专利名称：敬钊缨毛蜘蛛毒素提取物—敬钊毒素—v在制备镇痛药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽活性物质在医用配制品中的用途，尤其是敬钊缨毛蜘
蛛毒素提取物 一 敬钊毒素一 v在制备镇痛药物中的用途。
背景技术：
ZL200610031864.5号专利申请公开了从敬钊缨毛蜘蛛粗毒中提取分离出新 型神经毒素一敬钊毒素一V (简称敬钊镇痛肽)的方法。敬钊镇痛肽是一种新型 哺乳动物神经毒素，其化学结构为由29个氨基酸残基以特定的顺序组成的多肽， 含有三对链内二硫键，其化学结构如下式
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发明内容
本发明的目的旨在提供敬钊缨毛蜘蛛毒素提取物一敬钊毒素一v在制备镇
痛药物中的应用，这种镇痛药物既能够明显减轻病人的疼痛，且没有类似吗啡 的成瘾毒副作用。
本发明所述的敬钊镇痛肽的化学结构式如图l所示，其中Y为酪氨酸，C为 半胱氨酸，Q为谷氨酸，K为赖氨酸，W为色氨酸，M为甲硫氨酸，T为苏氨 酸，D为天门冬氨酸，S为丝氨酸，R为精氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，G 为甘氨酸，L为亮氨酸，I为异亮氨酸。敬钊镇痛肽可作为单一有效活性组份用 于制备镇痛药物。
镇痛药物是一类能够减轻疾病痛苦的物质，不仅能够选择性地减轻或缓解 疼痛感觉，也可以缓解因剧烈疼痛而引起的恐惧、紧张及焦虑等不愉快的情绪。 目前的镇痛药物可以分为解热镇痛药和麻醉性镇痛药物两类，前者以阿斯匹林 为代表，通过对组织中前列腺素合成过程的抑制作用，减轻神经末梢对致痛物质的敏感性，主要用于解除炎症性疼痛和其他钝疼；后者以吗啡为代表，其作 用部位主要在丘脑和皮层，作用于中枢神经系统中的p-型阿片受体，以缓解锐痛、 钝痛和内脏绞痛，从而产生镇痛作用，主要用于各种疾病所引起的疼痛和手术 后病人的严重疼痛，特别是晚期癌症疼痛。但是目前这种以吗啡为代表的麻醉 性镇痛药物存在成瘾性强，戒断症状严重，病人必须不断增加剂量才能维持镇 痛效果，而且最终导致对这类药物失效，同时对神经损伤性疼痛无疗效等主要 缺点。
本发明的敬钊镇痛肽是通过与特异性分布于外周神经元上的河豚毒素不敏
感型钠离子通道亚型(Navl.8、 Navl.9)以及河豚毒素敏感型钠离子通道亚型 Navl.7结合，抑制相关的电压门控钠离子通道电流而阻断痛觉神经信号的传导， 因此具有明显的镇痛作用，但没有明显的毒副作用。
下面将结合附图与动物药理实验对本发明作进一步的详细说明。 图1敬钊镇痛肽的化学结构。
图2敬钊镇痛5太硬l莫外注射对福尔马林所致大鼠强直性疼痛的镇痛作用。 图3肌肉注射敬钊镇痛肽对福尔马林所致大鼠强直性疼痛的镇痛作用。 图4肌肉注射敬钊镇痛肽对手术后疼痛的镇痛作用。
具体实施例方式
为了更好的理解和更充分的公开本发明，下面将通过大鼠硬膜外注射与肌 肉注射两种用药途径，采用大鼠福尔马林致炎疼痛实验动物模型与手术后实验 动物疼痛模型来说明敬钊镇痛肽的镇痛作用。
实验1:硬膜外注射敬钊镇痛肽对福尔马林所致大鼠强直性疼痛的镇痛作用。
1)实验用主要原料实验用敬钊镇痛肽是从敬钊缨毛蜘蛛粗毒中分离纯化 而得到，同时通过HPLC和MALDI-TOF质谱仪鉴定，其纯度为98%以上；PE-10 型聚乙烯管为美国Befon-Dickson公司生产；SD实验大鼠由中南大学湘雅医学 院动物房提供，体重180-220g之间，肌注生理盐水与肌注吗啡均购自湖南师范 大学校医院。2) 给药途径硬膜外注射是目前手术后病人与晚期癌症病人进行镇痛的常
用给药方式，该方式具有有效作用集中持久，毒副作用小等优点。
具体操作如下手术前先用盐酸氯胺酮0.4-0.6ml麻醉大鼠，剪掉两耳后方
的毛，酒精棉消毒，然后切开大鼠颈后部皮肤，依次分离肌层，暴露出寰枕膜, 用五号针挑开寰枕膜与第一颈椎之间的结膜，但不挑破寰枕膜，然后将早已准
备好的PE-10聚乙烯管插入硬膜外腔，插入深度为7.5 cm，直达腰膨大处，插管 方法与Yaksh等人报道的方法相一致，在管的开口处预先用封口膜缠一小结球 以确定插入深度，缝合小球固定在颈背肌。用火星封暴露在外的PE-10管口以 防感染。手术口涂碘酒消毒。手术后注射20万单位青霉素钠消炎。实验结束后， 注入10 |iL滂胺天兰染料，解剖后观察插管位置是否正确。术后动物均单笼饲 养，恢复一周，选择状态正常大鼠分为6组，每组IO只，分别是生理盐水对照 组，吗啡阳性对照组和4个敬钊镇痛肽溶液剂量组。
3) 大鼠福尔马林致炎疼痛模型的建立在大鼠爪跖部皮下注射稀释的福尔 马林(1%-5%)后，实验动物会出现舔、咬注射的足爪和抬腿等行为反应，并 呈现两个反应时相注射后立即产生的早时相(持续5-10min)和注射后15-60 min的迟时相，前者是基于化学刺激直接兴奋伤害性感受器，而后者包含组织痛 机理。 ，
4) 药物剂量设置:被试药物敬钊镇痛肽设置四个剂量组，分别为10.0 )Ig/kg、
25.0 ng/kg、 50.0 pg/kg和75.0 fig/kg体重，阳性对照药物盐酸吗啡的剂量组为 25.0 pg/kg体重，阴性对照为生理盐水，其注入硬脊膜外腔容量同以上测试药物， 均按1.0)iiL/10g体重(鼠)计算，给药次数为测定镇痛前30min给药。
5) 实验结果与分析
参照Lewis和Kellgren等的方法，实验在大鼠插管手术后第五天进行，此 时动物已处于完全清醒的正常状态，对有运动功能障碍者予以剔除。实验时室 温25'C，湿度40-60%。实验时间9 : 00—18 : 00，隔绝噪音。实验大鼠在试验 开始前3天被放置在观察室(一个20x20x30有机玻璃盒，并提供足够食物及饮 水)中每天至少30min，使其适应实验环境，消除恐惧及不安。大鼠实验前至少 在观察室内再适应30min，然后经留置的导管向硬膜外腔给药敬钊镇痛肽、盐酸 吗啡或生理盐水。给药30 min后在大鼠后脚掌皮下注射5%福尔马林液50 |iiL， 立即进行测试，记录每个5min内足底皮下注射了福尔马林液的大鼠行为表现的 疼痛评分值(S).福尔马林的致痛定量是以消耗在不同行为状态的总时间来衡量的，不同的行为状态是指动物舔、咬、摇被注射的足或减轻在被注射足上所承
受重量的各种行为表现，测定时间持续60min。疼痛评估曲线见图2。图中纵坐 标每一个点代表鼠后肢足底皮下注射福尔马林液后，每5 min内大鼠疼痛评分值 (S)。横坐标每个点代表每5min时间间隔。由图中可见各组实验大鼠足底皮 下注射福尔马林后，疼痛反应均呈典型二相反应。第一相反应(急痛)在注射 后立即开始，持续约5-10min。接着15-20min，鼠很少有提示伤害性作用的行为。 第二相反应(慢痛)大约在注射福尔马林后20-25min开始，持续到测痛结束。
与生理盐水对照，4个不同剂量的敬钊镇痛肽对福尔马林所致大鼠强直性疼 痛均有明显镇痛效应，其镇痛效应随敬钊镇痛肽的剂量递增呈正相关，用药后 30 min镇痛效果最强，镇痛作用可以持续近60 min。其中，硬膜外注射75.0 pg/kg 敬钊镇痛肽的作用效果与注射25.0 pg/kg吗啡的镇痛效果无显著性差异。所有实 验动物用药后，均未呈现任何明显的毒副作用症状，并且全部没有后遗症。
实验2:肌肉注射敬钊镇痛肽对福尔马林所致大鼠强直性疼痛的镇痛作用
1) 实验用主要原料实验用敬钊镇痛肽是从敬钊缨毛蜘蛛粗毒中分离纯化 而得到，同时通过HPLC和MALDI-TOF质谱仪鉴定，其纯度为98%以上；SD 实验大鼠由中南大学湘雅医学院动物房提供，体重180-220g之间，肌注生理盐
水与肌注吗啡均购自湖南师范大学校医院。
2) 肌肉注射给药途径首先用75%的酒精对大鼠一侧大腿进行消毒处理， 然后从大腿外侧距膝盖骨2/3处由后向前进针，进针角度以30度为宜，刺入肌 肉大约0.5cm即可，注意不要刺入太深，以免刺伤骨头。
3) 大鼠福尔马林致炎疼痛模^的建立在大鼠爪跖部皮下注射稀释的福尔 马林(1°/。-5%)后，实验动物会出现舔、咬注射的足爪和抬腿等行为反应，并 呈现两个反应时相注射后立即产生的早时相(持续5-10min)和注射后15-60 min的迟时相，前者是基于化学刺激直接兴奋伤害性感受器，而后者包含组织痛 机理。
4) 实验分组与药物剂量敬钊镇痛肽实验动物数为10只一组，肌肉注射 敬钊镇痛肽的剂量为500 pg/kg，空白实验对照组动物数为10只，肌肉注射生理 盐水的剂量为1.0^L/g，阳性实验对照组动物数为IO只，肌肉注射吗啡的剂量 为500.0 |ag/kg。
5) 实验结果与分析
给药30 min后在大鼠后脚掌皮下注射5。/。福尔马林液50 pL，立即进行测 试，记录每个5min内足底皮下注射了福尔马林液的大鼠行为表现的疼痛评分值(S)福尔马林的致痛定量是以消耗在不同行为状态的总时间来衡量的，不同的 行为状态是指动物舔、咬、摇被注射的足或减轻在被注射足上所承受重量的各
种行为表现，测定时间持续60min。疼痛评估曲线见图3，图中纵坐标每一个点 代表鼠后肢足底皮下注射福尔马林液后，每5min内大鼠疼痛评分值(S)。横坐 标每个点代表每5 min时间间隔。实验显示，与肌肉注射生理盐水实验组相比较， 肌肉注射500 pg/kg的敬钊镇痛肽具有明显的镇痛效果，且在实验过程中，未发 现有任何明显的毒副作用，并且全部没有后遗症。而肌肉注射吗啡与生理盐水 组相比较，镇痛效果不明显，证明肌肉注射等剂量吗啡的镇痛效果比注射敬钊 镇痛肽的镇痛作用要弱得多，这与硬膜外给药途径的实验结果是非常吻合的。 实验3:肌肉注射敬钊镇痛肽对手术后疼痛的镇痛作用
1) 实验用主要原料实验用敬钊镇痛肽是从敬钊缨毛蜘蛛粗毒中分离纯化
而得到，同时通过HPLC和MALDI-TOF质谱仪鉴定，其纯度为98%以上；SD 实验大鼠由中南大学湘雅医学院动物房提供，体重180-220g之间，肌注生理盐
水与肌注吗啡均购自湖南师范大学校医院。
2) 肌肉注射给药途径首先用75%的酒精对大鼠一侧大腿进行消毒处理， 然后从大腿外侧距膝盖骨2/3处由后向前进针，进针角度以30度为宜，刺入肌 肉大约0.5cm即可，注意不要刺入太深，以免剌伤骨头。
3) 手术后疼痛实验动物模型参照Yong-Xiang Wang(pain 84(2000): 151-158) 的方法进行。先将大鼠称重后，用乙醚进行快速麻醉。将左足消毒后切开1.0 cm 长的创口，并确保只切开肌肉，而尽量避开大的血管，手术完毕后缝合2针。 大鼠很快就会苏醒，待手术后1.5小时就可以开始进行疼痛测定实验。
4) 机械刺激测痛法参照陈军(Pain,1999,83:67-76)等的方法将大鼠放 在一铁丝网架上，用有机玻璃(20x20x25 cm)罩住，让大鼠活动30分钟直至 安静，然后用一套(10根)10种不同内径的Von Frey尼龙丝，它们分别代表 IO种不同的力量，弯曲力量范围是0.06-34.9g，其中1 10号代表的力量分别为 34.9g、 26.2g、 14.8g、 8.1g、 4.85g、 0.77g、 0.43g、 0.25g、 O.llg、 0.06g。
实验开始时用Von Frey尼龙丝从铁丝网下方刺激大鼠手术后足底的不同位
点，每一根Von Frey尼龙丝刺激10次(每次3—4秒)，能让大鼠产生50%的
縮腿率的那一根丝被认为是它的机械诱发痛域，痛域大于39.4g的被认为是无反应。
5) 实验分组与药物剂量敬钊镇痛肽实验动物数为10只一组，肌肉注射 敬钊镇痛肽的剂量为500.0 Mg/kg，空白实验对照组动物数为10只，肌肉注射生 理盐水的剂量为1.0 mL/kg，阳性实验对照组动物数为IO只，肌肉注射吗啡的剂量为500.0吗/kg。
6)实验结果与分析
从图4的实验结果显示，比较肌肉注射吗啡的阳性实验对照组与注射生理 盐水的阴性实验对照组，发现肌肉注射吗啡能使手术后0.5-2.5 h痛域值积分显 著下降，统计学显示具有极显著差异，说明手术后疼痛的实验模型是成功的。 其中注射敬钊镇痛肽的实验动物在给药后l-4.5h会产生镇痛作用，但与注射吗 啡的实验动物组相比较发现，敬钊镇痛肽对手术后疼痛的肌肉注射的镇痛效果 比吗啡弱，手术后0.5-1.5小时之间两者具有显著性差异，但从作用时间来看， 敬钊镇痛肽的作用时间要优于吗啡，持续时间长，而且在肌肉注射敬钊镇痛肽 的实验过程中没有发现任何明显的毒副作用，并且全部没有后遗症。
本文中所述的敬钊缨毛蜘蛛毒素提取物一敬钊毒素一V与敬钊镇痛肽具有 相同的含义。
权利要求
1、一种敬钊缨毛蜘蛛毒素提取物—敬钊毒素—V在制备镇痛药物中的应用，所述的敬钊缨毛蜘蛛毒素提取物—敬钊毒素—V的化学结构式为其中Y为酪氨酸，C为半胱氨酸，Q为谷氨酸，K为赖氨酸，W为色氨酸，M为甲硫氨酸，T为苏氨酸，D为天门冬氨酸，S为丝氨酸，R为精氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，G为甘氨酸，L为亮氨酸，I为异亮氨酸，其特征在于敬钊缨毛蜘蛛毒素提取物—敬钊毒素—V作为单一有效活性组份用于制备镇痛药物。
全文摘要
一种敬钊缨毛蜘蛛毒素提取物—敬钊毒素—V在制备镇痛药物中的应用，特别是敬钊缨毛蜘蛛毒素提取物—敬钊毒素—V作为单一有效活性组份用于制备镇痛药物。由于敬钊镇痛肽是通过与分布于外周神经元上的河豚毒素不敏感型钠离子通道亚型(Nav1.8、Nav1.9)以及河豚毒素敏感型钠离子通道亚型Nav1.7结合，抑制相关的电压门控钠离子通道电流而阻断痛觉神经信号的传导，因此具有明显的镇痛作用，且没有明显的毒副作用。可制备治疗癌症、爱滋病、术中与术后、风湿与类风湿关节炎、坐骨神经与三叉神经性疼痛等病人的镇痛药。
文档编号A61P29/00GK101428138SQ20081021806
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月4日 优先权日2008年12月4日
发明者严陆根, 鹏 刘, 刘中华, 曾雄智, 梁宋平, 冉 王, 曦 陈 申请人:深圳金蜘蛛生物科技有限公司