miR-451在制备治疗非小细胞肺癌药物的应用的制作方法

专利名称：：miR-451在制备治疗非小细胞肺癌药物的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程领域，特别涉及miR-451在制备治疗非小细胞肺癌药物的应用。
背景技术：
：RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。但长久以来，RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，它从DNA那儿获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。然而，一系列的研究表明，这些小分子RNA事实上操纵着许多细胞功能，它可通过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。最近发现的一类非蛋白编码的RNA家族，microRNA(miRNA,即微小RNA)，可以通过与特定mRNA结合或调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因表达。目前人类基因组中已确认的miRNA有一千多种，可能参与调控人类30%蛋白编码基因的表达。MicroRNA简称为miRNA，通常长度为1925个核苷酸，广泛存在于各种动植物甚至单细胞真核生物中，是一类在进化上高度保守的小分子单链RNA。miRNA位于基因内含子区域，在细胞核内编码miRNA的基因转录成pri-microRNA(pri-miRNA)。Pri-miRNA在一种DroshaRNase的作用下，剪切为约70个核苷酸长度，具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNA)。pre-miRNA在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin5的作用下，从核内运输到胞质中。在Dicer酶的作用下，pre-miRNA被剪切成2125个核苷酸长度的双链miRNA:miRNA*。随后双链miRNA:miRNA*解旋，成熟的miRNA进入到胞浆RISC(RNA诱导的沉默复合物)中发挥基因沉默功能。miRNA与下游特定基因的信使RNA(mRNA)的3’端非编码区(3’UTR)产生碱基互补配对，引起该mRNA的降解或抑制其翻译，导致蛋白表达失败。我们将这些下游的基因称作miRNA的靶基因，他们在细胞中通常具有重要的生物学功能，miRNA通过调节靶基因的表达在细胞中行使重要的功能，与胚胎的发育，生长发育、细胞的增殖、分化密切相关。科学家已证实，miRNA的核苷酸序列在不同物种间高度保守，突变率极低，其表达有基因簇集现象，时空及组织特异性。miRNA在转录后水平调控蛋白质基因的表达谱来决定细胞分化、胚胎发育等一系列重要生命活动的进程及多样性。据发现，miRNA不仅是细胞增殖、分化和凋亡的重要调控因子，50%以上的miRNA定位在肿瘤相关基因组区域，包括L0H区、染色体扩增区及脆性位点等。经鉴定，miRNA在多种血液系统肿瘤和实体瘤中的表达谱发生改变，这为我们从RNA调控的角度揭示肿瘤发生机制提供理论基础，并为肿瘤诊断和治疗提供新的基因靶点和分子标记。在人类基因组序列中，miR-451为一种MicroRNA，位于17qll.2，大鼠和斑马鱼基因组中，分别位于11号和5号染色体。miR-451的序列为5’-aaaccguuaccauuacugaguu-3’(GeneBank:GeneID=574411)。miR-451在进化上高度保守，不同物种间存在同源性。根据世界卫生组织(WHO)公布的资料显示，肺癌的发病率和死亡率在世界各国均呈明显上升的趋势，尤其是工业发达的国家。在发达国家，肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，列男性常见恶性肿瘤的第一位，列女性常见恶性肿瘤的第2、3位。20世纪末肺癌已占恶性肿瘤死亡的首位。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%，可分为鳞癌、腺癌、大细胞肺癌等。许多肺癌患者在诊断时已发生转移，往往失去手术机会，而针对肺癌的化疗方案效果亦欠佳，患者容易产生耐药，五年生存率低于5%，亟需寻找新的、有效的治疗肺癌的方法。随着基因工程研究的深入，科学家对运用基因工程研制肿瘤药表现出浓厚的兴趣。发明人发现miR-451在治疗非小细胞肺癌方面具有很好应用前景。
发明内容技术目的本发明的目的是提供miR-451在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。本发明的目的是通过下列步骤来实现的1、扩增Pre-miR-451:Pre_miR-451，即编码miR-451前体pre-miR-451的基因序列，其RT及PCR引物由invitrogen公司合成，引物序列见具体实施例中RT-PCR。RT-PCR扩增Pre-miR-451，纯化产物经琼脂糖凝胶电泳显示，约72bp处扩增出一条与预期大小相一致的条带。2、连接pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体(购自上海吉玛公司，载体见图1，其中EmGFP为绿色荧光蛋白报告基因，用以检测转染效率)，经BamHI和XhoI酶切后得到线性载体，将PCR产物连接至载体上构成pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451重组体。10ul连接体系2ulPCR产物，lul线性载体，lul10*T4ligasebuffer,1u1T4DNAligase，5ulddH20。3、转化A、制备新鲜大肠杆菌感受态细胞(JM109)，混勻感受态细胞。B、取20ul感受态细胞于新的离心管中，加入lul连接体系，静置30min冰浴。C、感受态细胞于42°C加热42秒，取出后迅速4°C冰水中放置2min。D、加入400ul空白LB培养液，37°C振摇，恒温培养30min，重悬后用消毒玻棒涂于琼脂板上，待板干燥后，倒置平皿，37°C孵育1216h。4、扩增根据该质粒载体上携带杀稻瘟菌素抗性的特性，挑选阳性克隆于5mlLB培养液中37°C恒温振摇1216h，大量扩增pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451重组体。重组体提取、纯化参照BI0MIGA无内毒质粒小提试剂盒(PD1214)说明书。5、载体pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451经BamHI和XhoI酶切得到两个片段，分别为72bp的Pre-miR-451片段和5.7kb的线性pcDNA6.2-GW载体，结果与预期结果相符，pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451测序结果与GenBank中序列完全一致。6、测序正确的重组体转染肿瘤细胞使用脂质体法，转染步骤参照LipofectamineTiGOOO说明书。转染成功的细胞有绿色荧光蛋白表达，转染效率用流式细胞仪分析，不同的细胞系转染效率均可达到60%。7、Pre-miR-451随质粒转染入肿瘤细胞后，CMV启动子在肿瘤细胞中快速、高效、持续表达Pre-miR-451，经过Drosha(RNaselll)作用形成具有茎环结构的pre_miR-451(约72nt)，再经过Dicer作用形成成熟的miR-451(22nt)，发挥基因沉默功能。一、miR-451抗非小细胞肺癌的基础验证试验(一):miR-451在非小细胞肺癌组织与癌旁正常组织中的表达谱1.样本准备收集60例非小细胞肺癌(NSCLC)手术切除标本，经临床病理分析均属于Illb和IV期，标本由南京医科大学第二附属医院病理科提供。2.芯片制备及分析按照美国的LCSciences公司的要求准备肺癌组织标本，交由LCSciences公司进行芯片制备，SangermiRBaseV10.0版本完成芯片分析。3.芯片结果实验数据来自LCSciences公司，结果如图2及表格1所示。4.结果分析miR-451在正常组织(SampleA)中信号为26，894.73，在肿瘤组织(SampleB)中信号为157.30，log2(SampleB/SampleA)为_7.41，表示miR-451在正常组织中高表达，在肿瘤组织中显著低表达，二者差异达150倍，提示miR-451在肺癌中可能作为一个抑癌基因发挥重要的抗肿瘤作用。表1显著性差异列表(p值<0.01的显著性差异表达转录子，其中hsa为检测人标本的探针)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(二)RT_PCR分析miR-451在非小细胞肺癌组织与癌旁正常组织中的表达谱1.方法Trizol试剂提取组织总RNA，RT-PCR运用Ambion公司SuperTaq聚合酶系统和mirVana检测盒，人TO作为内参。2.RT-PCR结果如图3所示。3.结果分析miR-451在正常组织中表达量增高，肿瘤组织中表达下降，与基因芯片结果一致。二、miR-451对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、迁移、耐药的影响(一)细胞增殖实验1.MTT法测细胞增殖选择四株NSCLC细胞系，其中肺腺癌细胞系A549，H3255，肺鳞癌细胞系H157，肺大细胞癌细胞系H1299，四株细胞系转染Pre-miR-451为实验组，空载体序列(negativecontrol,NC)设为对照组。将这些细胞株种在96孔板上，2500个细胞/孔。转染3天后MTT染色法监测细胞增殖情况。2.结果测定如图4所示。3.结果分析MTT法显示，与对照组相比，转染了Pre-miR-451的A549细胞增殖数明显减少。H157，H1299，H3255三个细胞系中也观察到此现象，提示miR-451可以抑制肿瘤细胞的生长。实验二细胞凋亡实验1.Caspase3/7活性法测细胞凋亡在NSCLC细胞系A549,HI57，HI299，H3255中分别转染Pre-miR-451和空载体序列，后者设为对照组。转染72h后将这些细胞株分放于OilMDDP(顺钼，化疗药)和2iiMDDP的培养基中培养，运用ApoONEHomogeneousCaspase3/7Assay测定细胞中caspase3/7活性。2.caspase3/7活性测定如图5所示。3.结果分析与对照组相比，转染Pre-miR-451后，四个细胞系中均出现caspase3/7活性上升，提示miR-451可促进肿瘤细胞的凋亡。尽管单用Pre-miR-451引起的caSpaSe3/7活性增加没有单用DDP效果明显，但联合使用DDP和Pre-miR-451后，caspase3/7活性显著上升，高于单用Pre-miR-451和DDP提示miR-451能够增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性，可作为肿瘤治疗的干预靶点。实验三细胞侵袭实验1.Transwell迁移实验A549细胞系分别转染Pre-miR-451和空载体序列，后者设为对照，接种到Transwell上室中，选择接种后24h，48h，72h时间点观察A549细胞侵袭情况。2.细胞计数用直接计数法测定Transwell下室中肿瘤细胞的数目。实验组明显低于对照组。计数结果如图6所示。3.结果分析与对照组相比，转染Pre-miR-451后A549细胞的侵袭能力下降，miR-451可以抑制肿瘤细胞的侵袭，转移。实验四活体水平观察miR-451的抗癌作用(一)、皮下瘤实验1.活体模型我们选取四只5-6周龄大小的雌性裸鼠，将转染了Pre-miR-451和空载体(NC)的A549细胞分别接种到同一只小鼠两侧肋背部的皮下组织中，每侧接种细胞数为1*105或5*104个，观察肿瘤细胞的生长情况。2.肿瘤生长情况评估每天观察一次，持续至少五周。测量肿瘤灶的长度L和宽度W，按照公式(L*W~2)*0.5计算肿瘤灶的体积来判断miR-451在活体水平对肿瘤细胞生长的影响。3.测量结果到观察结束为止，4只小鼠转染了Pre-miR-451的一侧未见明显肿瘤灶的形成，而4只小鼠中有3只在观察的22-27天时，接种NC—侧可触摸到肿瘤灶的形成，观察结束时，这些肿瘤灶体积为35-145cm2大小。肿瘤体积如图7所示。4.结果分析从活体实验结果可以看出，miR-451在小鼠体内可抑制肺癌细胞生长，与我们之前在细胞系水平得到的结果一致，证实了miR-451具有抑癌作用。(二)肺原位癌实验1、肺癌模型的建立的材料4只Lox-stop-loxK-RasG12D(LSLK-RasG12D)转基因小鼠由人类癌症协会小鼠模型库(MouseModelsofHumanCancerConsortium,MMHCC)馈赠，HEK293(AmericanTypeCultureCollection,cat#CRL.1573)腺病毒的包装细胞由第三军医大学生物化学与分子生物学教研室馈赠，ADCre,AdPre-miR-451重组腺病毒由Microbix公司提供。Ad腺病毒载体上带有0半乳糖苷酶操纵子，用以检测转染效率。利用Cre重组酶在转基因小鼠体内诱导K-Ras基因表达，促进肺部肿瘤发生的原理建立肺腺癌的模型°参照文献⑴Thelet_7microRNAreducestumorgrowthinmousemodelsoflungcancer.CellCycle7:6，759-764.2008(2)小鼠肺腺癌动物模型的建立。山西医科大学学报。1007-6611(2009)05-0408-03。2、建模步骤及miR-451的干预以戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射麻醉3周龄小鼠，再以Ad腺病毒CaPi(Ad腺病毒CaPi:滴度为2.5X10，pfu的Ad腺病毒50ul加入到69ul的MEM中，再加入6ul的2.5mol/L的氯化钙)的共沉淀物滴入小鼠的鼻腔，共滴入约125ul，分2次滴人，隔5天后重复，共两次。实验组AdCre+AdPre-miR-451，n=2，对照组AdCre+AdNC,n=2。3、结果测定鼻腔滴注7周后处死小鼠，取小鼠肺部组织称重，石蜡包埋，切片，HE染色。实验组(Cre/Pre-miR-451)较对照组(Cre/NC)相比肿瘤体积显著缩小，肺肿瘤全肺组织比值如图8所示。4、结果分析该实验运用转基因小鼠LSLK-RasG12D建立肺腺癌模型，再次证明，miR-451可抑制肺腺癌的发生，抑制肿瘤细胞的生长。所述miR-451的表达载体，这些表达载体包括但不限于质粒、细菌、宿主细胞。含有治疗有效量的所述miR-451或其表达载体和药学上允许的辅料组成的药物组合物。所述的药物组合物，其制剂采用药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、口服液或脂质体。上述miR-451序列或它们的表达载体在制备肿瘤靶向药物中的应用。本发明中的统计学分析采用SPSS11.0软件(Release11.0，SPSSInc.)进行数据处理，数据表示以均值士标准差。进行方差分析和t检验，结果以P<0.05为差异有显著性意义有益效果1、目前较为常用的制备miRNAs的方法，有体外制备miRNAs和以DNA为模板转染到细胞并在体内转录得到miRNAs。本发明采用了后一种方法，本法简便，已有大量文献报道可成功制备miRNAs，不需要直接操作RNA，克服了人工合成miRNA容易降解，成本昂贵的缺点。而且由于含表达载体的菌株可长期保存并大量扩增，为今后的研究提供了极大的方便。2、由于miR-451在体内一般以前体形式(pre_miR-451)存在，并且Pri_miR-451在一种DroshaRNase的作用下，剪切为约72个核苷酸长度，具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNA)。pre-miR-451在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin5的作用下，从核内运输到胞质中。在Dicer酶的作用下，pre-miR-451被剪切成22个核苷酸长度的双链miRNA:miRNA*o随后双链miRNA:miRNA*解旋，成熟的miR-451进入到胞浆RISC(RNA诱导的沉默复合物)中发挥基因沉默功能。由于Pre-miR-451在体内可以成功地加工成为成熟体miR-451，本发明也采用Pre-miR-451代替miR-451。试验中通过重组体转染大肠杆菌JM109细胞获得大量的Pre-miR-451，为进行相应的药理试验做好准备。同时为了避免载体对本实验影响，采用空载体做对照试验，结果表明空载体对本发明没有影响。3、通过miR-451对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、迁移、耐药的影响，说miR-451对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、耐药皆有抑制作用，且促进非小细胞肺癌细胞的凋亡，同时活体水平也表明miR-451具有抗癌作用。图1为表达miR-451的质粒载体。图2为基因芯片分析肺癌组织与癌旁正常组织中miRNA表达谱的情况(左边的SampleA是癌旁正常组织，信号值为Cy3；中间的SampleB是肺癌组织，信号值为Cy5，右边的是癌旁/癌的信号比值Cy3/Cy5；在Cy3/Cy5信号比值图中，当Cy3信号高于Cy5信号时，色彩显示为绿色；当Cy3信号与Cy5信号相当时，色彩显示为黄色；当Cy5信号高于Cy3信号时，色彩显示为红色)。图3RT-PCR测肺癌组织⑴与癌旁正常组织(N)中miR-451水平，GAPDH设为内参。图4为MTT法测miR-451对肺癌细胞系A549，H1299，H3255，H157细胞增殖的作用。图5为miR-451前体对肺癌细胞系A549，H1299，H3255，H157凋亡的检测图6为Transwell法测miR-451前体对肺癌细胞系A549细胞迁移的作用图7为活体实验测miR-451对A549细胞增殖的作用，纵坐标为皮下瘤体积，横坐标为小鼠代号图8为LSLK-RasG12D转基因小鼠模型上观察miR-451对肺腺癌生长的作用，其中纵坐标为肺肿瘤(Tumor)全肺组织(TotalLungArea)的比值；横坐标为转基因小鼠代号，#1，#2为实验组(Cre/Pre-miR-451)，#3，#4为对照组(Cre/NC)。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。一般性说明实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的8《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。本发明的材料本申请中提及的微生物、细胞系、质粒或其他表达载体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。实施例11、扩增Pre-miR-451:Pre_miR-451，其RT及PCR引物由invitrogen公司合成，引物序列见如下的RT-PCR。RT-PCR扩增Pre-miR-451，纯化产物经琼脂糖凝胶电泳显示，约72bp处扩增出一条与预期大小相一致的条带。RT-PCR分别设计miR-451和TO(作为内参)引物，由Invitrogen公司合成。1)引物序列及反应条件MiR-451的RT引物5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAACTCAG-3，GAPDH的RT引物为Oligo(dT)15表1.PCR引物序列及反应条件GenesymbolPrimersCDNATacyclesPre-miR-451Forv/ard:5'-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTAcr-yReverse:5'-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3'72bp60°C30GAPDHforword:5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3'lOlbp55°C35Reverse:5'-GG6TGGAATCATATTGGAACATGT-3'2)cDNA的合成5XRTBufferdNTPInhibitorPrimerRNARTaceH20(RNaseFree)4u12u11u11u1lU1(质量小于1Ug)1u110u1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>3)RT-PCR反应体系(50u1体系)以cDNA为模板，PCR反应体系10XExTaqBuffer(Mg2+Free)5u1MgC12(25mM)5u1dNTP(2.5mM)5u1上游引物(20pM/iil)2u1下游引物(20pM/iil)2u1Template2u1ExTaq(5U/u1)0.5u1ddH2028.5ill_总体积50ill采用以下反应条件94°C2min预变性，后接35个循环(18SRNA25个循环)，每一次循环的条件是94°C30s变性，54°C45s退火，72°C2分钟延伸。4)PCR产物的鉴定50\了六￡|￡存液配制扑1860.5g，冰醋酸14.3ml，0.5mol/LEDTA25ml，加ddH20至250ml。1.0%琼脂糖凝胶配制琼脂糖1.0g，1XTAE溶液100ml，加热至琼脂糖融解，冷却至50°C左右时加入溴乙锭至0.g/ml，铺板凝固后使用。琼脂糖凝胶电泳电泳槽中注入IXTAE溶液至高于凝胶面，取10illPCR产物，加1yl的10XDNA上样缓冲液，混勻上样，用DL2000DNAMarker作为参照，80V电泳，捷达凝胶成像系统观察并采集图象，实验重复三次。2、连接pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体购自上海吉玛公司，(载体见图1，其中EmGFP为绿色荧光蛋白报告基因，用以检测转染效率)，经BamHI和Xhol酶切后得到线性载体，将PCR产物连接至载体上构成pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451重组体。10ul连接体系2ulPCR产物，lul线性载体，lul10*T41igasebuffer,lulT4DNAligase，5ulddH20。3、转化1.制备新鲜大肠杆菌感受态(JM109)细胞，混勻感受态细胞2.取20ul感受态细胞于新的离心管中，加入lul连接体系，静置30min冰浴。3.于42°C加热42秒，取出后迅速4°C冰水中放置2min。4.加入400ul空白LB培养液，37°C振摇，恒温培养30min，重悬后用消毒玻棒涂于琼脂板上，待板干燥后，倒置平皿，37°C孵育1216h。4、扩增根据该质粒载体上携带杀稻瘟菌素抗性的特性，挑选阳性克隆于5mlLB培养液中37°C恒温振摇1216h，大量扩增pcDNATM6.2-Gff-Pre-miR-451重组体。重组体提取、纯化参照BI0MIGA无内毒质粒小提试剂盒(PD1214)说明书。5、真核表达载体pcDNATM6.2-Gff-Pre-miR-451经BamHI和XhoI酶切得到两个片段，分别为72bp的Pre-miR-451片段和5.7kb的线性pcDNA6.2-GW载体，结果与预期结果相符，pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451测序结果与GenBank中序列完全一致。6、测序正确的重组体转染肿瘤细胞使用脂质体法，转染步骤参照LipofectamineTiGOOO说明书。转染成功的细胞有绿色荧光蛋白表达，转染效率用流式细胞仪分析，不同的细胞系转染效率均可达到60%。实施例2MTT法测细胞增殖1)接种细胞用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMIt604培养液配成单个细胞悬液，以每孔100-1000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。分成四个实验组空载体组、Pre-miR-451组，DDP组，Pre-miR-451+DDP组。2)培养细胞；将培养板移入COz孵箱中，在37°C、5%C02及湿度条件下，培养3_5天。3)呈色培养第2-5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37°C，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。加入150illDMS0(二甲基亚砜)振荡lOmin，使结晶物充分溶解。4)比色490nm波长处测定光密度值(0D)，每组3个复孔，重复三次实验。以空载体感染对照组作为对照，计算生存率。生存率=实验组0D值/对照组0D值X100%。按如上方法选择四株非小细胞肺癌细胞(NSCLC系，其中肺腺癌细胞系A549，H3255，肺鳞癌细胞系H157，肺大细胞癌细胞系H1299，四株细胞系转染miR-451前体序列(Pre-miR-451)，空载体序列(negativecontrol)设为对照组。将这些细胞株种在96孔板上，2500个细胞/孔。转染3天后MTT染色法监测细胞增殖情况。MTT法显示与对照组相比，转染了Pre-miR-451的A549细胞增殖数明显减少。H157，H1299，H3255三个细胞系中也观察到此现象，提示miR-451可以抑制肿瘤细胞的生长。实施例3细胞凋亡实验(蛋白免疫印迹法测定)1.提取细胞总蛋白2.SDS-PAGE电泳1)清洗、安装玻璃板，陶瓷片。2)配制灌注分离胶，37°C静置25min。11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3)配制灌注浓缩胶，室温静置20min。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4)加蛋白样品和分子量marker，每个时期蛋白上样量均为40yg。5)恒压电泳(浓缩胶80V，分离胶160V)。3.半干式转膜1)电泳结束后，戴手套，根据目的蛋白分子量范围参照分子量marker切胶(切角标记)，切相同大小硝酸纤维素膜(切角标记)一张和滤纸2张。2)转膜缓冲液中浸泡胶、膜和滤纸lOmin。3)在转膜仪上从下至上平铺滤纸，膜，凝胶，滤纸，赶除气泡，尤其注意膜和凝胶之间禁留气泡。擦干多余液体，0.8mAX膜面积(cm2)电流转膜1.5小时。4.免疫印迹1)转膜结束，检验marker是否已转至膜上(或丽春红染色)以判定转膜效果。TBST清洗膜后，5%脱脂奶粉(TBST配制)4°C封闭过夜。2)加一抗CaSpaSe-3/7(激活型)单克隆抗体(1500和1500)，室温摇动2h。3)TBST漂洗3次，每次lOmin。4)加二抗(1200)，室温摇动lh。5)TBST漂洗3次，每次lOmin。5.ECL检测1)AB液混合，待膜不滴水后，平铺其上。2)反应5min后，根据荧光强度暗室压片5s30min。3)显影1530s，水洗，定影13min。4)图片扫描和定量分析。按如上方法，在NSCLC细胞系A549，H157，H1299，H3255中分别转染Pre-miR-451和空载体序列，后者设为对照组。转染72h后将这些细胞株分放于OyMDDP(顺钼，化疗药)和2iiMDDP的培养基中培养，运用ApoONEHomogeneousCaspase3/7Assay测定细胞中caspase3/7活性。caspase3/7活性测定如图5所示。与对照组相比，转染Pre-miR-451后，四个细胞系中均出现caSpaSe3/7活性上升，提示miR-451可促进肿瘤细胞的凋亡。尽管单用Pre-miR-451引起的caSpaSe3/7活性增加没有单用DDP效果明显，但联合使用DDP和Pre-miR-451后，caspase3/7活性显著上升，提示miR-451能够增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性，可作为肿瘤治疗的干预靶点。实施例4Transwell(细胞侵袭实验)1.Transwell小室准备①包被基底膜用50mg/LMatrigel18稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4°C风干。②水化基底膜吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37°C，30min。2.制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12_24h，进一步去除血清的影响。②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10X105。3.接种细胞①取细胞悬液100-200u1加入Transwell小室，②24孔板下室一般加入500ill含FBS或趋化因子的培养基，③培养细胞常规培养12_48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。4.结果统计“贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里。通过给细胞染色，可在镜下计数细胞①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，有结晶紫染色。②细胞计数我们使用的是LeicaDC300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。“非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。按如上方法将A549细胞系分别转染Pre-miR-451或空载体序列，后者设为对照，接种到Transwell上室中，选择接种后24h，48h，72h时间点观察A549细胞侵袭情况。细胞计数用直接计数法测定Transwell下室中肿瘤细胞的数目。实验组明显低于对照组。计数结果如图6所示。与对照组相比，转染Pre-miR-451后A549细胞的侵袭能力下降，miR-451可以抑制肿瘤细胞的侵袭，转移。实施例5活体水平观察miR-451的抗癌作用皮下瘤实验1、活体模型我们选取四只5-6周龄大小的雌性裸鼠，将转染了miR-451和空载体(NC)的A549细胞分别接种到同一只小鼠两侧肋背部的皮下组织中，每侧接种细胞数为1*105或5*104个，观察肿瘤细胞的生长情况。2、肿瘤生长情况评估每天观察一次，持续至少五周。测量肿瘤灶的长度L和宽度W，按照公式(L*W~2)*0.5计算肿瘤灶的体积来判断miR-451在活体水平对肿瘤细胞生长的影响。3、测量结果到观察结束为止，转染了miR-451前体的一侧未见明显肿瘤灶的形成，而4只小鼠中有3只在观察的22-27天时，接种NC—侧可触摸到肿瘤灶的形成，观察结束时，这些肿瘤灶体积为35-145cm2大小。肿瘤体积如图7所示。4、结果分析从活体实验结果可以看出，miR-451在小鼠体内可抑制肺癌细胞生长，与我们之前在细胞系水平得到的结果一致，证实了miR-451具有抑癌作用。肺原位癌实验1、肺癌模型的建立的材料4只Lox-stop-loxK-RasG12D(LSLK-RasG12D)转基因小鼠由鼠由人类癌症协会小鼠模型库(MouseModelsofHumanCancerConsortium,MMHCC)馈赠，HEK293(AmericanTypeCultureCollection,cat#CRL.1573)腺病毒的包装细胞由第三军医大学生物化学与分子生物学教研室馈赠，ADCre,AdPre-miR-451重组腺病毒由Microbix公司提供。Ad腺病毒载体上带有3半乳糖苷酶操纵子，用以检测转染效率。利用Cre重组酶在转基因小鼠体内诱导K-Ras基因表达，促进肺部肿瘤发生的原理建立肺腺癌的模型°相关文献⑴Thelet_7microRNAreducestumorgrowthinmousemodelsoflungcancerCellCycle7:6，759-764.2008(2)小鼠肺腺癌动物模型的建立。山西医科大学学报。1007-6611(2009)05-0408-03。2、建模步骤及miR-451的干预以戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射麻醉3周龄小鼠，再以Ad腺病毒CaPi(Ad腺病毒CaPi:滴度为2.5X10，pfu的Ad腺病毒50ul加入到69ul的MEM中，再加入6ul的2.5mol/L的氯化钙)的共沉淀物滴入小鼠的鼻腔，共滴入约125ul，分2次滴人，隔5天后重复，共两次。实验组AdCre+AdPre-miR-451，n=2，对照组AdCre+AdNC,n=2。3、结果测定鼻腔滴注7周后处死小鼠，取小鼠肺部组织称重，石蜡包埋，切片，HE染色。实验组(Cre/Pre-miR-451)较对照组(Cre/NC)相比肿瘤体积显著缩小，肺肿瘤全肺组织比值如图8所示。4、结果分析该实验运用转基因小鼠LSLK-RasG12D建立肺腺癌模型，再次证明，miR-451可抑制肺腺癌的发生，抑制肿瘤细胞的生长。权利要求miR-451在制备治疗非小细胞肺癌药物的应用。全文摘要本发明属于基因工程领域，特别涉及miR-451在制备治疗非小细胞肺癌药物的应用；通过对Pre-miR-451的重组体对非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡、迁移、耐药的影响，说明miR-451对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、耐药皆有抑制作用，对非小细胞肺癌细胞凋亡具有促进作用，同时活体水平也表明miR-451具有良好抗癌作用。文档编号A61P11/00GK101804208SQ20101011455公开日2010年8月18日申请日期2010年2月26日优先权日2010年2月26日发明者德伟,杨劲松,潘旋,王朝霞,王锐,袁栎,边海波,陈龙邦申请人:南京医科大学;南京医科大学第二附属医院;中国人民解放军南京军区南京总医院