专利名称：：白藜芦醇在治疗肾脏病中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种蒽醌萜类化合物，特别涉及白藜芦醇在治疗肾脏病中的应用。肾脏病严重的危害人类的生命健康，每年有数千万的病人死于肾脏疾病，其中原发性肾病综合征是儿科常见的泌尿系统疾病，临床主要表现为蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和不同程度的水肿，每年因原发性肾病综合征而死亡的儿童呈上升趋势，国外报道16岁以下人群其发生率约为15.7/10万，我国部分省、市医院住院患儿据统计资料显示，肾病综合征约占泌尿内科疾病患儿的2131%，肾病综合征如不采取积极有效的治疗，患儿往往会死于感染等多种并发症。目前治疗原发性肾病综合征主要以肾上腺糖皮质激素为基础药物，且治疗周期长，长期使用该类药物会引起机体免疫功能的低下，从而影响疾病的治疗，且长期使用糖皮质激素药物会带来，如肥胖、生长抑制、高血压、糖尿病和骨质疏松等不良反应，微小病变型肾病是儿童肾病综合征最常见的病理类型，其病理改变主要以电镜下肾小球上皮细胞足突融合为特征；同时，肾小球肾炎也是肾脏疾病中危害人类生命健康的主要疾病，每年因肾小球肾炎疾病死亡的人数逐年升高，目前治疗肾小球肾炎主要以化学药为主，但长期使用化学药会产生多种不良反应，且有些药物通过肾脏排泄对肾脏产生严重的毒副作用。目前研究显示，白藜芦醇是一种蒽醌萜类化合物，主要来源于寥科植物虎杖的根茎提取物。研究表明白藜芦醇是一种良好的抗氧化剂，具有抗衰老作用，且文献报道白藜芦醇具有降低血液粘稠度、抗动脉粥样硬化、抑制血小板凝结、保持血液畅通作用，临床上用于治疗冠心病，缺血性心脏病和高血脂疾病，且研究显示白藜芦醇具有抗肿瘤作用，可用于治疗乳腺癌等疾病。发明目的本发明的目的是为了充分利用中药资源，在白藜芦醇原有功效的基础上，开发其新的临床用途，提供白藜芦醇在治疗肾脏疾病中的应用。技术方案为实现以上目的，本发明提供的白藜芦醇，其化学命名为(E)-5-[2-(4-羟苯基)-乙烯基]-1，3-苯二酚，是一种单体化合物，其结构式为通过病理实验模型研究表明，白藜芦醇具有很好的治疗肾脏疾病的作用，作为优
背景技术：
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发明内容选方案，白藜芦醇对原发性肾病综合症和系膜增生性肾小球肾炎具有很好的治疗作用，因此，白藜芦醇可用于制备治疗肾脏疾病的药物，特别是可用于制备治疗原发性肾病综合症和肾小球肾炎，作为更优方案可用于制备系膜增生性肾小球肾炎的药物。当然，含有本发明提供的不同浓度的白藜芦醇的植物提取物也可以用于制备治疗肾脏疾病的药物，特别是可用于制备治疗原发性肾病综合症和肾小球肾炎的药物。本发明提供的白藜芦醇做成治疗肾脏疾病的制剂时，可以将白藜芦醇和药学上可接受的载体制备成口服液、颗粒剂、胶囊剂、片剂、粉针剂或注射液剂型的药物。将本发明提供的白藜芦醇制成口服液时，将各原料的提取物加蒸馏水溶解，过滤，加入糖浆，调节PH，制成口服液。将本发明提供的白藜芦醇制成片剂时，把各原料和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。本发明提供的白藜芦醇制成胶囊剂时把各原料的提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。本发明提供的白藜芦醇制成颗粒剂时，把各原料的提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。本发明提供的白藜芦醇制成注射液时，取各原料的提取物加入生理盐水溶解然后加入活性碳，搅拌均匀，8(TC加热30分钟，过滤，调节pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115t:灭菌30分钟制成注射液。以上提供的白藜芦醇在治疗肾脏疾病中的应用，特别是用于治疗原发性肾病综合征药物中的应用和在治疗肾小球肾炎药物中的应用。有益效果本发明在白藜芦醇原有功效的基材上进行新的用途开发，实验研究表明白藜芦醇具有很好的治疗肾脏病的作用，尤其对原发性肾病综合症和肾小球肾炎具有很好的治疗作用，且不良反应小，原料易得，有望开发成为新一代的治疗肾脏病的药物。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比及其实验结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1:白藜芦醇对原发性肾病综合征的药理作用。—、实验材料氨基核苷嘌呤霉素、白藜戸醇购自美国Sigma公司；SuperScriptIIIRNaseH-ReverseTranscriptase试齐U盒购自美国Invitrogen公司；山羊抗n印hrin、podocin抗体、辣根过氧化物酶标记抗山羊和小鼠二抗购自美国SantaCruz公司。二、实验方法1、动物模型制备及实验分组取雄性SD大鼠40只，体重80100克，随机分为正常对照组、模型组、白藜芦醇低剂量组、白藜戸醇高剂量组和白藜戸醇对照组，每组8只。其中模型组、白藜戸醇低剂量组和白藜芦醇高剂量组予一次性腹腔注射剂量为150mg/kg的氨基核苷嘌呤霉素(PAN)，制备肾病综合征动物模型，从注射当天(第0天)起，白藜芦醇低剂量、白藜芦醇高剂量以及白4藜芦醇对照组大鼠，每天腹腔注射剂量分别为60，120，120mgKg—1的白藜芦醇，每天一次，正常对照组、模型组腹腔注射等量生理盐水。然后用代谢笼隔日(分别为第1、3、5、7天)收集大鼠24h的尿液，检测24h尿蛋白总量，第8天集中处死所有大鼠，留取肾脏。2、实验观察指标2.1大鼠24小时尿蛋白含量测定应用Bradford法测定各组大鼠24h尿液中尿蛋白总量。2.2肾脏病理形态学观察采用光镜检查和肾脏超微结构检查，光镜检查所有大鼠肾脏标本用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片(3践)，分别用行苏木素-伊红(HE)和希夫氏(PAS)染色，光镜下观察肾组织。超微结构检查采用透射电镜观察，取约lmm3的大鼠肾皮质，经2.5%戊二醛固定、1%锇酸后固定、脱水、用环氧树脂618包埋，超薄切片后采用醋酸铀柠檬酸铅染色，并在JEM-1010透射电镜下观察各组大鼠的肾组织超微结构。2.3实时定量RT-PCR方法取各组大鼠的肾皮质，采用Trizol—步抽提法提取总RNA，其中逆转录以随机六核苷酸寡聚合物(PdN6)为引物，采用Invitrogen公司的SuperscriptIIIRNaseH-ReverseTranscriptase试剂盒进行。实时定量PCR在美国ABIPRISM7000SDS上进行，并采用primer3软件(http:〃frodo.wi.mit.edu)设计引物，所设计的引物序列为:n印hrin:上游引物，5'-GGAGGACAGGATCAGGAATGAA-3，，下游引物，5'-CCCGGTCCCCAGTCCA-3';podocin:上游引物，5'-GTGAGGAGGGCACGGAAG-3'，下游引物，5'-AGGGAGGCGAGGACAAGA-3';GAPDH:上游引物，5，-GTCTTCACTACCATGGAGAAGG-3，，下游引物，5'-TCATGGATGACCTTGGCCAG-3，。实时定量PCR采用SYBRGreenmastermix(AppliedBiosystems)试剂盒在96孔板上进行，每一管的反应总体积为25yL，并且PCR的温度循环设计为95°C，10分钟；随后以95°C，15秒和60°C，1分钟循环40次。mRNA表达量采用管家基因GAPDH校正。2.4大鼠肾组织蛋白质提取及免疫印迹冰上称取lOOmg各组大鼠肾皮质，加入冰预冷的蛋白质裂解缓冲液lml(50mMTris-HCL(pH7.4)、150mMNaCl、1%TritonX-亂O.25%脱氧胆酸钠、1慮EDTA、lmMDTT、5%甘油、100ug/mlPMSF、lug/mlAprotinin、1ug/mlLeup印tin禾口1ug/mlP印statin)冰上匀浆，并与4。C孵育lh，然后在4。C下16000转/分离心15min，取上清。采用Bradford法测各组的蛋白浓度。然后取30yg各组总蛋白加上样缓冲液煮沸5分钟后上SDS聚丙烯酰胺凝胶(10%)电泳，转移至硝酸纤维素膜，然后将转移后的硝纤膜TBS-T室温封闭lh，加l:1000山羊抗n印hrin或podocin抗体室温反应2h，辣根过氧化物酶标记的二抗室温作用lh，最后化学发光后自显影、定影。3、统计学方法实验结果以均数±标准差表示，采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，多个均数之间的比较采用q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。三、实验结果3.1、白藜芦醇对实验性肾病大鼠24h尿蛋白总量的影响实验前，各组大鼠尿蛋白排泄量无明显差别，在氨基核苷嘌呤霉素注射造模后第3天，模型组大鼠尿蛋白的排泄量开始增加，至第7天达最高峰，尿蛋白总量达259.73mg/24h;白藜芦醇各治疗组在腹腔注射白藜芦醇3天后对大鼠实验性肾病模型有明显降低尿蛋白的作用(P<0.05)，具体实验结果如表1所示。表1各组大鼠24h尿蛋白总量变化情况(n=8，mg/24h)组别24h尿蛋白总j第l天第3天第5天第7天正常对照组3.71±1.284.85±1.934.23±1.653.87±1.63模型组6.05±2.1918.74±4.28*158.97±35.68*259.73±70.38*白藜芦醇低剂量组5.34±1.8615.67士3.1957.28±9.14*33.95士6.84命白藜芦醇高剂量组5.75±2.1415.05±4.2846.05±4.43*19.37±3.35*白藜芦醇对照组4.82±2.333.84±1.564.96±1.254.19±1.88与正常对照组比较，*P<0.01;与模型组相比较,P<0.01。由以上检测结果表明白藜芦醇高、低剂量组能有效的降低氨基核苷嘌呤霉素诱发的肾病综合征动物模型的尿蛋白总量，且与模型组相比具有统计学意义，并且实验结果表明白藜芦醇对正常大鼠的尿蛋白总量没有影响，说明白藜芦醇具有很好的抑制肾病综合征动物模型导致的尿蛋白总量增高的作用。3.2肾脏病理形态学观察结果光镜下模型组大鼠、白藜戸醇高低剂量组的肾小球与正常对照组相比未见明显异常，透射电镜下观察正常对照组肾小球足细胞足突形态正常，但模型组大鼠肾小球足细胞足突广泛融合、消失，白藜芦醇高、低剂量组治疗后，能显著减轻大鼠肾小球足细胞足突的融合。说明白藜芦醇能够很好的抑制氨基核苷嘌呤霉素诱导的肾小球足突的融合和消失，有效抑制尿总蛋白增高。3.3肾组织中n印hrin和podocin表达实时定量RT-PCR和WesternBlot检测结果显示，模型组大鼠肾组织中n印hrin和podocin表达显著降低，是正常对照组大鼠的3542%，白藜戸醇治疗后，大鼠肾组织中n印hrin和podocin表达显著上调，且随剂量增大其作用更为显著，呈现较好的量效关系，白藜芦醇高剂量治疗组，大鼠肾组织中n印hrin和podocin表达恢复到正常对照组的78-86%。实验结果进一步表明白藜戸醇能上调足细胞裂孔隔膜蛋白n印hrin和podocin表达，对肾脏组织具有明显的保护作用。微小病变型肾病是儿童肾病综合征最常见的病理类型，其病理改变主要以电镜下肾小球上皮细胞足突融合为特征，且肾脏疾病患者中足突的融合和消失是蛋白尿形成的启动机制之一，而尿蛋白的排泄又可加重足细胞损伤。以上实验结果显示，白藜芦醇对肾脏具有很好的保护作用，能有效降低尿蛋白含量，明显缓解足细胞损伤，减轻足突融合，并且能上调足细胞裂孔隔膜蛋白n印hrin和podocin表达，能够有效的治疗肾病综合征。实施例2白藜戸醇对系膜增生性肾小球肾炎的药理作用。6—、实验材料健康雄性SD大鼠40只，4周龄，体重160g左右，购自江苏省实验动物中心；白藜芦醇、完全弗氏佐剂、FITC标记的羊抗兔IgG及Schiff试剂购自美国Sigma公司，增殖细胞核抗原(PCNA)和单核细胞趋化因子-l(MCP-l)单克隆抗体购自美国SantCruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、正常山羊血清封闭液、DAB显色剂购自北京中山生物技术公司。二、实验方法1、抗大鼠胸腺细胞抗血清(ATS)的制备选4周龄SD大鼠，取其胸腺并制备成一定浓度的单胸腺细胞悬液，与完全弗氏佐剂等体积混匀后，按5X107细胞皮下多点注射免疫新西兰大白兔，其后每隔2周按IX107胸腺细胞经耳缘静脉注射加强免疫3次。7周后颈动脉放血并分离血清，大鼠胸腺细胞涂片及大鼠肾组织冰冻切片测定ATS效价，间接免疫荧光法测抗体效价达1:1280。2、大鼠抗Thyl.1系膜增生性肾小球肾炎模型制备及实验分组雄性SD大鼠40只，随机分为5组正常对照组、模型组、白藜戸醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组和白藜芦醇对照组，每组8只。正常对照组和白藜芦醇对照组经尾静脉一次性注射10ml/kg的正常兔血清，模型组、白藜戸醇低剂量组和白藜戸醇高剂量组经尾静脉一次性注射10ml/kg的抗大鼠胸腺细胞抗血清造模，从注射抗大鼠胸腺细胞抗血清当天(第0天)起，白藜芦醇低剂量、白藜芦醇高剂量以及白藜芦醇对照组大鼠分别每天给予60，120，120mgKg—1剂量的白藜芦醇，腹腔注射，每天一次，正常对照组、模型组大鼠每天腹腔注射等量生理盐水，用代谢笼隔日(分别为第1、3、5、7天)收集大鼠24h尿液，检测24h尿蛋白总量，第8天集中处死所有大鼠，留取肾脏。3、观测指标3.1大鼠24小时尿蛋白含量测定应用Bradford法测定24h尿蛋白总量(mg/24h)。3.2肾脏病理形态学观察所有标本用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片(3iim)，分别用行苏木素-伊红(HE)和希夫氏(PAS)染色，光镜下观察肾组织。每张切片高倍镜下随机选取10个肾小球，对肾小球内有核细胞进行计数，并采用捷达病理图像分析系统软件测定肾小球系膜区面积及肾小球面积。3.3肾组织中PCNA、MCP-1的表达肾组织中PCNA和MCP-1的表达采用WesternBlot检测。4、统计学方法实验结果以均数±标准差表示，采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析，多个均数之间的比较采用q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。三、实验结果3.1白藜芦醇对系膜增生性肾小球肾炎大鼠模型24h尿蛋白总量的影响模型组在注射抗大鼠胸腺细胞抗血清后24h，尿蛋白即升高，至第5天达最高峰，尿蛋白总量达59.43mg/24h;白藜芦醇治疗组在腹腔注射白藜芦醇3天后对大鼠系膜增生性肾小球肾炎模型有明显降低尿蛋白的作用(P<0.05)，具体实验结果如表2所示表2各实验组大鼠24h尿蛋白总量的变化情况(n=8，mg/24h)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与正常对照组比较，*P<0.01;与模型组相比较,P<0.01。由以上检测结果表明白藜芦醇高、低剂量组能有效的降低系膜增生性肾小球肾炎模型的尿蛋白总量，且与模型组相比具有统计学意义，并且实验结果表明白藜芦醇对正常大鼠的尿蛋白总量没有影响，说明白藜芦醇具有很好的对抗系膜增生性肾小球肾炎导致的尿蛋白总量增高。3.2肾脏病理形态学观察结果PAS染色光镜下，正常对照组大鼠的肾小球无明显改变；模型组大鼠的肾小球内细胞数明显增多，肾小球系膜细胞和系膜基质弥漫性重度增生，系膜区明显扩大，肾小球毛细血管腔广泛受压狭窄、闭塞，部分肾小球可见球囊粘连、细胞性新月体形成及肾小球硬化，及肾小管上皮细胞灶性颗粒样、空泡样变性，部分小管管腔内见蛋白管型，间质可见弥漫性炎性细胞浸润；但白藜芦醇高剂量治疗组大部分肾小球已基本接近正常，且毛细血管管腔开放良好，偶见球囊粘连，未见新月体形成及肾小球硬化，间质内无明显炎性细胞浸润，表明白藜芦醇具有很好的保护肾脏和修复肾脏组织病理变化的作用。并且图像分析显示模型组肾小球内有核细胞总数、系膜区面积及肾小球面积均明显高于对照组(P<0.01)，白藜芦醇治疗组肾小球内有核细胞总数、系膜区面积及肾小球面积均明显低于模型组(P<0.01)，具体实验结果如表3所示表3各组大鼠肾小球病理形态学指标变化情况(n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与对这种比较，*P<0.01;与模型组比较,P<0.01。由以上实验结果表明本发明提供的白藜芦醇高、低剂量组能有效的降低肾小球有核细胞总数，且能减少系膜区面积和肾小球面积，和模型组相比具有统计学意义，表明白藜芦醇对肾脏具有明显的保护作用，且白藜芦醇高、低剂量之间呈现较好的量效关系。3.3肾组织中PCNA和MCP-1的表达WesternBlot检测结果显示，正常大鼠肾组织表达少量的PCNA和MCP-1，模型组大鼠肾组织中PCNA和MCP-1表达显著增加，分别是对照组的3.61倍和2.79倍。白藜戸醇治疗后，大鼠肾组织中PCNA和MCP-1表达均显著降低，低剂量白藜芦醇对PCNA和MCP-1表达的抑制率分别为57%和63%，高剂量白藜芦醇对PCNA和MCP-1表达的抑制率分别为75%和81%，实验结果进一步表明白藜戸醇能够防治肾组织内炎症细胞的浸润，减轻炎症反应。本研究结果显示，白藜芦醇能有效阻止大鼠系膜增生性肾小球肾炎疾病的进一步发展，给予大鼠腹腔注射白藜芦醇3天后，大鼠24小时尿蛋白总量较模型组即有显著下降，第7天后，治疗组肾小球内系膜细胞增殖及系膜基质增生较模型组均有显著减轻，间质中炎性细胞浸润程度较模型组明显下降，且随着白藜芦醇治疗剂量的增加，其作用更为明显，证实白藜芦醇对系膜增生性肾小球肾炎具有确切的治疗作用。且实验结果表明，系膜增生性肾小球肾炎模型大鼠在第8天肾皮质中PCNA和MCP-1表达明显增强，经白藜芦醇治疗后，肾组织内PCNA和MCP-1的含量均明显减少。MCP-1具有趋化激活单核细胞，促进氧自由基的产生及肾组织内炎症细胞的浸润，加重炎症反应作用。白藜芦醇可显著减低肾组织中MCP-1表达，提示白藜芦醇可能通过阻断MCP-1表达而减轻肾组织损伤，进一步说明白藜芦醇对肾脏具有保护作用，能够有效防治系膜增生性肾小球肾炎。通过以上实验结果表明白藜芦醇对肾脏具有明显的保护作用，对肾脏疾病常表现的尿蛋白总量增高，足突的融合和消失，肾小球有核细胞总数升高，系膜区面积和肾小球面积增大等病理症状具有明显的抑制作用。因此，实验结果表明白藜芦醇其对原发性肾病综合征和肾小球肾炎具有很好的防治作用，白藜芦醇有望用于制备治疗肾脏疾病的新一代药物。9权利要求白藜芦醇在治疗肾脏病中的应用。2.根据权利要求1所述的白藜芦醇在治疗肾脏病中的应用，其特征在于，白藜芦醇在治疗原发性肾病综合症中的应用。3.根据权利要求1所述的白藜芦醇在治疗肾脏病中的应用，其特征在于，白藜芦醇在治疗肾小球肾炎中的应用。4.根据权利要求3所述的白藜芦醇在治疗肾脏病中的应用，其特征在于，白藜芦醇在治疗系膜增生性肾小球肾炎中的应用。全文摘要本发明公开了白藜芦醇在治疗肾脏病中的应用，经动物实验研究表明，白藜芦醇具有很好的保护肾脏的作用，白藜芦醇对肾脏疾病常表现的蛋白尿，足细胞损伤，肾小球系膜细胞增生，细胞外基质积聚等病理症状具有明显的抑制作用，对原发性肾病综合征和系膜增生性肾小球肾炎具有很好的防治作用，且本发明提供的白藜芦醇原料易得，药理活性强，不良反应低，有望成为新一代治疗肾脏病的药物。文档编号A61K31/05GK101780062SQ201010129038公开日2010年7月21日申请日期2010年3月22日优先权日2010年3月22日发明者张爱华,黄松明申请人:张爱华;黄松明