一种γ-聚谷氨酸-氧钒复合物及其制备和应用的制作方法

专利名称：：一种γ-聚谷氨酸-氧钒复合物及其制备和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种Y-聚谷氨酸一氧钒复合物及其制备和应用，确切说，涉及一种VO-Y-PGA复合物及其制备和应用，属有机钒化合物及其制备和应用的
技术领域：
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背景技术：
：糖尿病系一组由于胰岛素分泌缺陷及其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。它能引起一系列严重的并发症而导致各种脏器的长期损害、功能不全和衰竭，是世界范围的常见病和多发病。在过去的20年中，世界范围内糖尿病患者数量呈爆炸性增长，几乎翻了3倍。目前全世界糖尿病患者总数近2亿，估计到2010年将上升到2.2亿，2025年将超过3亿。随着经济的发展和人们生活方式的变化，目前我国糖尿病的患病率和病死率也在呈快速上升趋势，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的严重危害人民健康的第三大非传染性疾病。糖尿病患者在最近25年内增加了近5倍。目前我国糖尿病患者人数为4000多万，仅次于印度居世界第二位，预计每年发病增长率超过6%,因此，高效价廉的抗糖尿病药物的市场潜力巨大。钒是人体必需的微量元素，在葡萄糖的代谢过程中起重要作用。早在1899年法国科学家Lynnet就发现钒可以降低尿糖。上世纪80年代，人们就发现了钒的类胰岛素作用及抗糖尿病作用，并对硫酸氧钒(VOS04)等无机物的降血糖活性作了系统的研究。结果表明这种化合物能降低血糖的水平。但无机钒化合物的脂溶性小、生物利用度低、活性不高、所需剂量大，并常伴有胃肠道不适、恶心、呕吐、腹泻等副作用。为了减少副作用和促进钒化合物的吸收，钒的有机配合物受到广泛关注，它已经成为国内外科研工作者的研究热点。国内外一系列研究结果表明，有机钒化合物的降血糖作用一般高于无机钒化合物，脂溶性高，细胞渗透力强，且无明显的消化道副作用。而他们选择的配体主要包括生物小分子氨基酸及其衍生物；低毒的有机羧酸类以及含杂原子三角架型有机化合物。但这些配体分子量都较小，进入体内起不到缓释效果、生物利用度低、活性不高。此外，有机羧酸类还有一定的毒性。本发明要解决的第一个技术问题是提出一种VO-Y-PGA复合物，其特征在于，该复合物由Y-PGA与VOS04通过前者上的羧基与后者上的VC^+形成的配位键连接而成，其分子结构通式和结构式分别为(V02+)m-(Y-PGA)，其中，m是介于2500~6000的正整数，和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>该复合物的优点是生物利用度高、活性强、毒副作用小。本发明要解决的第二个技术问题是提供VO-"PGA复合物的制备方法。本发明解决上述技术问题的方案是利用市售的菌种进行Y-PGA的发酵并对其进行分离纯化，将y-PGA与VOS04进行修饰反应，得到VO-Y-PGA复合物粗品，再经离心、真空干燥得到VO-Y-PGA复合物。现详细说明本发明的技术方案。该复合物的制备方法，其特征在于，具体操作步骤第一步Y-PGA-Na的制备将购于中国微生物菌种保藏中心的及SwZ^7^;活化后按3%~7%的接种量接入LB液体培养基，每升LB液体培养基中加入麦芽糖
发明内容其分子量介于1000kD2000kD。30g70g，酵母膏5g15g，谷氨酸钠10g50g，NaCl5g15g,KH2P04lg9g，MgS04.7H200.1g0.9g，培养基的pH值为5.0~7.0，20°C~50。C下摇瓶发酵24h72h，得发酵液，发酵液加蒸馏水稀释1~7倍，8000r/min~15000r/min离心10min20min去菌体，将无水乙醇加入上清液中，上清液与无水乙醇的体积比为1:1~5，搅拌得沉淀，真空干燥，得Y-PGA-Na粗品，该粗品溶于蒸馏水，浓度为0.5%~1.5%，以蒸馏水为透析液透析，过滤，得滤液，滤液冷冻干燥，得Y-PGA-Na，其分子量介于1000kD2000kD，每升培养基制得y-PGA-Na20.0g~30.26g;第二步VO-y-PGA复合物的制备将1.5g15g第一步制备的y-PGA-Na溶于450ml蒸馏水，搅拌至完全溶解，得Y-PGA-Na溶液，2.62gVOS04溶于200ml蒸馏水，搅拌至完全溶解，得VOS04溶液，搅拌下将vos04溶液加入Y-PGA-Na溶液，"PGA-Na溶液的-COOH与VOS04溶液的V()2+的摩尔比为卜10:1，30。C70。C下，搅拌反应0.5h5h，20。C30。C下，10000r/min~15000r/min离心20min40min，弃上清液，沉淀溶于5~20倍体积的蒸馏水，2(TC30。C下，10000r/min~15000r/min离心20min~40min，弃上清液，得到VO-y-PGA复合物粗品，蒸馏水洗沉淀1次~5次，过滤，弃滤液，真空干燥，得1.42g14.2g的VO-"PGA复合物。本发明要解决的第三个技术问题是提供一种用VO-Y-PGA复合物降低I型糖尿病小鼠的血糖的方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下的技术方案。一种用VO-y-PGA复合物降低I型糖尿病小鼠的血糖的方法，其特征在于，将浓度为20mmol/mL的VO-^PGA复合物溶于0.1%的琼脂糖溶液以灌胃方式给I型糖尿病小鼠口服，剂量介于O.lmmolV/kg/day~0.4mmolV/kg/day。本发明的优点是以"PGA为载体，其分子量大，能起到缓释所载药物的作用，生物相容性好，无毒。将其与VOS04结合生成较稳定的VO-y-PGA复合物。该复合物进入体内后将缓慢释放出药物，载体y-PGA则可被溶酶体降解为内源性谷氨酸，降解产物没有毒性。VO-Y-PGA复合物的生物利用度比游离vos04要高，所需剂量小，毒性副作用较低，载体Y-PGA由微生物发酵制备获得，结构均一，分子量较大，成本低廉。图1为显示本发明的VO-y-PGA复合物对I型糖尿病小鼠血糖的影响的图线。图2为显示本发明的VO-y-PGA复合物对I型糖尿病小鼠饮水的影响的图线。图3为显示本发明的VO-Y-PGA复合物对I型糖尿病小鼠口服糖耐量的影响的图线。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1~6完全按照以上的制备方法或应用方法的具体操作步骤进行操作，它们的每一个步骤仅罗列关键的技术数据。实施例1Y-聚谷氨酸一氧钒复合物的制备之一第一步中，及St/6他邱的接种量为3%，每升LB液体培养基中加入麦芽糖30g，酵母膏5g，谷氨酸钠10g,NaCl5g,KH2P04lg，MgS04'7H20O.lg，培养基的pH值为5.0，20°C下摇瓶发酵24h，发酵液加蒸馏水稀释l倍，8000r/min离心10min，上清液与无水乙醇的体积比为l:l，Y-PGA-Na粗品水溶液的浓度为0.5%,每升培养基制得Y-PGA-Na20.0g;第二步中，第一步制备的^PGA-Na和VOS04的用量分别为1.5g和2.62g，Y-PGA誦Na溶液的國COOH与vos04溶液的VC)2+的摩尔比为1:1，30。C下，搅拌反应0.5h，2(TC下，10000r/min离心20min，沉淀溶于5倍体积的蒸馏水，20'C下，10000r/min离心20min，得到VO-y-PGA复合物粗品，蒸馏水洗沉淀1次，得1.42g的VO-y-PGA复合物。实施例2"聚谷氨酸一氧钒复合物的制备之二第一步中，5.Sw&^s.印的接种量为5%，每升LB液体培养基中加入麦芽糖50g，酵母膏10g，谷氨酸钠30g，NaCl10g，KH2P045g，MgS(V7H200.5g，培养基的pH值为6.0,35°C下摇瓶发酵48h，发酵液加蒸馏水稀释4倍，11500r/min离心15min，上清液与无水乙醇的体积比为1:3，"PGA-Na粗品水溶液的浓度为1.0%，每升培养基制得Y-PGA-Na25.12g;第二步中，第一步制备的Y-PGA-Na和VOS04的用量分别为8.5g和2.62g，y-PGA-Na溶液的-COOH与VOS04溶液的VO"的摩尔比为5:1，5(TC下，搅拌反应2.5h，25'C下，12500r/min离心30min，沉淀溶于12.5倍体积的蒸馏水，25°〇下，12500r/min离心30min，蒸馏水洗沉淀3次，得7.7g的VO-y-PGA复合物。实施例3Y-聚谷氨酸一氧钒复合物的制备之三第一步中，ASMto7&w的接种量为7%，每升LB液体培养基中加入麦芽糖70g，酵母膏15g，谷氨酸钠50g，NaCl15g，KH2P049g，MgS04'7H200.9g，培养基的pH值为7.0，50°C下摇瓶发酵72h，发酵液加蒸馏水稀释7倍，15000r/min离心20min,上清液与无水乙醇的体积比为1:5，Y-PGA-Na粗品水溶液的浓度为1.5%，每升培养基制得y-PGA-Na30.26g;第二步中，第一步制备的^PGA-Na禾nVOS04的用量分别为15g和2.62g，Y-PGA-Na溶液的-COOH与VOS04溶液的VO"的摩尔比为10:1,70'C下，搅拌反应5h，3(TC下，15000r/min离心40min，沉淀溶于20倍体积的蒸馏水，3(TC下，15000r/min离心40min，蒸馏水洗沉淀5次，得14.2g的VO-^PGA复合物。实施例4用VO-Y-PGA复合物降低I型糖尿病小鼠的血糖之一剂量为O.lmmolV/kg/day。实施例5用VO-Y-PGA复合物降低I型糖尿病小鼠的血糖之二剂量为0.25mmo1V/kg/day。实施例6用VO-y-PGA复合物降低I型糖尿病小鼠的血糖之三剂量为0.4mmolV/kg/day。实施例7VO-y-PGA复合物对I型糖尿病小鼠血糖、饮水的影响采用雄性健康昆明鼠，注射200mg/kg四氧嘧啶建立糖尿病模型，7天后禁食4h，血糖〉llmmol/L者，确认为成模鼠。选取32只体重为30g左右的按上述方法制成的I型DM小鼠，禁食4h测血糖综合考察初始血糖和体重平均分成3组，分别设为生理盐水对照组、VOS04组、禾卩VO-y-PGA组。给药小鼠灌胃剂量为0.2mmo1V/kg/day，生理盐水对照组灌服相应体积生理盐水。给药2周，停药检测1周。每天记录饮水情况，隔天禁食3h测血糖。实验数据表明在同等剂量情况下，VO-"PGA要比vos04降血糖能力强。给药组动物饮水量明显低于对照组。见图1和图2。实施例8VO-y-PGA复合物对I型糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影响选取32只体重为30g左右的按实施例3方法制成的I型糖尿病小鼠，禁食4h测血糖综合考察初始血糖和体重平均分成3组，分别设为生理盐水对照组、VOS04组禾nVO-Y-PGA组。给药小鼠灌胃剂量为0.2mmo1V/kg/day，生理盐水对照组灌服相应体积生理盐水。给药2周，停止给药当晚禁食过夜(12h)，按lg/kg体重灌服50%葡萄糖溶液，用血糖仪测定0min、45min、1.5h、3h、4h、6h和8h的血糖值。实验数据表明给药后糖尿病鼠口服糖耐量明显提高。见图3。实施例9不同剂量的VO-Y-PGA复合物对I型糖尿病小鼠一些血清生化指标的影响。选取40只体重为30g左右的按实施例5所述方法制成的I型糖尿病小鼠，禁食4h测血糖，综合考察初始血糖和体重平均分成5组，分别设为生理盐水对照组、0.2mmolV/kg/dayVOS04组、O.lmmolV/kg/dayVO-y-PGA组(低剂量组)、0.2mmolV/kg/dayVO^-PGA组(中剂量组)禾b0.4mmolV/kg/dayVO-y-PGA组(高剂量组)。灌胃给药4周，停止给药当晚禁食过夜，次日眼眶取血，离心取血清，利用全自动生化分析仪检测血清游离脂肪酸(FFA)、总甘油三脂(TG)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、血清尿素氮(BUN)。实验数据表明高剂量药物可明显降低I型糖尿病小鼠的FFA、TG、GPT、GOT、BUN水平。见表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>a表明与Control组相比P<0.05，b表明与Control组相比P〈0.01。权利要求1、一种VO-γ-PGA复合物，其特征在于，该复合物由γ-PGA与VOSO4通过前者上的羧基与后者上的VO2+形成的配位键连接而成，其分子结构通式和结构式分别为(VO2+)m-(γ-PGA)，其中，m是介于2500～6000的正整数，和id="icf0001"file="A2008100393250002C1.tif"wi="72"he="64"top="62"left="24"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>其分子量介于1000kD～2000kD。2、权利要求l所述的VO-Y-PGA复合物的制备方法，其特征在于，具体操作步骤第一步Y-PGA-Na的制备将购于中国微生物菌种保藏中心的及^W/k^活化后按3%~7%的接种量接入LB液体培养基，每升LB液体培养基中加入麦芽糖30g70g，酵母膏5g15g，谷氨酸钠0g50g，NaCl5g15g，KH2P04lg9g，MgS04.7H200.1g0.9g，培养基的pH值为5.0~7.0，20°C50'C下摇瓶发酵24h72h，得发酵液，发酵液加蒸馏水稀释1~7倍，8000r/min~15000r/min离心1020min去菌体，将无水乙醇加入上清液中，上清液与无水乙醇的体积比为1:1~5，搅拌得沉淀，真空干燥，得Y-PGA-Na粗品，该粗品溶于蒸馏水，浓度为0.5%~1.5%，以蒸馏水为透析液透析，过滤，得滤液，滤液冷冻干燥，得Y-PGA-Na，其分子量介于1000kD2000kD，每升培养基制得y-PGA-Na20.0g~30.26g;第二步VO-y-PGA复合物的制备将1.5g15g第一步制备的Y-PGA-Na溶于450ml蒸馏水，搅拌至完全溶解，得y-PGA-Na溶液，2.62gVOS04溶于200ml蒸馏水，,其分子量介于1000kD2000kD。搅拌至完全溶解，得VOS04溶液，搅拌下将VOS04溶液加入Y-PGA-Na溶液，Y-PGA-Na溶液的-COOH与vos04溶液的VC)2+的摩尔比为1~10:1，30。C7(TC下，搅拌反应0.5h5h，20。C3(TC下，10000r/min~15000i7min离心20min40min，弃上清液，沉淀溶于5~20倍体积的蒸馏水，2(TC3(TC下，10000r/min~15000r/min离心20min40min，弃上清液，得到VO-y-PGA复合物粗品，蒸馏水洗沉淀1次~5次，过滤，弃滤液，真空干燥，得1.42g14.2g的VO-"PGA复合物。3、用权利要求1所述的VO-Y-PGA复合物降低I型糖尿病小鼠的血糖的方法，其特征在于，将浓度为20mmol/mL的VO^-PGA复合物溶于0.1%的琼脂糖溶液以灌胃方式给I型糖尿病小鼠口服，剂量介于O.lmmolV/kg/day0.4mmo1V/kg/day。全文摘要一种γ-聚谷氨酸-氧钒复合物及其制备和应用，属有机钒化合物及其制备和应用的
技术领域：
。该复合物由γ-PGA与VOSO₄通过前者上的羧基与后者上的VO²⁺形成的配位键连接而成，其分子结构通式为(VO²⁺)_m-(γ-PGA)，其中，m是介于2500～6000的正整数。利用市售的菌种进行γ-PGA的发酵并对其进行分离纯化，将γ-PGA与VOSO₄进行修饰反应，得到VO-γ-PGA复合物粗品，再经离心、真空干燥得到VO-γ-PGA复合物。本发明的优点是以γ-PGA为载体，其分子量大，能起到缓释所载药物的作用，生物相容性好，无毒。载体γ-PGA由微生物发酵制备获得，结构均一，分子量较大，成本低廉。文档编号A61K47/48GK101293101SQ20081003932公开日2008年10月29日申请日期2008年6月20日优先权日2008年6月20日发明者坚刘,雯刘,吴叶林,吴自荣,昭孙,李文娟,胡荣章,静黄申请人:华东师范大学