使用脐带血细胞治疗脑损伤的制作方法

专利名称：使用脐带血细胞治疗脑损伤的制作方法
使用脐带血细胞治疗脑损伤
相关申请
本申请要求2008年3月观日提交的发明名称为使用脐带血细胞治疗脑损伤的美 国临时申请系列号61/072，173的优先权，其全部内容通过引用合并入本文。发明领域
本发明涉及脐带血细胞用于治疗脑损伤的用途。
发明背景
卒中一般是指阻断或减少对整个脑或部分脑的血液供给的任何事件。其在美国是 导致死亡的第三大病因和成人失能(adultdisability)的首要病因。卒中每年影响大约75 万人。三分之一的卒中患者在卒中发生后的一周内死亡。在存活的患者当中，相当大比例 的患者遗留下中度至严重的失能，包括但不限于面瘫、肢体瘫痪或全身瘫痪。
已对治疗与卒中相关的慢性症状作了各种努力。最近，已报导使用G-CSF动员的 外周血细胞来治疗急性和慢性卒中症状。然而仍然存在对适合于大部分群体(包括对于自 体动员细胞疗法可能不合适的受试者)的治疗形式的需要。
发明概述
本发明在其广义上提供了使用脐带血细胞治疗脑损伤的方法。特别重要的是使用 脐带血细胞治疗慢性卒中和神经退行性疾病。本发明已令人惊讶地发现，当将脐带血细胞 施用入慢性卒中受试者的脑实质时，可逆转受试者经历的至少一些与卒中相关的失能。
因此，在一个方面，本发明提供了治疗患有脑组织损伤的受试者的方法，其包括以 有效地治疗脑组织损伤的量给有此需要的人受试者的脑实质内施用富集了 CD34+、CD133+ 或⑶34+/⑶133+脐带血细胞的分离的脐带血细胞群体。
在另一个方面，本发明提供了治疗慢性卒中的方法，其包括以有效地治疗卒中的 量将富集了⑶34+、⑶133+或⑶34+/⑶133+脐带血细胞的分离的脐带血细胞群体实质内施 用入已患有卒中的人受试者的脑，其中在卒中后7天以后施用所述分离的群体。在一个实 施方案中，在卒中后超过1个月施用群体。在另一个实施方案中，在卒中后超过3个月施用 群体。在另一个实施方案中，在卒中后超过6个月施用群体。在另一个实施方案中，在卒中 后超过1年施用群体。
在另一个方面，本发明提供了治疗由创伤性脑损伤引起的脑组织损伤的方法。更 具体地，在一个实施方案中，本发明提供了通过将富集了⑶34+、⑶133+或⑶34+/⑶133+细 胞的分离的脐带血细胞群体施用入患有由创伤性脑损伤引起的脑组织损伤的受试者的脑 实质来治疗脑组织损伤的方法。此类脑损伤包括在创伤性脑损伤发生后存在数月(例如， 至少一个月)或数年的脑损伤。因此，可在创伤性脑损伤发生后超过1个月，超过3个月， 超过6个月，超过1年，或更长时间以后治疗受试者(即，可给受试者施用细胞)。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有神经退行性病症的受试者的方法，其包括 以有效地治疗神经退行性病症的量将富集了 CD34+或CD133+脐带血细胞的分离的群体实 质内施用入有此需要的人受试者的脑。神经退行性病症可以是但不限于帕金森病、阿尔茨5海默病、多发性硬化、亨廷顿病、匹克病、小脑变性和肌萎缩侧索硬化(ALS)。
在一个实施方案中，在脑组织损伤发生或最早观察到这样的损伤后超过1个月施 用分离的群体。在另一个实施方案中，在脑组织损伤发生或最早观察到这样的损伤后超过6 个月施用分离的群体。在另一个实施方案中，在脑组织损伤发生或最早观察到这样的损伤 后超过1年施用分离的群体。
各种实施方案适用于上述方面，并且在下文中引述此类实施方案。
在一个实施方案中，群体富集了 CD34+脐带血细胞。在一个相关的实施方案中，群 体包括为至少75%⑶34+，或为至少90%⑶34+的单个核细胞。
在另一个实施方案中，群体富集了⑶133+脐带血细胞。在一个相关实施方案中， 群体包括为至少75%⑶133+或为至少90%⑶133+的单个核细胞。
在一个实施方案中，群体富集了⑶34+/⑶133+脐带血细胞。在相关实施方案中， 群体包括为至少75%⑶34+/⑶133+或为至少90%⑶34+/⑶133+的单个核细胞。
在一个实施方案中，受试者至少60岁。
在一个实施方案中，给受试者施用至少2X106个细胞。在另一个实施方案中，给 受试者施用至少5 X IO6个细胞。在另一个实施方案中，给受试者施用至少8 X IO6个细胞。
在一个实施方案中，将群体施用至沿着受损的皮质脊髓束的3个位点。
在一个实施方案中，群体来源于单个脐带血单位。在另一个实施方案中，群体来源 于多个脐带血单位。在一些相关的实施方案中，在6个组织相容性标志物中，群体与受试者 共有少于4个所述标志物。在另一个实施方案中，群体与受试者共有6个组织相容性标志 物中的至少4个。
在本文中将更详细地描述本发明的这些和其他方面以及实施方案。
附图概述
附图无意按比例绘制。在不同图中举例说明的各相同或几乎相同的组分由相同的 数字代表。为了清楚起见，在每一幅附图中可能没有标出每一个组分。
图IA是举例说明进行的模型研究的实验设计的示意图。
图IB是一系列显示富集了⑶34和⑶133的细胞群体的表型的图。
图2是显示两个实验组和一个对照组中身体摆动的恢复作为时间的函数的图。
图3A是显示两个实验组和一个对照组中垂直运动作为时间的函数的图。
图;3B是显示两个实验组和一个对照组中垂直运动的次数作为时间的函数的图。
图3C是显示两个实验组和一个对照组中垂直运动时间作为时间的函数的图。
图4是显示两个实验组和一个对照组中握力的百分比的图。
图5是对照和实验动物中大鼠脑的PET影像。
图6是显示针对GFAP或Neu-N (绿色)和双苯甲亚胺(蓝色)染色的脑组织切片 的照片。
图7是显示针对MAP-2或vWF (绿色)和双苯甲亚胺(蓝色)染色的脑组织切片 的图像。
图8A和8B是显示针对NG2(绿色)和双苯甲亚胺(蓝色)染色的脑组织切片的 图像。
图9是显示针对A2B5(绿色)和双苯甲亚胺(蓝色)染色的脑组织切片的图像。


图10是显示针对CNP酶(绿色)和双苯甲亚胺(蓝色)染色的脑组织切片的图像。
图11是显示针对层粘连蛋白(绿色)和双苯甲亚胺(蓝色)染色的脑组织切片 的图像。
图12显示来自慢性卒中动物的脑组织切片的MRI-T2扫描和普鲁士蓝染色。在慢 性卒中动物中观察到皮质梗塞(Corticalinfarction)。在注射后7天在右基底节区中观察 到了注射的干细胞。这些细胞沿着神经纤维迁移至梗塞区，其大小在移植后14天减小。
图13A和B显示注射的染料沿着再生皮层脊髓束的运输的示意图和实际显微照 片。
发明详述
本发明部分基于一项重大的和令人惊讶的发现即脐带血细胞可逆转与慢性卒中 相关的症状。这是令人吃惊的，因为迄今卒中的许多效应一直被认为是不可逆的或一直未 能通过使用其他治疗改善。本发明涉及在卒中发生后甚至数年使用脐带血细胞对慢性卒中 受试者进行的治疗。
本发明也部分地基于如下发现即必须将脐带血细胞施用入脑的实质。本发明的 各个方面和实施方案提供了将细胞更特别地放置至因卒中而损伤的脑的区域内。脐带血细 胞向此类受试者的全身性施用未曾引起任何治疗益处。
本发明还部分基于如下发现即表达一个或多个早期造血标志物例如⑶34和 CD133的脐带血细胞特别适用于治疗慢性卒中。因此，本发明提供了包括将具有造血祖细胞 表型的脐带血细胞施用入慢性卒中受试者的脑实质的方法。具有造血祖细胞表型的细胞是 表达⑶34或⑶133或两者的细胞。
如本文中所使用的，卒中是指向受试者的整个或部分脑的血液供给的中断和从而 氧气的供给的减少，作用持续超过M小时。卒中可由血栓形成、栓塞或出血引起，并且可称 为局部缺血性卒中(包括血栓性卒中和栓塞性卒中(embolic stroke)，并且由血栓形成、 栓塞、全身性血流灌注过少(hypoperfusion)等引起)或出血性卒中(其由脑内出血、蛛 网膜下出血、硬膜下出血、硬膜外出血等引起)。如本文中所使用的，卒中不包括中暑和短 暂性脑缺血发作(TIA)。中暑由体内的升高的温度引起，其在脑中的临床表现与本文中定 义的卒中的表现(即与脑中氧减少相关的血液供给中断)不同。TI A有时称为“轻微中风 (mini-strokes) ”，然而因它们能够在发生的M小时内完全消退而可以与本文中定义的卒 中相区别。
卒中在受影响的受试者中通过一个或多个症状表现。尽管这些症状和它们的严重 性可因患者不同而变化，但它们通常包括肌无力(偏瘫)、麻木、感觉和/或振动感的减弱。 在许多情况下，这些症状只影响身体的一侧(通常损伤存在于脑的另一侧)。其他症状包 括意识的丧失、头痛、呕吐、改变的嗅觉、味觉、听觉和视觉(完全或部分)、眼睑下垂(上睑 下垂)、眼球肌肉的衰弱、反射减弱(包括张口(gag)、吞咽(swallow)和对光反射的瞳孔 反应)、面部的肌无力和感觉减退、平衡问题、平衡不稳、眩晕、眼球震颤、改变的呼吸频率和 /或心率、胸锁乳突肌(SCM)的衰弱(不能将头转向一侧)、舌无力(与不能吐出和/或从 一侧移动至另一侧相关)、失语症(即，不能说话或理解语言)、失用症(即，改变的随意运 动)、改变的运动协调(alteredmovement co-ordination)、视野缺损、记忆缺陷、半边忽略(hemineglect)、性欲过度的姿势(hypersexual gestures)、膀胱或肠控制的缺乏(lack of bladder or bowel control)以及认知下降(例如，痴呆、思维瓦解、意识错乱、有限的注意 力广度(limitedattention span)、不能集中注意力)和改变的步型。卒中的一些标志性症 状包括急性面瘫、手臂瘫痪(arm drift)和谈话异常。通常使用预先确定的评分系统(例 如但不限于美国卫生研究院卒中量表(NIHSS))对患者症状分级。
通过神经学检查、血液检测和/或医学成像技术例如CT扫描(例如，在无造影剂 的情况下)、MRI扫描、多普勒超声和动脉造影术(arteriography)诊断卒中。
如本文中所使用的，急性卒中是指在卒中发生后即刻(S卩，在前7天的时期内)由 受影响的受试者经历的一个或多个症状和/或一个或多个危险。主要的危险是死亡，因为 大约三分之一的受试者在此7天窗口期中死亡。在该时期中经历的症状包括许多上文列 出的症状，包括但不限于谈话异常、手臂瘫痪、意识的丧失、头痛、呕吐、眼睑下垂(上睑下垂)、平衡问题和平衡不稳、急性面瘫等。对于一些患者，及时干预可减轻症状的严重度和数 目。
然而显著比例的患者在长时期内持续经历一个或多个此类症状，本发明针对的患 者正是此类患者。此类患者被认为患有慢性卒中(或称为慢性卒中患者)，因为他们的卒 中症状在急性期后存在(即，卒中症状在卒中发生后持续7天以上和/或在卒中发生7天 以后表现)。因此如本文中所使用的，慢性卒中是指与最初的卒中事件相关的并且在超过7 天以前发生卒中的患者中存在的一个或多个症状和/或一个或多个危险。通常这些症状的 严重度和集中导致患者的失能。例如，慢性卒中患者可能不能说话或理解语言，他们可能不 能行走或可能行走困难(如通过步法追踪所证明的)，他们可能具有改变或受损的面肌控 制，他们可能具有改变的或受损的全体肌肉控制，从而导致协调运动或四肢控制的缺乏，他 们可能具有视觉损伤，他们可能部分或完全瘫痪，他们可能处于昏迷中等。
本发明已显示此类受试者极大地受益于向脑实质内施用脐带血细胞。本发明者已 证实，以该方式治疗的慢性卒中受试者恢复了对他们的肌肉功能的控制，如由其更有规律 (或正常)的步法或步型和/或更大的肢端控制(extremity control)所证明的。
可将本发明的方法用于在治疗之前超过7天发生了卒中以及持续经历与卒中相 关的一个或多个症状的任何患者。本发明涉及在急性期以后的任何时间治疗此类患者。因 此可在卒中发生后第二周内(即在卒中发生后8、9、10、11、12、13或14天)治疗患者。在 一些重要的实施方案中，可在卒中发生后2周后(即在卒中发生后15、16、17、18、19、20或 21天)、3周后或4周后治疗患者。还可在卒中发生后1、2、3、4、5或6个月治疗其他患者， 以及可在6个月的时期以后(包括在卒中发生后7、8、9、10、11或12个月)或在卒中发生 后1、2、3、4、5或更多年治疗其他患者。如本文中所使用的，在例如卒中发生后1年时的治疗 意指自患者发生该卒中以来已过去至少1年。其不是指治疗在卒中发生的一周年时进行。 许多此类患者的损伤在本发明之前可能被认为是不可逆的或不可治疗的。
可基于他们的卒中史(即，卒中发生与治疗时间之间的时间)和任选地基于他们 的卒中评分来鉴定根据本发明待治疗的患者。卒中评分是由患者经历的症状的严重度的数 值表示。NIHSS、ESS、EMS和Barthel指数全都是用于确定患者卒中症状的严重度的评分系 统。在NIHSS的情况下，更低的评分表示更少的症状和更少的失能。虽然本文中描述的方 法可用于治疗任何卒中患者，但优选用于治疗具有更严重的症状的患者。因此，在一个实施方案中，根据本发明治疗具有9-20的NIHSS评分的患者，包括具有9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19和20的NIHSS评分的患者。NIHSS评分为9的患者的实例是只有反射运动或 自主作用(autonomic effect)的反应，哑(即，不具有可用的言语理解或听觉性理解)，并 且具有面部单侧或两侧的完全麻痹(即，不存在上下脸的脸部运动)的患者。医疗从业人 员具有此类评分的知识，从而可容易地通过使用本文中提供的时间选择(timing)和卒中 评分指导方针鉴定可根据本发明治疗的受试者。
本发明也涉及患有神经退行性病症的受试者的治疗。神经退行性病症是特征在 于神经元的进行性恶化和/或死亡的病症。实例包括但不限于帕金森病、阿尔茨海默病、 多发性硬化、亨廷顿病、匹克病、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、进行性核上麻 痹(PSP)、帕金森症、Siy-Drager综合征、小脑皮层萎缩、弗里德赖希运动失调(Friedrich ataxia) > S ^ Χ ^ (dentatorubraldegeneration) ^ 1 - Kj (Machado-Joseph disease)、脊髓性肌萎缩、苍白球脑桥黑体退化(pallidopontonigral degeneration, PPND)、苍白球黑质丘脑下核变性(pallidonigroluysiandegeneration，PNLD)、肌萎缩侧 索硬化(ALS)、Guam-ALS 综合征、皮质基底退化(corticobasal degeneration, CBD)、癫痫 症、缺血性脑损伤、老年性痴呆、科尔萨科夫综合征(Korsakov' s syndrome)、脑桥小脑 萎缩(pontocerebellar atrophy)、橄榄体脑桥小脑萎缩或退化、戊二酸血症(glutaric acidaemia)、弥漫性路易体痴呆(diffuseLewy body dementia)、具有与17号染色体关联的 帕金森症的额颞叶性痴呆(FTDP-17)、多发梗塞性痴呆、脑炎症、多系统萎缩(MSA)和苍白 球变性。
本发明还涉及患有由创伤性脑损伤(TBI)引起的慢性脑损伤的受试者的治疗。
可对任何患者(无论年龄或性别)进行本发明的方法，虽然预期老年受试者可特 别有益。如本文中所使用的，老年患者是60岁或以上的患者。在本说明书的上下文中应理 解优选受试者是人受试者。
如本文中所使用的，治疗患有慢性卒中的受试者是指改善、减少或完全消除一个 或多个慢性卒中症状。例如，根据本发明治疗患有卒中的受试者，以减少由卒中引起的脑损 伤的程度。可通过使用标准医学成像技术测定梗塞大小来测量脑损伤。因此脑损伤程度 的减少可以使用此类成像技术观察到的梗塞大小的减少来衡量。在一些情况下，梗塞面积 (或体积)可减少至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或其 可以完全消失。在一些优选实施方案中，治疗可减少梗塞面积至少10%。同样地，可使用测 量神经系统功能的测试来测定脑损伤的程度。评分系统例如NIHSS也可用于评估受试者的 治疗。例如，NIHSS评分降低1、2、3、4、5、10、15或20个点都可指示治疗。在一些优选实施 方案中，治疗导致至少降低4个点。在其他一些实施方案中，治疗导致NIHSS评分为0-8。
本发明的方法包括给受试者施用脐带血细胞。脐带血细胞是从脐带的静脉和动脉 收集的细胞。用于从脐带提取此类细胞的方法在本领域内是已知的并且已经公布(参见例 如美国公开的申请案20060275271)。可在使用之前收获和冷冻此类细胞，或可以无需冷冻 而使用它们。用于冷冻此类细胞的方法在本领域内也是已知的并且已经公布(参见例如美 国公开的申请案20060275271)。
如本文中所使用的，分离的细胞群体是在物理上已与其天然发生或存在的环境和 /或背景分开的细胞群体。因此，一旦从脐带中取出脐带血细胞，它们就被认为是分离的。
在本发明的一些重要实施方案中，对脐带血细胞进行分级分离以产生富集的细胞 群体。如本文中所使用的，富集的细胞群体是已经历操作以便增加特定细胞类型在群体中 的频率(相对于操作之前该细胞类型的频率)的细胞群体。应理解，被富集的细胞类型是 在操作之前已经存在于群体中的细胞类型，并且富集是通过从群体中除去其他细胞类型而 非加入目的细胞类型而产生的。根据本发明，特别有利的是富集了⑶34+、⑶133+或⑶34+/ ⑶133+的细胞群体。⑶34和⑶133是之前已被鉴定存在于造血祖细胞上(包括在造血干 细胞上)的细胞表面蛋白(或标志物)。如本文中所使用的，CD34+细胞是在其细胞表面上 表达⑶34的细胞。类似地，⑶133+细胞是在其表面上表达⑶133的细胞。⑶34+/⑶133+ 细胞是在其表面上表达⑶；34和⑶133的细胞。⑶34+和⑶133+细胞各自代表所有单个核 的脐带血细胞中的大约0. 1%。此外，在⑶34+与⑶133+细胞群体中存在相当大的重叠，这 样许多⑶34+细胞也表达⑶133，反之亦然。如本文中所使用的，富集了⑶34+细胞、⑶133+ 细胞或⑶34+/⑶133+细胞的群体是其中⑶34+细胞、⑶133+细胞或⑶34+/⑶133+细胞各 代表群体中单个核细胞的至少60%的群体。此类群体中该特定细胞类型可具有甚至更高 的频率。例如，此类群体的单个核细胞级分可以是至少65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的0)34+、0)133+或0)34+/0)133+。例 如，属至少75%⑶34+的细胞群体是其中至少75%的其单个核细胞表达⑶34的群体。在 一些优选实施方案中，施用的群体是至少90%⑶34+、至少90%⑶133+或至少90%⑶34+/ CD133+o
用于制备富集了特定细胞类型的细胞群体的方法在本领域内是已知的。在通过细 胞表面标志物(例如⑶34+、⑶133+和⑶34+/⑶133+细胞)定义的细胞群体的情况下，这 些方法通常使用特异于所表达的标志物的抗体。可将抗体附着至许多固体支持物，包括板 (例如，在淘选方法中)、柱子基质(例如，在柱子富集法中)、磁珠(例如，在磁性分离法中) 等。然后将此类支持物与目的细胞群体接触，让表达目的标志物的细胞结合抗体，而除去剩 余的未结合的细胞。然后通过许多技术(例如，酶促、机械、竞争结合、温度等)取下结合的 细胞。还可通过将细胞与目的抗体接触，然后使用荧光激活细胞分选术基于抗体的存在或 不存在分选细胞来产生富集的群体。通常通过用荧光探针(例如，FITC)标记抗体或通过将 细胞与识别一抗并且其本身用荧光探针标记的二抗接触来观察抗体的存在。此类方法以及 其他方法在本领域内是已知的，并且本领域普通技术人员将能够容易地富集期望的群体。
抗CD34 抗体包括但不限于 QBendlO、563、HPCA-2、581、AC136 和 Birma K3。抗 CD133抗体包括但不限于ANC9C5。此类抗体可从各种来源例如R&D Systems, Santa Cruz Biotechnology 商购获得。
以有效地治疗患者的量(或数目)给患者施用分离的富集的群体，如本文中所描 述的。治疗所必需的细胞数目将取决于许多因素，包括受试者经历的症状的严重度(这可 根据例如NIHSS评分推导)、使用医学成像技术例如MR I测定的梗塞的大小(或面积)、 施用的群体中期望的细胞类型的富集程度、患者的年龄和/或体重等。通常，预期可以给 患者施用1至10 X IO6,更优选2至8 X IO6范围内的细胞数目。因此，取决于待施用的特定 患者和群体，施用的细胞数目可以是大约2X 106、大约3X 106、大约4X 106、大约5X 106、大 约6X106、大约7X106或大约8X106。取决于实施方案和细胞富集的程度，这些量可以指 ⑶34+、⑶133+或⑶34+/⑶133+细胞的总数或给受试者施用的总的单个核细胞。10
可以以单个脐带血单位提供待施用的细胞，然而在一些情况下，必须组合多个剂 带血单位来获得待施用的细胞数目。如本文中所使用的，脐带血单位是从单个脐带收获的 脐带血的量。通常，每一个脐带血单位包含大约120-150X 107个单个核细胞，其中只有大 约 0. 是 CD;34+ 和 / 或 CD133+。
无论给受试者施用1个还是多个单位，在一些情况下可能期望施用与待治疗的受 试者组织相容的细胞。如本文中所使用的，组织相容性是指6个主要组织相容性标志物中 至少4个是待移植的细胞和待治疗的受试者所共有的。显然，本发明还涉及其中细胞和受 试者共有5个或甚至6个相同组织相容性标志物的情况。根据本发明还发现，在一些情 况下，与受试者共有少于4个，少于3个，少于2个组织相容性标志物或不共有组织相容性 标志物的细胞对于该受试者仍然可以是治疗上有益的。组织相容性标志物包括I类标志 物HLA-A、HLA-B和HLA-C、II类标志物HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR以及非经典I类标志物 HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H、HLA-J和HLA-X、MIC0在一些实施方案中，6个组织相容性标 志物可以是HLA-A、HLA-B, HLA-C, HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。还涵盖其他组合。
因为所述群体是施用入脑实质，因此以合理地尽可能地小的体积施用该群体也是 非常重要的。施用的体积可变化，这取决于患者的年龄和/或体重和待施用的细胞的数目， 以及其他因素。通常，施用的量少于lmL，优选少于0. 75mL，更优选大约为或少于0. 5mL。在 一些情况下，施用0. 4、0. 3或0. 2mL。
将细胞群体施用入脑实质(即，脑的组织)。在这点上，这样的施用被称为实质内 施用。优选地，将细胞置于脑实质内，优选损伤区域中和/或周围，可包括在损伤区域的外 周以及损伤区域的边界的区域。
甚至更优选，可将总施用群体的等份试样置于脑实质的2、3或更多个位点。例如， 可沿着牵涉的或受影响的皮层脊髓束放置细胞，一个放置可置于损伤区域之外，一个放置 可置于损伤区域的中央，以及一个放置可置于损伤区域与颅骨之间。可使用立体定位装置 确定放置的区域。用于细胞的注射和放置的坐标在不同患者间可变化，但可由本领域普通 技术人员容易地确定。
可使用例如沈规汉密尔顿氏注射器或等效的注射器或装置将细胞施用至脑实 质。为了举例说明的目的，在一个实施方案中，给注射器装载细胞，将针沿着损伤的皮层脊 髓束插入脑实质，直至其尖端到达损伤区域以外(或在其边界)的位点。将大约三分之一 的细胞(或注射器筒中相似的体积)放置在该位点。然后抽回针直至其尖端到达位于损伤 区域中的位点(优选但不必在损伤的中央内或中央附近)，在该点上放置另外三分之一的 细胞(或注射器筒中的体积)。然后再将针抽回直至其尖端到达位于损伤区域后方(或在 其边界上)的位点。将剩余的三分之一的细胞(或注射器筒中的体积)放置在该位点。然 后将针在每一次放置后原位保持大约5分钟。一旦将针完全抽回，塞住进入的位点以防止 注射体积的外漏(和损失)。这可通过使用例如骨蜡来实现。然而应理解，本发明涉及将细 胞单次移植至损伤的脑内而非多日的施用方案。
将细胞悬浮于药学上可接受的载体中并且与其一起施用，以该形式存在的细胞被 当作药物组合物或制剂。如本文中所使用的，药学上可接受的载体是指适合于施用入人的 一种或多种相容性液体填充剂、稀释剂等。如本文中所使用的，载体是指可将其与活性成分 组合以促进功效和/或施用的天然的或合成的有机或无机成分。药物制剂可包含合适的缓冲剂，包括但不限于乙酸盐；柠檬酸盐；硼酸盐；和磷酸盐。药物组合物还可任选地包含合 适的防腐剂，例如苯扎氯铵、三氯叔丁醇、对羟苯甲酸和硫柳汞。以使不存在可实质上损害 期望的药物功效的相互作用的方式将药物组合物的成分与细胞群体以及彼此混合。药物组 合物或制剂还可包含其他物质，包括其本身具有治疗效果的或增强施用的细胞的治疗功效 的非细胞试剂。可在小瓶中一起，在试剂盒的单独的小瓶中或在单独的试剂盒中提供此类 成分。
适合施用的组合物可包含细胞的无菌水混悬液，其优选与受者的血液等渗。可使 用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂按照已知的方法配制该水性制剂。无菌可注射制剂还可 以是无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1，3_ 丁二醇 中的溶液。可使用的可接受的载体或溶剂包括水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，常规 地将无菌不挥发油用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何刺激性小的不挥发油，包括 合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，可将脂肪酸例如油酸用于注射剂的制备。适合用于口 服、皮下、静脉内、肌内等施用的载体制剂可见于Remington，s PharmaceuticalSciences, Mack Publishing Co. , Easton, PA。实施例
材料和方法
￠0347133^6 ChUCBaizm)的纯化和选择
从人脐带全血(hUCBw) (Stemcyte, USA)制备单个核细胞(MNC)。收集MNC层并 用PBS中的ImM EDTA清洗2次。按照制造商的说明书，利用磁珠分离法(MACS ；Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)从 2 X IO8 个 MNC 分离 CD34+ 和 CD133+MNC。简而言之，将 MNC 悬 浮于300 μ L PBS和5mM EDTA中。用半抗原缀合的抗CD34和CD133的单克隆抗体(Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)标记这些细胞，然后在4°C以每IO8个细胞100 μ L珠粒的比例 用与微珠偶联的抗半抗原抗体进行标记，进行15分钟。在磁场中在阳性选择柱装置上富集 珠粒阳性细胞(即，CD34+和CD133+MNC)。使用藻红蛋白(PE) (Becton Dickinson, USA)标 记的抗 CD34 和抗 CD133 抗体(Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)对 MACS 分选细胞进 行的FACS分析显示，90% 士3%的所选细胞对于⑶34和⑶133 二者都是阳性的，如图IB中 显示的。然后，将用lPg/mL双苯甲亚胺(Hoechst 33342 ；Sigma, USA)标记的、重悬浮于 300 μ L 伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove' s ModifiedDulbecco' s Medium) (Gibco/ Invitrogen,UK) +2% FBS(Hyclone,Road Logan,UT)的细胞与3ml MethoCult GF H4434(含 有重组细胞因子和红细胞生成素(StemCell Technologies, USA)以及抗生素)在37°C于 5% C02/95%空气的潮湿气氛中混合，进行1小时，并且准备用于移植。
大鼠实验性卒中模型
将30只称重为大约250_300g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠经历三血管结 扎术(three-vessel 1 igation)。按照大学机构指导方针(University Institutional guidelines)使用消毒/无菌技术进行所有外科手术。用水合氯醛(0. 4g/kg)腹膜内麻醉 大鼠。在第O天利用从由Chen等人(Stroke，1986，17 (4) =738-743)描述的方法改进的方 法进行右侧大脑中动脉(MCA)和双侧颈总动脉(CCA)的结扎。用非创伤性动脉夹夹紧CCA。 在外科显微镜下，在颧骨与鳞骨融合的地方钻取2 X 2颅骨穿孔。用10-0尼龙缝线结扎右侧MCA0 使用激光多普勒流量计(PF-5010, system, Perimed system, Perimed AB, Stockholm, Sweden)在麻醉的动物中连续测量皮质血流量。在右额顶骨区域产生钻孔(直径Imm)以 便放置光检测器。将探针(直径0.45mm)通过立体定向置于皮层中(前因点后1.3mm，侧 2. 8mm,和硬脑膜下1. Omm)。在结扎90分钟后，解除MCA的缝线和CCA上的动脉夹以允许再 灌注。使用热敏电阻探头(thermistor probe)监控中心体温，并且在麻醉期间使用加热垫 维持在37°C。在各大鼠恢复后，使用热灯将体温维持在37°C。如所预期的，所有大鼠在脑 缺血后第一天和在任何细胞施用之前产生显著的身体不对称并转向缺血性脑侧的对侧。
使用大脑内hUCB—细胞或媒介物处理的实验动物
然后将大鼠分成三组，如图IA中所示。在实验性卒中后第1天给第1组施用单独 的媒介物。在实验性卒中后第1天给第2组施用hUCB34m3细胞。该组代表急性卒中的实验 模型，因为在实验性卒中后1天施用细胞。在第7天给第3组施用hUCB34m3细胞。该组代 表慢性卒中的实验模型。将细胞或单独的媒介物通过立体定向注射入尾状壳核的受损锥体 束。使用26规汉密尔顿氏注射器将大约2X IO5个用双苯甲亚胺标记的hUCBW133细胞(悬 浮于3-5 μ L PBS中)注射入硬脑膜下3-5mm的3个皮质区。皮质位点的大致坐标是(1) 前囟点之前1. 0至2. Omm和中线侧面3. 5至4. Omm, (2)前囟点之后0. 5至1. 5mm和中线侧 面4.0至4. 5mm，和( 前囟点之后3. 0至4. Omm和中线侧面4. 5至5. 0mm。在每一次注射 后将针在原位保持5分钟，然后将一块骨蜡用于颅骨缺损处以防止注射液外漏。通过空间 定位用盐水处理媒介物组中的实验大鼠。每天给各实验大鼠注射环孢菌素A(10mg/kg，ip， Novartis)，同时媒介物对照接受等体积的盐水，如之前所描述的(^iao等人，2004)。
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神经系统功能和其他行为的估量
为了估计3个大鼠实验组中的神经系统功能，在脑缺血之前3天(S卩，在第-3天) 和在局部缺血性损伤后1、7、14、21、观和35天进行行为评估。这些评估测量(a)身体不对 称性，(b)运动行为和(c)握力。记录基线检测评分以标准化脑缺血后获得的评分。
按照Borlongan 等人描述的方式(Neuror印ort，1998，9 (1 :28374842)，通过提 高的身体摆动测试(EBST)定量评估进行MCA结扎后身体的不对称性。最初，就侧向运动检 查每一只大鼠，同时通过尾巴将其身体悬挂。在20个连续的测试中计数最初头向局部缺血 侧的对侧摆动的频率，并且按照Chang等人描述的方式(Stroke. 2003 ；34(2) :558-564)标 准化该频率。
在运动行为检测中，将各大鼠经历动物活性监测(Accuscar^nstruments，Inc., Columbus，OH)，进行大约2小时以进行行为记录。动物活性监控器包括16个水平和8个垂 直的红外传感器(间隔87cm放置)。将垂直传感器置于离小室的地板IOcm处。运动行为 计数为被小室中大鼠运动中断的光束的次数。在晚上于2小时的时间内计算制造商的菜单 选项中定义的3个垂直参数(i)垂直活动，(ii)垂直时间和(iii)垂直运动的次数。
将行为测量评分全都针对基线评分进行标准化。发现，在处理后14至观或35天， 用hUCB处理的大鼠与对照大鼠相比较，展示显著减少的身体不对称性，如图2中所显示的。 hUCB组中的大鼠也显示与对照大鼠相比较显著增加的垂直活性(图3A)、垂直运动的次数 (图3B)和垂直运动的时间(FIG. 3C)。
根据由乂印1^11描述的方法(Neurosci. Lett. 1998,264 :1_4)改进的方法，使用握力计(TSE-Sy stems ,Germany)分析握力。简而言之，在各前肢上测量握力比，并且将其计算 为局部缺血对侧的20次拉力的平均力量与身体同侧(ipsilateral side)的20次拉力的 平均力量之间的比率。此外，也计算处理前(“Pre Tx")和处理后(第观天；“Post Tx")与基线之间的握力比，变化表示为基线值的百分比。发现，对于第1组(对照)、第2 组(第1天施用)和第3组(第7天施用)，比率为大约0. 95、1.8和1.95，如图4中显示 的。握力结果显示，施用了 hUCB的大鼠显示比未处理的对照大鼠有更高的握力比。
脑代谢和解剖
图5显示对照和处理动物中由FDG PET扫描监控的脑代谢。图12显示对照和处 理小鼠的MRI脑扫描。
免疫组织化学
进行免疫荧光染色以确定施用的hUCB细胞是否可在局部缺血脑中分化成神经 元、胶质细胞或内皮细胞。进行共聚焦显微镜检查以确定细胞类型特异性标志物是否与外 源移植的(双苯甲亚胺标记的)共定位。使用水合氯醛(0.4g/kg，ip)麻醉大鼠，通过盐水 穿心灌注，然后灌注并浸没在4%多聚甲醛中来固定它们的脑，然后包埋于30%蔗糖中。在 冠状面上从每一个脑切取一系列相连的20-pm厚的切片。
将每一个冠状切片与细胞类型特异性抗体一起温育神经胶质原纤维酸性蛋白 质(“GFAP “，对于星形胶质细胞，1:400，Sigma)、Von-Willebrand 因子(“vWF，，，对于内 皮细胞，1:400，Sigma)、神经元核抗原(“Neu_N”，对于神经元核，1 200，Chemicon)、微管 结合蛋白 2(" MAP-2“，对于神经元树突，1:200，BM)、CXCR4(CD 184,1:100, Toney Pines Biolab)或 Doublecortin(Dcx，1100， SantaCruz Biotechnology),使用 Cy3(Jackson Irnmunoresearch PAUSA, 1:500)染色。
结果显示，一些双苯甲亚胺标记的细胞(蓝色，细胞核自发荧光)与抗MAP-2、 Neu-N和GFAP (绿色，神经细胞类型特异性标志物)的抗体在hUCB处理的局部缺血性大鼠 脑的半影中共定位(图6-11)。
为了确定hUCB处理是否导致血管生成，利用双免疫荧光染色分析来自hUCB处理 的大鼠和对照大鼠的脑切片。以上述方式进行免疫荧光染色。结果表明几个外源移植的 hUCB细胞(双苯甲亚胺标记的)显示围绕处理大鼠的局部缺血性半球的血管周区域和内皮 区域的血管表型(vffF+)(图7)。
沿着皮质脊髓束的细胞迁移
图12和13显示细胞和/或注射的染料沿着再生的皮质脊髓束的存在和移动。
总之，结果表明，接受实质内施用入脑的hUCB细胞的大鼠显示与对照大鼠相比较 在慢性脑局部缺血后显著改善的神经系统功能。在hUCB处理的组中，看到外源移植的干细 胞向脑梗塞区迁移并且分化成胶质细胞(GFAP)、神经元(巢蛋白+、MAP-2+和Neu-N+)和血 管内皮细胞(vWF+)，从而增强缺血性大脑中的神经可塑性。
本发明的应用不限定于前述说明书中所列或附图中举例说明的成分的组成和排 列的详细内容。本发明能够以各种方式进行其他实施方案和进行实施或进行实践。此外， 本文中使用的措词和术语是为了描述目的，不应当被当作限定。“包括”、“包含”或“具有”、 “含有”、“涉及”和其变化形式的使用是指包括其后所列的项和其等价物以及另外的项。
因此，在描述了本发明的至少一个实施方案的几个方面之后，对于本领域技术人员来说应理解各种改变、变动和改善可容易地进行。此类改变、变动和改善构成本公开内容 的一部分，并且在本发明的精神和范围之内。因此，上述描述和附图仅以举例说明的方式提供。
权利要求
1.用于治疗慢性卒中的方法，其包括将富集了⑶34+、⑶133+或⑶347⑶133+细胞的分离的脐带血细胞群体实质内施用至 已经历卒中的人受试者的脑，其中在卒中后超过7天施用所述分离的脐带血细胞群体。
2.权利要求1的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体富集了CD34+脐带血细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体富集了CD133+脐带血细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体富集了CD34+/CD133+脐带血细胞。
5.权利要求1或2的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少75%⑶34+的 单个核细胞。
6.权利要求1或2的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少90%⑶34+的 单个核细胞。
7.权利要求1或3的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少75%⑶133+ 的单个核细胞。
8.权利要求1或3的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少90%⑶133+ 的单个核细胞。
9.权利要求1或4的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少75%⑶34+/ ⑶133+的单个核细胞。
10.权利要求1或4的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少90%⑶34+/ ⑶133+的单个核细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述受试者至少60岁。
12.权利要求1、2、3或4的方法，其中给所述受试者施用至少2XIO6个细胞。
13.权利要求1、2、3或4的方法，其中给所述受试者施用至少5XIO6个细胞。
14.权利要求1、2、3或4的方法，其中给所述受试者施用至少8XIO6个细胞。
15.权利要求1、2、3或4的方法，其中在卒中后超过1个月施用所述分离的脐带血细胞 群体。
16.权利要求1、2、3或4的方法，其中在卒中后超过6个月施用所述分离的脐带血细胞 群体。
17.权利要求1、2、3或4的方法，其中在卒中后超过1年施用所述分离的脐带血细胞群体。
18.权利要求1、2、3或4的方法，其中将所述分离的脐带血细胞群体沿着受损的皮质脊 髓束施用至3个位点。
19.权利要求1、2、3或4的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体来源于单个脐带血单位。
20.权利要求1、2、3或4的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体来源于多个脐带血单位。
21.权利要求1、2、3或4的方法，其中在6个组织相容性标志物中，所述分离的脐带血 细胞群体与所述受试者共有少于4个所述组织相容性标志物。
22.权利要求1、2、3或4的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体与所述受试者共有6 个组织相容性标志物中的至少4个。
23.用于治疗脑组织损伤的方法，其包括将富集了⑶34+、⑶133+或⑶34+/⑶133+脐带血细胞的分离的脐带血细胞群体实质内 施用至已经历脑组织损伤的人受试者的脑。
24.权利要求23的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体富集了CD34+脐带血细胞。
25.权利要求23的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体富集了CD133+脐带血细胞。
26.权利要求23的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体富集了⑶34+/⑶133+脐带血 细胞。
27.权利要求23或M的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少75%⑶34+ 的单个核细胞。
28.权利要求23或M的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少90%⑶34+ 的单个核细胞。
29.权利要求23或25的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少75% ⑶133+的单个核细胞。
30.权利要求23或25的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少90% ⑶133+的单个核细胞。
31.权利要求23或沈的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少75% ⑶;34+/⑶133+的单个核细胞。
32.权利要求23或沈的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体包含为至少90% ⑶;34+/⑶133+的单个核细胞。
33.权利要求23的方法，其中所述受试者至少60岁。
34.权利要求23、24、25或沈的方法，其中给所述受试者施用至少2X IO6个细胞。
35.权利要求23、24、25或沈的方法，其中给所述受试者施用至少5X IO6个细胞。
36.权利要求23、24、25或沈的方法，其中给所述受试者施用至少8X IO6个细胞。
37.权利要求23、24、25或沈的方法，其中在脑组织损伤后超过1个月施用所述分离的 脐带血细胞群体。
38.权利要求23、24、25或沈的方法，其中在脑组织损伤后超过6个月施用所述分离的 脐带血细胞群体。
39.权利要求23、24、25或沈的方法，其中在脑组织损伤后超过1年施用所述分离的脐 带血细胞群体。
40.权利要求23、24、25或沈的方法，其中将所述分离的脐带血细胞群体沿着受损的皮 质脊髓束施用至3个位点。
41.权利要求23、24、25或沈的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体来源于单个脐带 血单位。
42.权利要求23、24、25或沈的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体来源于多个脐带 血单位。
43.权利要求23、24、25或沈的方法，其中在6个组织相容性标志物中，所述分离的脐 带血细胞群体与所述受试者共有少于4个所述标志物。
44.权利要求23、24、25或沈的方法，其中所述分离的脐带血细胞群体与所述受试者共 有6个组织相容性标志物中的至少4个。
45.权利要求23、24、25或沈的方法，其中脑组织损伤由帕金森病、阿尔茨海默病、多发 性硬化或亨廷顿病引起。
46.用于治疗脑组织损伤的方法，其包括将富集了⑶34+、⑶133+或⑶34+/⑶133+脐带血细胞的分离的脐带血细胞群体实质内 施用至患有由创伤性脑损伤引起的脑组织损伤的人受试者的脑，其中在创伤性脑损伤发生 后超过1个月施用细胞。
全文摘要
本发明涉及使用脐带血细胞进行慢性卒中、创伤性脑损伤和神经退行性病症的治疗。
文档编号A61P25/28GK102036671SQ200980115516
公开日2011年4月27日 申请日期2009年3月26日 优先权日2008年3月28日
发明者H·李, S-Z·林, W-C·徐 申请人:永生细胞生技股份有限公司