专利名称：一种具有治疗缺血再灌注损伤功能的含氢注射液的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种可用于治疗缺血再灌注损伤的含氢 注射液。
背景技术：
缺血是临床疾病中常见病因之一。缺血性疾病通常可以在早期采用溶 栓和抗自由基损伤等措施来治疗，但有可能继发缺血再灌注损伤，它是脑 梗塞等疾病重要的病理生理过程。在医药技术领域，氢气已经被用于饱和 潜水及减压病的治疗。至今未见有关采用含氢注射液防治缺血再灌注损伤 的相关报道。
发明内容
本发明提供一种含氢注射液，可用于治疗缺血再灌注导致的组织损伤 和器官功能障碍。 制备方法如下
1. 脱气处理
将生理盐水、糖盐水或碳酸氢钠等医用注射液软包装常温中放置于
0.4—0.8绝对大气压 (atmosphere absolute, ATA)的低压下2—24小时，再 在常温、常压下放置，使过饱和气体充分析出，随后抽除析出的气体；
2. 低温预处理
将脱气处理后的注射液软包装置于2—1(TC充分冷却，以增加对氢气的 溶解度；
3. 注入纯氢气
从低温处理后的注射液软包装中抽取占总体积5~15%的注射液，常压 下注入纯氢气使软包装充盈。4.加压助溶
将注入氢气后的注射液软包装在低温下持续加压12~24小时，使氢气 充分溶入注射液，减压后取出，置于(T5"C保存备用，稳定24小时后即可 使用。
本发明注射液经动物实验证明对大鼠脑缺血再灌注损伤模型能明显 减少脑梗死体积、减轻脑组织损伤、减少神经组织细胞凋亡数量、降低海 马和大脑皮层中凋亡酶的活性；在心肌缺血再灌注、肾脏缺血再灌注和肝 脏缺血再灌注的损伤模型中也观察到了类似的效果。因此本发明含氢注射 液可用作治疗缺血再灌注损伤的药物。
图1为大鼠脑缺血再灌注后梗死体积的比较图谱，其中，A:正常对
照组；B:生理盐水组；C:含氢注射液治疗组。
图2为大鼠脑缺血再灌注后尼氏染色图谱，其中，A:正常对照组， Al:皮层50x， A2波层400x， A3:海马50x， A4:海马400x; B:阴性对照组， Bl:皮层50x， B2:皮层400x， B3:海马50x， B4:海马400x; C:低剂量组， Cl:皮层50x， C2:皮层400x， C3:海马50x， C4:海马400x; D:中剂量组， Dl:皮层50x， D2:皮层400x， D3:海马50x， D4海马400x; E:高剂量组， El:皮层50x, E2:皮层400x, E3:海马50x， E4:海马400x。
图3为大鼠脑缺血再灌注后尼氏染色400X镜下细胞计数统计图。
图4为大鼠脑缺血再灌注后Tund染色细胞凋亡图谱。
图5为大鼠脑缺血再灌注后Tunel染色400X镜下凋亡细胞计数统计图。
图6为大鼠脑缺血再灌注后皮层和海马的凋亡酶caspase—3活性统计图。 图7为大鼠脑缺血再灌注后皮层和海马的凋亡酶caspase-12活性统计图。
具体实施例方式
现结合附图和实施例对本发明作详细描述。实施例仅用作说明本发明， 不能视为对本发明权利要求保护范围的限制。 实施例1.制备含氢生理盐水注射液
1. 脱气处理
将生理盐水注射液500 ml软包装袋置于低压舱中，常温下以0.4 ATA 减压处理2小时，取出后常温、常压下放置4小时，将析出气体用注射器 抽除；
2. 低温预处理
常压下将上述脱气处理后的注射液软包装袋置于2T:环境下2小时以 充分冷却；
3. 注入纯氢气
从上述低温处理后的软包装袋中抽出50ml的生理盐水，常压下注入2 'C的纯氢气(上海基量标准气体有限公司氢标准气，下同)50ml;
4. 加压助溶
将注入氢气后的注射液软包装袋放入加压舱，5'C下以5 ATA持续加压 12小时，随后减压至常压，置3~5匸保存备用，24小时后即可使用。经检 测，常温常压下所制得的含氢注射液氢气的体积百分比浓度为1.7% (ml/ml)。
实施例2.制备含氢葡萄糖盐水注射液
1. 脱气处理
将葡萄糖盐水注射液500 ml软包装袋置于低压舱中，常温下以0.8 ATA 减压处理24小时，取出后常温、常压下放置24小时，将析出气体用注射 器抽除；
2. 低温预处理 常压下将上述脱气处理后的注射液软包装袋置于l(TC环境下8小时以 充分冷却；
3. 注入纯氢气
从上述低温处理后的软包装袋中抽出25 ml的注射液，常压下注入IO 。C的纯氢气25 ml;
4. 加压助溶
将注入氢气后的注射液软包装袋放入加压舱，rC下以7ATA持续加压 24小时，随后减压至常压，置3—5"C保存备用，24小时后即可使用。经检 测，常温常压下所制得的含氢注射液氢气的体积百分比浓度为1.4% (ml/ml)。
实施例3.制备含氢碳酸氢钠注射液
1. 脱气处理
将氢碳酸氢钠注射液100 ml软包装袋置于低压舱中，常温下以0.6 ATA 减压处理20小时，取出后常温、常压下放置20小时，将析出气体用注射 器抽除；
2. 低温预处理
常压下将上述脱气处理后的注射液软包装袋置于6t环境下4小时以 充分冷却；
3. 注入纯氢气
从上述低温处理后的软包装袋中抽出15 ml的注射液，常压下注入6°C 的纯氢气15 ml;
4. 加压助溶
将注入氢气后的注射液软包装袋放入加压舱，3"C下以6 ATA持续加压 20小时，随后减压至常压，置3~5"保存备用，24小时后即可使用。经检 测，常温常压下所制得的含氢注射液氢气的体积百分比浓度为0.8%
(ml/ml) o
实施例4.制备含氢生理盐水注射液
1. 脱气处理
将生理盐水注射液500 ml软包装袋置于低压舱中，常温下以绝对压为 0.5 ATA减压处理12小时，取出后常温、常压下放置8小时，将析出气体 用注射器抽除；
2. 低温预处理
常压下将上述脱气处理后的注射液软包装袋置于4'C环境下2小时以充
分冷却；
3. 注入纯氢气
从上述低温处理后的软包装袋中抽出75 ml的生理盐水，常压下注入4 。C的纯氢气75 ml;
4. 加压助溶
将注入氢气后的注射液软包装袋放入加压舱，5"C下以5ATA持续加压 22小时，随后减压至常压，置3 5"C保存备用，24小时后即可使用。经检 测，常温常压下所制得的含氢注射液氢气的体积百分比浓度为2.0% (ml/ml)。
实施例5.制备含氢生理盐水注射液
1. 脱气处理
将生理盐水注射液500 ml软包装袋置于低压舱中，常温下以0.4 ATA 减压处理24小时，取出后常温、常压下放置12小时，将析出气体用注射 器抽除；
2. 低温预处理
常压下将上述脱气处理后的注射液软包装袋置于2。C环境下8小时以充 分冷却；
3. 注入纯氢气
从上述低温处理后的软包装袋中抽出75 ml的生理盐水，常压下注入2 r的纯氢气90ml;
4. 加压助溶
将注入氢气后的注射液软包装袋放入加压舱，5'C下以7ATA持续加压 24小时，随后减压至常压，置3^5"C保存备用，24小时后即可使用。经检 测，常温常压下所制得的含氢注射液氢气的体积百分比浓度为2.4% (ml/ml)。
本发明方法制备的含氢注射液在常温常压下经中国科学院大连化学物 理研究所测得氢气的体积百分比浓度为0.8~2.4% (ml/ml)。 动物实验
实验动物SD雄性大鼠，体重22(T250克，购于第二军医大学实验动 物中心。
取大鼠65只，雄性，随机分成5组正常对照组、阴性对照组、实施 例l制备的注射液低、中、高剂量治疗组，每组13只。除正常对照组外， 其余各组大鼠先制备成脑缺血再灌注损伤模型，再灌注后10分钟，分别腹 腔注射生理盐水和本发明实施例1制备的注射液。本发明注射液按体重低 剂量组注射0.3 ml/100 g，中剂量组注射0.6 ml/100 g，高剂量组注射0.9 ml/100 g，阴性对照组和正常对照组均注射生理盐水0.6 ml/100 g。
大鼠脑缺血再灌注损伤模型的制备
参照Longa、Kuge等报道的方法(详见Kuge Y， MinematsuK, Yamaguchi T, et al. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke, 1995,26:1655-58)，采用颈外动脉插入线 栓法造模。SD大鼠用N20/U (70:30)加1%七氟烷麻醉，仰卧固定，颈正中 切口，钝性分离暴露右侧颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉，结扎颈外动脉远端，游离其主干备用。尼龙线长40mm，直径0.2CT0.23腿， 一端约O. 5 cm 长度上均匀涂布聚胺酯清漆，使其头端成一光滑的锥型，头端直径小于O. 25 mm，从右侧颈外动脉入口，至右颈总动脉后，转向右颈内动脉入颅推进17~19 mm，微遇阻力时停止，完成一侧大脑中动脉的阻塞。再灌注时缓慢地轻拉 线栓使其头端回到颈外动脉内，可实现大脑中动脉再灌注。本实验采用的 动物模型均为缺血90分钟后再灌注。
上述各组大鼠在腹腔注射24小时后处死,分别取脑组织进行TTC、HE、 尼氏、细胞凋亡染色，并提取海马和大脑皮层脑，测定其中凋亡酶的活性。 实验结果如下-
1. 观察对大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积的影响 取各组动物脑组织，进行TTC染色，TTC染色是检测组织缺血梗死体积
的经典方法，染色后缺血区显示为白色，正常组织为红色。结果见图l，图 l中，A.正常对照组；B.阴性对照组；C.本发明注射液中剂量治疗组。图l 显示，阴性对照组梗死范围分布在缺血侧大脑皮层、海马和尾核；用ImageJ 软件算出各脑片截面面积和梗死区面积，再用所有连续切片梗死面积之和 除以所有连续切片横截面面积之和，得到的商数即约为梗死体积占全脑体 积的比例为(20.7±4.5) %;本发明中剂量治疗组梗死范围仅出现在缺血 侧部分皮层，梗死体积占全脑体积(12.5±3.6) %。结果表明，本发明注 射液可明显减少脑梗死体积。
2. 观察对大鼠脑缺血再灌注后24小时大脑皮层与海马神经元数量的 影响
取各组动物脑组织，石蜡固定并切片，采用经典的尼氏染色(详见 Li Z, Liu W， Kang Z, Lv S, Han C， Yun L, Sun X, Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156)，结果见图2和图3。在尼氏染色中尼氏
体清晰可辨，胞核、核仁也非常清晰，而且很容易区分轴突和树突，在生 理情况下，尼氏体大而数量多，反映神经细胞合成蛋白质的功能较强，在 神经元受损时，尼氏体的数量可减少甚至消失。图2中可以清晰显示具有
生物活性的神经元细胞，在400X镜下计数，将各组的细胞数绘制成图3。 图3中，園表示皮层，口表示海马；Control组为正常对照组，HI组为阴性 对照组，H2l组为低剂量组，H22组为中剂量组，H23组为高剂量组。如图 3示，与正常对照组相比，阴性对照组中缺血侧大脑皮层与海马的神经元明 显减少(* p <0.05， ** p <0.01)，说明脑缺血再灌注后大脑皮层与海马 神经元出现明显损伤。本发明注射液低、中、高剂量组对脑缺血再灌注后 脑皮层与海马神经元均有改善，其中以中剂量0.6ml/100g组作用最明显， 神经元细胞数量和组织结构均接近正常对照组。结果表明，本发明注射液 可减轻大鼠脑缺血再灌注后神经元损伤。
3. 观察对大鼠脑缺血再灌注后24小时大脑皮层与海马细胞凋亡数量 的影响
取各组动物脑组织，石蜡固定并切片，采用Tunel染色(详见Li Z， Liu W， Kang Z, Lv S， Han C, Yun L， Sun X， Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156)，结果见图4，图4中分组同图2。图中被显色细胞 为Tund染色的阳性细胞，即凋亡细胞。在400X镜下分别计数个组凋亡细 胞数，并由此绘制成图5，图5中分组如图3。由图5可见本发明注射液 低、中、高剂量组对脑缺血再灌注后缺血侧大脑皮层与海马细胞凋亡数量 减少，其中以中剂量组作用最明显，接近于正常对照组水平(*p <0.05，
<0.01)。结果表明，本发明注射液可减少大鼠脑缺血再灌注后细胞凋 亡数量。
4. 观察对大鼠脑缺血再灌注后24小时大脑皮层与海马凋亡酶活性的 影响
取各组动物新鲜脑组织，采用荧光酶活性检测(详见Li Z, Liu W, Kang Z, Lv S, Han C， Yim L， Sun X, Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156)，结果见图6、图7，分别是凋亡酶caspase-3和caspase-12
的活性比较，其分组情况同图3。此两图均可见本发明注射液低、中、高 剂量组对脑缺血再灌注后缺血侧大脑皮层与海马中的凋亡酶的活性明显减
小，其中以中剂量组0.6ml/100g作用最明显，接近于正常对照组水平(*;> <0.05， <0.01)。结果表明，本发明注射液可降低大鼠脑缺血再灌注
后凋亡酶的活性。
上述实验结果表明，本发明注射液可减少大鼠局灶性脑缺血后脑梗死 的体积、减少神经细胞损伤、减少细胞凋亡数量、降低皮层和海马中的凋 亡酶活性，在心肌缺血再灌注、肾脏缺血再灌注和肝脏缺血再灌注损伤模 型中观察到类似效果。所以本发明可用作治疗脑、心、肾等重要器官缺血 再灌注损伤的药物。
ii
权利要求
1.一种含氢注射液，其特征在于常温常压下所含氢气的体积百分比浓度为0.8～2.4％，所说的注射液选自生理盐水、葡萄糖生理盐水、碳酸氢钠或其他医用注射液。
2. 按权利要求1所述的含氢注射液，其特征在于常温常压下所 含氢气的体积百分比浓度为1.6~2.1%。
3. 按权利要求1或2所说的含氢注射液，其特征在于所说的注 射液为生理盐水。
4. 权利要求1或2所述含氢注射液的制备方法，步骤如下 (O脱气处理将医用注射液软包装，以0.4~0.8 ATA减压处理2~24小时，再在常温常压下放置，使气体充分析出，将析出的气体 抽除；(2) 低温预处理将脱气处理后的注射液软包装置于2 10'C充 分冷却；(3) 注入纯氢气从低温处理后的注射液软包装中抽出占总体 积5 15%的注射液，常压下注入纯氢气使软包装充盈；(4) 加压助溶将注入氢气后的注射液软包装在低温下持续加 压12~24小时，使氢气充分溶入注射液即可。
5. 权利要求1或2所述含氢注射液用作治疗缺血再灌注损伤药 物的用途。
6. 权利要求3所述含氢注射液用作治疗缺血再灌注损伤药物的 用途。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一种可用于治疗脑、心、肾等组织器官缺血再灌注损伤的注射液。制备方法为将医用注射液软包装袋置于低压下脱气处理，抽除气体后进行低温预处理，再注入氢气进行加压助溶，使氢气溶于注射液，在常压下置4℃左右保存备用。稳定24小时后就可使用。动物实验表明，本发明注射液可减少大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑梗死体积、减少神经细胞损伤、减少细胞凋亡数量、降低大脑皮层和海马中的凋亡酶的活性；还可减少心、肾缺血再灌注后损伤程度，保护心、肾缺血再灌注后心、肾功能。所以本发明含氢注射液可用作治疗脑、心、肾等重要器官缺血再灌注损伤的药物。
文档编号A61K33/00GK101347451SQ20081003942
公开日2009年1月21日 申请日期2008年6月24日 优先权日2008年6月24日
发明者刘文武, 孙学军, 康志敏, 合 张, 徐伟刚, 丁 茆, 蔡建美, 陶恒沂 申请人:中国人民解放军第二军医大学