用于治疗再灌注损伤的方法

专利名称：用于治疗再灌注损伤的方法
技术领域：
本发明涉及使用鞭毛蛋白相关多肽治疗受再灌注影响的组织。
背景技术：
缺乏血液和氧气的组织会经历缺血性坏死或梗死和可能不可逆的器官损害。一旦恢复对器官或组织的血液和氧气流(再灌注)，器官不会立即回到正常的缺血前状态。冠状动脉血流的再灌注对于使缺血或缺氧组织或器官复苏是必须的。即时的再灌注有助于拯救细胞和减少患病率和死亡率。缺血区域的再灌注可能导致反常的功能障碍，包括明显的内皮细胞功能障碍，这可能导致血管收缩、血小板和白细胞激活、氧化剂生成增加以及流体和蛋白外渗增加。过去二十年间，几种设计来限制再灌注损伤的药理学干预已经得到见证。不幸的是，某些试剂的成功仅限于缺血和再灌注的实验模型。一致性临床益处的缺乏可能与多种因素有关，包括不良的临床试验设计、不当的药代动力学/药效学研究和人类体内模型的复杂性。本领域中需要区分针对缺血相比再灌注的治疗策略，且可能需要试剂的组合来产生最大的临床益处。

发明内容
本文提供了一种治疗受再灌注影响的哺乳动物的组织的方法，所述方法可以包括对需要该治疗的哺乳动物施用包含鞭毛蛋白的组合物。所述组合物可以与可选自氮磷汀和维生素E的抗氧化剂共同施用。再灌注可以由损伤所导致，所述损伤可以为缺血或缺氧。缺血可以选自心动过速、 梗死、低血压、栓塞、血栓性栓塞(血凝块)、镰状细胞病、身体局部极端受压(localized pressure to extremities to the body)禾口月中瘤。缺氧可以选自血氧不足性缺氧(一氧化碳中毒；睡眠呼吸暂停、慢性阻塞性肺病、呼吸骤停；分流)、贫血性缺氧( 含量低)、血氧不足性缺氧和组织中毒性缺氧。所述局部受压可能因止血带所致。所述组合物可以于氧气流入之前、同时或之后施用。所述组织可以选自胃肠道、 肺、肾、肝、心血管系统、血管内皮、中枢神经系统、周围神经系统、肌肉、骨和毛发毛囊。


图1展示了在静脉内施用浓度为0.01 μ g/只、Ojyg/只、l.Oyg/只或5. Oyg/ 只的鞭毛蛋白后的5天中的小鼠血清中的肌酸酐水平。
图2展示了在强加肾缺血和在对缺血性肾再灌注后测定存活率和肌酸酐之前施用于小鼠的鞭毛蛋白的影响。图A显示了用浓度为0.01 μ g/只、0.5 μ g/只、l.Oyg/只或 5. Oyg/只的鞭毛蛋白或作为对照的PBS预处理的小鼠的存活百分比。图B显示相同的预处理小鼠和对照小鼠组中的肌酸酐水平。图3展示了用浓度为0. 01 μ g/只、0. 5 μ g/只、1. 0 μ g/只或5. 0 μ g/只的PBS或
鞭毛蛋白预处理的再灌注后M小时的缺血性肾细胞的组织病理学。Siam列指示分离自未强加肾缺血的小鼠的肾细胞。图4展示了再灌注后7天的肾细胞的组织病理学。在第一图中，组织病理学载玻片显示出从在肾缺血前用PBS预处理并其后对缺血性肾进行再灌注的小鼠中分离的肾细胞。 在第一图中，组织病理学载玻片显示出从在肾缺血前用PBS预处理并其后对缺血性肾进行再灌注的小鼠中分离的肾细胞。在第二图中，组织病理学载玻片显示出从用浓度为0.5yg/ 只的鞭毛蛋白预处理但未强加以肾缺血的小鼠中分离的肾细胞。第三图展示了如下的组织病理学载玻片其显示了从用浓度为0. 5 μ g/只的鞭毛蛋白预处理并强加以肾缺血且其后对缺血性肾进行再灌注的小鼠分离的肾细胞。图5展示了向分离自用0. 5 μ g/只的PBS或鞭毛蛋白预处理的小鼠的缺血肾细胞再灌注后的9小时和M小时的白细胞浸润。图fe是经免疫组织化学染色的肾组织细胞，其用于显示来自用0. 5 μ g/只的PBS或鞭毛蛋白预处理的小鼠的经缺血和非缺血处理的肾细胞中再灌注后的9小时和M小时的嗜中性粒细胞的水平。图恥是浸润至分离自用0. 5 μ g/ 只的PBS或鞭毛蛋白预处理的小鼠的肾组织细胞的嗜中性粒细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞和 ⑶8+T细胞的数目。图5c图6展示了鞭毛蛋白在趋化因子CXCL1/KC和CXCL2/KC引导白细胞浸润缺血肾组织中的关键作用。图6b展示了在经鞭毛蛋白预处理的动物中再灌注后9小时在缺血性肾中急性期蛋白ILHb和IL-6 (但不是TNFa)的mRNA水平也降低。图7展示了经受45分钟的双侧肾蒂阻塞并在移除肾钳夹后的不同时间施用 0. 5μ g鞭毛蛋白的C57BL/6小鼠组中的存活率和肌酸酐水平。图8展示了在用野生型骨髓重建的野生型C57BL/6小鼠的缺血性肾的再灌注30 分钟内施用0. 5 μ g鞭毛蛋白减少了 CXCLl和CXCL2mRNA水平。在用MyD88+或野生型骨髓重建的MyD88+接受者中，在缺血性肾的再灌注期间几乎没有诱导CXCLl和CXCL2 mRNA, 并且在这些肾的再灌注期间施用鞭毛蛋白没有减少这些趋化因子的mRNA水平。相反，来自 MyD88+供体的骨髓的野生型接受者表达了高水平的CXCLl和CXCL2 mRNA,且这些水平受缺血性肾的再灌注期间的鞭毛蛋白的施用而减少。图9展示了来自野生型C57BL/6和BALB/c小鼠的肾切片由抗TLR5抗体染色。图 9b展示了 TLR5 mRNA的表达水平在强加肾缺血/再灌注之前的肾中较低，而在缺血性肾的再灌注期间快速增加。图10显示了细菌鞭毛蛋白的域结构。F41的Ca骨架轨迹、疏水性核分布和结构信息。限定域Dl、D2a、D2b和D3的4个不同疏水性核。所有疏水性侧链原子与Ca骨架一同展示。侧链原子经彩色标注Ala，黄色；LeiuIle或Val，橙色；Phe和Tyr，紫色(碳原子) 和红色(氧原子)。c，鞭毛蛋白的氨基酸序列中的不同结构特征的位置和区域。所示从上到下为蓝色的F41片段；棕色的3个b叶折叠(b-folium fold) ；二级结构，其中a-螺旋为黄色，b-结构为绿色，且b-转角为紫色；蓝色的每50个残基的tic标记；域D0、D1、D2和 D3 ；青色的原始单元(proto-element)内的轴亚基接触区；红色的保留良好的氨基酸序列和紫红色的可变区；F41中产生不同的超卷积的单元的点突变。底部的字母指示突变单元的形态:L (D107E, R124A, R124S, G426A)，L-型直线；R(A449V)，R-型直线；C (D313Y, A414V, A427V, N433D)，曲线 33。图11显示了沙门氏菌属鞭毛蛋白域、其片段及其与TLR5的相互作用的示意图。黑色条形表示用于构建包含A、B、C、A’和B’的片段的鞭毛蛋白基因的区域。图12描绘了鞭毛蛋白衍生物。选定的鞭毛蛋白(列于右侧)的域结构和大致边界(氨基酸坐标)。都柏林沙门氏菌的FliC鞭毛蛋白在505个氨基酸(aa)内编码。图13显示了以下鞭毛蛋白变异体的核苷酸和氨基酸序列AA’ (SEQ ID NO :7_8)、 AB (SEQ ID NO :9-10)、BA (SEQ ID NO 11-12), BB (SEQ ID NO 13-14)、CA (SEQ ID NO: 15-16), CB (SEQ ID NO :17-18)、A (SEQ ID NO : 19-20)、B (SEQ ID NO :21-22)、C (SEQ ID NO :23-24)、GST-A(SEQ ID NO :25-26) ,GST-B (SEQ ID NO :27-28)、AA，nl_170(SEQ ID NO 29-30)、AA，nl-163 (SEQ ID NO :33-34)、AA，n54_170 (SEQ ID NO :31-32)、AA，n54_163 (SEQ ID NO :335-36)、AB，nl-170(SEQ ID NO :37-38)、AB，nl-163(SEQ ID NO :39-40)、 AA，nl-129(SEQ ID NO :41-42)、AA，n54_129(SEQ ID NO :43-44)、AB，nl_129(SEQ ID NO 45-46)、AB，n54-129 (SEQ ID NO :47-48)、AA，nl-100 (SEQ ID NO :49-50)、AB，nl-100 (SEQ ID NO :51-52)、AA，nl-70 (SEQ ID NO :53-54)和 AB' nl_70(SEQ ID NO :55-56)。pRSETb 前导序列以斜体显示(前导序列包括Met，其也是FliC的1号氨基酸)。N端恒定域以下划线显示。氨基酸连接子序列以粗体显示。C端恒定域以下划线显示。GST在存在时突出显
7J\ ο图14A显示了使用苏木精/曙红染色的3小时热缺血之后再灌注后第14天的小鼠后肢肌肉的组织学，其中所述小鼠已在15分钟的再灌注中被给予0.5yg CBLB502。图 14B显示了使用苏木精/曙红染色的3小时热缺血之后再灌注后第14天的小鼠后肢肌肉的组织学，其中所述小鼠已在15分钟的再灌注中被给予空载剂(PBS)。图14C显示了在缺血3小时后的15分钟再灌注期间施用了 CBLB502或PBS的小鼠的肢体中的组织水肿的湿重/干重比。还在施用了 CBLB501或PBS但未进行3小时缺血的小鼠的肢体中测定了水肿比例。图15显示了使用在缺血3小时后的15分钟再灌注期间施用了 CBLB501或PBS的小鼠的肢体的每克重量的蓝色染料的血管泄露湿重/干重比。也在施用了 CBLB501或PBS但未进行3小时缺血的小鼠的肢体中测定了血管泄露的比例。图15显示了来自21个细菌物种的保守的氨基(图15A)和羧基(图15B)端的氨基酸序列的比较。对于TLR5活性较重要的13个保守氨基酸以阴影显示。氨基酸序列通过其来自TrEMBL (首字母=Q)或Swiss-Prot (首字母=P)的登录号识别。
具体实施例方式本发明人惊人地发现鞭毛蛋白保护免受再灌注的影响。氧和来自血液的养分的缺失或减少创建了如下的状况循环的恢复通过诱导氧化应激而非恢复正常功能而导致炎症和氧化损伤。恢复的血流重新将氧导入细胞内，其损害细胞蛋白、DNA和质膜。对细胞膜的损害可能继而导致释放更多的自由基。这类反应性物质也在氧化还原信号转导中起作用以诱导缺血组织细胞的凋亡。另外，炎性响应进而损害所述组织。由新返回的血液携带至所述区域的白细胞响应于组织损害而释放大群如白介素等炎性因子以及自由基。白血球还可能在小毛细血管中聚积，从而将其阻塞并导致更多的缺血。虽不受理论所束缚，鞭毛蛋白可以通过减少氧化和炎性应激而提供使组织的免受再灌注影响的保护，由此避免凋亡和使得组织能更快地恢复至正常状态。鞭毛蛋白的这种保护性质可以用于再灌注起始时或用于避免因再灌注引起的进一步损害。下述的发明部分涉及鞭毛蛋白施用以治疗受再灌注影响的哺乳动物的组织。1.定义本文所用的术语的目的在于仅描述具体实施方式
而并非旨在进行限制。如发明书和所附权利要求书中所用，除非上下文明确另外指出，单数形式"a"、“ an"和"the" 包含复数参照物。对于本文中数值范围的列举而言，明确考虑到其间的每个具有相同精度的中间数字。例如，对于6 9的范围而言，除6和9以外，还考虑到数字7和8，而对于6.0 7.0 的范围而言，明确考虑到数字 6. 0,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4,6. 5,6. 6,6. 7,6. 8,6. 9 和 7. 0。“施用”可以指诱导NF-KR活性的试剂的剂量，指代该试剂的单次剂量或多次剂量。在肽或多肽背景下，“类似物”可以指包含一种或多种非标准氨基酸或来自常规氨基酸组的其它结构变化体的肽或多肽。 “抗体”可以指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类抗体或片段、包括Fab、F (ab ‘ ) 2、Fd片段或其衍生物、以及单链抗体、双链抗体、双特异抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，其展示出对所需表位或源自其的序列的足够结合特异性。抗体也可为嵌合抗体。抗体可通过连接一种或多种本领域内已知的化学、肽或多肽部分而衍生化。抗体可以缀合有化学部分。“凋亡”可以指某种细胞死亡形式，其包括通过光学或电子显微镜所观察到的胞质细胞器保留而细胞体积逐渐收缩、染色体凝聚(即核凝聚)；和/或如离心沉降测试所确定的DNA断裂为核小体尺寸的片段。细胞死亡在细胞的膜整体性丧失且无损的细胞片段(“凋亡体”)被吞噬细胞吞噬时发生。“肽”或“多肽”可以指连接的氨基酸序列，并且可以是天然序列、合成序列或者天然和合成序列的修饰或组合。“治疗”可以指在临时或永久性基础上减轻、抑制、阻遏、消除、预防或减缓病况或病症的症状、临床体征或基础病理的出现。对疾病的预防涉及在疾病发生前对动物施用本发明的组合物。对疾病的抑制涉及在疾病引入后但在其临床征象出现前对动物施用本发明的组合物。对疾病的阻遏涉及在疾病临床征象出现后对动物施用本发明的组合物。2.治疗再灌注的影响本文提供了一种通过对需要治疗的哺乳动物施用包含鞭毛蛋白的组合物而治疗再灌注的影响的方法。再灌注可由损伤导致。当血液供给在损伤后返回身体部件时，再灌注可能损害该身体部件。再灌注的影响可能比损伤本身对身体部件的损害更大。存在几种再灌注机制和介导物，包括氧自由基、 胞内钙超载和内皮功能障碍。过量的反应性氧物种在被重新引入此前受损的身体部件时会进行一系列还原从而导致形成氧自由基。如超氧化物负离子、羟基自由基和过氧亚硝基(peroxynitrite)可以在返流至身体部件的开始数分钟内产生，并且可能在再灌注损伤的发展中起到关键作用。氧自由基也可从除分子氧的还原以外的来源产生。这些来源包括酶， 如黄嘌呤氧化酶、细胞色素氧化酶和环氧合酶，以及儿茶酚胺的氧化。再灌注也是对嗜中性粒细胞激活和积聚的有力刺激，后者继而充当反应性氧物种生成的有力刺激。具体而言，嗜中性粒细胞呼吸爆发的主要产物是包括过氧化氢、氧自由基和次氯酸盐等强氧化剂。嗜中性粒细胞是最大量的吞噬细胞类型，通常代表总的循环白细胞的50% 60%，且通常是第一个到达受损身体部件位点的细胞。氧源自由基通过与多不饱和脂肪酸反应产生损害，从而导致损害身体部件并使膜结合酶体系受损的脂过氧化物和氢过氧化物的形成。自由基刺激血小板激活因子和趋化因子的内皮释放，诸如嗜中性粒细胞激活因子趋化因子(C-X-C基序)配体1和吸引更多嗜中性粒细胞并放大氧化自由基的生成和再灌注损伤程度的趋化因子(C-X-C基序)配体1。反应性氧物种也会使一氧化氮淬灭，扩大内皮损伤和组织细胞功能障碍。除产生的增加以外，还存在内源性氧化物清除酶的相对缺乏，后者进而扩大自由基介导的心脏功能障碍。再灌注还可能导致显著的内皮细胞功能障碍。内皮细胞功能障碍促进特征为血小板和嗜中性粒细胞激活(再灌注的重要介导物)的促血栓表型的表达。一旦嗜中性粒细胞与功能障碍的内皮接触，其被激活并在一系列定义明确的步骤(滚动、牢固粘附和迁移)中作为天然免疫响应的一部分穿过内皮细胞连接而迁移至组织损伤区域。胞内钙稳态的变化在再灌注的发展中起着重要作用。再灌注可能与胞内钙的增加相关；该效应可能与通过L-型钙通道进入的肌膜钙的增加有关，或可能继发于肌质网钙循环的改变。除了胞内钙超载以外，对钙的肌丝敏感性的改变也牵涉于再灌注中。已据表明， 钙依赖蛋白酶(钙蛋白酶I)的激活及所导致的肌原纤维蛋白水解会强化再灌注损伤，如同肌钙蛋白的水解那样。受到损伤的组织细胞的再灌注具有改变的细胞代谢，这继而可能有助于延迟功能恢复。例如，损伤可能诱导细胞中的无氧代谢而净生成乳酸。乳酸释放在再灌注期间持续， 从而表明正常的有氧代谢的恢复被延迟。类似地，线粒体丙酮酸脱氢酶(PDH)的活性在损伤后可能被抑制高达40%并可能在再灌注后的至多30分钟内保持被抑制。再灌注期间的这些事件中的每一个都能导致对组织细胞的应激以及编程细胞死亡(凋亡)和组织细胞的坏死。凋亡通常起着“清除”来自受伤和受到遗传损害的细胞的组织，而细胞因子起着动员生物体抵抗病原体的防御系统的作用。然而，在严重损伤情况下， 这两种应激响应机制都能自身充当死亡成因。a.鞭毛蛋白鞭毛蛋白可以是鞭毛蛋白相关多肽。鞭毛蛋白可以来自任何来源，包括各种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌物种。鞭毛蛋白可以具有23种鞭毛蛋白中的一种的氨基酸序列， 所述23种鞭毛蛋白来自美国专利公开第2003/00444 号的图7所描绘的细菌物种，本文通过参考并入其内容。编码美国2003/00444 号的图7中所列鞭毛蛋白多肽的核苷酸序列可于包括NCBI Genbank数据库等来源公开获得。鞭毛蛋白可能是细菌鞭毛的主要成分。鞭毛蛋白可由三个域组成(图10)。域 I(Dl)和域2(拟)可以为非连续并且可以在氨基末端和羧基末端中的残基通过形成发夹结构而并列时形成。包含Dl和D2域的氨基和羧基端可能是得到最大保留的，而中部超变域(D3)可以高度可变。采用通过大肠杆菌铰链(NDl-2/ECH/t^)分离的包含氨基Dl和D2 和羧基Dl和D2的重组蛋白的研究表明，Dl和D2在与ECH单元偶联时可能是生物活性的。 这种嵌合物而非单独的铰链可以诱导两个小肠上皮细胞系的IkBa降解、NF-kB激活和IL-8 生成。非保留D3域可以处于鞭毛丝的表面上并且可以含有主要的抗原表位。鞭毛蛋白的强力促炎性活性可能处在高度保留的N和C Dl和D2区。鞭毛蛋白可以通过与Toll样受体5 (TLR5)结合来诱导NF_kB活性。TLR家族可以由至少10个成员组成且对于抵抗病原体的天然免疫防御是至关重要的。天然免疫系统可以识别微生物病原体上的病原体相关分子模式(PAMP)。TLR可以识别对于细菌编码蛋白特别的保守结构。所述保守结构可能由一大组残基组成，所述残基在某种程度上允许氨基酸内含物的变化。Smith等，Nat Immunol. 4 =1247-53(2003)已鉴定出鞭毛蛋白中的13种保守氨基酸，其为由TLR5识别的保守结构的一部分。对于TLR5活性可能较为重要的鞭毛蛋白中的所述13种氨基酸在图11中示出。鞭毛蛋白可以来自沙门氏菌属的物种，其代表性实例是都柏林沙门氏菌(由 GenBank登录号M84972编码)(SEQ ID NO :1)。鞭毛蛋白相关多肽可以为SEQ ID NO 1的碎片、变异体、类似物、同源物或衍生物或者其组合，其与TLR5结合并诱导TLR5介导的活性如激活NF-kB活性。鞭毛蛋白的片段、变异体、类似物、同源物或衍生物可以基于鞭毛蛋白的域结构和由TLR5识别的保守结构通过基于理论的设计而获得。鞭毛蛋白可以包含图11中所示的13个保守氨基酸(第89位、第90位、第91位、 第95位、第98位、第101位、第115位、第422位、第423位、第似6位、第431位、第436位和第452位)中的至少10个、11个、12个或13个氨基酸。鞭毛蛋白可以具有与SEQ ID NO 1的第1 174号氨基酸和418 505号氨基酸至少30% 99%的同一性。图沈列出了具有已知TLR-5刺激活性的鞭毛蛋白的氨基端和羧基端与SEQ ID NO :1相比的百分比同一性。鞭毛蛋白可以是来自任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌物种的鞭毛蛋白多肽，包括但不限于美国专利公开第2003/0000444 号(本文并入其内容)和对应于美国专利公开第2003/0000444 号的图25中所示的BLAST结果中所列出的登录号的鞭毛蛋白肽或其变异体。鞭毛蛋白可以刺激TLR5活性。已经制备出鞭毛蛋白的多个缺失突变体 (deletional mutant)，其保留至少某些TLR5刺激活性。鞭毛蛋白可以为本文的实施例中公开的缺失突变体，并且可以包含从GenBank登录号D13689翻译的序列(缺失第185 306号氨基酸或第444 492号氨基酸)或从GenBank登录号M84973翻译的序列(缺失第 179 415号氨基酸)或其变异体。鞭毛蛋白可以包含对可变D3域的转位子插入和变化。D3域可以部分或完全地由使得Dl和D2域能正确折叠的铰链或连接子多肽取代，以使变异体刺激TLR5活性。所述变异体铰链单元可见于大肠杆菌MukB蛋白并且可以具有如SEQ ID NO :3和4所示的序列或其变异体。可以使用其他试剂来靶向TLR5受体。这些试剂可以是TLR5的激动剂并刺激TLR5 活性。所述激动剂可以是抗TLR5抗体或其他小分子。b.损伤
再灌注的影响可能通过对身体部位的损伤而造成。损伤可能因缺血、缺氧、梗死或栓塞引起。对损伤的治疗可能导致再灌注和进一步的对身体部位的损害。(1)缺血缺血可能是对身体部位的血液供给的绝对或相对短缺。相对短缺可能是与身体部位的适当氧合所需的血液相比供给至身体部位的血液的不匹配(不管多小)。缺血也可能是因供应血液的血管的缩窄或堵塞而引起的血液向身体部位的不当流动，并且可能影响身体的任何身体部位。不足的供血导致身体部位变得缺氧，或者如果根本没有氧气供给，则变得无氧。这可能导致坏死。缺血的机制可能变化很大。例如，任何身体部位的缺血可能是因为心动过速(心脏异常快速跳动)、动脉粥样硬化(阻塞动脉腔的载满脂质的斑块)、血栓栓塞(血凝块)、血管外挤压(肿瘤)、镰状细胞病(异常形状的血红蛋白)、梗死、限制血流并迫使血液流向体肢端的诱导重力、因冻伤、冰、不正确的冷敷治疗而引起的局部极冷以及任何其它限制血液流向肢端的力(如止血带)而引起。由于严重撕裂、切口、刺穿(例如， 切割、因钝力创伤引起的粉碎损伤和因枪击或榴弹伤口引起的弹道创伤)而可能需要限制血液流向肢端的力。缺血可能是心脏病、缺血性结肠炎、短暂性缺血发作、脑血管意外、急性肾损伤、破裂动静脉畸形和外周动脉阻塞性疾病。(2)缺氧缺氧可以是缺乏适当的氧供给。缺氧可以是其中身体整体(一般性缺氧)或身体局域(组织缺氧)缺乏适当的氧供给。动脉氧水平的变化可能因身体部位的供需之间的不匹配而引起。完全的氧供给缺乏是无氧。缺氧可以是血氧不足性缺氧、贫血性缺氧、血氧不足性缺氧、组织毒性缺氧、组织毒性缺氧和缺血性缺氧。血氧不足性缺氧可能是因动脉血液中的氧部分分压较低造成的对身体整体的氧供给不当。血氧不足性缺氧可能是因大气氧部分分压较低(诸如高纬度)、改性大气(如下水道)的呼吸混合物中氧替换、如休闲使用氮氧化物中的氧替换、因睡眠呼吸暂停或呼吸不足引起的血液氧饱和下降、肺通气不当(如慢性阻塞性肺病或呼吸停滞)、肺循环中的解剖学或机械分流或者心肺中的右向左分流而引起。分流可能导致仍处于灌流或阻断向肺的某区域通气的肺泡的坍塌。分流可能带来意在用于不应通气的肺体系的血液，并因 Thebesia血管放空于左心室而阻止气体交换和阻止对支气管供给氧气的支气管循环。贫血性缺氧可能是总氧含量减少但动脉氧压正常。血氧不足性缺氧可能在血液未能将氧气输送至靶标身体部位时出现。血氧不足性缺氧可能由一氧化碳中毒或正铁血红蛋白血症所导致，一氧化碳中毒抑制血红蛋白释放其所结合的氧的能力，而正铁血红蛋白血症是血液中累积的异常血红蛋白。组织毒性缺氧可能因由于氧化磷酸化酶不可用而无法有效使用氧所引起。(3)梗死梗死是一类能造成缺血的病理性病况。梗死可以是因阻塞而导致损失适当的供血的肉眼可见面积的坏死组织。梗死可以是由血小板组成的白色梗死，并导致如心脏、脾脏和肾脏等器官组织中的坏死。梗死可以是由红细胞和肺器官组织中的纤维蛋白链组成。与梗死相关的疾病可以包括心肌梗死、肺栓塞、脑血管意外(脑卒中)、急性肾衰竭、外周动脉阻塞性疾病(例如坏疽)、抗磷脂综合征、脓毒症、巨细胞动脉炎、疝气和肠扭转。(4)栓塞
栓塞是一类能造成缺血的病理性病况。栓塞可以是从身体的一个部位迁移并导致身体的另一个部位中的血管的阻塞或堵塞的物体。栓塞可以是血栓栓塞、脂肪栓塞、空气栓塞、脓毒性栓塞、组织栓塞、外来体栓塞、羊水栓塞。血栓栓塞可以是从血栓位点完全或部分脱离的血块。脂肪栓塞可以是从血液循环中逸出的内源性脂肪组织。骨骼断裂是脂肪组织泄露至破裂的血管和动脉中的一个实例。空气栓塞可以是肺泡的破裂和泄露至血管内的吸入空气。锁骨下静脉刺穿或静脉内治疗是空气泄露至血管内的实例。气体栓塞可以是因如氮气和氦气等气体在血液中不溶和形成小气泡而引起。c.身体部位本发明涉及对哺乳动物中的身体部位的治疗。身体部位可以是器官、组织或细胞。身体部位可以来自腹部、髋白、脂肪、肾上腺皮质、肾上腺、肾上腺髓质、肺泡巨噬细胞、 羊膜、主动脉、动脉、腹水、腹水液、腋窝淋巴结、膀胱、血液、骨、骨髓、肠、脑、乳腺、支气管、 软骨、尾柄(caudal trunk)、小脑、子宫颈、绒膜绒毛、结肠、结膜、结缔组织、角膜、真皮、背根神经节、十二指肠、发育不良舌粘膜、卵子、胚胎、内分泌腺、子宫内膜、表皮、上皮、红细胞生成体、眼、成纤维细胞、鳍、胎儿、脚、包皮、Gasser节点、牙龈间质、性腺、腹股沟淋巴结、心脏、肱骨、回肠、小肠、回盲部、回肠、胰岛(Islet ofLangerhanm)、肾、幼虫(Larvae)、幼虫 (Larval)、喉、肝、肺、肺(支气管肺泡)、淋巴、淋巴结、淋巴组织、淋巴样组织、淋巴样器官、 乳房、乳腺结节肺泡、乳腺、中肾、间皮、蜕皮若虫、口、肌肉、鼻、鼻中隔、神经系统、神经、食道胃交界处、食道、口腔、卵巢、腭间质、胰腺、乳头状卵巢、阴茎、外周血、腹膜、咽、垂体、胎盘、胸腔积液、胸膜液、前列腺、蛹卵巢、直肠、视网膜、右轴向淋巴结、唾液腺导管、唾液腺、 骨骼肌、皮肤、小肠、小肠、软组织、脾脏、胸骨、胃、尾、睾丸、睾丸、大腿、胸腺、甲状腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、躯干、鼻甲、脐带、脐、子宫、阴道、内脏、外阴、胃肠道、肺、肾、肝、心血管系统、血管内皮、中枢和外周神经系统、肌肉、骨、毛囊和卵黄囊。3.组合物本发明还涉及包含治疗有效量的鞭毛蛋白的组合物。所述组合物可以为药物组合物，其可以使用本领域公知方法制备。所述组合物还可以包含助剂。如上所述，可以将所述组合物施用于哺乳动物以治疗再灌注的影响。a.施用使用本文所述方法的组合物施用可以通过口腔、胃肠外、舌下、透皮、直肠、透粘膜、局部、经由呼吸、经由含服施用或其组合而进行。胃肠外施用包括但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鞘内和关节内施用。对于兽医应用，所述组合物可以根据常规兽医实践作为适于接受的剂型施用。兽医师能容易地确定对于特定动物最为适当的给药方案和施用途径。所述组合物可以施用于人类患者、猫、狗、大型动物或禽类。所述组合物可以与其它治疗同时或按节奏施用。本文所用术语“同时的”或“同时地”是指所述组合物和其它治疗彼此在48小时、优选M小时、更优选12小时、再更优选6 小时且最优选3小时以下施用。本文所用术语“按节奏”是指所述组合物以不同于所述其它治疗的时间施用且以相对于反复施用特定的频率施用。所述组合物可以在再灌注以前的任何时间点施用，包括再灌注前约120小时、118 小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、
1078小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58 小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、 16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50 分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、 7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和1分钟。所述组合物可以在损伤前的任何时间点施用，包括损伤前约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88 小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、 46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26 小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、 4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、 20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和1 分钟。所述组合物可以在再灌注后的任何时间点施用，包括再灌注后约1分钟、2分钟、3 分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、 30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时、50 小时、52小时、54小时、56小时、58小时、60小时、62小时、64小时、66小时、68小时、70小时、72小时、74小时、76小时、78小时、80小时、82小时、84小时、86小时、88小时、90小时、 92小时、94小时、96小时、98小时、100小时、102小时、104小时、106小时、108小时、110小时、112小时、114小时、116小时、118小时和120小时。b.配制所述方法可以包括施用组合物以治疗再灌注的影响。本文所提供的组合物可以为以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。例如，口服施用的片剂和胶囊剂可以含有常规赋形剂，包括但不限于粘合剂、填料、润滑剂、崩解剂和润湿剂。粘合剂包括但不限于糖浆、金合欢胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、淀粉和聚乙烯比咯烷酮的胶浆。填料包括但不限于乳糖、糖、 微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙和山梨糖醇。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、 聚乙二醇和二氧化硅。崩解剂包括但不限于土豆淀粉和淀粉乙醇酸钠。润湿剂包括但不限于十二烷基硫酸钠。片剂可以根据本领域公知方法进行涂覆。本文所提供的组合物也可为液体制剂，包括但不限于水性或油性悬浮液、溶液、乳化液、糖浆剂和酏剂。所述组合物也可被配制为用于在使用前用水或其它合适的载剂重建的干燥产品。此类液体制备物可以包含添加剂，包括但不限于悬浮剂、乳化剂、非水性载剂和防腐剂。悬浮剂包括但不限于山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂肪。乳化剂包括但不限于卵磷脂、山梨聚糖单油酸酯和金合欢胶。非水性载剂包括但不限于食用油、杏仁油、分级椰油、油性酯、 丙二醇和乙醇。防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和山梨酸。
本文所提供的组合物还可以配制为栓剂，其可含有栓剂基质，包括但不限于可可脂或甘油酯。本文所提供的组合物还可以配制用于吸入，其可以为包括但不限于溶液、悬浮液或乳化液的形式，其可作为干粉施用或以气溶胶形式使用推进剂(如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷)施用。本文所提供的组合物还可配制为包含水性或非水性载剂的透皮制剂，包括但不限于乳膏、软膏、洗剂、糊剂、医用石膏、贴剂或膜剂。本文所提供的组合物还可以配制用于胃肠外施用，包括但不限于注射或连续输注。注射用制剂可以为处于油性或水性载剂中的悬浮液、溶液或乳化液形式，并且可以含有配制剂，包括但不限于悬浮剂、稳定剂和分散剂。所述组合物还可以以用于用合适的载剂 (包括但不限于无菌无热原水)重建的粉末形式提供。本文所提供的组合物还可以配制为贮存制剂，其可通过植入或肌内注射施用。所述组合物可以用合适的聚合性或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳化液)、离子交换树脂或作为微溶衍生物(例如作为微溶盐)配制。c.剂量所述方法可以包括对需要治疗的患者施用治疗有效量的所述组合物。治疗中使用所需的治疗有效量随待治疗的病况的性质、增加血流内的造血干细胞所需的时长以及患者的年龄/状况而有所不同。但一般而言，成年人治疗所采用的剂量通常为约0. OOlmg/kg/ 日 约200mg/kg/日。所述剂量可以为约lyg/kg/日 约100yg/kg/日。所需剂量可以便利地以单次剂量或作为以适当间隔(例如，每日2次、3次或4次以上的亚剂量)施用的多次剂量施用。多次剂量可能是所需或必需的。所述剂量可以是任何剂量，包括但不限于约0. 1μ g/kg、0. 2μ g/kg、0. 3μ g/kg、 0. 4 μ g/kg、0. 5 μ g/kg、0. 6 μ g/kg、0. 7 μ g/kg、0. 8 μ g/kg、0. 9 μ g/kg、lμ g/kg、25 μ g/kg、 50μ g/kg,75y g/kgU00y g/kgU25y g/kgU50y g/kgU75y g/kg,200y g/kg,225 y g/ kg,250 μ g/kg,275 μg/kg,300 μ g/kg,325 μ g/kg,350 μg/kg,375 μ g/kg,400 μ g/kg、 425 μ g/kg、450 μ g/kg、475 μ g/kg、500 μ g/kg、525 μ g/kg、550 μ g/kg、575 μ g/kg、600 μ g/ kg、625 μ g/kg、650 μg/kg、675 μ g/kg、700 μ g/kg、725 μ g/kg、750 μ g/kg、775 μg/kg、 800 μ g/kg,825 μ g/kg,850 μ g/kg,875 μ g/kg,900 μ g/kg,925 μ g/kg,950 μ g/kg,975 μ g/ kg 或 lmg/kg。4.助剂鞭毛蛋白或所述组合物可以与助剂共施用。所述助剂可以为减缓或避免再灌注的影响的任何化合物。助剂可以为抗氧化剂。抗氧化剂能够减缓并避免其它分子、细胞、组织或器官的氧化。抗氧化剂可以为维生素E、抗坏血酸、谷胱甘肽、硫辛酸、尿酸、如β-胡萝
卜素和视黄醇等胡萝卜素、维生素E和辅酶Q、如半胱氨酸等硫醇、半胱胺、谷胱甘肽和胆红素、氮磷汀和类黄酮。助剂可以为钠-氢逆向转运抑制剂。损伤和再灌注可能造成显著的细胞内酸中毒。可以使用钠-氢逆向转运抑制剂来减少质子分泌并避免Ca2+的增加。钠-氢逆向转运抑制剂可以为卡立泊来德。助剂可以为胰岛素。胰岛素可以用于刺激PDH活性和避免再灌注后PDH活性被抑制。助剂可以为腺苷。腺苷可以用于打开线粒体KATP通道。
5.组合治疗所述方法可以与其它方法组合以治疗损伤。所述其它方法可以为对心肌梗死(心脏病发作)、肺栓塞、脑血管意外(脑卒中)、外周动脉阻塞性疾病(例如坏疽)、抗磷脂综合征、脓毒症、巨细胞动脉炎、疝气、肠扭转、实体肿瘤癌、减压病、镰状细胞贫血、锁骨下静脉刺穿、骨折、高原病、休闲使用氮氧化物、睡眠呼吸暂停、呼吸不足、分流、贫血、一氧化碳中毒、正铁血红蛋白血症、血栓栓塞、脂肪栓塞、空气栓塞、脓毒性栓塞、组织栓塞、外来体栓塞、羊水栓塞、诱导重力以及避免因严重割伤、阉割或矫直而引起的血流的外压。所述方法也可与再灌注损伤治疗方法组合使用，如低剂量施用硫化氢(H2S)、gliSoden或小麦麸朊或者进行治疗性低温术或主动脉横断钳闭术。实施例本发明具有由以下非限制性实施例说明的多个方面。实施例1.鞭毛蛋白对肾功能的剂量依赖性保护[鞭毛蛋白可为TLR5激动剂]在特定剂量，鞭毛蛋白不会影响肾功能。通过在系统施用不同剂量的鞭毛蛋白后测定小鼠血清中的肌酸酐水平而展示出该效果。用0. 01μ g、0. 5μ g、l. 0μ g或5. 0μ g鞭毛蛋白对小鼠进行注射，并每日监测血清肌酸酐水平(mg/dl)，如图1所示。施用5yg鞭毛蛋白导致血清浓度增加，这在施用后M小时内显而易见。经过额外M小时后(总共48 小时)，肌酸酐水平达到峰值然后到施用后72小时回落至背景水平，然后开始缓慢上升至较低水平(图1)。相反，施用Iyg鞭毛蛋白也引起血清肌酸酐水平的上升，但这仅在48小时后作为单峰被检测到，然后在施用后72小时时回落至背景水平。施用0. 5 μ g和0. 1 μ g 在整个研究阶段没有引起可测定的血清肌酸酐水平的增加。实施例2.鞭毛蛋白对肾功能的剂量依赖性影响在特定剂量，鞭毛蛋白能保护哺乳动物的肾组织免受急性肾缺血的影响。通过在强加肾缺血并在缺血性肾的再灌注后测定存活率来展示出该效应。具体而言，在进行 45分钟的双侧肾蒂阻塞以前的30分钟，通过静脉施用对C57BL/6小鼠组给予在400 μ 1 PBS中的不同剂量的鞭毛蛋白(0. 01 μ g/只、0. 5 μ g/只、1. 0 μ g/只或5. 0 μ g/只)或仅 PBSGOOy 1)。然后收集小鼠的存活率、血清肌酸酐的水平和组织病理学数据。a.存活率如前文所详述(参考文献)，在小鼠中进行双侧肾蒂阻塞。在手术前20分钟通过腹膜内施用对小鼠给予20U(单位/ml)的肝素钠。将小鼠用苯巴比妥麻醉并在术前在60W 灯泡下一直保暖。在无菌条件下，采用中线切开打开腹腔，并用微血管钳(World Precision Instruments, Sarasota,FL)非创伤性阻塞双侧肾蒂，用4-0丝线将创口暂时闭合。将小鼠置于60W灯泡下的加热板上，并将Traceable 认证记忆监测温度计(FisherScientif ic) 的传感器尖端置于腹腔内以确保在强加肾缺血期间温度维持在32°C。使肾缺血45分钟。 除去血管钳后，从外观确认立即和完全的肾再灌注，并闭合腹膜腔。以相同方式处理经Siam 操作的小鼠，不同之处在于肾蒂的双侧钳。在给予不带鞭毛蛋白的PBS的对照组中，80%的动物在缺血性肾再灌注后5日内死亡(见图加)。所有在强加肾缺血前给予5yg鞭毛蛋白的动物在再灌注后5日内死亡。 相反，所有在肾缺血前给予1 μ g或0. 5 μ g鞭毛蛋白的动物在再灌注后存活了超过45天。 此外据观察，鞭毛蛋白在急性肾缺血中的保护性效果是剂量依赖性的，因为给予0. 1 μ g或0.01yg的动物未受保护免受损伤。b.肾功能测定还测定了血清肌酸酐水平以确定鞭毛蛋白对肾功能的保护性效果。将经Siam操作的小鼠和受到双侧肾I/R损伤的小鼠用异氟醚麻醉并使用肝素涂覆的微毛细管以M 小时间隔从眼窝后丛取血。将血清在测量前储存于-80°C。使用肌酸酐试剂盒(Sigma Diagnostics, Inc.，St. Louis, MO)测定血清肌酸酐水平。在强加缺血前30分钟给予
1.25 μ g或0. 5 μ g的鞭毛蛋白的动物中于再灌注后M小时确定的血清肌酸酐水平较低反映出鞭毛蛋白的保护性效果(见图2b)。给予非保护性低剂量鞭毛蛋白(O.lyg和 O.Olyg)的动物具有更高的肌酸酐水平，其正好低于在双侧肾蒂阻塞前30分钟接受PBS的对照组中所观察到的肌酸酐水平之下。c.肾组织的组织学研究高血清肌酸酐水平表明受强加缺血-再灌注损伤诱导的肾功能障碍，其得到再灌注后M小时的缺血性肾的组织病理学支持(见图幻。对于免疫组织化学而言，将回收的肾对剖，嵌入OCT复合物(MkuraFinetek U. S. A.，Torrence，CA)，并立即在液氮中冷冻。将冠状部分切片(7mm)，置于载玻片上，干燥1小时，然后在丙酮中固定10分钟。在室温将载玻片浸入PBS 10分钟并浸入3%过氧化氢/甲醇5分钟以消除内源性过氧化物酶活性。用生物素阻断系统(DAK0，Carpentaria，CA)阻断内源性生物素活性。在用正常大鼠血清(1 100) 处理后，将在PBS中用牛血清白蛋白(BSA)稀释为1 100的用以检测嗜中性粒细胞的抗小鼠Gr-I mAb(RB6.8C5)、或用以检测⑶4+T细胞的大鼠抗小鼠⑶4 mAb (GK1. 5)的 1 50稀释液、用以检测⑶8+T细胞的大鼠抗小鼠⑶8a mAb(53-6. 7)或者大鼠抗小鼠巨噬细胞(F4/80)mAb(SER0TEC，Raleigh，NC)添加至所述切片。将对照载玻片与大鼠IgG—同温育。1小时后，用PBS将载玻片洗涤3次，并与在PBS/1% BSA中稀释为1 100的生物素化兔抗大鼠IgG抗血清(Sigma Aldrich)温育20分钟。在PBS中洗涤3次后，将载玻片与抗生物素链霉亲和蛋白-辣根过氧化物酶(DAKO)温育20分钟。将DAB(3，3' - 二氨基联苯胺)底物-发色团溶液(Vector Laboratories, Inc.，Burlingame, CA)应用于载玻片 0. 5分钟 3分钟。在dH20中润洗后，用苏木精将载玻片复染色，用dH20，盖上盖玻片，并通过光学显微镜观察。使用 Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD)获取图像。为使TLR5 染色，将 Img 的抗 TLR5 mAb (ABR-AffinityBioReagents, Inc. ,Golden, CO)应用于载玻片并在室温温育1小时，在室温洗涤后，用稀释为1 100的生物素化山羊抗小鼠IgG抗体处理30分钟。在应用DAB后，用自来水洗涤载玻片，浸入苏木精中3秒然后洗涤。用递增浓度至50%的乙醇将载玻片脱水，然后浸入citrasolve两次，每次10分钟。将载玻片用自来水洗涤，盖上盖玻片，并通过光学显微镜观察。作为由强加缺血-再灌注损伤的肾功能障碍的指标，血清肌酸酐水平的使用得到再灌注后M小时缺血性肾的组织病理学的支持(见图幻。在强加肾缺血前30分钟给予PBS的对照组动物具有严重的肾小管坏死，且在再灌注后M小时显著形成分级(caste formation) 0与通过施用5 μ g鞭毛蛋白诱导的肾功能障碍相一致的是，在施用5 μ g鞭毛蛋白而不强加缺血后30分钟显见肾病理，且这随着肾缺血的强加和再灌注其严重性增加并具有明显的出血、血栓和分级形成。相反，在强加缺血前30分钟给予0.5 μ g鞭毛蛋白的动物在再灌注后M小时具有较低水平的白细胞浸润，但肾结构似乎相对正常。较低的非保护性剂量(0. 1 μ g鞭毛蛋白)未能挽救由缺血/再灌注损伤诱导的肾病理。当在再灌注后第7天检验存活动物的肾时，在强加缺血前给予0. 5μ g鞭毛蛋白的动物中观察到肾小管坏死和白细胞浸润的显著减少，以及不存在血栓和分级形成(见图4)。d.对受损肾组织的嗜中性粒细胞浸润由于嗜中性粒细胞浸润和激活是肾缺血-再灌注后的组织损伤的主要促成因素， 因而从仅用PBS处理和用0. 5 μ g鞭毛蛋白处理的动物中在再灌注后9小时和M小时获取缺血性肾，并通过对制备的组织切片的免疫组织化学染色来评估嗜中性粒细胞浸润水平。为直接确定再灌注期间缺血性肾中的嗜中性粒细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞和 ⑶8+T细胞的数目，将1/4的所获肾切下并称重。将这些肾在具有2%胎牛血清的RPMI 1640培养基中温育1小时，然后使用注射器活塞挤压通过70mm细胞过滤网。收集细胞并用ACK裂解缓冲液(GIBCO，Grand island，NY)裂解红细胞。洗涤2次后，使用台盼蓝排斥(Trypan blue exclusion)对活细胞计数。将细胞等分式样与抗CD16/CD32Fc受体抗体(BD Pharmingen, San Diego, CA)预温育5分钟以阻断非特异性抗体结合，然后在4°C， 将样品与FITC缀合抗⑶45mAb以及PE缀合抗体温育30分钟以检测巨噬细胞(F4/80)或 CD8+T细胞(53-6. 7)，和与APC缀合抗体温育以检测嗜中性粒细胞(RB6. 8C5)或CD4+T细胞(GK1. 5)(所有抗体均来自BD Pharmingen)。使用双色流式细胞仪在FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA)上分析细胞。前向散射和FLl (CD45+)通道用于挡住肾组织中的白细胞，接着分析特定的白细胞群。对于每个样品，累积200，000次事件。使用CellQuest 软件(BD Biosciences)分析数据。每个白细胞群的总数由以下方式计算(所计得的白细胞总数)X (CD45+细胞中计得的白细胞群的百分比)/100。数据以每个白细胞群的数目/g 来自sham和VR动物的肾组织报告。在动物被给予0. 5 μ g鞭毛蛋白时再灌注后9小时和M小时观察到嗜中性粒细胞浸润的显著减少(见图fe)。对浸润至缺血性肾内的白细胞的直接定量表明，0.5yg鞭毛蛋白使嗜中性粒细胞浸润几乎减少至在经sham操作的对照动物中所观察到的水平(见图 5b)。在再灌注后M小时的缺血性肾中观察到CD4和CD8T细胞以及巨噬细胞的数目的减少，且在缺血前30分钟施用0. 5 μ g鞭毛蛋白进一步使⑶4和⑶8T细胞的数目减少。实施例3.鞭毛蛋白调节减少缺血性肾再灌注期间的促炎性细胞因子表达本实例展示出鞭毛蛋白避免细胞因子CXCL1/KC和CXCL2/KC将白细胞浸润引导至缺血性肾组织内的关键作用。此前研究已表明，缺血性肾中嗜中性粒细胞化学吸引剂 CXCLl/KC和CXCL2/KC的峰值水平出现在再灌注后9小时[参考文献]。为开始研究当用0. 5μ g鞭毛蛋白调节动物时缺血性肾内白细胞浸润减少的基本机制，在再灌注后9小时和M小时移除肾并确定嗜中性粒细胞和巨噬细胞化学吸引剂的 mRNA和蛋白水平(图6)。从收集的肾中切下1/4并在液氮中冷冻。使用RNeasyTM微型试剂盒 OlIAGEN，Valencia, CA)提取组织 RNA，并使用 High-Capacity cDNA Archive 试剂盒 (Applied Biosystems, Foster City, CA)进行逆转录。用测试 KC/CXCL1、MIP-2/CXCL2 和 MCP-1/CCL2 引物在 Prism 7700 序列检测系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)上进行实时 PCR，并将 Mrpl32 (Applied Biosystems, Foster City, CA)用作对照。将储存于液氮中的肾样品溶解于带有0. OlM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物(IOmg/ml苯甲基磺酰氟、2mg/ml抑肽酶、2mg/ml亮肽素、100mg/ml Pefabloc SC和100mg/ml糜蛋白酶抑素(chymostatin))的 500ml PBS 中，然后添加 Iml 的 1. 5% Triton X-100 的 PBS 溶液。于4°C振荡下温育1小时后，将样品离心，收集上清液，并使用BCATM蛋白测试试剂盒(Pierce，Rockford，IL)确定总蛋白浓度。使用 Quantikine M 试剂盒(R&D Systems, MinneapoIis,MN)通过夹心 ELISA 测定 KC/CXCL1、MIP_2/C)(CL2 和 MCP-1/CCL2 浓度。为确定缺血性肾的再灌注期间的嗜中性粒细胞的激活，使用小鼠MPO ELISA测试试剂盒(Cell Sciences,Canton,ΜΑ)测定髓过氧化物酶(MPO)的浓度。结果以测试蛋白浓度/mg总组织蛋白士SD报告。用保护性剂量的鞭毛蛋白(1.25yg或0.5yg)进行预调节导致再灌注后9小时 mRNA表达和嗜中性粒细胞化学吸引剂CXCLl和CXCL2的蛋白水平的显著减少。CCL2 mRNA 表达或蛋白水平在再灌注后9小时和M小时均较低，且不受鞭毛蛋白预调节的进一步影响。另外，在经鞭毛蛋白预调节的动物中再灌注后9小时的缺血性肾中，急性期蛋白IL-Ib 和IL-6而非TNFa的mRNA水平也减少(图6)。实施例4.鞭毛蛋白在缺血性肾的再灌注期间施用时的保护性效果本实施例说明鞭毛蛋白在再灌注开始后给予时提供对急性缺血处理的肾提供保护性效果。如上所述，在小鼠中进行双侧肾蒂阻塞并测定血清肌酸酐水平以确定鞭毛蛋白对再灌注开始后肾功能的保护性效果。具体而言，对C57BL/6小鼠组进行45分钟的双侧肾蒂阻塞并在移除肾钳后在不同时间施用0. 5 μ g鞭毛蛋白(见图7)。在除去钳之前的30分钟或除钳后的30分钟内施用鞭毛蛋白使所有小鼠的生存力未受到缺血性损伤的影响。再灌注后1小时以及再往后的时间的鞭毛蛋白施用未能使任何小鼠免受损伤。在除钳前30分钟或除钳后的30分钟内使用鞭毛蛋白的保护性效果由缺血性肾再灌注后24小时所监测到的低血清肌酸酐水平所反映(图7b)。实施例5.鞭毛蛋白的保护性效果需要肾实质细胞上的TLR5信号转导本实施例说明组织再灌注期间的鞭毛蛋白治疗的保护性效果的靶源。如实施例 1 4中所讨论，再灌注研究在缺血性肾上进行。在野生型C57BL/6和B6. MyD88+小鼠质检产生放射诱导的骨髓重建嵌合体。通过从野生型C57BL/6和B6. MyD88+小鼠切去股骨和胫骨的端部并用RPMI 1640冲洗以收集骨髓细胞来产生放射诱导的骨髓重建嵌合体。骨髓接受小鼠首先接受IlOORad g照射，然后在3小时后于静脉内接受20X 106个骨髓细胞。经照射的⑶90. 1接受体从同类系⑶90. 1 供体接受骨髓，反之亦然。重建的接受体在第1至第7日从饮水中接受抗生素(0. 2mg/ml 磺酰甲噁唑和0. 4mg/ml甲氧苄啶)作为预防。让接受体恢复8 12周并通过用FITC缀合的90. 2和PE缀合的90. 1来染色外周血细胞来证实完全嵌合。图8显示，在用野生型骨髓重建的野生型C57BL/6小时的缺血性肾的再灌注的30 分钟内施用0. 5 μ g鞭毛蛋白降低了 CXCLl和CXCL2mRNA水平。在用MyD88+或野生型骨髓重建的MyD88+接受体中，在缺血性肾的再灌注期间几乎没有诱导CXCLl和CXCL2 mRNA, 并且在这些肾的再灌注期间施用鞭毛蛋白没有降低这些趋化因子的mRNA水平。相反，来自 MyD88+供体的骨髓的野生型接受体表达高水平的CXCLl和CXCL2 mRNA,且这些水平通过在缺血性肾的再灌注期间施用鞭毛蛋白而降低。这表明鞭毛蛋白的靶标是实质肾细胞而不是白细胞。
为对其进行进一步研究，将来自野生型C57BL/6和BALB/c小鼠的肾切片用抗TLR5 抗体染色(图9a)。染色为阳性的细胞主要是血管结构中的细胞，且染色在肾小管细胞或肾小球上不显著。来自在TLR5表达上具有遗传缺陷的虫蛀小鼠(Moth Eaten mice)的肾切片未能以抗TLR5抗体染色。TLR5 mRNA的表达水平在强加肾缺血/再灌注之前在肾中较低，但在缺血性肾的再灌注期间快速提高(图9b)。实施例6.鞭毛蛋白在后肢缺血模型中的保护性效果在对止血带诱发的缺血性损伤的模拟中，研究了 CBLB502在小鼠后肢缺血模型中的潜在保护性效果。这些研究来自于以下研究其表明给予受到双侧肾蒂阻塞的小鼠的 CBLB502减轻了缺血性损伤和肾功能障碍，包括减少响应于再灌注的嗜中性粒细胞化学吸引剂的产生、减少浸润至缺血性肾内的嗜中性粒细胞、以及减轻血清肌酸酐水平的上升和存活力的丧失。可以在强加肾蒂阻塞前或在缺血性肾再灌注后至多30分钟(这对于临床应用更为重要)给予所述保护剂。止血带诱发的损伤如下模拟将宽橡皮带在小鼠的左后肢上束紧2 4小时。经过所述缺血时间后，松开橡皮带并移除。动物从麻木中恢复但表现出无法使用缺血的后肢， 其在长达9天的时间内被它们拖曳于身后。缺血性损伤还包括清晰可见的所述后肢的浮肿 (其可通过湿重-干重测量和与对侧肢的比较来定量)，以及高水平的促炎性细胞因子(包括嗜中性粒细胞化学吸引剂)的诱导和嗜中性粒细胞强烈浸润至缺血后肢内。另外，注射伊文思蓝染料指示出缺血后肢中可观的血管泄露量(数据未示出)。在研究CBLB502的保护性效果时，通过将宽橡皮带在左后肢束紧3小时来对小鼠再次施加止血带诱导的损伤。经过所述缺血时间后，松开橡皮带并除去。除去橡皮带和再灌注开始后15分钟，将0.5yg的CBLB502或空载剂(PBS)肌内施用于缺血的左后肢内。 施用CBLB502的小鼠具有更快的对肢端使用的恢复，且在再灌注后第14天对于缺血后肢已具有IOGF的可测握力。相反，在再灌注后15分钟仅施用PBS的小鼠直到第21天才达到该力量。给予CBLB502的肢端在再灌注后25小时也没有显著的浮肿，这由2. 5的湿重/干重比证实(相比来自在再灌注时仅给予空载剂的小鼠的缺血肢端的湿重/干重比为3. 4)(见图14C)。就血管泄露而言，施用CBLB501的小鼠具有7. 4 μ g伊文思蓝染料/克湿重肢端组织，相比对于施用空载剂的小鼠为13. 1 μ g，P < 0. 001)(见图14D)。最后，在再灌注时用 CBLB502处理的肢端的组织嗜中性粒细胞和巨噬细胞化学吸引剂sCXCL2、CCL2和髓过氧化物酶显著减少(对于每个测试P < 0. 05)[是否有定量数据？]。在用CBLB502 (图14A)或空载剂(图14B)处理的小鼠的缺血3小时后的再灌注后的第14天对后肢肌肉进行苏木精 /曙红染色。在再灌注30分钟内注射CBLB502也导致嗜中性粒细胞化学吸引剂生成和浸润至缺血肢端的嗜中性粒细胞的减少、浮肿的可见减少和缺血肢端使用的加速恢复(第4 6 天)。组织学检查也表明用保护剂处理的动物的缺血肢端具有更大的肌纤维束厚度(数据未示出)。这些结果将通过对采用相比于不采用CBLB502保护剂施用时受到后肢缺血的动物中的炎症和肢端功能障碍的定量测定来进一步研究。这将包括对其它促炎性细胞因子的定量、对嗜中性粒细胞浸润的直接定量、对肌纤维束厚度和肌纤维凋亡的定量以及浮肿的幅度和持续时间。
权利要求
1.一种治疗受再灌注影响的哺乳动物的组织的方法，所述方法包括对需要该治疗的哺乳动物施用包含鞭毛蛋白的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述再灌注由损伤造成。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述损伤是缺血或缺氧。
4.如权利要求3所述的方法，其中缺血选自心动过速、梗死、急性肾衰竭、脑卒中、低血压、栓塞、血栓性栓塞(血凝块)、镰状细胞病、身体局部极端受压和肿瘤。
5.如权利要求3所述的方法，其中缺氧选自血氧不足性缺氧(一氧化碳中毒；睡眠呼吸暂停、慢性阻塞性肺病、呼吸骤停；分流)、贫血性缺氧(02含量低)、血氧不足性缺氧和组织中毒性缺氧。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述损伤选自心肌梗死、脑卒中和急性肾衰竭。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述局部受压是因止血带所致。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物在氧气流入之前、同时或其后施用。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述组织选自胃肠道、肺、肾、肝、心血管系统、血管内皮、中枢神经系统、周围神经系统、肌肉、骨和毛发毛囊。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物与抗氧化剂共同施用。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述抗氧化剂选自氮磷汀和维生素E。
12.—种治疗受再灌注影响的哺乳动物的组织的方法，所述方法包括对需要该治疗的哺乳动物施用能够靶向TLR5的试剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述试剂是TLR5的抗体或激动剂。
全文摘要
本发明涉及使用鞭毛蛋白治疗受到再灌注影响的哺乳动物的组织。
文档编号A61K45/00GK102170911SQ200980138907
公开日2011年8月31日 申请日期2009年7月31日 优先权日2008年8月1日
发明者安德烈·V·古德科夫, 罗伯特·费尔柴尔德 申请人:克里夫兰临床基金会, 克里夫兰生物实验室公司