将其于-80°C下冷冻24 小时。在该步骤后，用OCT湿润条，然后于-20°C使用冷冻切片机进行切片(20 μ m,每动物6 个切片)。将切片在环境温度下固定在覆盖有甘油(90% )和Tris-HCL缓冲液(10% )的 凝胶化薄片上并且保持冷冻直至进行共聚焦分析(LSM-510)。使用共聚焦显微镜中的激光 扫描仪(“氩离子激光器”，油浸物镜，63X)(激发488nm)获得荧光图像。捕获各切片的至少 一个图像，由细胞释放的一氧化氮在共聚焦显微镜下产生绿色荧光。在10分钟后用10 μ 1 DAF (2. 5 μ molar)灌注接受48μ g/Kg Tx2_6(静脉内)的正常血压大鼠的海绵体，然后立即 切取并且制备用于通过共聚焦显微镜进行的分析。也切取了高血压大鼠(模型DOCA-sal) 和假手术大鼠的海绵体并且在预定的制备后通过共聚集显微镜进行了分析。结果表示为平均值士SEM。统计分析使用“两因素方差分析(two-way AN0VA) ”差 异检验，然后进行Bonferroni检验。ρ < 0. 05的差异被认为是统计学上显著的。实施例4 毒素Τχ2-6 (通过皮下和静脉内途径注射的)对大鼠勃起功能的效应。将毒素Τχ2-6的样品(12μ g/kg)通过皮下和静脉内途径注射入麻醉的大鼠，在骨 盆大神经节(major pelvic ganglion)的整个电刺激过程中就平均动脉血压(MAP)和海 绵体内压(ICP)连续监控麻醉的大鼠。通过电压变动(0.5-3. 0V，12Hz，0. lms，各步骤进行 30秒)获得发现的曲线。在毒素注射之前和之后15分钟获得此类曲线。在皮下注射毒素 Tx2-6后勃起反应得到显著增强。实施例5 毒素Τχ2-6恢复高血压大鼠(DOCA-sal)的勃起功能。已知高血压大鼠(模型DOCA-sal)与手术对照(假手术)相比较显示严重的勃 起功能障碍(MILLS, Τ. Μ.，CHITALEY, K.，WINGARD, C. J.，LEWIS, R. W.，WEBB, R. C. Effect of Rho-kinase inhibitionon vasoconstriction in the penile circulation. J Appl Physiol，91,1269-1273，2001)。通过将12. 0 μ g/kg Tx2_6 (皮下)注射入腹部区域使高血 压大鼠接受的预处理(15分钟)已诱导了这些大鼠的勃起功能恢复。在实验过程中连续监 控它们的勃起功能(对神经节电刺激的制剂反应)(ICP/AMP比率)。实施例6 在毒素Tx2-6存在的情况下大鼠的海绵体一氧化氮释放。一氧化氮是来源于参与勃起过程的神经和内皮的最重要的神经递质。因此，使用 特异性荧光标记(DAF)(其具有在一氧化氮存在的情况下发绿色光的性质)评估大鼠阴茎 组织中的NO释放。利用共聚集显微镜分析该荧光。观察和评估不同状况i)将血压正常大鼠的阴茎组织的切片在体外与不同浓度 的毒素Tx2-6 —起温育10分钟；ii)在另一系列的实验中，在血压正常大鼠中静脉内注射 该毒素，10分钟后将DAF试剂输注入海绵体中，之后立即切取海绵体并且制备切片；iii)将 该毒素皮下注射入正常血压大鼠和高血压大鼠，20分钟后，将DAF试剂注射入海绵体，之后 切取阴茎组织，并且制备切片。实施例7-—氧化氮合酶(NOS)的阻断阻碍了 Tx2-6在大鼠的勃起功能中的作用。
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通过NOS酶作用从L-精氨酸产生一氧化氮(NO)。该合成在生物体的不同部分包 括海绵体中发生。在该实验中，海绵体内注射非特异于NOS的抑制剂(L-NAME，200mg/Kg)。 验证了 L-NAME阻断大鼠的勃起功能并且毒素Τχ2-6(12μ g/kg，皮下)不能将其逆转。本发明显示巴西漫游蜘蛛的毒素Tx2-6通过一氧化氮释放诱导大鼠海绵体的 松弛。平滑肌中的松弛物质例如NO在副交感神经末稍和覆盖海绵体中的血管壁和腔隙 空间的内皮细胞中合成(BURNETT，A. L.，L0WENWTEIN, C. J.，BREDT, D. S.，CHANG, Τ. S.， SNYDER, S. H. Nitric oxide -.a physiologic mediator of penile erection. Science 257, 401-403，1992)。在本发明中，在毒素Tx2_6存在的情况下观察到大鼠的海绵体中一氧化氮的释 放，在该毒素存在或不存在的情况下监控由电刺激引起的其勃起过程(ICP/MAP比)。观察 到毒素Tx2-6在接受骨盆神经节电刺激的被麻醉的血压正常大鼠中引起显著的勃起功能 增强。该结果在已通过皮下途径接受该毒素的动物中得到明确证实。已进行静脉内注射的 动物也显示毒素作用，该作用也在通过共聚焦显微镜观察的NO释放中得到验证。高血压大鼠(模型DOCA-sal)的勃起功能障碍是已知的。当皮下注射毒素Tx2_6 时，此类动物中的勃起功能被完全恢复。在毒素释放的一氧化氮存在(这可通过共聚焦显 微镜分析证明)的情况下温育血压正常和高血压大鼠的海绵体组织。由来源于“NANC”(非 肾上腺素能，非胆碱能)神经和可能地来源于窦状内皮细胞的一氧化氮在海绵体阴茎勃起 中进行的至关重要的作用得到广泛承认(T0DA N, AYAJIKIK, 0KAMURA Τ. Nitric oxide and penile erectile function. Pharmacol Ther.2005 May ； 106 (2) :233_66)。在过去数十年中已对参与海绵体和阴茎血管系统的收缩和松弛的机制进行了广 泛研究(ANDERSS0N K. Ε. , WAGNER G. Physiologyof penile erection. Physiol Rev 75， 191-236,1995)。NO已被建议为海绵体中NANC神经的主要体外调节剂以及许多种哺乳 动物中海绵体压力的体内调节剂，所述哺乳动物包括大鼠(BURNETT，A.L.，L0WENWTEIN, C. J.，BREDT, D. S.，CHANG, Τ. S.，SNYDER, S. H. Nitric oxide :a physiologic mediator of penile erection. Science 257，401-403，1992)、兔子(TEIXEIRA，C. E.，IFA，D. R.， C0RS0, G.，SANTAGADA, V.，CALIENDO, G.，ANTUNES, Ε.，de NUCCI，G. Sequence and structure-activityrelationship of scorpion venom toxin with nitrergirc activity in rabbitcorpus cavernosum. FASEB J, 17,485-487,2003)、狗(HayashidaH,Fujimoto H, Yoshida K, Tomoyoshi Τ, Okamura Τ, Toda N. Comparison of neurogenic contraction and relaxation in caninecorpus cavernosum and penile artery and vein. Jpn J Pharmacol. 1996Nov ；72 (3) :231_40)、猴子(0KAMURA T，AYAJIKI K, TODA N. Monkey corpus cavernosum relaxation mediated by NO and otherrelaxing factor derived from nerves. Am J Physiol. 1998 Apr ；274 (4 Pt2) :H1075_81)和人(LEONE AM，WIKLUND NP, H0KFELT T, BRUNDIN L, MONCADA S. Release of nitric oxide by nervestimnlation in the human urogenital tract. Neuroreport. 1994 Feb24 ；5 (6) :733_6)。已知动作电位开放氮能神经末梢中对河豚毒素敏感的钠通道，这促进钙可能通过 血管中的N型Ca2+通道流入。海绵体中的情况似乎是这样，因为通过电刺激犬科动物海绵 体切片诱导的松弛对芋螺毒素(N型钙通道的特异性阻断剂)是敏感的(Leone等人，1994 ； Okamura等人，2001)。增加的收缩钙在钙调蛋白存在的情况下参与nNOS的激活(Bredt &Snyder, 1990)。使用兔子海绵体的实验表明NO神经元型释放或NO的合成依赖于钙的胞内 活性(intracellularviability) (Satio 等人，1993)。毒素例如Tx2-6的分离和纯化为研究参与阴茎勃起的作用机制(包括导致NO释 放的氮能神经刺激)提供了重要的工具。实施例8-Τχ2-6的环糊精包合物的制备和表征以及环糊精包含的Τχ2-6在大鼠勃 起功能中的作用。以范围从1 1至1 20的摩尔比的Τχ2-6 β _cd在水性溶液中制备β -环 糊精和其衍生物与Τχ2-6和其药学上可接受的盐之间的包合物和相同的非限定性摩尔比 的机械混合物。在水性溶液中以上述β _环糊精与毒素Τχ2-6和其药学上可接受的盐的摩尔比制 备制剂。不断地搅拌溶液混合物直至β-环糊精完全溶解。之后，将混合物于液氮的温度下冷冻，然后冷冻干燥24小时。利用物理化学分析 技术表征所获得的固体物质。提供主体-客体相互作用的重要特征的技术是圆二色性、 ITC、DSC、质谱法(MALDI-T0F)、荧光和紫外可见区域中的吸收光谱学。使用毒素_环糊精包合物溶液进行生物吸收和稳定性检测。使用环糊精包含的毒 素并且按照与用于非包含毒素(实施例4)的方法相同的方法进行实验。将环糊精包含的 毒素Tx2-6的样品(12yg/kg)皮下注射入麻醉的大鼠，通过在骨盆大神经节的整个电刺激 过程中测量平均动脉压(MAP)和海绵体内压(ICP)来连续监控所述大鼠。利用电压变动 (0.5-3. 0V，12Hz，0. lms，每一步骤进行30秒)获得描绘的曲线。在毒素注射后15分钟获 得这些曲线。在皮下注射毒素Tx2-6后勃起反应得到显著增强。因此，环糊精包合的Τχ2-6可以用于制备具有更长勃起效应的口服或全身性制 剂。可将此类制剂封装在粘膜粘着聚合物或凝胶中，这允许获得Τχ-2-6的局部制剂和其用 于在正常血压动物以增强勃起和用于高血压动物中以恢复它们的勃起活性的用途。实施例9-制备和表征粘膜粘着制剂和凝胶(基于羟丙基甲基纤维素)用于毒素 Τχ2-6和Τχ2-6的环糊精包合组合物的局部施用制备基于非离子聚合物的凝胶，在聚合物中存在达到3%的羟乙基纤维素和羟丙 基甲基纤维素，达到Τχ2-6的环糊精包含的组合物。为了制备此类凝胶，将尼泊金甲酯溶解于蒸馏水中，然后在搅拌的条件下放置于 70°C的温度。制备包含具有环糊精包合的Tx2-6、丙二醇和抗氧剂(FDC-维生素C 1500mg LOT 017G9, NutroLaboratorie, Inc. EUA)的包合物的第二溶液。将这两种溶液混合，然后 在高达25°C下静置以形成凝胶。蒸馏水100%HEC 或 HPMC3%尼泊金0. 15%丙二醇15%CD :Tx2-6 或 Τχ2_6 1%抗氧剂5%适量实施例10-制备和表征基于卡波姆的粘膜粘着制剂和凝胶用于Τχ2-6和Τχ2_6的 环糊精包合物的局部施用
在(ρ/ν)的卡波姆中制备高达的Τχ2-6凝胶需要在缓慢搅拌的条件下将 该产物的粉剂在蒸馏水中溶解20分钟。制备Τχ2-6和其药学上可接受的盐的溶液，使之在 丙二醇(10%，15%和20%)中高达并且在70°C保温。缓慢地向该溶液中加入柠檬酸， 持续搅拌该溶液直至达到环境温度。在搅拌的条件下混合两种溶液，将尼泊金甲酯溶解在 无水乙醇中，然后加入至混合物中。在下述成分完全均一化后加入NaOH。制备包含1 % Tx2-6的卡波姆凝胶和其高达1 %的包合物。卡波姆Τχ2-6和/或包合物1 %丙二醇15%尼泊金甲酯0. 15%乙醇50 μ 130% 的 NaOH50 μ 1柠檬酸500 μ 1 *蒸馏水100%*终凝胶的ρΗ大约7.02附图概述

图1.在皮下注射Τχ2-6后，通过神经节刺激在正常血压对照大鼠中诱导的阴茎勃 起。神经节刺激(0. 5-3. 0V)诱导增加的ICP/AMP比率(海绵体内压/平均动脉压)，通过 皮下(η = 6)(图1Α)或静脉内(η = 5)(图1Β)注射Τχ2_6 (12 μ g/kg)显著增加了 ICP/ AMP比。*P < 0. 05 ( “两因素”方差分析，然后Bonferroni检验)。图2.被L-NAME (N0S ( 一氧化氮合酶)的非选择性抑制剂)抑制的大鼠勃起功能 不能被Tx2-6恢复。(图2Α)由次最大神经节刺激(1. 5V)诱导的ICP/AMP比率(对照)。 通过Τχ2-6皮下注射，神经节刺激得到显著增强(图2Β)。使用L-NAME (200mg/Kg，海绵 体内)的处理显著阻断了由次最大刺激诱导的ICP/AMP比率增加。该效应不被皮下注射 Τχ2-6(12μ g/kg)抑制。< 0.05 (两因素方差分析，然后Bonferroni检验)。图3.使用DAF-FM技术显示通过Tx2-6诱导的正常血压对照大鼠的海绵体中 NO (—氧化氮)的释放增加。图3Α，与Τχ2-6 (0. 01 μ g/ml)的体外温育在海绵组织切片中 诱导NO释放。图3B，与Tx2-6 —起温育的大鼠的海绵体切片中的荧光强度增加。图3C， Τχ2-6的静脉内注射(48yg/Kg)在海绵体切片中引起NO释放。图3D，在使用Tx2_6静脉 内注射的正常血压对照大鼠的海绵体中观察到荧光强度增加。结果表示为平均值士SEM ；η =3。*Ρ < 0. 05 (Student t 检验)。图4.在Tx2-6皮下注射后高血压(DOCA-Sal)大鼠中由刺激诱导的阴茎勃起。图 4Α，神经节刺激(0. 5-3. 0V)在实施假手术的大鼠中诱导增加的ICP/AMP比率，所述增加可 通过皮下注射Τχ2-6(12μ g/kg，η = 9)得到减弱。图4Β，高血压DOCA-Sal大鼠在骨盆大 神经节(MPG)刺激下展示严重降低的ICP/AMP比率，这可在皮下注射Τχ2-6(12μ g/kg，n = 6)后得到完全恢复。* <0.05(两因素方差分析，然后彻11作灯01^检验)。图5.使用DAF-FM技术，通过神经节刺激实施假手术的大鼠和用Tx2_6处理的高 血压DOCA-Sal大鼠的海绵体诱导了一氧化氮(NO)释放增加。Td(UygAg)的注射增 强了实施假手术的大鼠和高血压DOCA-Sal大鼠的海绵体组织中由神经节刺激引起的NO释放增加。
权利要求
巴西漫游蜘蛛毒素TX2 6的经遗传修饰的序列，其包含DNA序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3。
2.权利要求1的用于增强勃起功能的药物组合物，其中除了药学上和生理学上可接受 的载体和赋形剂外，还包含天然或合成毒素Tx2-6、其类似物或衍生物。
3.权利要求2的用于增强勃起功能的药物组合物，其包含毒素Τχ2-6的氨基酸序列。
4.权利要求3的用于增强勃起功能的药物组合物，其中天然毒素Τχ2-6分离自巴西漫 游蜘蛛，序列SEQ ID NO :1，或其通过合成产生。
5.权利要求4的用于增强勃起功能的药物组合物，其包含有效增强哺乳动物勃起功能 的量的毒素Τχ2-6。
6.权利要求5的用于增强勃起功能的药物组合物，其通过口服、肌内、静脉内、皮下、局 部、经皮途径或作为待植入或甚至直接注射入海绵体的装置递送。
7.权利要求6的用于增强勃起功能的药物组合物，其包含药物控释系统。
8.权利要求7的用于增强勃起功能的药物组合物，其包含环糊精、可生物降解聚合物、 粘膜粘着剂聚合物、凝胶或脂质体。
9.增强勃起功能的方法，其包括使用包含毒素Τχ2-6的药物组合物或制剂。
10.权利要求9的增强勃起功能的方法，其刺激一氧化氮释放至哺乳动物的海绵体内。
11.权利要求10的增强勃起功能的方法，其应用于血压正常和高血压个体。
12.毒素ΤΧ2-6的药物制剂用于制备增强哺乳动物的勃起功能的药剂的用途。
全文摘要
本发明涉及利用来自巴西漫游蜘蛛的毒素Tx2-6增强雄性勃起功能的方法。
文档编号A61K38/17GK101981190SQ200980108900
公开日2011年2月23日 申请日期2009年1月30日 优先权日2008年1月31日
发明者A·M·D·C·比门塔, K·P·努内斯, L·F·兰萨, M·D·C·瓦伦提姆, M·D·N·考叠罗, M·E·D·L·佩雷斯加西亚, M·R·巴斯康赛罗斯迪尼斯, M·理查德森, R·D·斯尼斯戴拉米兰, R·雷特 申请人:米纳斯吉拉斯联合大学;厄泽克尔迪亚斯基金会;米纳斯吉拉斯州科研资助基金会